Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (theobroma cacao l.) bằng kỹ thuật microsatellite

TÓM TẮT KHÓA LUẬN Tên đề tài: Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử Microsatellite trên cở sở phương pháp PCR và phân tích trình tự tự động để xây dựng phương pháp nhận diện hiệu quả và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng cacao. Mục đích nghiên cứu: - Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao bằng kỹ thuật microsatellite với độ chính xác và ổn định cao. - Tối ưu hoá phương pháp bằng kỹ thuật multiplex PCR. - Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao, làm cơ sở để đánh giá, phân loại và chọn lọc các giống có định hướng. Phương pháp nghiên cứu: - Sử dụng 5 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18 để phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng. - Tiến hành phân tích microsatellite trên máy giải trình tự DNA (ABI 3100), sử dụng phần mềm Gene Mapper để phân tích dữ liệu microsatellite thu được. - Sử dụng phần mềm Genetix để phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao khảo sát. Kết quả: - Phương pháp và kỹ thuật định danh ổn định, có độ chính xác cao - Tối ưu hóa phương pháp nhờ thực hiện thành công qui trình phản ứng multiplex PCR với 3 primer khác màu huỳnh quang, có cùng nhiệt độ bắt cặp 46oC. - Thiết lập được mối quan hệ di truyền giữa 21 dòng cacao khảo sát. Kết luận : 5 cặp primer microsatellite sử dụng trong đề tài đủ để định danh chính xác 21 dòng cacao khảo sát và phân tích được tính đa dạng di truyền của chúng. Đồng thời phương pháp và kỹ thuật định danh của đề tài phù hợp với phương pháp phân tích microsatellite của Ngân hàng cacao thế giới ICGD, mở ra một triển vọng cho các ứng dụng tiếp theo của microsatellite. MỤC LỤC CHƯƠNG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các hình ix Danh sách các bảng x 1. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 2 1.2.Mục đích yêu cầu 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu tổng quan về cây cacao 3 2.1.1. Nguồn gốc cây cacao 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái 3 2.1.3.Yêu cầu sinh thái 5 2.1.4. Các giống cacao 5 2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài 6 2.2. Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật 6 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR 8 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 8 2.3.2. Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 10 2.3.2.1. DNA mẫu 10 2.3.2.2. Taq polymerase 10 2.3.2.3. Primer 11 2.3.2.4. Nhiệt độ bắt cặp 13 2.3.2.5. Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu 14 2.3.2.6. Các thành phần khác 14 2.3.2.7. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR 15 2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR 15 2.3.3. Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 16 2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 17 2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA 19 2.5. Giới thiệu về Microsatellite 20 2.5.1. Khái niệm về Microsatellite 20 2.5.2. Các loại Microsatellite 20 2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite 21 2.5.4. Vai trò của Microsatellite 22 2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite 24 2.5.5.1.Phương pháp lai 24 2.5.5.2.Phương pháp PCR 24 2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR 25 2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài 27 2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite 28 2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ các phương pháp khác 29 2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite 30 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan 31 2.6.1. Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao bằng Microsatellite marker 31 2.6.2. Nghiên cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng Microsatellite marker 32 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1. Vật liệu 35 3.1.1. Các giống cacao thí nghiệm 35 3.1.2. Hóa chất thí nghiệm 37 3.1.2.1. Primer 37 3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 38 3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 38 3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự 38 3.1.3. Thiết bị thí nghiệm 39 3.2. Phương pháp 39 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 39 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 39 3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA 41 3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA 42 3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 42 3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ kế 42 3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite 42 3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer 42 3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer 43 3.2.6.Điện di sản phẩm PCR 45 3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA 45 3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus 46 3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1.Sản phẩm DNA li trích 50 4.2.Sản phẩm PCR 51 4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao 52 4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa 55 4.5. So sánh dữ liệu microsatellite 58 4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR 59 4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền 61 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 6. PHỤ LỤC 65 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite Al: Allele bp: base pair CT: Cần Thơ CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate ICGD: International Cocoa Genebank Database mM: milimolar (milimol/lite) mTcCIR: microsatellite Theobroma cacao CIRAD OD: Optical density. PCR: Polymerase chain reaction pmol: picomol RNA: Ribonucleic acid Rnase: Ribonuclease SSR: Single sequence repeat Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp) TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid) Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) U: Đơn vị hoạt tính USDA: United States Department of Agriculture DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Kết quả phân tích fingerprinting 32 Bảng 3.1. Các giống cacao thương mại khảo sát 36 Bảng 3.2. Primer microsatellite 37 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR 43 Bảng 3.4. Qui trình phản ứng PCR 43 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR 44 Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR 44 Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus 47 Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix 48 Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer 49 Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer 49 Bảng 4.1: Dữ liệu Microsatellite với 3 primer 53 Bảng 4.2: Dữ liệu Microsatellite với 2 primer 53 Bảng 4.3: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 56 Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 57 Bảng 4.5: Kết quả so sánh của giống NA33 58 Bảng 4.6: Kết quả so sánh của giống AMAZ15/15 58 Bảng 4.7: Kết quả so sánh của giống PA107 59 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá thể tương ứng 49 Biểu đồ 3.2: 5 primer với số lượng al tương ứng 49 Biểu đồ 4.1: Sự đa dạng di truyền của 6 quần thể cacao khảo sát 62 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Theobroma cacao 3 Hình 2.2. Nguyên tắc phản ứng PCR 9 Hình 2.3. Cấu trúc của máy ABI 9 Hình 2.4. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 21 Hình 2.5. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã 22 Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 25 Hình 2.7 : Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite 26 Hình 2.8 ữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel 26 Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên mao quản .27 Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn 36 Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn 36 Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu 41 Hình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch 41 Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu 46 Hình 3.6: Lắp capillary vào máy 46 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA 50 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 51 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR 51 Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 al dropping 246 với primer mTcCIR15 54 Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền 55 Hình 4.6:So sánh kết quả của 2 mẫu multiplex PCR giống nhau ở primer mTcCIR8 Hình 4.7:Kết quả phân tích mẫu CT3 bằng phương pháp kết hợp 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer mTcCIR7, mTcCIR15 và mTcCIR11 60 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE