Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α

sau 5 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) kết quả cấy vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. (a) sau 7 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Sau 4 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.06, giá trị này tƣơng đối thấp nên chúng tôi chỉ pha loãng và đếm số khuẩn lạc không ghi lại hình ảnh. b a a b 40 Sau 5 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.14, với giá trị OD này chúng tôi pha loãng từ 100 – 10-6. Nhƣng chỉ chọn nồng độ pha loãng 10-1 để đếm, kết quả 3 lần lập lại nhƣ sau : 283, 298,252. Ở nồng độ này các khuẩn lạc mọc rất dày phải chia ra ½ giọt đếm. Tuy nhiên ở nồng độ pha loãng kế tiếp thì số khuẩn lạc mọc ít không đủ từ 25 – 300 khuẩn lạc. Sau 6 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.36, chúng tôi pha loãng từ 10-1 đến 10-6 và chọn đếm ở độ pha loãng 10-2, kết quả đếm của 3 lần lặp lại là : 109, 138, 143. Sau 7 giờ nuôi cấy giá trị OD đạt đƣợc là 0.6, ở lần đếm này chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-7 để cấy lên đĩa và chọn ở nồng độ 10-3 để đếm, số khuẩn lạc đếm đƣợc nhƣ sau : 43, 52, 59. Sau 8 giờ nuôi cấy giá trị OD đo đƣợc là 1.3, chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8 để cấy lên đĩa và chọn đếm ở độ pha loãng 10-5 kết quả là : 20,38, 47. Khi giá trị OD đạt 1.3 thì dừng lại không theo dõi nữa vì thực tế chúng tôi chỉ cần biết trong điều kiện làm thí nghiệm này, để đạt đƣợc mật số tế bào 108 tế bào/ml thì giá trị OD tƣơng ứng sẽ là bao nhiêu. Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA 4 gờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.12 0.3 0.54 0.96 1.81 5 x 10 4 1.6 x 10 5 1.3 x 10 6 10 7 1.3 x 10 8 4.7 5.2 6.1 7 8.1 Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA 4 giờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.06 0.14 0.36 0.6 1.3 10 5 3 X 10 5 1.3 X 10 6 5 X 10 6 3.5 X 10 8 5 5.5 6.1 6.7 8.6 41 Biểu đồ 4. 1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. Theo đƣờng tƣơng quan này chúng tôi nhận thấy mối tƣơng quan giữa hai giá trị khảo sát tƣơng đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tế bào là 108/ml tƣơng ứng với giá trị OD là 0.145-0.45, nhƣng theo chúng tôi để đạt đƣợc 108 tế bào/ml thì giá trị OD phải là 1.5-1.8. với so sánh này chúng tôi nghi ngờ đã có một lƣợng lớn tế bào bị chết khi pha loãng bằng nƣớc cất. Chúng tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm, sử dụng nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc muối sinh lý. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. 42 Dựa vào đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật số tế bào ta thấy để đạt đƣợc mật số tế bào từ 5 x 107 – 108 tế bào/ ml thì ta nên chọn dịch nuôi cấy có giá trị OD từ 0.6 – 1, kết quả này khác biệt rất nhiều so với lần thí nghiệm thứ 1. Điều đó cho thấy khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí cho kết quả chính xác hơn khi pha loãng bằng nƣớc cất. So sánh giữa pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý và pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng có sự khác biệt rất lớn. Pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng số tế bào đếm đƣợc sẽ ít hơn khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý dù chúng có giá tri OD tƣơng đƣơng nhau. Kết quả này cho thấy khi dùng nƣớc cất vô trùng pha loãng sẽ có một số tế bào bị chết. Vì vậy, khi cần sự chính xác thì phải sử dung nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Và khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) vẫn có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này do nhiều nguyên nhân. Trong đó có hai nguyên nhân chính là chủng vi khuẩn và thiết bị đo OD. Những điều cần lƣu ý Do phải hút dịch vi khuẩn đang nuôi cấy để đo OD nhiều lần nên dịch nuôi cấy rất dễ bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài, phải cẩn thận khi thao tác. Mật độ tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố sau Thể tích môi trƣờng nuôi cấy Lƣợng tế bào vi khuẩn cho vào ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy Tốc độ của máy lắc Vì vậy mặc dù mỗi lần xác định giá trị OD đều có các mốc thời điểm cụ thể, nhƣng không thể áp dụng các mốc thời điểm này để chuẩn bị khả nạp mà không cần xác định giá trị OD. 43 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. . b a c DC 44 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X- gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả biến nạp trong 90 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên hình 4.3. Với kết quả biến nạp này cho thấy có một lƣợng khả nạp tiếp nhận đƣợc plasmid và thể hiện đƣợc đặc tính chọn lọc trên môi a b c DC 45 trƣờng LB/Amp/X-gal/IPTG, nhƣ vậy tế bào khả nạp đƣợc chuẩn bị có khả năng tiếp nhận plasmid. Tuy nhiên, việc xuất hiện khuẩn lạc trắng với mật độ rất cao ở các đĩa biến nạp và cả đĩa đối chứng không cho phép xác định đƣợc tỉ lệ biến nạp nào là thích hợp, đồng thời cho phép khẳng định nồng độ kháng sinh 60µg/ ml không đủ để chọn lọc thể biến nạp Biến nạp trong 60 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên Hình 4.4. Kết quả này tƣơng tự với kết quả biến nạp trong 90 giây. Nhƣ vậy, trong các quy trình biến nạp trên không có sự khác biệt lớn về nồng độ plasmid và mật độ vi khuẩn, cũng không có sự khác biệt lớn về thời gian biến nạp. Vì vậy, ở các lần biến nạp sau chúng tôi chọn sốc nhiệt trong 60 giây. Mặc khác, ở đĩa đối chứng mọc rất nhiều khuẩn lạc nhƣng chỉ toàn là khuẩn lạc trắng, còn ở các đĩa có trang vi khuẩn biến nạp thì có cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Điều này chứng tỏ nồng độ kháng sinh có trong môi trƣờng không đủ để loại những vi khuẩn không mong muốn. Với nhận định này, chúng tôi quyết định chọn lọc thể biến nạp với nồng độ kháng sinh là 100µg/ ml. 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. 46 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. 47 Với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml, đĩa đối chứng không xuất hiện khuẩn lạc nào. Trên cơ sở này tiến hành đánh giá các tỉ lệ biến nạp. Kết quả chọn lọc thể biến nạp ở nồng độ kháng sinh 100µg/ ml (Hình 4.6, 4.7, 4.8) cho khuẩn lạc xanh với mật độ rất cao, điều này cho thấy đây là nồng độ phù hợp để chọn lọc các khuẩn lạc mong muốn. Biến nạp ở thể tích 30µl khả nạp và 3µl plasmid cho kết quả ở giữa đĩa chỉ toàn khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng chỉ có ở xung quanh đĩa. Điều này có thể giải thích do trong quá trình làm thí nghiệm đã có những xảy ra làm cho một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh, thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa, do đó các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân huỷ vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng, tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen lacZ diễn ra chậm. Đối với các khuẩn lạc này khi quan sát kĩ sẽ thấy màu xanh nhạt Tổng số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 450, nhƣ vậy theo công thức tính hệ số biến nạp do Sambrook và cộng sự đƣa ra, chúng tôi tính đƣợc hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 3,073x103CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 10µl khả nạp và 1µl plasmid xuất hiện cả khuẩn lạc xanh và trắng với mật độ tƣơng đƣơng nhau. Điều này chỉ có thể giải thích là do các tế bào bị đột biến kháng kháng sinh. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 150, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,9x103CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 3µl khả nạp và 0.5µl plasmid chỉ thu đƣợc toàn khuẩn lac màu xanh, đây là kết quả tốt nhất trong các quy trình biến nạp mà chúng tôi đƣa ra. Theo chúng tôi thì tỉ lệ giữa khả nạp và plasmid trong quy trình này là phù hợp nhất và chúng tôi sẽ dựa vào tỉ lệ này để làm các bƣớc tiếp theo trong thí nghiệm. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 180, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,846x103CFU/ μg plasmid. Nhƣ vậy, sau 3 lần lập lại thí nghiệm với các tỉ lệ biến nạp khác nhau, chúng tôi thu đƣợc hệ số biến nạp nằm trong khoảng từ 1,8-3,0x103CFU/ μg plasmid. 4.3 Tách chiết DNA plasmid Chọn ở mỗi tỉ lệ biến nạp trong mục 4.2 năm khuẩn lạc cấy chuyền sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh 100μg/ml, nuôi cấy lắc 48 ở 370C qua đêm, cả 15 ống nghiệm trên đều có sinh khối vi khuẩn.Tiến hành tách chiết plasmid, thu đƣợc kết quả nhƣ sau : Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). Mẫu số 1, 2, 3, 4, 5 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 30 :3 ; Mẫu số 6, 7, 8, 9, 10 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 10 :1 ; Mẫu số 11, 12, 13, 14, 15 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 3 :0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 20 phút. Trong 15 mẫu tách chiết, mẫu số 3, 5, 7, 15 mặc dù vi khuẩn phát triển đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh nhƣng không thu đƣợc plasmid. Kết quả bƣớc đầu chiết tách plasmid còn lẫn rất nhiều DNA của bộ gen. Các mẫu không thu đƣợc plasmid có thể do sai sót trong quá trình tách chiết plasmid. Chiết tách DNA plasmid còn lẫn DNA của bộ gen là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Qua kết quả tách chiết trên tính đƣợc tỉ lệ tế bào tiếp nhận plasmid là 11/15. Với nhận định trên chúng tôi tiến hành chiết tách plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.10. Kết quả chiết tách plasmid 5 mẫu, mẫu số 4 không thu đƣợc plasmid. Ở lần tách chiết này đã loại đƣợc DNA genome Tuy nhiên còn lẫn rất nhiều tạp chất, lỗi này có thể do khi thực hiện bƣớc 7 và bƣớc 8 trong quy trình tách chiết, chúng tôi đã để cho các tạp chất lẫn vào phần dịch nổi phía trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách chiết lần 3 với mong muốn xác nhận những nghi ngờ của mình. Kết quả tách chiết lần 3 (có chú ý khắc phục những sai sót khi thực hiện ở lần tách chiết thứ 1 và thứ 2) đƣợc thể hiện ở Hình 4.11. Tiến hành tách chiết plasmid 5 mẫu, cả 5 mẫu đều có plasmid. Trong sản phẩm thu đƣợc không còn lẫn tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 DNA genome DNA plasmid 3.0kb 49 chất, chỉ thu đƣợc toàn plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hoá chất sử dụng đơn giản. Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở 100V trong 30 phút. Qua 3 lần tách chiết, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp DC 1 2 3 4 5 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb DNA plasmid 3.0kb 50 chất khác. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzym cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid : Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. (EcoRV) sản phẩm cắt bằng enzym EcoRV của plasmid tách chiết từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 :0.5 (lần 1), (DC1) plasmid gốc (chưa biến nạp), (DC2, DC3) plasmid đối chứng từ sản phẩm tách chiết. Kết quả trên hình cho thấy plasmid đã đƣợc cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kých của plasmid đối chứng, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS. Từ dạng thẳng này chúng ta có thể thực hiện phản ứng khử phosphoril ở hai đầu để duy trì sự ổn định của plasmid nhằm thực hiện phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid. 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng (blunt end) cho đoạn DNA DC TS TS DC EcoRV DC1 DC2 DC3 DNA plasmid 3.0kb 51 sau đó tinh sạch. kết quả tinh sạch đoạn DNA bằng 2 phƣơng pháp đƣợc thể hiện ở Hình 4.13 và Hình 4.14 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. . Kết quả điện di (hình 4.13) cho thấy quá trình tinh sạch đã loại đƣợc hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzym Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể đƣợc kiểm tra khi đã chèn vào plasmid (đã đƣợc cắt tạo đầu bằng) và biến nạp vào vi khuẩn. Kết quả diện di (hình 4.14) cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch không còn band phụ, tuy nhiên trong lúc kiểm tra kết quả tinh sạch cần chú ý chạy thêm đối chứng để 1 (DC) đoạn DNA đối chứng kích thước 629bp từ sản phẩm PCR chưa tinh sạch, (TS) đoạn DNA kích thước 629bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. (1) đoạn DNA kích thước 580bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX DC TS TS DC 52 đối chiếu, ở thí nghiệm này chúng tôi đã không chú ý đến điều này, đây là một thiếu sót của chúng tôi. Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.5.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzym cắt mở vòng mới tinh sạch. Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. Kết quả điện di cho thấy sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm của phản ứng cắt. Từ sản phẩm tinh sạch này chúng tôi tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng blunt-end sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm của phản ứng blunt-end, và nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid ta đƣợc plasmid tái tổ hợp. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp, thu đƣợc kết quả nhƣ sau DC1 DC2 TS (DC1) mẫu plasmid cắt bằng enzym EcoRV chưa tinh sạch, (DC2) mẫu plasmid cắt bằng enzym HindIII chưa tinh sạch, (TS) mẫu plasmid cắt bằng EcoRV được tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. 53 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. (a) Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) một phần của hình ( a) được phóng to. Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG. (a)Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợpvới đoạn DNA 580bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) một phần của hình a được phóng to. a b a b 54 Với đoạn DNA có kých thƣớc 629bp, chỉ có 6 khuẩn lạc trắng trong tổng số 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc xanh là do sự tái đóng vòng của plasmid, các khuẩn lạc trắng có thể là do các tế bào mang plasmid tái tổ hợp. để khẳng định, chúng tôi tiến hành cấy chuyền, chiết tách plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thựic hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers T3, T7. Với đoạn DNA có kých thƣớc 580bp, kết quả cho 4 khuẩn lạc trắng trong tổng số 108 khuẩn lạc, để kiểm tra các khuẩn lạc trắng này chúng tôi thực hiện cấy chuyền, tách chiết plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thực hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers ITS4, ITS5. 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng từ hình 4.15 cấy sang môi trƣờng LB lỏng/Amp nhân sinh khối qua đêm và tiến hành tách chiết theo quy trình 3.3.7 Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp. (1.1), (1.2), (1.3), (1.4), (1.5), (1.6) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Theo kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết mẫu số 1.5 nằm cao hơn các mẩu plasmid khác nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III các mẫu số 1.2, 1.4, 1.5. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 Kích thƣớc dự đoán 3.0kb Kích thƣớc dự đoán 3.629kb 55 Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (2.1) ,(2.2),( 2.3),( 2.4) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết chỉ thu đƣợc hai mẫu có mang plasmid, mẫu số 2.1 nằm cao hơn mẫu 2.3 nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III mẫu số 2.1 và chạy kiểm tra với plasmid đối chứng. 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp Sản phẩm tách chiết plasmid các mẫu biến nạp đƣợc cắt với hai enzym là BamHI và HindIII. Hai enzym này có trình tự nhận biết nằm ngoài trình tự nhận biết của enzym EcoRV, do đó khi cắt mẫu plasmid tái tổ hợp sẽ tạo dạng thẳng mang cả đoạn DNA đƣợc chèn vào theo đúng sơ đồ cắt trong vùng MCS. Kích thƣớc dự đoán 3.58kb Kích thƣớc dự đoán 3.0kb 56 Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp và mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (DCB) plasmid đối chứng cắt với enzym BamHI, (DCH) plasmid đối chứng cắt với enzym HindIII, (2.1B-1.4B) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym BamHI, (2.1H-1.4H) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym HindIII. Cắt bằng BamHI mẫu số 1.5, 2.1 khi chạy điện di các band cao hơn band mẫu đối chứng, mẫu số 1.2, 1.4 có band bằng với band của mẫu đối chứng. Cắt bằng HindIII mẫu số 2.1 khi chạy điện di band cao hơn band mẫu đối chứng, các mẫu còn lại có các band bằng với band của mẫu đối chứng. Nhƣng mẫu số 1.5 còn có thêm 1 band mờ nằm ở dƣới, có thể đoạn DNA đƣợc chèn ở mẫu số 1.5 có chứa site cắt của HindIII. Qua kết quả kiểm tra bằng men cắt chúng tôi có thể khẳng định đã chọn lọc đƣợc thể tái tổ hợp. 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR Tiến hành chạy PCR kiểm tra mẫu số 7 với primer của đoạn DNA đó, kiểm tra mẫu số 9 với cặp primer T3, T7. DCB 2.1B 1.5B 1.2B 1.5B 1.4B 2.1H 1.5H 1.2H 1.5H 1.4H DCH 57 Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp. (1) đối chứng mẫu số 2.1 (sản phẩm PCR từ genome, đoạn DNA insert), (2) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 2.1 với cặp primer của chính đoạn gen đó (ITS4, ITS5), (3) leader 100bp, (4) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 1.5 với cặp primer T3, T7, (5)đối chứng mẫu số 1.5 (đoạn DNA insert). Mẫu số 2.1 : Sản phẩm PCR trên genome và trên plasmid có trọng lƣong phân tử băng nhau, chứng tỏ đã chèn đƣơc đoạn DNA kých thƣớc 580bp vào plasmid và biến nạp thành công vào vi khuẩn DH5α. Mẫu số 1.5 : Sản phẩm PCR trên plasmid có kých thƣớc lớn hơn sản phẩm PCR trên genome, kết quả trên band diện di cho thấy sản phẩm này có kých thƣớc tƣơng đƣơng với tổng kých thƣớc của đoạn DNA chèn và kých thƣớc của vùng poly cloning site trên plasmid. Điều này cho thấy phản ứng nối đã không gây ảnh hƣởng khả năng hoạt động của T3, T7 RNA polymerase promoter. Tuy nhiên, mức độ khuyếch đại của phản ứng này thấp, nguyên nhân có thể do bởi phản ứng PCR chƣa hoàn chỉnh 1 2 3 4 5 580bp 857bp 629bp 58 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng áp dụng trực tiếp tại phòng thí nghiêm. Các bƣớc chính trong quy trình là Chuẩn bị khả nạp Dịch tế bào chuẩn bị để làm khả nạp phải có mật độ tế bào từ 5 x 107 đến 108 và tiến hành theo quy trình sau : Bƣớc 1: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 2: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 3: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần. Bƣớc 4: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 5: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40c Bƣớc 6: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 7: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700C. Biến nạp plasmid vào khả nạp Bƣớc 1: Hút 3µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Bƣớc 2: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ. Bƣớc 5: Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Bƣớc 6: Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. 59 Quy trình tách chiết plasmid Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 37 0 C trong 1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. 5.2 Đề nghị Tiếp tục hoàn thiện quy trình theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, chuyển đoạn DNA từ sản phẩm cắt vào tế bào, chuyển một gen hoàn chỉnh vào tế bào chủ và kiểm soát sự biểu hiện của của gen đó. 60 Nếu trong trƣờng hợp không đủ hoá chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm thì nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm các bƣớc sau : Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200c Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200c, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Hoà tan kết tủa trong 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa. Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa trong 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh . Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan đều. Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi trong 1- 2 phút. Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf mới. Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M và thêm 550μl dung dịch isopropanol. Trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu lấy kết tủa. Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Bƣớc 13: Loại bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 14: Hoà tan kết tủa trong TE với lƣợng thích hợp. Bƣớc 15 : Điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid. 61 TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt 1. Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM. 2. Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning và chỉ thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội bộ trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục. 4. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật 5. Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM. Tài lyệu tiếng nƣớc ngoài. 1. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall. 2. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 3. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 4. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques. Các website 1. 2. 12. 3. 13. 4. 14. 5. 15. 6. 16. 7. 17. 8. 9. 62 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 63 PHỤ LỤC Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillyn Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillyn nồng độ cuối 60µg/ml, 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillyn + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coly) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillyn, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch  Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid 64 Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch STET (sodium chloride, Tris, EDTA, Triton) Sucrose 8% Triton X - 100 0.5% EDTA pH 8.0 50mM Tris- HCl pH 8.0 10mM Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) 65 Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer  PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH4)2SO4 166mM MgCl2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1%  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Lygation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 66 Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 67 Hình 2 : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) 68 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ................................................................................................................ i Tóm tắt .........................................................................................................................ii Mục lục ........................................................................................................................iii Danh sách các chữ viết tắt ...........................................................................................vii Danh sách các hình ......................................................................................................viii Danh sách các bảng, biểu đồ và sơ đồ .........................................................................x PHẦN 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1 Đặt Vấn Đề ............................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ................................................................................................. 2 1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2 1.3.1 Phần 1 .............................................................................................................. 2 1.3.2 Phần 2 .............................................................................................................. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU .............................................................................. 3 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn............................................................................. 3 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp ........................................................................................ 3 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen ............................................................ 3 2.1.2.1 Vai trò ....................................................................................................... 3 2.1.2.2 Ứng dụng .................................................................................................. 3 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp .......................................... 4 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly ................................................................. 5 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. ..................................................................... 5 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly ....................................................... 5 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp .................................................................................. 7 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý ................................................................................... 7 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học ............................................................................... 7 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ............................. 8 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid ................................................................................. 9 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................ 10 iii 69 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR .................................................................. 10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR ................................................. 10 2.3.7 Điện di DNA ................................................................................................. 14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA ............................................................................ 14 2.4.1 Plasmid .......................................................................................................... 15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút ....................................................................................... 16 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA ...................................................... 16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn ................................................................................. 16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA ............................................................................ 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ............................................................. 19 2.5.2.2 Terminal transferase ............................................................................... 19 2.5.2.3 Các DNase .............................................................................................. 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. .................................................................... 20 2.5.4 Các enzym nối DNA ..................................................................................... 20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase ................................................................................. 20 2.5.3.2 T4 DNA lygase ....................................................................................... 21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội ................................................................... 21 2.6.1 Với plasmid ................................................................................................... 21 2.6.2 Với DNA phage ............................................................................................ 21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận ............................................................ 21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 23 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ........................................ 23 3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm ................................................ 23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm ................................................................................ 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α ........................................................................... 23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) ............................................................................ 23 3.2.1.3 Đoạn DNA .............................................................................................. 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm ....................................................................................... 24 3.2.3 Các thiết bị máy móc .................................................................................... 24 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn ......................................................... 24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ...................................................... 25 iv 70 3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ......................................................... 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 26 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 26 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra ....... 27 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ........................................................................................................ 28 3.3.3.1 Nguyên tắc .............................................................................................. 28 3.3.3.2 Cách tiến hành ........................................................................................ 28 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................... 29 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ........................................................................................... 30 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp ......................... 31 3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra .................................. 31 3.3.7.1 Chiết tách plasmid .................................................................................. 31 3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid .................................................................... 33 3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose .......................................................... 34 3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR ..................................... 34 3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR .................................. 35 3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ............................................................................................................... 36 3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp .............. 37 3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III, thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) ....... 38 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 39 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính .............................................................. 39 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ........................................... 43 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml .................... 43 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml .................. 45 4.3 Tách chiết DNA plasmid ..................................................................................... 47 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV ...................................... 50 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV ............................. 50 v 71 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA ..................................................................................... 50 4.5.2 Tinh sạch plasmid ......................................................................................... 52 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp .................................................................... 52 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp .................................................................. 54 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp ............................................................ 55 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR .................................................................... 56 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 58 5.1 Kết luận ................................................................................................................ 58 5.2 Đề nghị ................................................................................................................. 59 TÀI LYỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 61 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 63 vi 72 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. ..................................................... 6 Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. ...................................................................... 10 Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ......................................................... 15 Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn .................................................................... 18 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA. ..................................... 36 Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy. ................................................................................................................................. 39 Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. ................................................................................................................................. 39 Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. .................................... 43 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. ................................... 44 Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. ..................................................... 45 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. ................................ 46 Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. ................................ 46 Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. ............................... 46 Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). .......................... 48 Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). ....................... 49 Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). ....................... 49 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. 50 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. ... 51 Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. ......................................................................................... 51 Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. ......... 52 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. ....................................................... 53 viii 73 Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG. ................................................................................. 53 Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp. ................... 54 Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. .................. 55 Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp và mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. ........................................................................................... 56 Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp. .............................. 57 Hình 1: Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) ............................................................. 66 Hình 2 : Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ............................................................ 67 ix 74 DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục .................... 12 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-) .............................. 24 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn........................................... 26 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra. ...... 27 Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn ................................................................ 28 Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1 ......................... 40 Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2 ......................... 40 Biểu đồ 4. 1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc cất. . ................................................................................................... 41 Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc muối sinh lý. . .................................................................................... 41 x