Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp ch ất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)

MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm Tắt .iv Mục lục vii Danh sách các chữ viết tắt .xi Danh sách các hình và biểu đồ xii Danh sách các bảng và sơ đồ .xiii 1. MỞ ĐẦU .1 1.1. Đặt vấn đề .2 1.2. Mục đích - Yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa .3 2.1.1. Đặc điêm thực vật học .3 2.1.2. Đặc điểm hình thái 3 2.1.3. Phân bố 4 2.1.4. Nhân giống 4 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 4 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian .4 2.2.2. Tác dụng sinh học .5 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan .5 2.3.1.2. Ảnh hưởng lên bệnh tiêu chảy ở heo .10 2.3. Thành phần hóa học .13 2.4. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên .15 2.4.1. Alcaloid .15 2.4.2. Flavonoid .16 2.4.3. Tinh dầu 16 2.4.4. Saponin 17 2.5. Đại cương về vi khuẩn đường ruột 17 2.5.1. Định nghĩa .17 2.5.2. Hình thể .17 2.5.3. Tính chất nuôi cấy .18 2.5.4. Đặc tính sinh hóa .18 2.5.5. Sức đề kháng .19 2.5.6. Độc tố 19 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên 19 2.5.8. Khả năng gây bệnh 21 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 21 2.6.1. Staphyl ococcus aureus .21 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa 21 2.6.3. Escherichia coli .21 2.6.4. Salmonella .22 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH .23 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 24 3.1. Vật liệu .24 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện .24 3.2.1. Địa điểm 25 3.2.2. Thời gian .25 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .25 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ 25 3.3.2. Hóa chất 27 3.4. Phương pháp tiến hành .28 3.4.1. Xử lý nguyên liệu 28 3.4.2. Điều chế các loại cao .28 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa 28 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform 29 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol .29 3.4.2.4. Điều chế cao nước 29 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao .31 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform 32 3.4.4.1. Sắc ký cột 32 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng 35 3.4.4.3. Sắc ký điều chế 37 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn .38 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn được tách chiết từ cao chloroform .38 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH .40 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH .40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 44 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng 45 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform 45 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. 47 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 47 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 .47 4.2.2.3. Phân đoạn XH13 48 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết 49 4.3.1. Chất XH-K13 49 4.3.2. Chất XH-K11 50 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn được chiết từ cao chloroform. 52 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa .55 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C .55 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa 56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .58 5.1. Kết luận 58 5.2. Đề nghị .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .60 PHỤ LỤC 62 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa . 3 Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê 29 Hình 3.2: Chất phân tích đã được đưa vào cột sắc ký .33 Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng .36 Hình 3.4: Sắc ký điều chế .37 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH vào .43 Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella .44 Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng 47 Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng 48 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli .52 Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 .53 Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 54 Đồ thị 4.1: Vitamin C 55 Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa 56 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột 7 Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lượng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl /kg thể 4 trọng 9 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl /kg thể trọng chuột . 9 4 Bảng 2.4: Kết quả hàm lượng men gan .10 Bảng 2.5: Ảnh hưởng của lá tươi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trưởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo 11 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy 12 Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm .39 Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa .42 Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C .43 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao 44 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform 45 Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn .53 Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C 55 Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa .56 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH 57 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu 28 Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao .30 Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH 41 xiii

pdf120 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Lượt xem: 6401 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp ch ất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii 1 LỜI CẢM TẠ Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con nên ngƣời. Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành biết ơn: - TS. Phan Phƣớc Hiền. - Kỹ sƣ Trịnh Phi Ly. Đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu đã tận tình giúp đỡ trong việc lấy mẫu lá Xuân Hoa và đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn. - TS. Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm. - Cô và Chú Đinh Công Bảy, chủ cơ sở trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã tận tình giúp đỡ và cung cấp số lƣợng lớn lá Xuân Hoa. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. iv TÓM TẮT Đỗ Thị Tuý Phƣợng, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2007. “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Phƣớc Hiền Đề tài đƣợc tiến hành tại: - Phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007. Nội dung tiến hành: - Tiến hành chiết tách các phân đoạn từ cao kháng khuẩn nhất bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. - Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. - Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH. Kết quả đạt đƣợc: - Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ ức chế tối thiểu là : MICE. coli = 500 µg/ml. v MICsalmonella= 500 µg/ml. - Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13. - Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2 hợp chất XH-K11 và XH-K13. - Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5. - Khảo sát tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng các phân tử ức chế DPPH là khá cao (85,7%), thông qua so sánh chỉ số IC50 của mẫu Xuân Hoa với Vitamin C: IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vi SUMMARY Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City. “Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves”. Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Content: - Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions. - Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process. Result: - Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE. coli = 500 µg/ml. MICsalmonella= 500 µg/ml. - Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction. - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin 7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside. - Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C): IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm Tắt ......................................................................................................................... iv Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ ...................................................................................... xii Danh sách các bảng và sơ đồ ....................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 2 1.2. Mục đích - Yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa ................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điêm thực vật học ......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3 2.1.3. Phân bố ................................................................................................................ 4 2.1.4. Nhân giống .......................................................................................................... 4 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa ................................................................................ 4 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian ................................................................................. 4 2.2.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 5 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan ............................................................................................. 5 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo ............................................................... 10 2.3. Thành phần hóa học ............................................................................................... 13 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ..................................................... 15 viii 2.4.1. Alcaloid ............................................................................................................... 15 2.4.2. Flavonoid ............................................................................................................. 16 2.4.3. Tinh dầu .............................................................................................................. 16 2.4.4. Saponin ................................................................................................................ 17 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột ........................................................................ 17 2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 17 2.5.2. Hình thể ............................................................................................................... 17 2.5.3. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................... 18 2.5.4. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 18 2.5.5. Sức đề kháng ....................................................................................................... 19 2.5.6. Độc tố .................................................................................................................. 19 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên........................................................................................ 19 2.5.8. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 21 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 21 2.6.1. Staphyl ococcus aureus ....................................................................................... 21 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa.................................................................................... 21 2.6.3. Escherichia coli ................................................................................................... 21 2.6.4. Salmonella ........................................................................................................... 22 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH ............................................................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...................................................... 24 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 24 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................. 24 3.2.1. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2.2. Thời gian ............................................................................................................. 25 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 25 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 25 3.3.2. Hóa chất .............................................................................................................. 27 ix 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................................... 28 3.4.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................................ 28 3.4.2. Điều chế các loại cao ........................................................................................... 28 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa .................................................................................. 28 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform .................................................................................. 29 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol..................................................................................... 29 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc ............................................................................................ 29 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao ....................................................... 31 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform ........................................................ 32 3.4.4.1. Sắc ký cột ........................................................................................................ 32 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35 3.4.4.3. Sắc ký điều chế ................................................................................................ 37 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn ............................................................................. 38 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc tách chiết từ cao chloroform ....................................................................................................................................... 38 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH ...................................................... 40 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH ................................................................... 40 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH ................................................. 40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 44 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết .................................... 44 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng .................... 45 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform ................................................................ 45 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. ................................................ 47 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 .............................................................................................. 47 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 ................................................................................. 47 4.2.2.3. Phân đoạn XH13 .............................................................................................. 48 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. ............................................................... 49 x 4.3.1. Chất XH-K13 ...................................................................................................... 49 4.3.2. Chất XH-K11 ...................................................................................................... 50 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. .................................................................................................................... 52 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa ................................................................. 55 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C ....................................................................... 55 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa .................................................. 56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 58 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 58 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 62 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infirm C Chloroform Cfu Colony forming unit COSY Correclation Spectroscopy d Double: mũi đôi DEPT Distortionlees Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethylsulfuoxid DPPH 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl E Ete dầu hỏa HMBC Heteronuclear multiple bond correction HSQC Heteronuclear single quantum coherence IC50 Inhibitory Concentration 50: nồng độ ức chế 50% DPPH IR Infrared Spectrometry: hồng ngoại J Coupling constant: hằng số ghép cặp LD50 Lethal dose 50: liều gây chết 50% số cá thể m Multiplet: mũi đa Me Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration: nồng độ ức chế tối thiểu MS Mass Spectrometry: khối phổ Nt Nhƣ trên NMR Nuclear Magnetic Resonnace: cộng hƣởng từ hạt nhân Rf Retention factor s Single: mũi đơn t Tripplet: mũi ba TSA Tryptic Soy Agar xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa............................................................................................. 3 Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê ........................................................................ 29 Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký ................................................... 33 Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng ................................................................... 36 Hình 3.4: Sắc ký điều chế ............................................................................................. 37 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH vào ................................................................................................................................. 43 Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella ............................. 44 Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng ........................................................................ 47 Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng ........................................................................ 48 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli ................................... 52 Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 ........................................... 53 Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 ........................ 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 .......................... 54 Đồ thị 4.1: Vitamin C .................................................................................................... 55 Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa........................................................................................ 56 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột ...................................................................... 7 Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng ................................................................................................................................ 9 Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột ..................... 9 Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan ......................................................................... 10 Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo .......................................................................... 11 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy .............................................................. 12 Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm ........................................................... 39 Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa..................................................... 42 Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C ..................................................... 43 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao ...................... 44 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform .................................................. 45 Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn ........................... 53 Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C.................................................... 55 Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa ........................................... 56 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH ................ 57 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu .................................................................... 28 Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao ............................................................... 30 Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH ............................................ 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) là một loại cây đƣợc dân gian biết đến nhƣ là một dƣợc liệu có thể chữa đƣợc rất nhiều căn bệnh: bệnh tiêu hóa, tiểu đƣờng, trĩ nội, chảy máu, suy nhƣợc thần kinh…Tuy nhiên, trên thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vẫn đề trên. Hiện nay trên thế giới chƣa có một nghiên cứu nào sâu xa về cây này. Các nhà khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bƣớc đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó. Trần Công Khánh và cộng sự (1999) đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính và có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng bảo vệ tế bào gan. Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chƣa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa đƣợc bệnh dịch tả. Và gần đây, trong Hội Nghị Khoa Học và Công Nghệ Hóa Hữu Cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà Nội 11 – 2005, Phan Phƣớc Hiền và cộng sự đã công bố công trình phân lập Triterpenoid và Steroid từ lá cây Xuân Hoa Psenderanthemum palatiferum họ Acanthaceae bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân. Hiện nay, nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa trở nên rất phổ biến. Phƣơng pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tƣợng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phƣơng pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh nhiễm khuẩn. Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn nhƣ 2 các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…Vì thế trong công trình này chúng tôi cũng khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá Xuân Hoa. Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ cao chloroform . Xác định phân đoạn kháng vi khuẩn: E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn kháng khuẩn. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá cây Xuân Hoa. 1.2.2. Yêu cầu Cô lập 4 loại cao: Ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol, nƣớc. Dùng phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch để xác định cao có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Tiến hành sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để tách các phân đoạn và một số hợp chất từ lá Xuân Hoa. Sử dụng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn đƣợc ly trích từ cao chloroform. Tiến hành ly trích lá cây Xuân Hoa và đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517 nm [3] để xác định khả năng chống oxy hóa. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa 2.1.1. Đặc điểm thực vật học [2] Tên khoa học: Pseudranthemum palatiferum. Họ: Ô rô (Acanthaceae) Tên thông thƣờng: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Tú Linh, Nhật Nguyệt, Thần Tƣợng Linh, Lan Điền,… 2.1.2. Đặc điểm hình thái [2, 6] Cây có thể cao 1-2 m (nếu trồng trên đất vƣờn nhà), sống lâu năm. Thân cây xanh hoặc tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều mảnh. Lá mọc đối hình mũi mác, dài 12-17 cm, rộng 3,5-5 cm, gốc lá hơi men xuống. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành. Cụm hoa dài 10-16 cm. Hoa lƣỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có Hình 1.1: Cây Xuân Hoa 4 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nửa chiều dài của thùy, môi dƣới gồm 3 thùy to, thuỳ giữa của môi dƣới có các chấm màu tím. Quả nang 2 ổ, mỗi ổ chứa 2 hạt. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. 2.1.3. Phân bố [6, 14] Hiện nay cây Xuân Hoa đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ một loại cây thuốc gia đình. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. Gần đây đƣợc phát hiện mọc hoang ở vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình), rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Lộ, 1999). Ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa một số bệnh về tiêu hóa. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số nhà trồng cây Xuân Hoa để chữa táo bón. Đặc biệt gần đây nhất chúng tôi đƣợc biết có một số doanh nghiệp ở Tây Ninh đã dùng lá và rễ cây Xuân Hoa này làm trà và đƣợc bán rộng rãi ra thị trƣờng với tên gọi trà Hoàn Ngọc. 2.1.4. Nhân giống [6 ] Cây Xuân Hoa có thể nhân giống dễ dàng bằng cách giâm cành. Lấy đoạn cành bẻ, cách ngọn khoảng 20 cm, bỏ bớt vài lá phía dƣới, cắm vào đất ẩm, để chỗ mát, hàng ngày tƣới đều (khoảng 2-3 lần/ngày). Cây chịu đất xốp và độ ẩm trung bình. Chỉ sau 1 tuần cành giâm đã ra rễ. Cây phát triển nhanh. Trồng khoảng trên 2 tháng là có thể dùng làm thuốc chữa bệnh. 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian Cây Xuân Hoa đƣợc dùng trong dân gian để chữa nhiều bệnh nhƣ: - Nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá, đau dạ dày, đau bụng không rõ nguyên nhân. - Loét hành tá tràng, chảy máu đƣờng ruột. - Khôi phục phục sức khoẻ cho ngƣời ốm yếu, chữa suy nhƣợc thần kinh. - Chấn thƣơng chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thƣơng sọ não. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. 5 - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trƣớng, làm giảm đau khi bị ung thƣ gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp. - Ở Trung Quốc, ngƣời ta dùng rễ cây Xuân Hoa để chữa đòn ngã tổn thƣơng. Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc đƣờng tiêu hóa. Thời gian gần đây, một số Việt kiều ở Mỹ cũng đã dùng cây Xuân Hoa để chữa bệnh đái tháo đƣờng. Bệnh nhân dùng liên tục cây Xuân Hoa giữ đƣợc ổn định tỷ lệ đƣờng trong máu. Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Ngƣời ta thƣờng dùng lá tƣơi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nƣớc, giã nát lấy nƣớc uống hoặc nấu ăn. Liều lƣợng phu thuộc vào ngƣời bệnh, từng bệnh, thông thƣờng ăn 2-8 lá/ngày, chia làm 2 lần trƣớc bữa ăn. 2.3.1. Tác dụng sinh học 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan [9] Để góp phần xác minh tác dụng đƣợc lƣu truyền trong dân gian và chứng minh tác dụng của cây thuốc Xuân Hoa, Trần Công Khánh và cộng sự của ông đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá cây Xuân Hoa trên in vivo.  Thử độc tính cấp - Chuột nhắt trắng, chia làm 6 lô, mỗi lô 7 con. - Thuốc thử: Cao đặc toàn phần đƣợc cân và hòa tan bằng nƣớc cất, thu đƣợc các dung dịch có hàm lƣợng khác nhau: 33,2 mg/ml; 66,8 mg/ml; 125,2 mg/ml; 222,4 mg/ml; 367,6 mg/ml; 460 mg/ml. - Tiến hành: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa ở các lô khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg; 11,5g/kg thể trọng chuột. Quan sát diễn biến hành vi, sau đó giết ngẫu nhiên 3 chuột ở 3 lô khác 6 nhau: quan sát đại thể phủ tạng và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc nhƣ tim - gan - thận - dạ dày - ruột. - Kết quả: o Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc và trong suốt quá trình thử nghiệm thuốc không gây thay đổi trạng thái hoạt động của chuột: Chuột vẫn bò lui tới, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi… o Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kh; 11,5 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhƣng sau 1giờ thì trở lại bình thƣờng, chuột rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. o Tất cả các chuột thí nghiệm (ở liều trên) đều không chết. Chuột sống khỏe mạnh sau 48 giờ. o Quan sát đại thể: Các phủ tạng đều bình thƣờng. o Làm vi thể các cơ quan: Cắt thành miếng mỏng và nhuộm tế bào, quan sát dƣới kính hiển vi (Bảng 2.1). Cơquan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 7 Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột Kết luận: Cao toàn phần Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Nhƣ vậy, trên độc tính cấp cao Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan - Chuột nhắt trắng, chi làm 6 lô, mỗi lô từ 8 – 12 con. - Cao toàn phần lá Xuân Hoa đã loại bỏ chlorophyl, hòa tan với nƣớc cất. 0,83g/kg Cơ tim bình thƣờng. Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Quản cầu và các ống thận bình thƣờng. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Không có tổn thƣơng thực thể ở các tạng. 9,19g/kg Cơ tim bình thƣờng. Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ. Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thƣờng. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Có thoái hoá nhẹ ở gan. 11,5g/kg Cơ tim bình thƣờng. Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Có tổn thƣơng nhẹ ở gan và thận. 8 - Mô hình gây ngộ độc gan: Gây tổn thƣơng gan chuột nhắt bằng carbon tetrachloride (CCl4) theo phƣơng pháp đƣợc dung thông thƣờng (Shibayama, 1989; Yoshitake và cộng sự, 1991) với liều 1ml CCl4/kg thể trọng (liều cao) hoặc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng (liều thấp). - Chia chuột thành 6 lô, mỗi lô 2 nhóm: o Lô 1 (đối chứng sinh học): Chuột bình thƣờng, không gây mô hình viêm gan, không dung thuốc Xuân Hoa. o Lô 2: Gây mô hình viêm gan đối chứng, không sử dụng thuốc Xuân Hoa. o Lô 3: Gây thí nghiệm viêm gan, cho uống thuốc Xuân Hoa trƣớc, sau 1 giờ thì tiêm CCl4 vào. - Nguyên tắc của phƣơng pháp là xác định hàm lƣợng malonic dialdehyde (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hoá lipide màng tế bào. Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm [9]. Cƣờng độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng MDA tính theo công thức: X = E x 30,8 Trong đó: X: Hàm lƣợng MDA (mM) E: Độ hấp thụ ở 532 nm. 30,8: Hệ số tắt phân tử. Bảng 2.2: Hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng. Lô n (số chuột) ETB MDATB 1 8 0,163 5,0296 2 12 0,458 14,1156 9 3 8 0,348 10,7091 Chú thích: MDA: Malonic dialdehyde. ETB: E trung bình. MDATB: MDA trung bình. Nhận xét: - Ở lô có sử dụng cao Xuân Hoa hàm lƣợng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091). - Hàm lƣợng men gan (AST, ALT) quá cao, không đo đƣợc trên máy. - Xét nghiệm vi thể : Chƣa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do thuốc điều trị. Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột. Lô n (số chuột) ETB MDATB 1 8 0,1915 5,8982 2 12 0,385 11,547 3 8 0,203 6,2463 Nhận xét: - Ở lô có sử dụng cao Xuân Hoa hàm lƣợng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 11,547 xuống còn 6,2463). - Xác định hàm lƣợng men gan trên máy Cobas Mira Plus, hãng Roche (Thụy Sĩ). Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan. Lô n (số chuột) AST(U/l) ALT(U/l) 1 8 270 432 2 12 9668 10870 3 8 8740 10533 10 Nhận xét: - Hàm lƣợng men gan giảm nhƣng chƣa đáng kể. - Xét nghiệm vi thể: ở lô chuột có sử dụng cao Xuân Hoa và lô gây mô hình nhận thấy rằng các tế bào ở vùng thoái hoá đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hƣớng hồi phục. Kết luận: Cao đặc toàn phần Xuân Hoa có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm. 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo [14] Bệnh tiêu chảy chủ yếu xảy ra ở heo chƣa cai sữa. Nhiều kháng sinh nhƣ avinamycine, colistin, oxytetracyclin, spectinomycin và trimethoprim là những phƣơng pháp phổ biến đƣợc áp dụng để điều trị bênh. Tuy nhiên, lƣợng tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm động vật đƣợc xem nhƣ là một nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khoẻ con ngƣời bởi vì tính độc và tính dị ứng của nó. Thêm vào đó, sự phát triển của các vi khuẩn kháng thuốc dẫn đến sử dụng liều lƣợng quá cao đã trở thành một vài vấn đề trên thế giới. Vì vậy, cần phải giảm việc sử dụng và thay thế vai trò của kháng sinh trong thức ăn gia súc bằng cách gia tăng việc sử dụng probiotics và những sản phẩm tự nhiên khác, đặc biệt ở đây ta sử dụng lá cây Xuân Hoa để điều trị bệnh tiêu chảy ở heo. Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo. Phƣơng pháp n Đối tƣợng Xuân Hoa Liều lƣợng (g/kg thể trọng/ngày) Qua đƣờng Thời gian TN1 C1 52 Heo chƣa - - - - T1-1 52 Lá tƣơi 1 miệng 1-7 11 T1-2 52 cai sữa 1 1-30 TN2 C2 60 Heo chƣa cai sữa - - - - T2-1 60 Lá tƣơi 0,5 miệng 1-30 T2-2 60 Bột 0,1 T2-3 60 0,2 TN3 C3 62 Heo đã cai sữa - - - - T3-1 62 Lá tƣơi 0,5 thức ăn 1-30 T3-2 62 Bột 0,1 T3-3 62 0,2 Sự biểu hiện tăng trƣởng đƣợc đo lƣờng dựa vào việc tăng cân và tốc độ tăng trƣởng chậm lại. Heo tăng ít hơn 4kg/28 ngày đƣợc xem là tăng trƣởng chậm lại. Sự truyền bệnh tiêu chảy đƣợc đo lƣờng hằng ngày dựa trên tỉ lệ heo mắc bệnh trong những con heo thí nghiệm, số trƣờng hợp và thời gian mắc bệnh. Ngoài ra, Huỳnh Kim Diệu và Trần văn Hòa [14] đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang đƣợc sử dụng trị bệnh tiêu chảy ở heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lƣợt: Bột Xuân Hoa 92,86%; Coli-norgen 90,48%; Cotrimxazol 83,33%. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14%; 9,52%; 14,29%. Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy. Loại thuốc Số heo thử nghiệm Số lƣợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Số con % Số con % Số con % Bột Xuân Hoa 42 10 23,81 29 69,05 39 92,86 Coli-norgen 42 10 23,81 25 59,52 38 90,48 12 Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33 Nhận xét: Không có tác dụng phụ của lá Xuân Hoa đối với heo trong thí nghiệm này. Nồng độ ức chế nhỏ nhất của cây đƣợc tính toán là 0,75-1,5 g lá tƣơi hoặc 0,15-0,3 g bột/kg thể trọng cho phƣơng pháp này. Liều lƣợng đƣợc sử dụng cho việc ngăn chặn bệnh, nồng độ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhỏ hơn nồng độ gây ức chế thấp nhất để tránh gây tác dụng phụ. Sử dụng lá hay bột Xuân Hoa có thể cải thiện những thông số đo lƣờng nói trên và kết quả có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣớc tiên, lá Xuân Hoa chứa một tỉ lệ cao protein thô (30,8% DM: dry matter), so sánh với cỏ voi (18,6% DM) và cây sắn dây (18,4% DM). Ảnh hƣởng của liều sử dụng sẽ rất nhỏ bởi vì tỉ lệ nhỏ của nó trong khẩu phần. Thứ hai, lá Xuân Hoa có hàm lƣợng cao một số loại khoáng nhƣ: Ca (6,5% DM), K (4,4% DM), Mg (6,3% DM), Fe (0,3% DM). Hàm lƣợng Fe, đặc biệt trong các chất khoáng cao gấp 4 lần đậu nành và 3 lần gan heo. Fe trong cây sẽ góp phần cải thiện tình trạng sinh lý máu bởi vì Fe cần thiết cho heo để thúc đẩy hồng cầu, đặc biệt hemoglobin có chức năng nhƣ một thể mang oxy và cacbonic, vì thế nó đƣợc biết nhƣ một sắc tố hô hấp và giải thích tình trạng của hồng cầu. Thứ ba, trong lá có chứa một protein ổn định nhiệt đƣợc gọi là pseuderantin (0,4% trong protein thô) có hoạt tính mạnh trong việc tiêu hoá casein và do đó việc tiêu hóa sữa sẽ đƣợc cải thiện nếu bổ sung lá. Thứ tƣ, một số hợp chất hoá học trong lá và một vài tác nhân kháng khuẩn có thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo. Kết luận: Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chƣa cai sữa và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tƣơng lai. 2.3. Thành phần hoá học [4, 5] 13 Hiện nay trên thế giới chƣa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Xuân Hoa, chỉ có một số công trình nghiên cứu bƣớc đầu về cây này ở Việt Nam nhƣ Trần Công Khánh (1998), Phan Phƣớc Hiền (2005), Huỳnh Kim Diệu (2003). Các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng nhƣ Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lƣợng Vanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tƣơi). Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lƣợng tổng số khá cao (751-1365 mg%). Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa còn giàu Valin (29-1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin còn ảnh hƣởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hoá quan trọng. Trong các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Xuân Hoa ngƣời ta đã tìm thấy -Sitosterol, Phytol, 3-O-( -D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp gồm hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan-1-ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O- -glucoside và apigenin 7-O- -glucoside [4]. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự (2004) [4], đã phân lập đƣợc tiếp theo là: 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, acid palmitic và acid salicylic. - Triacontanol: Là chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 87-880C, là một Ancol no bậc một, không phân nhánh với công thức là : C30H62O. 1-triacontanol là một chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy 1- triancontanol có hoạt tính kháng viêm, ức chế các quá trình peroxy hóa các chất béo có cũng nhƣ không có sự tham gia của các enzyme và làm giảm mỡ trong máu. - Glycerol 1-hexadecanoate: Dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 65-670C, là một mono-ester của glycerin với acid Palmitic và công thức phân tử là C19H38O34. 14 - Acid palmitic: Là chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 48-510C, có đặc trƣng của một acid béo no mạch thẳng. - Acid Salicylic: Thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 140-142 0C và công thức phân tử là: C7H6O3. Acid salicylic có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn. Acid salicylic tổng hợp đƣợc sử dụng trong nhiều loại chế phẩm dựa vào tính chất này. Với các họat tính nêu trên, sự có mặt của 1-triancontanol và acid salicylic trong lá cây Xuân Hoa có thể góp phần giải thích các hoạt tính đã đƣợc phát hiện thấy trong các công trình nghiên cứu trƣớc đây cũng nhƣ giải thích tác dụng chữa bệnh của cây Xuân Hoa theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian. Tám hợp chất Dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloartanol, loliolide, - sitosterol, -sitosterol 3 -O-D-glucopyranosid và stigmasterol 3 -O-D-glucopyranosid lần đầu tiên đƣợc cô lập trong lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees) Radlk, họ Ô rô (ancathaceae) của Trần Kim Thu Liễu và cộng sự (2006). 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên [ 7 ]. 2.4.1. Alcaloid Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có hoạt tính sinh học rõ rệt. Đa số alcaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có hoa nhƣng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và thực vật hạ đẳng. Đa số alcaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định. Vài alcaloid ở dạng keo, vô định hình và alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng; betanidin màu đỏ). Các alcaloid ở dạng bazơ tự do thƣờng hoà tan đƣợc trong dung môi hữu cơ, tuy nhiên các alcaloid ở dạng bazo tứ cấp thì chỉ hòa tan trong nƣớc. Muối của đa số alkaloid thì 15 hòa tan trong nƣớc. Độ hòa tan của alkaloid và các muối của chúng giữ vai trò quang trọng trong kỷ nghệ dƣợc phẩm; trong việc trích ly chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alcaloid thành các dạng thuốc phù hợp. Đa số alcaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alcaloid cực kỳ nhạy cảm, dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ. Nhiều alcaloid đã đƣợc sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alcalid có tác dụng kích thích thần kinh nhƣ: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật nhƣ: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alcaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ƣơng nên đƣợc dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thƣ giai đoạn cuối: morphin và các dẫn xuất của morphin nhƣ: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc). Có alcaloid đƣợc bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol. Một số alcaloid nhƣ: berberin, palmatin, taspin…có khả năng ức chế con men sao chép ngƣợc (reverse trancriptase) đây là con men chủ yếu của retrovirus mà các loại thuốc kháng HIV tập trung tiêu diệt. 2.4.2. Flavonoid Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sƣờn. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose… Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glicisid flavonol nhƣ: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thƣờng xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glicosid thí 16 dụ nhƣ: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam-đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dƣơng tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. Quercetin ở môi trƣờng kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhƣng ở môi trƣờng acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid nhƣ rotenon (trích từ dây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhƣng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng nhƣ hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc). 2.4.2. Tinh dầu Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid. Từ 2000 năm trƣớc ngƣời ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho. Mentol là alcol terpen trích từ tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của nó. Các gia vị nhƣ: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hƣơng…bên cạnh mùi vị làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn. Nhiều tinh dầu có khả năng kháng khuẩn mạnh nhƣ: tinh dầu rau ngỗ Enhydra fluctuans; tinh dầu hồi Illicium verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long não Cinnamonium campho; tinh dầu gừng Zingiber officinalist; tinh dầu nghệ Curcuma longa… 2.4.3. Saponin Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trƣng: khi hòa tan vào nƣớc sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thƣờng cao từ 200oC trở 17 lên và có thể trên 300oC. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormone steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột [8, 12] 2.5.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có men oxidase, lên men đƣờng glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhƣng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào. 2.5.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thƣớc trung bình 2-4 m x 0,4-0,6 m. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không bao giờ sinh nha bào. Mộ số có vỏ, có thể quan sát đƣợc bằng kính hiển vi thông thƣờng. 2.5.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Trong môi trƣờng lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trƣờng, có thể phát triển thành váng trên bề mặt, nhƣng cũng có thể vừa làm đục môi trƣờng vừa có cặn ở dƣới đáy ống. Trên môi trƣờng đặc có 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. - Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thƣờng gặp khi nuôi cấy giữ chủng. - Dạng M: Hình thức phát triển này thƣờng gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thƣớc lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hƣớng hòa vào nhau. 2.5.4. Đặc tính sinh hoá Những đặc tính sau đây thƣờng đƣợc xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đƣờng ruột: 18 - Di động hoặc không di động. - Lên men hoặc không lên men một số loại đƣờng. Hai loại đƣờng thƣờng đƣợc xác định nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đƣờng. - Có hay không có một số enzym. Hai enzym thƣờng đƣợc xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lƣu huỳnh. - Phát triển đƣợc hay không phát triển đƣợc trên một số môi trƣờng tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trƣờng Simmons. 2.5.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trƣờng. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100oC và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thƣờng. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trƣờng. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 2.5.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đƣờng ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ đƣợc giải phóng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố có khối lƣợng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhƣng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không đƣợc điều trị tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. 19 Một số thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sinh ngoại độc tố nhƣ S.Shiga, E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET). Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đƣờng ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân của vi khuẩn. đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết địng tính độc. Không bị phá huỷ ở 100oC trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhƣng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết, gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” với các hạt ngƣng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng ng

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfDO THI TUY PHUONG.pdf
Luận văn liên quan