Xác định trình tự vùng ITS - RDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille - Ký sinh trên côn trùng gây hại

LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. Trung tâm Phân tích Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật khoa Nông học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành quyển luận văn này. Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị tại Trung tâm phân tích hóa sinh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Chị Phan Đặng Thái Phương đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian làm đề tài. Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Võ Thị Thu Oanh và thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Thành kính ghi ơn cha mẹ đã nuôi dưỡng, thương yêu và dạy dỗ con nên người. Sau cùng, tôi xin cảm ơn bạn Huỳnh Ngọc Phương và tất cả các bạn trong lớp đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2005 Trần Thị Thủy Tiên SUMMARY Beauveria bassiana is insect parasitizing species. It plays a very important role in plant protect. To enhance its application in this aspect, molecular study should be carried out to identify the genetic relationships between the isolates of Beauveria bassiana collected in Viet Nam and to identify how the pathogenicity of these isolates relates to the genotypes. ITS - rDNA which is a conservative region in most of the organisasm genome has high significance in taxonomy so this study is based on the sequence of this region. Nineteen isolates of Beauveria bassiana collected from diferrent geographical regions and hosts have been inoculated in broth culture, extracted DNA and amplified the ITS1 - 5,8 S - ITS2 region with two primers ITS4 and ITS5. 580 bp products have been obtained. PCR products of two isolates PUL-Q2-4 and RN-LA-10 have been sequenced and compared by Clustal software. The alignment showed that there is no difference between these two sequences. The alignment of these sequences and 6 sequences of Beauveria bassiana choosen spontanuously from NCBI showed that the identities of ITS1 and ITS2 region are 93,5 % and 90,1 %, respectively, the 5,8 S sequences have 99,9 % homology. This preliminary study indicated that a variation in genetic of ITS - rDNA region may be detected among isolates of Beauveria bassiana. Therefore, the PCR products of other isolates should be sequenced and compared in the future to identify the relationship between pathogenicity and genotypes based on which the isolates with high toxicity would be found to protect plant. TÓM TẮT TRẦN THỊ THỦY TIÊN, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại” Hội đồng hướng dẫn: Th.S Võ Thị Thu Oanh TS Lê Đình Đôn Nấm Beauveria bassiana có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại, chiếm vị trí quan trọng trong các chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh từ vi nấm. Để nâng cao hiệu quả ứng dụng của nấm này cần đẩy mạnh các nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử nhằm xác định mối quan hệ di truyền của các nguồn nấm Beauveria bassiana thu thập được và mối liên hệ của tính độc với đặc điểm di truyền của nấm. Vùng ITS - rDNA là vùng trình tự tương đối bảo tồn có ý nghĩa lớn trong phân loại, do đó chúng tôi tiến hành khuếch đại và đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao nhằm xác định sự biến đổi trong trình tự của vùng này. Kết quả đạt được: Phân lập được nguồn nấm Beauveria bassiana SCL - KG. Thu thập các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao, tiến hành nhân sinh khối, li trích DNA, và khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 bằng 2 primer ITS4 và ITS5 đã khuếch đại được đoạn DNA kích thước khoảng 580 bp của các nguồn nấm SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, PUL-Q2-4, PUL-BC-6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9, SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q9-8, SN-PT-9, BH-BD-12. Đọc trình tự sản phẩm PCR của 2 nguồn nấm PUL-Q2-4 RN-LA-10. Trình tự vùng ITS – rDNA của hai nguồn nấm này hoàn toàn giống nhau. Đoạn trình tự đọc được có kích thước 411 bp trong đó gen 5,8 S có kích thước 158 bp, vùng ITS1và ITS2 có kích thước lần lượt là 132 và 121 bp. So sánh trình tự 2 nguồn nấm PUL-Q2-1 và RN-LA-10 với 6 nguồn nấm ký sinh trên nhiều ký chủ khác nhau từ cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng trên toàn vùng là 94,4 %. Tỷ lệ tương đồng của 3 vùng ITS1, 5,8 S, ITS2 lần lượt là 93,5 %, 99,9 % và 90,1 %. Tỷ lệ tương đồng trong vùng 5,8 S cao hơn vùng ITS1 và ITS2 rất nhiều. Qua kết quả trên cho thấy vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana khá đa dạng rất có ý nghĩa trong xác định quan hệ di truyền giữa các nguồn nấm có tính độc cao và tìm mối liên hệ giữa những biến đổi của vùng này với tính độc. Đề tài này giúp tạo cơ sở cho nghiên cứu xác định sự biến đổi trình tự ITS - rDNA trên tất cả các nguồn nấm Beauveria bassiana thu thập được trong nước từ đó so sánh chọn lọc nguồn nấm có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại. MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Summary vi Tóm tắt v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 1.3 Yêu cầu 2 1.4 Nội dung thực hiện 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana 3 2.1.1 Vị trí phân loại 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái 3 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 4 2.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 4 2.1.3.2 Điều kiện nhiệt độ 4 2.1.3.3 Điều kiện pH 4 2.1.4 Điều kiện phân bố 4 2.1.5 Độc tố của nấm Beauveria bassiana 5 2.1.6 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng 6 2.1.6.1 Sự xâm nhập 6 2.1.6.2 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết 6 2.1.7 Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm 7 2.1.8 Các chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana 8 2.2 Tổng quan về ITS - rDNA 9 2.2.1 Giới thiệu về rDNA và ITS 9 2.2.2 Phân nhóm rDNA 10 2.2.3 Sơ lược lịch sử nghiên cứu rDNA 11 2.2.4 Sơ đồ vị trí và trình tự các primer dùng trong nghiên cứu rDNA và vùng ITS 12 2.2.4.1 Vị trí và trình tự primer khuếch đại nu-rDNA 12 2.2.4.2 Vị trí và trình tự primer khuếch đại mt-rDNA 13 2.2.5 Ý nghĩa của ITS - rDNA trong phân loại nấm 14 2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR 15 2.3.1 Khái niệm 15 2.3.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 15 2.3.3 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng 16 2.3.3.1 Primer và nhiệt độ lai 16 2.3.3.2 DNA mẫu 16 2.3.3.3 Enzyme DNA polymerase 16 2.3.3.4 dNTP 17 2.3.3.5 Mg2+ và nồng độ Mg2+ 17 2.3.4 Những ứng dụng quan trọng của phản ứng PCR 17 2.4 Nguyên tắc đọc trình tự 18 2.4.1 Nguyên tắc phương pháp đọc chuỗi mã Sanger 18 2.4.2 Nguyên tắc giải trình tự gen bằng máy sequencer 18 2.4.3 Đọc trình tự sản phẩm PCR 18 2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước về nấm Beauveria bassiana 19 2.5.1 Nghiên cứu trong nước 19 2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 22 3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22 3.2 Phân lập và nhân sinh khối các nguồn nấm Beauveria bassiana 23 3.2.1 Hóa chất và dụng cụ 23 3.2.1.1 Hóa chất 23 3.2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 23 3.2.2 Phương pháp phân lập nấm 23 3.2.3 Phương pháp nhân sinh khối 24 3.3 Khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao 25 3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 25 3.3.1.1 Hóa chất 25 3.3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 25 3.3.2 Chuẩn bị khuôn DNA 26 3.3.3 Thành phần hóa chấ cho một phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt của của phản ứng PCR 26 3.3.4 Đánh giá kết quả 27 3.3.5 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 27 3.3.6 Bố trí thí nghiệm trong phản ứng PCR 28 3.4 Đọc trình tự sản phẩm PCR 29 3.4.1 Chuẩn bị DNA khuôn 29 3.4.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR 29 3.4.1.2 Định lượng DNA đã được tinh sạch 30 3.4.2 Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Sequencing Kit 30 3.4.2.1 Thành phần hóa chất 30 3.4.2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự 31 3.4.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại 31 3.4.4 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer 31 3.4.5 Quy trình tóm tắt các bước đọc trình tự 32 3.4.6 Bố trí thí nghiệm tinh sạch, đọc trình tự và phân tích kết quả 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và nhân sinh khối nấm trong môi trường CZA 34 4.2 Kết quả lio trích DNA tổng số các nguồn nấm Beauveria bassiana 35 4.3 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 37 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 41 4.5 Kết quả đọc trình tự 42 4.5.1 Kết quả đọc trình tự trên máy sequencer 42 4.5.1.1 PUL-Q2-4 42 4.5.1.2 RN-LA-10 42 4.5.2 Kết quả tìm trình tự đáng tin cậy 43 4.5.2.1 PUL-Q2-4 43 4.5.2.2 RN-LA-10 45 4.5.3 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của PUL-Q2-4 và RN-LA-10 45 4.5.4 So sánh trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 với các nguồn nấm Beauveria bassiana từ cơ sở dữ liệu NCBI 46 4.5.5 Biểu đồ phân nhánh 49 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 5.3 Giới hạn đề tài 51 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT bp: base pair. Cp: Chloroplast. dNTP: 2’-dideoxynucleotide-5’-triphosphate. dATP: 2’-dideoxyadenine-5’-triphosphate. dCTP: 2’-dideoxycytosine-5’-triphosphate. dGTP: 2’-dideoxyguanine-5’-triphosphate. dTTP: 2’-dideoxyadenine-5’-triphosphate. ddNTP: 2’, 3’-dideoxynucleotide-5’-triphosphate. ddATP: 2’, 3’-dideoxyadenine-5’-triphosphate. ddCTP: 2’, 3’-dideoxycytosine-5’-triphosphate. ddGTP: 2’, 3’-dideoxyguanine-5’-triphosphate. ddTTP: 2’, 3’-dideoxyadenine-5’-triphosphate. EDTA: Ethylene Diamin Tetracetic Acid. ETS: External Transcribed Spacer. ITS: Internal Transcribed Spacer. LSU: Large Subunit. Mt: Mitochondria. NCBI: National Center for Biotechnology Informatic. PCR: Polymerase Chain Reaction. rDNA: ribosomal DNA. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. SDS: Sodium Dodecyl Sulfate. SSU: Small Subunit. Taq: Thermus aquaticus.. TAE: Tricacetic ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris ethylene diamine tetra acetate. Tm: Melting Tempereture. DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ BẢNG, BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 2.1 Trình tự primer dùng khuếch đại nu - rDNA 13 Bảng 2.2 Trình tự primer dùng khuếch đại mt - rDNA 14 Bảng 3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Thành phần môi trường phân lập và nhân nấm 23 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 26 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự 30 Bảng 3.5 Các nguồn nấm dùng trong so sánh 33 Biểu đồ 4.1 Biểu đồ phân nhánh dựa trên trình tự vùng ITS – rDNA 49 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin 5 Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng 7 Hình 2.3 Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) 9 Hình 2.4: Sơ đồ vị trí primer trên nu - rDNA (White và cộng sự, 1989) 12 Hình 2.5: Vị trí primer trên rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) 14 Hình 3.1 Quy trình khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 dùng 2 primer ITS4 và ITS5 27 Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR 32 Hình 4.1 Hình dạng sợi nấm và cách mọc bào tử của Beauveria bassiana 34 Hình 4.2 DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996 35 Hình 4.3 DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996 36 Hình 4.4 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol/ml 37 Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 3 pmol/ml 38 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ml 39 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/ml 39 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol/m 39 Hình 4.9 Sản phẩm PCR trước và sau khi tinh sạch bằng phương pháp cắt gel 41