Xác định sự hoạt hóa của phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (pip5k) a và c661 trên dòng tế bào hela chuyển gene
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase (PIP5K). 2
1.1.1. Cấu trúc của PIP5K. . 2
1.1.2. Quá trình tổng hợp PIP2 của PIP5K trong tế bào. . 3
1.1.3. Protein PIP5KA. . 5
1.1.4. Protein PIP5KB 6
1.1.5. Protein PIP5KC 7
1.1.6. Các nhân tố hoạt hóa PIP5K 8
1.2. Protein kinesin KIF2A . 9
1.2.1. Họ protein kinesin (KIFs) 9
1.2.2. Protein KIF2A 11
1.3. Phức hợp adaptor protein AP-2 . 12
1.3.1. Cấu trúc của protein AP-2 12
1.3.2. AP-2 là protein tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. . 13
1.4. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử Split Venus. 15
1.4.1. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử (Bimolecular Fluorescence
Complementation – BiFC). 15
1.4.2. Hệ thống Split Venus . 16
Mục tiêu và nội dung thực hiện 17
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.VẬT LIỆU 18
2.1.1.Dụng cụ - Thiết bị . 18
2.1.1.1.Dụng cụ 18
2.1.1.2.Thiết bị . 18
2.1.2.Hóa chất – Môi trường 18
2.1.2.1.Hóa chất 18
2.1.2.2.Môi trường . 21
2.1.3.Nguyên vật liệu . 22
2.1.3.1.Tế bào . 22
2.1.3.2.Chủng vi sinh vật . . 22
2.1.3.3. Các plasmid sử dụng trong luận văn . 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 24
2.2.1. Phương pháp thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng
PCR 24
2.2.1.1. Đặc điểm cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR 24
2.2.1.2. Phản ứng PCR . 25
2.2.2.Tạo dòng trình tự mã hóa vùng hình cầu của protein KIF2A. 26
2.2.2.1.Xử lý sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và plasmid pVenus-N1
bằng enzyme XhoI và EcoRI 26
2.2.2.2.Tinh sạch sản phẩm cắt bằng bộ kit gel M . 27
2.2.2.3.Thiết lập phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp. . 28
2.2.2.4.Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α. 28
2.2.2.5. Thu nhận dòng tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp pVenus-KIF2AGD
29
2.2.3. Tạo dòng trình tự mã hóa vùng ear của protein β2-Adaptin-ear 31
2.2.4. Tách chiết lượng lớn plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit Midiprep
(Quiagen) 31
2.2.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật. . 32
2.2.5.1. Phương pháp cấy chuyền tế bào. . 32
Mục lục
lxxv
2.2.5.2. Bảo quản tế bào nuôi cấy 33
2.2.6. Kiểm tra sự biểu hiện protein KIF2A-GD và protein β2-Adaptin-ear . 34
2.2.6.1. Phương pháp chuyển DNA vào tế bào động vật bằng
Lipofectamine . 34
2.2.6.2. Phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa invitro bằng phương pháp
kính hiển vi huỳnh quang. 37
2.2.6.3. Xác định tỉ lệ tế bào phát huỳnh quang. 37
2.2.6.4. Kiểm tra sự tái sắp xếp của actin trong tế bào 37
2.2.6.5. Xác định cường độ tín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm Image J
Basics (NIH). 38
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A
(KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear) . 39
3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp
PCR. . 39
3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus
(1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. 40
3.1.3. Kết quả giải trình tự . 42
3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống
Split Venus. . 46
3.2.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. . 46
3.2.2. Kết quả xác định hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid . 50
3.3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tế bào HeLa
clone 3. 51
3.3.1. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi được kích thích
bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF. 52
3.3.2. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi protein ARF6 QL
biểu hiện vượt mức . 53
3.3.2. Kết quả định lượng cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa
clone 3 55
Chương 4: KẾT LUẬN
KẾT LUẬN 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC
10 trang |
Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 2636 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xác định sự hoạt hóa của phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (pip5k) a và c661 trên dòng tế bào hela chuyển gene, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
PHỤ LỤC
Phụ lục.
1.Sơ đồ plasmid pVenus (1-173) N1
Phụ lục.
Phụ lục.
2.Sơ đồ plasmid pVenus (155-238) N1
Phụ lục.
3.Kết quả xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển
plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KA và KIF2A-GD vào tế bào COS-7
Lần 1
(%)
Lần 2
(%)
Lần 3
(%)
173kif2a-155pip5kA 10.4 6.1 9.5
173kif2a-155pip5kA-ARF6 22.5 15.6 21
173kif2a-155pip5kA-ST 0 0 0
173kif2a-155pip5kA-ARF6-
ST 13.6 12 10.3
155Kif-173PIP5KA 4 5.3 7
155Kif-173PIP56KA-ARF6 5 6.1 7.1
155Kif-173PIP5KA-ST 0 0 0
155Kif-173PIP56KA-ARF6-
ST 3.2 5.8 5
Phụ lục.
Descriptives
VAR00002
Test of Homogeneity of Variances
VAR00002
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
3.919 7 16 .011
ANOVA
VAR00002
Sum of
Squares df
Mean
Square F Sig.
Between
Groups 886.423 7 126.632 38.701 .000
Within
Groups 52.353 16 3.272
Total 938.776 23
Homogeneous Subsets
VAR00002
Duncan
VAR000
01 N
Subset for alpha = .05
1 2 3 4 5
N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% Confidence
Interval for Mean
Minimu
m
Maximu
m
Lower
Bound
Upper
Bound
1.00 3 8.6667 2.26789 1.30937 3.0329 14.3004 6.10 10.40
2.00 3 19.7000 3.62905 2.09523 10.6849 28.7151 15.60 22.50
3.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
4.00 3 11.9667 1.65025 .95277 7.8672 16.0661 10.30 13.60
5.00 3 5.4333 1.50444 .86859 1.6961 9.1706 4.00 7.00
6.00 3 6.0667 1.05040 .60645 3.4573 8.6760 5.00 7.10
7.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
8.00 3 4.6667 1.33167 .76884 1.3586 7.9747 3.20 5.80
Tota
l 24 7.0625 6.38877 1.30410 4.3648 9.7602 .00 22.50
Phụ lục.
3.00 3 .0000
7.00 3 .0000
8.00 3 4.6667
5.00 3 5.4333 5.4333
6.00 3 6.0667 6.0667
1.00 3 8.6667
4.00 3 11.9667
2.00 3 19.7000
Sig. 1.000 .383 .053 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
4.Kết quả xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển
plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KC661 và β2-Adaptin-ear vào tế bào
COS-7
Lần 1 (%)
Lần 2
(%)
Lần 3
(%)
173b2Adaptin-155PIP5KC 9.5 11.2 12.3
173 b2Adaptin-
155PIP5KC+ARF6 QL 17.7 15 18.3
173 b2Adaptin-155 PIP5KC ST 6 8.1 5
173 b2Adaptin-
155PIP5KC+ARF6 QL ST 14 9.4 10.6
155 b2Adaptin-173PIP5KC 4.2 5 5
155b2Adaptin-
173PIP5KC+ARF6 QL 7 8 10
155 b2Adaptin-173PIP5KC-ST 0 0 0
155b2Adaptin-
173PIP5KC+ARF6 QL ST 4 6.7 5.4
Descriptives
N Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% Confidence
Interval for Mean
Minimu
m
Maximu
m
Lower
Bound
Upper
Bound
1.00 3 11.0000 1.41067 .81445 7.4957 14.5043 9.50 12.30
2.00 3 17.0000 1.75784 1.01489 12.6333 21.3667 15.00 18.30
3.00 3 6.3667 1.58219 .91348 2.4363 10.2971 5.00 8.10
Phụ lục.
VAR00003
Test of Homogeneity of Variances
VAR00003
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
2.147 7 16 .098
ANOVA
VAR00003
Sum of
Squares df
Mean
Square F Sig.
Between
Groups 556.480 7 79.497 36.040 .000
Within
Groups 35.293 16 2.206
Total 591.773 23
Homogeneous Subsets
VAR00003
Duncan
VAR000
01 N
Subset for alpha = .05
1 2 3 4 5
7.00 3 .0000
5.00 3 4.7333
8.00 3 5.3667
3.00 3 6.3667 6.3667
6.00 3 8.3333
1.00 3 11.0000
4.00 3 11.3333
2.00 3 17.0000
4.00 3 11.3333 2.38607 1.37760 5.4060 17.2607 9.40 14.00
5.00 3 4.7333 .46188 .26667 3.5860 5.8807 4.20 5.00
6.00 3 8.3333 1.52753 .88192 4.5388 12.1279 7.00 10.00
7.00 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00
8.00 3 5.3667 1.35031 .77960 2.0123 8.7210 4.00 6.70
Tota
l 24 8.0167 5.07240 1.03540 5.8748 10.1586 .00 18.30
Phụ lục.
Sig. 1.000 .220 .124 .787 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
5.Kết quả cường độ huỳnh quang tương tác giữa PIP5KA và KIF2A trong tế
bào HeLa clone 3
KIF2A-PIP5KA
KIF2A-
PIP5KA-EGF
KIF2A-PIP5KA-
ARF6QL
Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2
1 75.729 55.150 98.692 57.353 135 73.2643
2 73.828 57.281 91.587 96.858 89.734 114.5097
3 74.426 89.614 67.751 79.585 141.86 117.1223
4 90.069 119.553 79.121 90.242 140.3604 115.816
5 105.607 67.096 86.779 85.625 67.3731 88.1758
6 107.190 59.934 76.249 73.514 133.2441 83.6177
7 85.820 128.580 94.112 73.681 131.2482 81.7872
8 69.943 72.000 70.949 96.101 112.9736 74.4935
9 33.696 80.852 66.942 109.583 97.9373 157.1252
10 65.291 85.564 63.597 106.491 115.0955 72.874
Trung Bình 78.160 81.562 79.578 86.903 116.483 97.879
Cường độ huỳnh quang
trung bình 79.861 83.241 107.181
STDEV 2.406 5.180 13.155
p Value 0.541 0.002
Sử dụng phần mềm Image J, xác định cường độ huỳnh quang 20 tế bào của 2 lần
lặp lại thí nghiệm. So sánh kết quả bằng phương pháp T-Test giữa cặp tế bào có và
không có kích thích với EGF, giữa cặp tế bào có biểu hiện và không có biểu hiện
ARF6 QL.
6. Kết quả cường độ huỳnh quang tương tác giữa PIP5KC661 và β2-Adaptin-
ear trong tế bào HeLa clone 3.
BETA-PIP5KC
BETA-PIP5KC-
EGF
BETA-PIP5KC-
ARF6QL
lần 1 Lần 2 lần 1 Lần 2 lần 1 Lần 2
1 109.057 84.276 96.721 91.913 127.763 120.139
2 127.066 116.879 68.565 87.117 121.235 87.007
3 89.909 52.704 82.249 80.040 102.649 150.607
Phụ lục.
4 114.627 120.855 69.343 94.411 103.697 89.992
5 100.755 77.861 55.079 82.106 138.339 128.136
6 75.130 71.348 141.300 90.473 140.571 102.789
7 78.040 112.831 76.522 74.613 89.585 76.365
8 92.861 80.751 77.617 75.906 114.179 174.899
9 75.130 100.772 75.940 192.818 134.408 152.068
10 71.719 96.973 53.368 67.368 78.784 159.608
Trung Bình 93.430 91.525 79.670 93.676 115.121 124.161
Cường độ huỳnh quang
trung bình 92.477 86.673 119.641
STDEV 1.347 9.904 6.392
p Value 0.489 0.006
