Ảnh hưởng của kích dục tố lên quá trình sinh sản cá trê vàng đực (Clarias Macrocephalus)

Kết quả kích thích cá Trê vàng ñực sinh sản dưới tác dụng của HCG + não thuỳ cũng khá cao, cao nhất ở liều lượng 500 UI+1,5 mg não (tỷ lệ thụ tinh là 90,67%). Cao hơn tỷ lệ thụ tinh khi sử dụng kích tố HCG ñơn thuần, chúng tỏ não thuỳ có tác dụng kích thích quatrình tạo tinh ở cá Trê vàng ñực và cho kết quả thụ tinh tinh cao khi kết hợp với HCG

pdf50 trang | Chia sẻ: lylyngoc | Ngày: 07/11/2013 | Lượt xem: 3154 | Lượt tải: 7download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Ảnh hưởng của kích dục tố lên quá trình sinh sản cá trê vàng đực (Clarias Macrocephalus), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
phương và 1 lồi cá Trê nhập nội: - Clarias macrocephalus - Phổ biến ở Nam Bộ - Clarias batrachus - Phổ biến ở Nam Bộ - Clarias fuscus - Phổ biến ở Bắc Bộ - Clarias gariepinus - Nhập nội vào miền Nam Clarias gariepinus được nhập vào miền Nam từ Trung Phi chuyển qua Pháp sang Sài Gịn tháng 1/1975 tại trại Dưỡng ngư Thủ ðức (Nguyễn Văn Hạo, Trần Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Lài, 1976; Dương Thúy Yên, Vũ Ngọc Út, 1991). Theo Nguyễn Tường Anh (2005) cĩ thể phân biệt 3 lồi cá Trê ở Nam bộ qua hình thái bên ngồi. ðặc điểm phân biệt giữa các lồi cá Trê dựa vào gốc xương chẩm: cá Trê vàng (Clarias macrocophalus) gốc xương chẫm cĩ hình cánh cung, cá Trê trắng (Clarias batrachus) gốc xương chẫm hình chữ V, cá Trê phi (Clarias gariepinus) gốc xương chẫm hình chữ M. (Hình 2.1) Hình 2.1.Phân biệt cá Trê vàng, Trê trắng và Trê phi theo hình thái xương chẩm. (1): Trê vàng (2): Trê trắng (3): Trê phi (Theo Nguyễn Tường Anh, 2005) Ngồi ra ở gốc vi đuơi cá Trê vàng cĩ một vạch thẳng đứng mà các lồi cá Trê khác khơng cĩ (Theo Từ Thanh Dung, Trần Thị Thanh Hiền, 1994). 4 Theo hệ thống phân loại của T.S. Rass và G.T. Lindberg,1972, cá Trê vàng thuộc: Ngành Chordata Lớp Actinopteryqii Bộ Siluriformes Họ Clariidae Giống Clarias Lồi Clarias macrocophalus Gunther,1864 Trong các lồi cá Trê trên thì cá Trê vàng (Clarias macrocophalus) được nuơi khá phổ biến ở ðBSCL và đây là đối tượng xuất khẩu cĩ giá trị cao. Cá Trê vàng phân bố phổ biến ở miền Nam Việt Nam, Malaisia, Thái Lan,…Sự phân bố rộng như thế chứng tỏ cá Trê là lồi dễ nuơi, cĩ khả năng thích nghi cao. 2.2. Sơ lược về đặc điểm sinh học của cá Trê vàng Cá Trê nĩi chung là những lồi sống đáy, thích nơi tối tăm bụi rậm nên râu rất phát triển để tìm mồi, đầu dẹp cứng để chui rút dưới bùn. Cá Trê sống được ở các mơi trường chật hẹp, dơ bẩn, hàm lượng oxy hịa tan thấp, thậm chí bằng 0 (Togsanga và ctv, 19630; Dương Thúy Yên-Vũ Ngọc Út,1991). Cá Trê sống trong bùn ẩm, ao cạn trong khoảng thời gian khá lâu nhờ cĩ cơ quan hơ hấp phụ ( cịn gọi là” hoa khế”) ((Smith, 1945) & (Sandon, 1950), Dương Thúy Yên-Vũ Ngọc Út,1991). Cá chịu được nhiệt độ nước từ 8 – 39.50 C, pH từ 3.5 – 9.5, độ muối dưới 16%o (Nguyễn Duy Khốt, 2004). Là lồi ăn tạp thiên về động vật ( Goss, 1963; Dương Thúy Yên- Vũ Ngọc Út, 1991). Cá sau khi nở dinh dưỡng hồn tồn bằng nỗn hồn từ 1- 2 ngày (Phạm Văn Khánh, Lý Thị Thanh Loan, 2004). Giai đoạn cá hương, cá giống thức ăn chủ yếu là Daphnia, Copepoda,… Ngồi ra trong dạ dày cịn xuất hiện một số giống lồi thực vật phù du với lượng rất nhỏ (Lê Thị Kim Hoa, 1981; Dương Thúy Yên- Vũ Ngọc Út, 1991). Cá trưởng thành cĩ tính ăn thịt nhất là thức ăn thối rữa (Blache, 1964; Dương Thúy Yên- Vũ Ngọc Út , 1991). Ngồi ra, cá Trê cịn cĩ thể sử dụng các loại thức ăn nhân tạo như: thức ăn chế biến, bột bắp, bột cá, phụ phẩm của nhà bếp,… Chúng thường hoạt động, bơi lội, ăn mạnh vào chiều tối hoặc ban đêm vào lúc trời gần sáng (Phạm Văn Khánh, Lý Thị Thanh Loan, 2004). Cá cĩ kích cở nhỏ, tốc độ lớn trung bình. Giai đoạn cá hương, cá giống thì lớn nhanh về chiều dài, sau đĩ từ cỡ 15cm trở đi tăng trọng nhanh hơn. Cá 1 năm 5 tuổi trong tự nhiên cĩ trọng lượng trung bình 400-500 gam/con (Phạm Văn Khánh, Lý Thị Thanh Loan, 2004). Trong các lồi cá Trê nuơi hiện nay ở ðBSCL, cá Trê phi cĩ sức lớn nhanh nhất, trọng lượng lớn nhất, kế đĩ là cá Trê lai rồi đến cá Trê vàng. Sức lớn của cá phụ thuộc vào mật độ cá thả nuơi, số lượng và chất lượng thức ăn, điều kiện ao nuơi (Từ Thanh Dung, Trần Thị Thanh Hiền, 1994). Cá Trê vàng ngồi tự nhiên 1 năm tuổi thì thành thục. Vào mùa sinh sản, cá bố mẹ tu sửa các hang ở các ao hồ, ruộng, cá đẻ trên những cánh đồng cĩ nước, con cái đào hang trịn nhỏ, rộng 30cm, sâu 5 -8cm. Gần đến ngày sinh sản chúng ve vãn nhau ở các khúc sơng, đoạn kênh. Con đực và con cái quấn quýt bên nhau hàng chục giờ (30-40 giờ), lúc đầu trứng chưa được đẻ ra. Quá trình sinh sản kéo dài trên 20 giờ. Trong suốt quá trình giao phối, con cái đẩy phần đầu của nĩ tỳ vào giữa của cơ thể con đực, ép lỗ sinh dục của nĩ thành hình chữ U. Trong suốt thời gian này chúng làm tổ và khơng bị tổn hại bởi các lồi cá khác. Cá cĩ tập tính đẻ trứng, bảo vệ trứng và con. Trứng được đẻ ra trên nền đất và dính nguyên ở đĩ. Ở chổ nước nơng, cá đẻ trứng dính vào cây cỏ thủy sinh. Trứng cá cĩ màu vàng nâu. Cá thường đẻ vào đêm rộ nhất vào lúc gần sáng, sau những cơn mưa rào, sau khi đẻ con đực giữ tổ con cái nằm gần đấy (Huỳnh Kim Hường, 2005). Trong ao do được chăm sĩc tốt nên cĩ thể đẻ được nhiều lần trong năm từ tháng 3-11dương lịch. Thời gian nuơi vỗ cá Trê vàng tốt nhất từ tháng 2-5, lúc này cá cĩ hệ số thành thục cao nhất. Hệ số thành thục của cá Trê đạt cực đại từ tháng 5-7 (Từ Thanh Dung, Trần Thị Thanh Hiền, 1994). Nếu được nuơi vỗ tốt sức sinh sản tối đa của cá Trê vàng là 50.000-70.000 trứng/kg cá cái. Thơng thường sức sinh sản cá Trê từ 30.000-50.000 trứng/kg cá cái. . Cĩ thể dùng kích dục tố hoặc các chất kích tố sinh sản như HCG, LH_RHa và não thùy cá để kích thích rụng trứng. ðể tăng hiệu quả sinh sản, thường tiêm 2 lần, liều tiêm sơ bộ với lượng bằng 1/3 lần tổng liều lượng và 2/3 cho lần tiêm quyết định, liều quyết định tiêm sau liều sơ bộ 7-8 giờ. Thuốc được tiêm vào cơ lưng hoặc xoang bụng của cá (Phạm Văn Khánh, Lý Thị Thanh Loan, 2004). Theo Phạm Báu (1984) nuơi vỗ cá bố mẹ bằng thức ăn tổng hợp cĩ bổ sung thêm ĩc vặn đập nhỏ nuơi với mật độ 100 con/ m2 , tỷ lệ thành thục đạt 90%. Nếu được nuơi vỗ tốt sức sinh sản tương đối của cá Trê vàng là 50 000–70 000 trứng/kg cá cái, thời gian tái phát 1.5 – 2 tháng (Nguyễn Văn Kiểm, 2005). 6 Hệ số thành thục của cá Trê đạt cực đại từ tháng 5 - 7. Tần số xuất hiện ở giai đoạn IV cao nhất ở 2 tháng này. Chứng tỏ đây là thời điểm sinh sản tập trung của cá ( Lê Ngọc Diện, 1980; Trần Thị Hồng, 1981; Dương Thúy Yên, Vũ Ngoc Út, 1991). Kết quả nhiên cứu của nhiều tác giả cho thấy ở đầu vụ sinh sản của cá nếu sử dụng đơn thuần HCG thì hiệu quả khơng cao, nhưng nếu kết hợp với não thùy tỷ lệ rụng trứng và đẻ trứng của cá tăng lên 10-15%. Khi nghiên cứu tác dụng tương hổ giữa chất chiết của não thùy với HCG đã xác lập được hoạt tính 1 mg não thùy tương đương với 500UI HCG nguyên chất (Nguyễn Văn Kiểm, 2000). Ở các lồi cá Trê thì con đực thành thục cĩ gai sinh dục (lồi hẳn ra ngồi và cĩ đầu nhọn), tập tính hung hăng hơn( Nguyễn Tường Anh, 2005). Cá Trê cái thành thục tốt thường cĩ bụng to, mỏng, mềm, lỗ sinh dục cá Trê cái hình trịn hơi cương nhưng khơng dài và nhọn. Cĩ thể tiết ra trứng khi nặn nhẹ ở vùng bụng gần lỗ sinh dục. ( Nguyễn Tường Anh, 2005). Hình 2.2. Phân biệt đực cái ở cá trê: cá đực bên trái cĩ đoạn cuối của ống dẫn tinh hình gai nhọn (Nguyễn Tường Anh, 2005). Ở tất cả các lồi cá Trê hiện cĩ ở nước ta, cơ quan sinh dục ngồi của con đực và con cái cĩ sự khác biệt về hình thái tương đối rõ. Phần cuối của ống dẫn niệu sinh dục của cá đực phía ngồi thân giống như gai nhọn. Ở cá cái lỗ sinh dục hình trịn ( Nguyễn Tường Anh, 2005).. 2.3. Tình hình nghiên cứu cá Trê vàng trong nước và trên thế giới 2.3.1.Trên thế giới 7 Trong các lồi cá nuơi nước ngọt và nước lợ trên thế giới, các lồi cá da trơn đứng thứ năm về sản lượng hàng năm, khoảng 350.000 tấn, với nhiều hình thức nuơi khác nhau như nuơi đơn, nuơi ghép hoặc nuơi xen canh với trồng lúa và các vật nuơi khác. Mặc dù cĩ tới hơn 2.600 lồi nhưng chỉ cĩ 3 họ đang được nuơi phổ biến, đĩ là họ cá Nheo Mỹ (Ictaluridae), họ cá Trê (Clariidae) và họ cá Tra (Pangasidae), (Huỳnh Kim Hường, 2005). Ở Thái Lan, cá Trê vàng và cá Trê trắng là 2 lồi được nuơi phổ biến, chúng phân bố rộng ở các vùng nước ngọt và là thực phẩm phổ biến, cĩ giá trị trên thị trường. Nuơi cá Trê hàng năm cho thu nhập cao hơn các lồi khác (Huỳnh Kim Hường, 2005). 2.3.2.Trong nước Trong những năm gần đây, phong trào nuơi ca Trê đã phát triển mạnh ở một số địa phương ở miền Nam mà đặc biệt là ðBSCL nhưng cá Trê được nuơi phổ biến là cá Trê lai (con lai giữa cá Trê vàng cái với cá trê phi đực). Việc nuơi cá Trê lai đem lại thu nhập đáng kể cho gia đình. Cá Trê nĩi chung cĩ khả năng thích ứng cao ao nuơi vỗ khơng địi hỏi các điều kiện kỹ thuật một cách nghiêm ngặt. Qua thực tế ợ ðBSCL cho thấy ao nuơi vỗ cĩ diện tích rất nhỏ cĩ diện tích từ vài chục đến vài trăm mét vuơng cá đều thành thục tốt. Nhưng ao nuơi vỗ cá Trê cần cĩ bờ chắn chắn, khơng được vị rỉ, khơng cĩ lỗ mội. mực nước ao từ 0.5-1m. Cá dùng để nuơi vỗ cĩ đủ 12 tháng tuổi, trong lượng trung bình 150-200g trở lên. Kết quả nuơi vỗ cá Trê ở trường ðHCT cho thấy với thức ăn hàm lượng protein là 35%, cho ăn 4-5% trọng lượng thân thì sau khoảng 60 ngày nuơi vỗ cá cĩ thể tham gia sinh sản. Khối lượng trung bình cĩ thể tham gia sinh sản của cá Trê vàng là 250-300 g và 350-400 g đối với cá Trê trắng (Nguyễn Văn Kiểm, 2002; Huỳnh Kim Hường, 2005) ðã cĩ một số nghiên cứu thành cơng khi cho cá Trê đẻ tự nhiên trong ao và kích tố (DOCA; LH; HCG, não thùy nhĩm cá chép) kích thích cá đẻ. Thời gian phát triển phơi 24-26h, ở nhiệt độ 26-280C (Lê Thanh Hùng va ctv, 1994; Nguyễn Tường Anh và ctv,1980; Trương Chí Học, 1998; ðược trích dẫn bởi Nguyễn Văn Kiểm, 2004; Huỳnh Kim Hường, 2005). Vào khoảng năm 1982-1987 ở thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh ðBSCL đã sản xuất ra một lượng cá Trê phi giống khá lớn đủ cung cấp cho người nuơi và việc nuơi cá Trê phi đã đem lại nguồn thu đáng kể cho người nuơi cá.Do sự cĩ mặt của cá Trê phi ở các tỉnh Nam bộ mà từ đĩ biện pháp kỹ thuật lai tạo 8 giữa Trê phi với Trê vàng ra đời. Vấn đề lai tạo giữa cá Trê phi với Trê vàng đã thu được những kết quả đáng khích lệ (Nguyễn Văn Kiểm và ctv, 1999) 2.4. Sơ lược một số hoạt chất gây chín và rụng trứng ở cá 2.4.1.HCG (Human chorionic Gonadotropine) Cĩ tên tiếng Việt là kích dục tố màn đệm hoặc kích dục tố nhau thai, được Zondec và Aschheim phát hiện từ năm 1927 trong nước tiểu phụ nữ cĩ thai 2- 4 tháng, là một polypeptide cĩ trọng lượng phân tử 36.000 ( Nguyễn Tường Anh, 1999). Ngày nay, HCG là loại kích dục tố được dung cĩ hiệu quả cho nhiều lồi cá nhất. Ngồi các lồi cá Mè, các lồi cá Trê, HCG cịn cĩ tác dụng gây rụng trứng cho nhiều lồi cá khác ở nước ta như cá Tra, cá Bống, cá Basa, cá Vàng,…Ở nước ngồi, HCG cịn được dung cho cá Chình (Yamamoto, Nagahama, 1973), cá Vược vằn (Stevens, 1967),…ðặc biệt là sự thành cơng của Morozova từ năm 1936 trên cá Perca fluviatilis bằng nước tiểu phụ nữ cĩ thai (Nguyễn Tường Anh,1999; Nguyễn Huấn , 2007) HCG trên con đực cĩ tác dụng như ICSH (interstitial cell stimulating hormone) nĩ cĩ tác dụng kích thích tế bào kẽ leydig trong tinh hồn tiết ra hormone sinh dục đực và kích thích quá trình tạo tinh cũng như hoạt tính của các tế bào dinh dưỡng sertoli bên trong ống sinh tinh ( Nguyễn Tường Anh, 1999; Nguyễn Huấn, 2007) 2.4.2.Não thùy thể Hiện nay , não thùy của cá được sử dụng dưới hai dạng não tươi và não khơ. ðây là loại kích dục tố được sử dụng phổ biến và sử dụng trên nhiều lồi cá. Hoạt tính của não thùy cao nhất khi cá cĩ tuyến sinh dục thành thục, tức là khả năng gây chin và rụng trứng cao nhất (Nguyễn Tường Anh, 1999; Nguyễn Huấn, 2007), việc tiêm não thùy cho cá bố mẹ các lồi tham gia sinh sản tùy thuộc vào nhiều yếu tố, mà quyết định liều lượng khác nhau như: chất lượng hoạt tính của não thùy, đặc tính nhạy cảm của lồi , tình trạng thành thục của cá bố mẹ khi được tiêm, nhiệt độ nước các điều kiện khác của mơi trường chứa cá sau khi được tiêm thuốc kích thích ( Nguyễn Tường Anh, 1999; Nguyễn Huấn, 2007) 2.4.3.LHRH-a (Lutenizing Hormon- Releasing Hormon analog) Trong nghề nuơi cá người ta thường dùng mGnRH-A (hay cịn gọi là LHRH-a là chất tương tự GnRH-A của động vật cĩ vú) và sGnRH-A (chất tương tự GnRH của cá hồi) và một chất kháng dopamine (Nguyễn Tường Anh, 9 1999).Trên cá đối người ta cấy hỗn hợp testostoron (T) và LHRH-a và thất cĩ sự lớn lên của nỗn bào (Kelley và ctv,1987). Trên cá măng biển cấy LHRH-a (200µg) và methytestosteron (MT)(0,25mg) đã làm tăng tỷ lệ cá cái thành thục (85%) so với đối chứng (3,3%)(Tamru và ctv,1988). Ở cá rơ đồng theo Phạm Ngọc Khánh liều từ 80-100 µg/ kg cá cái dung kèm với Domperidom (Dom) cĩ thời gian hiệu ứng là 10-12 giờ (được trích dẫn bởi Trần Thị Phương Lan, 2008) 2.5. Cơ chế quá trình chín và rụng trứng Theo Nguyễn Tường Anh (1999) tiếp theo sự chín hoặc trong thời gian chín, nhiều mối liên kết giữa nỗn hồng và nang trứng bị đứt ra được coi là sự tách nang (follicular separation). Tiếp sau sự tách nang một lổ hỏng rất rõ được hình thành trên nang trứng, qua đĩ nỗn hồng thốt ra ngồi gọi là sự vỡ nang (follicular rupture). Rụng trứng là quá trình màng folicule bị vỡ ra, trứng rơi vào xoang buồng trứng và ở trạng thái lưu động. Quá trình rụng trứng chỉ xảy ra trong thời gian ngắn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố mơi trường khác nhau, đặc biệt là nhiệt độ. Khi quá trình rụng trứng xảy ra, hoạt động nội tiết được tăng cường và cĩ sự tham gia của nhiều hormone vào quá trình này (Nguyễn Tường Anh, 1999) Dưới sự điều khiển của thần kinh trung ươn, hai loại kích dục tố FSH, LH làm cho lớp trong cùng của tế bào nang trứng thành thục thêm một bước, thay đổi hình thái và tiết ra nỗn tố foliculin. Nỗn tố này thẩm thấu từ trong ra ngồi tế bào để kích thích bạch cầu tiết ra men phân hủy màng folicul tạo thành chất dịch. Chất dịch này thẩm thấu ngược trở lại nang trứng kết quả là các tế bào tăng nhanh về kích thước. Quá trình này cứ diễn ra như vậy cho tới khi một thời điểm nào đĩ của màng follicul cĩ độ bền kém nhất bị phá vỡ trứng thốt khỏi màng follicul rơi vào xoang buồng trứng, quá trình rụng trứng kết thúc. Sự thành thục của tế bào trứng và màng follicul hồn tồn độc lập nhau nhưng phải được tiến hành đồng thời , nhịp nhàng. Nếu hai quá trình này xảy ra khơng đồng thời sẽ dẫn tới màng follicul vỡ và thải trứng quá sớm , trong khi đĩ tế bào trứng chưa chuẩn bị sẳn sàng để đĩn nhận sự thụ tinh hoặc màng follicul chưa vỡ nhưng trứng đã chín và đến khi thốt ra khỏi màng follicul một số trứng đã chết khơng cịn khả năng thụ tinh (Nguyễn Tường Anh, 1999). Thụ tinh nhân tạo là dựa vào đặc tính sinh lý của trứng và tinh trùng đã thành thục, thực hiện những biện pháp kỹ thuật thích hợp làm cho chúng kịp thời gặp nhau để hồn thành tác dụng thụ tinh. Nguyên lý cơ bản của việc kích thích sinh sản nhân tạo chính là dựa vào những nguyên lý chung về sinh vật học trong quá trình sinh sản tự nhiên của các lồi cá. Trong điều kiện nuơi 10 nhốt trong ao, lồng…, nhiều lồi cá nuơi khơng cĩ đủ điều kiện sinh thái làm thỏa mãn những yêu cầu về sinh sản của cá bố mẹ, nên phải dùng phương pháp nhân tạo, nghĩa là tiêm các chất kích thích tuyến sinh dục vào cơ thể để một mặt thay thế một phần hoạt động nội tiết của não thùy thể, mặt khác thúc đẩy hoạt động nội tiết của bản thân tuyến yên, kích thích cá bố mẹ sinh sản trứng, phĩng tinh. Theo Chung Lân (1969) trong sinh sản nhân tạo, điều kiện sinh thái cũng cần được xem trọng, việc kích thích sinh sản chỉ cĩ tác dụng giảm bớt một phần yêu cầu về điều kiện sinh thái sinh sản của. 11 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu - Cá Trê vàng bố mẹ: được mua tại các chợ ở Cần Thơ. Những cá cái thành thục phải cĩ bụng to mềm, lổ sinh dục màu hồng và cĩ hình vành khăn. Tế bào trứng cĩ đường kính từ 1,1-1,2mm màu nâu vàng sáng, rời. Tỷ lệ trứng phân cực ≥ 70-80%. Ngoại hình cá đực: thon, gai sinh dục dài, nhọn và cĩ màu hồng ở mút gai sinh dục. - Khung lưới ấp trứng - Bể giữ cá - Hệ thống cấp thốt nước - Hormon sử dụng trong thí nghiệm: HCG, não thuỳ thể họ cá chép và LH- Rha và Motilium. - Nhiệt kế rượu (0-100oC) - Các các vậy liệu khác 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1.Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện: Từ tháng 03/2008 đến tháng 06/2009 Ðịa điểm thực hiện: Trại cá thực nghiệm trường ðại học Cần Thơ 3.2.2. Thử nghiệm kích thích sinh sản cá Trê vàng đực dưới tác dụng của các loại kích dục tố khác nhau. 3.2.2.1. Kích thích cá Trê sinh sản với HCG Thí nghiệm được thực hiện với 3 nghiệm thức, với các liều lượng HCG khác nhau cho cá đực: 600, 800, 1.000 UI/kg. Trong thí nghiệm 1 cá cái chỉ sử dụng duy nhất một liều lượng HCG ở mức 3.000 UI/kg. Cá đực được tiêm trước cá cái 6 giờ. Tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều được thực hiện với 2 đến 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí 2 đợt, thời điểm bố trí thí nghiệm khác nhau 12 Bảng 3.1 Liều lượng HCG dùng trong thí nghiệm HCG (UI/kg cá) Giới tính NT1 NT2 NT3 NT ðC ðực 600 800 1000 0 Cái 3000 Chọn cá cái cho sinh sản trứng cĩ độ đồng đều cao, cá khỏe mạnh, màu sắc bĩng mượt, lổ sinh dục ửng hồng. Cá đực chọn cho sinh sản khỏe mạnh, màu sắc bĩng mượt. Lơ đối chứng cho thí nghiệm 1 là khơng tiêm kích dục tố cho cá đực. 3.2.2.2. Kích thích cá Trê sinh sản với HCG kết hợp với não thùy Bố trí thí nghiệm 2 với 3 nghiệm thức. Trong đĩ liều lượng não thùy ở mỗi nghiệm thức khác nhau cho cá đực: 1, 1.5, 2 mg/kg cá, liều lượng HCG như nhau là 500 UI/kg. Ở 3 nghiệm thức cá cái chỉ sử dụng một liều lượng duy nhất là 2.500 UI HCG/kg và 4 mg não thùy/ kg. Áp dụng phương pháp tiêm 2 lần cho cả cá đực và cá cái. ðối với cá đực lần 1 tiêm não thùy với liều lượng trên , sau 6 giờ thì tiêm lần 2 dùng HCG với liều lượng như trên. ðối với cá cái lần 1 cũng tiêm não với liều lượng như trên và tiêm cùng thời gian tiêm lần 2 của cá đực, lần 2 tiêm HCG và được tiêm sau 6 giờ so với lần 1. Lơ đối chúng cho thí nghiệm 2 khộng tiêm kích dục tố cho cá đực. Tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều được thực hiện với 2 đến 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí 2 đợt, thời diểm bố trí thí nghiệm khác nhau. Bảng 3.2. Liều lượng HCG+ não thuỳ dùng trong thí nghiệm HCG (UI/kg cá)+não thùy (mg/kg) Giới tính NT1 NT2 NT3 NT ðC ðực 500UI+1.0 mg 500UI+1.5mg 500UI+2.0mg 0 Cái 2.500 UI/kg + 4 mg/kg 3.2.2.3. Kích thích cá Trê sinh sản với LHRH-a + Motilium Thí nghiệm 3 sử dụng kích dục tố LHRH-a với liều lượng như nhau cho cá cái ở 3 nghiệm thức là (100 µg LHRH-a + 10 mg Motilium )/kg. Cá đực được 13 tiêm với liều khác nhau : 20 µg + Motilium, 30 µg + Motilium, 40 µg + Motilium /kg cá cho 3 nghiệm thức. Lơ đối chúng cho thí nghiệm khộng tiêm kích dục tố cho cá đực. Tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều được thực hiện với 2 đến 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được bố trí 2 đợt, thời diểm bố trí thí nghiệm khác nhau. Bảng 3.3. Liều lượng LHRH-a + Motilium dùng trong thí nghiệm LHRH-a + DOM (µg + Motilium /kg cá) Giới tính NT1 NT2 NT3 NT ðC ðực 20 30 40 0 Cái 100 3.2.3. Kỹ thuật sinh sản nhân tạo Hình3.1. Cá Trê vàng bố mẹ Cá Trê vàng cái Cá Trê vàng đực 14 3.2.3.1.ðối với cá cái Sau khi cá cái nhận 1 liều lượng nhất định chất kích thích, sau khoảng 14-18 giờ cá sẽ rụng trứng. Trứng được vuốt ra và trộn đều với dung dịch nước muối sinh lý cĩ chứa tinh trùng 3.2.3.2.ðối với cá đực Trước khi cắt và nghiền tuyến sinh dục đực thì tuyến sinh dục đực phải được quan sát mơ tả kỹ về mặt hình thái và so sánh với đặc điểm của nĩ trước khi tiêm chất kích thích. a) a) a) b) Hình 3.2. Cơ quan sinh dục cá cái a) và cá đực b) 3.2.3.3.Gieo tinh nhân tạo Sử dụng phương pháp gieo tinh bán khơ. ðể thụ tinh nhân tạo đạt kết quả cao điều quan trọng là phải xác định đúng thời điểm rụng trứng. Dấu hiệu nhận biết cá bắt đầu rụng trứng là khi lật bụng cá lên , ép nhẹ vùng bụng dưới, thấy trứng chảy ra dễ dàng. Sau khi kiểm tra thấy cá cái rụng trứng hồn tồn, bắt đầu chuẩn bị gieo tinh. ðầu tiên giải phẫu cá đực thu buồng tinh, lau sạch và khơ buồng tinh rồi cho vào cối sứ. Hình 3.3.Giải phẩu cá đực Buồng tinh cá đực Buồng tinh cá đực (tinh sào) Gai sinh dục Lỗ sinh dục 15 Sau đĩ, vuốt trứng cá cái vào thau nhựa đã lau sạch và khơ. Trung bình buồng tinh của cá đực nặng 50g cĩ khả năng thụ tinh 300-400g trứng. Sau khi vuốt trứng xong, cân tổng trọng lượng trứng đã vuốt để tính sức sinh sản của cá Hình 3.4. Vuốt trứng cá cái Sau đĩ, dùng kéo cắt nhuyễn buồng tinh rồi cho 20-30mL nước cất vào cối sứ chứa tinh dịch và ngay tức khắc đổ tinh dịch vào thau trứng. Dùng lơng gia cầm khuấy đảo đều và liên tục trong khoảng 1 phút Hình 3.5. Nghiền nhuyễn buồng tinh và cho nước muối sinh lý vào Sau khi gieo tinh 6-7 giờ, tiến hành xác định tỷ lệ thụ tinh. 3.2.3.4.Ấp trứng Ở đây khung lưới được chọn làm giá thể ấp vì nĩ cĩ các ưu điểm sau: + Mặt thống rộng, ấp được mật độ cao, ta dể rãi trứng đều, cung cấp đầy đủ oxy cho trứng + Khung lưới cĩ tác dụng như giá đỡ, nên trứng ít bị rơi vãi xuống bể ấp Buồng trứng cá Trê vàng Trứng cá Trê vàng 16 + Khi trứng nở, cá con rơi xuống bể, cịn trứng ung vẫn giữ ở lại trên khung. Hạn chế tình trạng trứng ung rớt lẫn với cá bột, hạn chế nấm thủy mỵ phát triển lan tràn gây hại cho cá. Giữ mơi trường ấp sạch. + Ấp bằng khung lưới thao tác thuận tiện, nhanh gọn, đơn giản,… Trứng sau khi thụ tinh 1-2 phút được rãi đều lên mặt khung lưới đã thả trong bể cĩ chứa nước sạch và cĩ sục khí. 3.2.4. So sánh các chỉ tiêu sinh sản - Tỷ lệ rụng trứng - Thời gian hiệu ứng Tính từ lúc tiêm kích thích tố lần 2 đến khi cá bắt đầu rụng trứng - Sức sinh sản tương đối: ΣA: số trứng thu, ∑ ∑ = M A S ΣM: Khối lượng cá cái (kg) S: sức sinh sản tương đối - Tỷ lệ thụ tinh (F(%)) - Tỷ lệ nở (TLN(%)) Thời gian nở (giờ) được tính từ lúc trứng rụng cho đến khi nở trên 30 % số trứng thụ tinh - Tỷ lệ dị hình (TLDH(%)) - Quá trình phát triển phơi Ngay sau khi trứng thụ tinh, sự phát triển phơi được quan sát dưới kính hiển vi cĩ độ phĩng đại 40 lần, nhằm xác định thời gian nở của trứng. số trứng nở TLN = x100 số trứng thụ tinh Số kg cá cái rụng trứng TLRT = x100 Số kg cá cái cho đẻ Số cá dị hình TLDH = x100 số trứng thụ tinh số trứng thụ tinh F = x100 số trứng quan sát 17 - Xác định một số yếu tố mơi trường trong quá trình làm thí nghiệm + Nhiệt độ + pH + Oxy hịa tan 3.3. Xử lý số liệu Các số trung bình, độ lệch chuẩn, biểu đồ sử dụng phần mềm Excel, SPSS để xử lý 18 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Kết quả xác định một số yếu tố mơi trường Quá trình sinh sản của các lồi cá nĩi chung và cá Trê nĩi riêng phụ thuộc vào 2 yếu tố: Khách quan (yếu tố mơi trường) và chủ quan (tình trạng thành thục và sức khỏe của cá) Dưới đây sẽ trình bày kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố mơi trường tới sự sinh sản và phát triển phơi cá Trê vàng. Bảng 4.1. Kết quả xác định một số yếu tố mơi trường ðợt 1 ðợt 2 Thời gian O2(mg/l) Nhiệt độ( 0C) pH O2(mg/l) Nhiệt độ( 0C) pH Sáng 4,33 - 6 26,5 - 27,17 6,83 - 7,1 5 - 6 26,5 - 27,25 6,8 - 7,25 Chiều 4,67 - 6 27,83 - 29 6,77 - 7,2 5 - 6 28,5 - 29 7 - 7,3 Oxy là yếu tố khơng thể thiếu được trong đời sống của cá cũng như các lồi động vật khác. ðối với các lồi thủy sinh vật Oxy lại cĩ ý nghĩa cực kỳ quan trọng. Theo Vertmaski, 1960 (trích dẫn từ Dương Thúy Yên, Vũ Ngọc Út, 1991) thì cuộc đấu tranh sinh tồn trong thủy quyển là cuộc đấu tranh giành lấy Oxy. Theo Dương Nhựt Long (2004) khi ấp trứng cần cung cấp nước liên tục và oxy đầy đủ, nhất là thời điểm trước và sau khi trứng nở phải đảm bảo từ 5-6 mg/l. Như vậy hàm lượng oxy hịa tan trong quá trình làm thí nghiệm là tương đối thích hợp. Theo Nguyễn Văn Kiểm (2005), nhiệt độ thích hợp cho hầu hết phơi cá phát triển dao động trong khoảng 26-280C. Ở các thí nghiệm cho cá Trê sinh sản trên nhiệt độ dao động từ 26,5- 290C. Như vậy, nhiệt độ ở các đợt cho đẻ trên là tương đối thích hợp cho quá trình sinh sản và quá trình phát triển phơi. Nguyễn Văn Kiểm (2005), độ pH trong bể ấp dao động từ 6,5-7,5 là tốt cho phơi phát triển. Qua kết quả theo dõi pH trong quá trình làm thí nghiệm cho thấy pH nằm trong khoảng thích hợp cho phơi phát triển từ 6,7- 7,3. 4.2.Kết quả thí nghiệm kích thích cá Trê vàng sinh sản 19 4.2.1. ðặc điểm hình thái tuyến sinh dục đực của cá Trê vàng trước và sau khi tiêm chất kích thích 4.2.1.1.Trước khi tiêm chất kích thích Tuyến sinh dục của cá Trê vàng chia nhiều thùy hình nhánh cây, các thùy dài và nhỏ, bề mặt tinh sào cĩ màu hồng nhạt các mau mạch nhìn khơng rõ và khơng phát hiện tinh sào nào cĩ màu trắng đục tương tự như tuyến sinh dục đực của cá Trê phi hoặc một số lồi cá nước ngọt khác Hình 4.1. Tuyến sinh dục cá Trê vàng trước khi tiêm chất kích thích 4.2.1.2. Sau khi nhận chất kích thích Sau khi nhận chất kích thích, hình thái tinh sào cĩ sự thay đổi rõ ràng như sau: Bề mặt tinh sào căng, các thùy cũng tăng về kích thước, tồn bộ bề mặt tinh sào cĩ màu trắng hồng nhạt. Mút các thùy cĩ màu trắng đục và số lượng thùy cĩ đặc điểm như vậy tăng lên rõ ràng. Khi dùng kéo cắt cĩ dịch màu trắng hồng nhạt hoặc vàng nhạt chảy ra. ðiều đĩ chứng tỏ, dưới tác dụng của kích tố đã cĩ sự gia tăng hoạt động sinh tinh của tinh sào. Hình 4.2. Tuyến sinh dục cá Trê vàng sau khi tiêm chất kích thích 4.2.2. Kích thích cá Trê đực sinh sản với HCG Kết quả thu được cho từng nghiệm thức được thể hiện trong bảng sau: 20 Bảng 4.2.Kết quả kích thích cá Trê vàng đực sinh sản bằng HCG Ghi chú: • Những giá trị cùng cột cĩ cùng ký tự là khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (P>0,05) • ðợt 1 tiến hành ngày 01/04/2009 • ðợt 2 tiến hành ngày 01/05/2009 69.33 63.33 55.67 47 31.5 46 77.5 63 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ t h ụ t in h ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.3. Tỷ lệ thụ tinh của thí nghiệm 1 ðợt T/N Nghiệm thức (NT) Tỷ lệ cá rụng trứng (%) SSS tương đối (trứng/g cá cái) Tỷ lệ thụ tinh (%) Tỷ lệ nở (%) Tỷ lệ đực/cái NT 1 100 35,2 69,3a±7,50 55a±9,84 3/1 NT 2 100 40,8 63,3a±9,86 38b±3,00 3/1 NT 3 100 42 55,7a±5,85 22,33c±5,03 3/1 1 NT ðC 100 38,99 47 72 1/1 NT 1 66,67 48,2 31,5a±30,41 96,5a ±4,94 2/1 NT 2 66,67 48,2 46a ±1,41 80,5a ±3,54 2/1 NT 3 66,67 43,82 77,5a ±3,54 81,5a ±9,19 2/1 2 NT ðC 66,67 43,82 63 67 1/1 21 55.00 38.00 22.33 72.00 96.5 80.5 81.5 67 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ n ở ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.4. Tỷ lệ nở của thí nghiệm 1 Khi mổ cá đực nhận thấy tinh sào cĩ một số đặc điểm sau: tinh sào khá to, cĩ nhiều thùy, nhiều hạt nhỏ màu trắng đục, càng ra chĩt thùy các hạt này càng nhiều và màu trắng đục càng thấy rõ. Cịn ở nghiệm thứ đối chứng, cá đực khơng được tiêm kích tố thì tinh sào màu trắng hồng, ít hạt màu trắng đục. Qua bảng 4.2 và hình 4.3 cho thấy tỷ lệ thụ tinh dao động từ 55,7-69,3% (đợt 1) cao hơn so với đối chứng (47%). Trong đĩ nghiệm thức 2 (tiêm cá đực với liếu 600 UI/kg) cho tỷ lệ thụ tinh cao nhất. Như vậy, kích tố HCG cĩ tác dụng đến sự chuyển hĩa tuyến sinh dục đực, tức là lượng tinh trùng sẽ tăng lên, từ đĩ làm tăng tỷ lệ thụ tinh của trứng. Nguyễn Tường Anh (1999) cho rằng HCG ngồi tác dụng gây rụng trứng ở cá cái, thì ở liều thấp cũng cĩ tác dụng thúc đẩy tế bào sinh dục đực chuyển hĩa nhanh tới giai đoạn chín. Mặc dù tỷ lệ thụ tinh của các nghiệm thức cao hơn so với đối chứng nhưng tỷ lệ nở lại thấp hơn. Nguyên nhân là do các khay ấp trứng khơng được trao đổi nước liên tục, đặc biệt những khay ấp khơng cĩ đáy thơng thống. Những khay ấp như vậy làm cho trứng bị phân hủy dẫn đến tỷ lệ nở thấp. Kết quả nghiên cứu ở đợt 2 cho thấy tỷ lệ rụng trứng của cá thấp hơn đợt 1 (66,67%). Tỷ lệ thụ tinh của các nghiệm thức cũng thấp (trừ nghiệm tức 3 cho tỷ lệ thụ tinh 77,5%). Nguyên nhân chính dẫn tới tỷ lệ rụng trứng, tỷ lệ thụ tinh thấp là do cá bố mẹ thu gom ngồi chợ bị xây xát nhiều, sức khỏe cá bị suy giảm (cĩ thể cá bị giữ lâu ngày trước khi đem ra chợ bán). Một trong các chỉ số liên quan tới sức khỏe của cá khi cho đẻ là thời gian hiệu ứng của kích tố kéo dài hơn so với đợt đẻ thứ nhất (thời gian hiệu ứng của đợt 1 là 13,5-14 giờ, cịn ở đợt 2 là 14,5-15 giờ) theo Từ Thanh Dung, Trần Thị Thanh Hiền (1994), nếu cá khỏe khơng bị xay xát thì thời gian hiệu ứng thuốc của cá là 12-14 giờ và cho tỷ lệ thụ tinh 22 cao. Riêng tỷ lệ nở ở đợt 2 cao hơn ở đợt 1 là do đã khắc phục được nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ nở thấp ở đợt1 của thí nghiệm. 4.2.3. Kích thích cá Trê vàng đực sinh sản bằng HCG kết hợp não thùy Kết quả thu được cho từng nghiệm thức được thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.3. Kết quả kích thích cá Trê vàng đực sinh sản bằng HCG kết hợp não thùy ðợt T/N Nghiệm thức (NT) Tỷ lệ cá rụng trứng (%) SSS tương đối (trứng/g cá cái) Tỷ lệ thụ tinh (%) Tỷ lệ nở (%) Tỷ lệ đực/ cái NT 1 100 47,6 90a ±6,24 58,33a±20,79 3/1 NT 2 100 53,42 90,67a±4,04 35,33ab±27,54 3/1 NT 3 100 41,2 89,33a±7,51 14b±6,56 3/1 1 NT ðC 100 31,87 72,5±31,82 19 ± 9,90 2/1 NT 1 100 45,06 73 99 1/1 NT 2 100 45,06 67 97 1/1 NT 3 100 51,14 38 58 1/1 2 NT ðC 100 51,14 89 99 1/1 Ghi chú: • ðợt 1 tiến hành ngày 17/04/2009 • ðợt 2 tiến hành ngày 28/05/2009 • Những giá trị cùng cột cĩ cùng ký tự là khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (P>0,05) 23 90 90.67 89.33 72.573 67 38 89 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ t h ụ t in h ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.5. Tỷ lệ thụ tinh của thí nghiệm 2 Quan sát tinh sào cá đực ở đợt thí nghiệm này cho thấy vào thời điểm chính vụ tinh sào của cá cĩ màu trắng đục quan sát kỹ trong tinh sào cĩ nhiều các hạt màu trắng đục đặc biệt là ở các chĩt thùy, các thùy được phân nhiều hơn, rõ ràng hơn Tỷ lệ thụ tinh của trứng trong đợt 1 cũng rất cao (dao động từ 89,33-90,67%). Tuy nhiên tỷ lệ nở thấp ở cả 3 nghiệm thức và tỷ lệ nở thấp nhất ở nghiệm thức 3 (14%). Cĩ nhiều nguyên nhân gây ra tỷ lệ nở thấp của trứng cá. Nhưng ở điều kiện thí nghiệm thì cĩ lẻ do đặc điểm của dụng cụ ấp trứng cĩ sự khác nhau. Kết quả thí nghiệm đã ghi nhận khi trứng ấp ở những khay nhựa cĩ lưới thơng thống ở mặt đáy oxy trao đổi tốt hơn thì cho tỷ lệ ở cao hơn so với những trứng ấp trong khay cĩ lưới ở mặt bên. 58.33 35.33 14 19 99 97 58 99 0 20 40 60 80 100 120 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ n ở ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.6. Tỷ lệ nở của thí nghiệm 2 Trong thí nghiệm đợt 2, do cá đực ở nghiệm thức 3 chết trước khi ca cái rụng trứng khoảng 2 giờ nên phải bảo quản tinh sào trong trong tủ lạnh. Cĩ lẻ đây là 24 lý do làm cho tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở ở nghiệm thức 3 thấp với các giá trị tương ứng là (38% và 58%). Chính vì vậy mà cá đực ở nghiệm thức đối chứng cho tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở cao với các giá trị tương ứng là (89% và 99%). 4.2.4. Kích thích cá Trê vàng đực sinh sản bằng LHRH-a + Motilium Kết quả thu được cho từng nghiệm thức được thể hiện trong bảng sau: Bảng 4.4. Kết quả kích thích cá Trê vàng đực sinh sản bằng LHRH-a + Motilium ðợt T/N Nghiệm thức (NT) Tỷ lệ cá rụng trứng (%) SSS tương đối (trứng/ g cái) Tỷ lệ thụ tinh (%) Tỷ lệ nở (%) Tỷ lệ đực/cái NT 1 100 44,62 88,67a±4,16 32,67a±9,02 3/1 NT 2 100 39,21 82,33a±4,16 53,00b±7,00 3/1 NT 3 100 45,54 88,67a±4,93 72,67c±6,66 3/1 1 NT ðC 100 42,28 75 34 1/1 NT 1 100 52,22 99,00a±0,00 95,50a±4,95 2/1 NT 2 100 50,78 98,50a±0,71 99,00a±0,00 2/1 NT 3 100 49,31 97,50a±0,71 96,00a±1,41 2/1 2 NT ðC 100 53,23 94 97 1/1 Ghi chú: • ðợt 1 tiến hành ngày 09/04/2009 • ðợt 2 tiến hành ngày 07/05/2009 • Những giá trị cùng cột cĩ cùng ký tự là khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (P>0,05) 25 88.67 82.33 88.67 75.00 99 98.5 97.5 94 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ t h ụ t in h ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.7. Tỷ lệ thụ tinh của thí nghiệm 3 Sau khi tiêm thuốc 12,5- 13 giờ , cá cái rụng trứng 100%, cho tỷ lệ thụ tinh khá cao và dao động từ 82,33-88,67% ở nhiệt độ từ 26-300C. Khi giải phẩu cá đực, tinh sào đều cĩ màu trắng hồng, nhiều thùy và nhiều hạt màu trắng đục. Tỷ lệ nở ở thí nghiệm này khơng cao là do nguyên nhân dụng cụ ấp trứng khơng thơng thống, các trứng phân hủy đã cản trở việc trao đổi nước nên làm nước bị nhiểm bẩn, gây thiếu oxy cục bộ. Ở đợt 2, đây là thời điểm chính vụ sinh sản của cá, nên tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở ở các NT đều cao do chất lượng trứng và tinh trùng đều tốt, khi vuốt trứng chảy ra thành dịng, khi nghiền tinh sào cĩ tinh dịch màu trắng sữa chảy ra. 32.67 53.00 72.67 34.00 95.5 99 96 97 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 NT1 NT2 NT3 NTDC Nghiệm thức T ỷ l ệ n ở ( % ) ðợt 1 ðợt 2 Hình 4.8. Tỷ lệ nở của thí nghiệm 3 26 4.2.5.Quá trình phát triển phơi Khi quan sát dưới kính hiển vi cho thấy quá trình phát triển phơi cá trê vàng cũng tương tự như quá trình phát triển phơi các lồi cá nước ngọt khác. Thời gian phát triển phơi cá Trê vàng trong nghiên cứu này từ 23-24 giờ ở điều kiện nhiệt độ nước 28-300C. Kết quả ghi nhận sự phát triển phơi được trình bày ở bảng 4.5 Bảng 4.5. Các giai đoạn phát triển phơi Thời gian sau thụ tinh Các giai đoạn phát triển 15 phút 45 phút 1 giờ 2 giờ 45 phút 3 giờ 25 phút 5 giờ 15 phút 7 giờ 30 phút 8 giờ 15 phút 8 giờ 50 phút 9 giờ 50 phút 10 giờ 10 phút 10 giờ 30 phút 13 giờ 15 giờ 30 phút 16 giờ 30 phút 20 giờ 22 giờ 23- 24 giờ Hình thành đĩa mầm, trứng màu vàng nâu 4 tế bào 8 tế bào Nhiều tế bào Phơi nang cao: phơi nang bì nhơ lên cao trên khối nỗn hồng, giữa phơi nang bào và khối nỗn hồng cĩ eo thấp Phơi nang thấp: phơi nang bì bọc 1/3 trứng ðầu phơi vị, phơi nang bì bọc1/2 trứng Giữa phơi vị, phơi nang bì bọc 2/3 trứng Cuối phơi vị, phơi nang bì chiếm 4/5 trứng Phơi thần kinh Xuất hiện 3 đốt thân Xuất hiện bọc mắt Mầm đuơi lộ ra trên khối nỗn hồng Xuất hiện tim, phơi cử động co rút ðầu đuơi phân biệt rõ ràng ðuơi cử động mạnh đầu đuơi tách khỏi nỗn hồng Cá bắt đầu nở Cá nở rộ 27 2 tế bào 8 tế bào 16 tế bào Nhiều tế bào Phơi dâu Cuối phơi vị Phơi thần kinh Hình thành đốt cơ Tách đuơi Nở Hình 4.9.Quá trình phát triển phơi cá Trê vàng 28 4.2.6. Sự phát triển của hậu phơi Lúc mới nở: Ấu trùng nằm nghiên vận động lắc lư. Ngày thứ 1: Ấu trùng dài 5-5,2 mm, xuất hiện màng vi lưng, vi hậu mơn và vi đuơi. 13 giờ sau khi nở ấu trùng ấu trùng cĩ khả năng bơi chủ động, 15 giờ sau khi nở ấu trùng cĩ mầm râu. Ngày thứ 2: Ấu trùng dài 5,2-5,5 mm, mắt cĩ sắc tố màu nâu đen, ấu trùng cĩ khả năng bơi từng quãng ngắn và định hướng. Mầm râu dài ra từ từ, lượng nỗn hồng giảm. Ngày thứ 3: Ấu trùng dài từ 6-7 mm, bắt đầu cĩ sự hình thành tia vi đuơi, lượng nỗn hồng giảm nhiều. Ngày thứ 4: Ấu trùng dài 7-8 mm, ấu trùng hình thành tia vi ngực, vi đuơi cĩ tia vây. ða số ấu trùng gần hết nỗn hồng, ấu trùng thường tập trung thành từng nhĩm. Ngày thứ 5: Ấu trùng dài 8-9 mm, ấu trùng cịn ít nỗn hồng, cĩ khả năng ăn moina Ngày thứ 6: Ấu trùng dài 9-12 mm, Tia vây lưng và vây hậu mơn đã cĩ tia vây bằng chất xương, ăn moina hồn tồn. Ngày thứ 7: Ấu trùng dài 10-13 mm, cĩ hình dạng cá con 4.2.7. Sự hình thành cá con Qua thí nghiệm, nhận thấy cùng với sự hồn thiện cơ quan, tập tính sống của ấu trùng ngày càng đa dạng và phức tạp. Lúc mới nở, khối nỗn hồng cịn lớn, vi lưng, vi đuơi nối liền thành một dãy bao quanh từ nữa sau của phần lưng đến sát lỗ hậu mơn nên chỉ vận động lắc lư. Khối nỗn hồng là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu. Lượng nỗn hồng ngày càng giảm đi cùng với sự hồn thiện và phát triển của các cơ quan: mầm râu biến thành râu vào ngày thứ 2- 3, mầm vi ngực phát triển thành vi ngực vào ngày thứ 4, vi lưng, vi đuơi và vi hậu mơn ngày càng phát triển vi đuơi từ chổ bắt đầu hình thành vào ngày thứ 3 đã cĩ tia vây bằng chất xương vào ngày thứ 4, màng vi lưng và vi hậu mơn bắt đầu hình thành tia vi bằng chất xương vào ngày thứ 5, khi nguồn năng lượng chính được cung cấp từ nỗn hồng hết vào ngày thứ 5-6. Chính vì thế mà vận động của ấu trùng ngày càng đa dạng và linh hoạt: từ chỗ vận động lắc lư (ngày thứ nhất) chuyển sang bơi lội chủ động vào ngày thứ 2 và 3 tiến đến bơi lội tự do vào ngày thứ 4 và ngày thứ 5. 29 Hiện tượng dinh dưỡng vừa bằng nỗn hồng vừa bằng thức ăn bên ngồi Qua thí nghiệm cho thấy: ấu trùng cá Trê hồn tồn sử dụng thức ăn ngồi trong khi cịn nỗn hồng vào ngày thứ 5. ðiều này cĩ ý nghĩa quan trọng trong thực tiễn sản xuất: ta cĩ thể cho thức ăn ngồi vào bể ương vào ngày thứ 3 để ấu trùng quên với việc dinh dưỡng ngồi và tạo điều kiện cho việc sử dụng tốt thức ăn bên ngồi khi hết nỗn hồng. Sự chấm dứt dinh dưỡng bằng nỗn hồng Ấu trùng chấm dứt dinh dưỡng bằng nỗn hồng hồn tồn vào ngày thứ 5 sau khi nở. Ngày thứ I Ngày thứ II Ngày thứ III Ngày thứIV Ngày thứ V Hình 4.10. Hình thái của hậu phơi trong 5 ngày 30 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 5.1.Kết luận i. Kích thích cá Trê vàng đực đầu mùa sinh sản bằng kích tố HCG cho tỷ lệ thụ tinh tương đối thấp, thấp nhất ở liều lượng 600 UI cho tỷ lệ thụ tinh 31,5% và cao nhất ở liều lượng 800 UI cho tỷ lệ thụ tinh là 77,5%. ii. Sử dụng LRH-a + Motidium kích thích cá Trê vàng đực sinh sản cho tỷ lệ thụ tinh khá cao, cao nhất ở nghiệm thức 1 ( 20µg/kg cá đực), tỷ lệ thụ tinh ở đợt 1 là 88,67% và đợt 2 là 94%. Tỷ lệ thụ tinh ở 3 nghiệm thức ở 2 đợt thí nghiệm đều cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức đối chứng đợt 1 là 75% và đợt 2 là 94%), qua đĩ cho thấy LRH-a cĩ tác dụng kích thích sự sinh tinh ở cá đực. iii. Kết quả kích thích cá Trê vàng đực sinh sản dưới tác dụng của HCG + não thuỳ cũng khá cao, cao nhất ở liều lượng 500 UI+1,5 mg não (tỷ lệ thụ tinh là 90,67%). Cao hơn tỷ lệ thụ tinh khi sử dụng kích tố HCG đơn thuần, chúng tỏ não thuỳ cĩ tác dụng kích thích qua trình tạo tinh ở cá Trê vàng đực và cho kết quả thụ tinh tinh cao khi kết hợp với HCG. iv. ðiều kiện mơi trường phù hợp với quá trình phát triển phơi cũng như ấu trùng: nhiệt độ dao động từ 26,5- 290C, oxy dao động từ 5- 6 mg/l , pH dao động từ 6,7- 7,3. 5.2. ðề xuất Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các loại kích dục tố khác đến sự thành thục và chin sinh dục cá Trê vàng đực. 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Âu Dương Cảnh, 1990. ðặc điểm phát triển tuyến sinh dục sinh sản, phát triển phơi cá trê vàng. Luận văn tốt nghiệp ðại học. 2. Dương Thúy Yên, Vũ Ngọc Út, 1991. Kỹ thuật Sản xuất giống và lai tạo cá Trê. Luận văn tốt nghiệp ðại học, 55 trang. 3. Phạm Báu và ctv, 1993 Nghiên cứu kỹ thuật nuơi cá trê lai. Bộ Thủy sản Viện nghiên cứu nuơi trồng Thủy sản I, 24 trang. 4. Phạm Trang – Phạm Báu, 2000. Kỹ thuật gây nuơi một số lồi đặc sản. NXB Nơng Nghiệp. 5. Nguyễn Thanh Xuân, 2003. Chuyên đề: Một số kết quả nghiên cứu về kỹ thuật sinh sản nhân tạo cá Trê vàng (Clarias macrocephalus). Luận văn tốt nghiệp ðại học.18 trang. 6. Nguyễn Duy Khốt, 2004. Kỹ thuật nuơi Ba Ba, Ếch đồng, cá Trê lai. NXB Nơng Nghiệp Hà Nội, 84 trang. 7. Phạm Văn Khánh - Lý Thị Thanh Loan, 2004. Kỹ thuật nuơi một số lồi cá kinh tế nước ngọt & phịng trị bệnh cá. NXB Nơng nghiệp, 103 trang. 8. Nguyễn Tường Anh, 2005. Kỹ thuật sản xuất giống một số lồi cá nuơi. NXB Nơng NghiệpTP HCM, 103 trang. 9. Phạm Minh Thành – Nguyễn Văn Kiểm, 2008. Cơ sở khoa học và kỹ thuật sản xuất cá giống. 10. Huỳnh Kim Hường, 2005. Nghiên cứu sự thành thục sinh dục và thử nghiệm sinh sản nhân tạo cá trê trắng (Clarias batrachus), 60 trang. 11. Dương Nhựt Long, 2004. Giáo trình kỹ thuật nuơi thủy sản nước ngọt, 200 trang. 12. Nguyễn Văn Kiểm, 2005. Giáo trình kỹ thuật sản xuất cá giống, 95 trang. 13. Từ Thanh Dung, Trần Thị Thanh Hiền, Sinh học và kỹ thuật sản xuất giống và nuơi cá Trê, trích từ Tài liệu tập huấn Kỹ thuật nuơi thủy sản nước ngọt, 1994. Khoa Thủy sản, trường ðại học Cần Thơ 14. Trần Thị Phương Lan, 2008. Ảnh hưởng của kích dục tố lên quá trình sinh sản cá Bống tượng (Oxyeleotris marmoratus Bleekr), 69 trang. 15. Một số vấn đề về nội tiết học sinh sản cá, 1999. NXB Nơng nghiệp Hà Nội, 200 trang. 32 PHỤ LỤC I. Ảnh hưởng kích dục tố lên sự sinh sản cá Trê vàng đực Phụ lục 1: Khối lượng cá và lượng kích dục tố HCG trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 1 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT(UI) TW cá cái(g) Lương KDT(UI) 200 190 NT1 170 600 200 180 190 NT2 200 800 200 180 200 NT3 190 1000 200 ðC 180 0 200 3000 Phụ lục 1a.Ảnh hưởng của kích dục tố HCG lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1A 77.00 52.00 13.50 NT1B 62.00 66.00 13.50 NT1C 69.00 47.00 35,2 7.040 13.50 NT1 69.33 55.00 13.50 NT2A 68.00 38.00 13.50 NT2B 70.00 41.00 13.50 NT2C 52.00 35.00 40,8 8.160 13.50 NT2 63.33 38.00 13.50 NT3A 58.00 17.00 14.00 NT3B 49.00 23.00 14.00 NT3C 60.00 27.00 42 8.400 14.00 NT3 55.67 22.33 14.00 DC 47.00 72.00 38,99 7.798 14.00 33 Phụ lục 2: Khối lượng cá và lượng kích dục tố HCG trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 2 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT(UI) TW cá cái(g) Lương KDT(UI) 140 NT1 160 600 120 NT2 100 800 200 120 NT3 140 1000 200 ðC 160 0 120 3000 Phụ lục 2a.Ảnh hưởng của kích dục tố HCG lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng ở đợt 2 TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1A 10.00 100.00 14.50 NT1B 53.00 93.00 14.50 NT1 31.50 96.50 48,2 9.640 14.50 30.41 4.95 0.00 NT2A 47.00 83.00 14.50 NT2B 45.00 78.00 15.00 NT2 46.00 80.50 48,2 9.640 14.75 1.41 3.54 0.35 NT3A 80.00 75.00 15.00 NT3B 75.00 88.00 15.00 NT3 77.50 81.50 43,82 5.258 15.00 3.54 9.19 0.00 DC 63.00 67.00 43,82 5.258 15.00 Phụ lục 3: Khối lượng cá và lượng kích dục tố LHRH-a trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 1 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT TW cá cái(g) Lương KDT 100 120 NT1 180 20µg + Motilium 200 180 160 NT2 130 30µg + Motilium 220 160 160 NT3 200 40µg + Motilium ðC 180 0 200 100 µg + Motilium 34 Phụ lục 3a.Ảnh hưởng của kích dục tố LHRH-a lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng Phụ lục 4: Khối lượng cá và lượng kích dục tố LHRH-a trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 2 TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1A 90.00 24.00 12.50 NT1B 84.00 32.00 12.50 NT1C 92.00 42.00 44,62 8.924 12.50 NT1 88.67 32.67 12.50 4.16 9.02 0.00 NT2A 81.00 50.00 13.00 NT2B 87.00 61.00 13.00 NT2C 79.00 48.00 39,21 8.627 13.00 NT2 82.33 53.00 13.00 4.16 7.00 0.00 NT3A 91.00 71.00 13.00 NT3B 83.00 80.00 13.00 NT3C 92.00 67.00 45,54 9.108 13.00 NT3 88.67 72.67 13.00 4.93 6.66 0.00 DC 75.00 34.00 42,28 7.610 13.00 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT(UI) TW cá cái(g) Lương KDT(UI) 140 NT1 140 20µg + Motilium 120 NT2 100 30µg + Motilium 180 100 NT3 140 40µg + Motilium 120 ðC 160 0 180 100µg + Motilium 35 Phụ lục 4a.Ảnh hưởng của kích dục tố LHRH-a lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng Phụ lục 5: Khối lượng cá và lượng kích dục tố HCG + não trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 1 TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1A 99.00 99.00 12.00 NT1B 99.00 92.00 52,22 9.400 12.00 NT1 99.00 95.50 12.00 0.00 4.95 0.00 NT2A 99.00 99.00 12.00 NT2B 98.00 99.00 50,78 9.140 12.00 NT2 98.50 99.00 12.00 0.71 0.00 0.00 NT3A 97.00 97.00 12.00 NT3B 98.00 95.00 49,31 8.876 12.00 NT3 97.50 96.00 12.00 0.71 1.41 0.00 DC 94.00 97.00 53,23 9.581 12.00 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT TW cá cái(g) Lương KDT 100 100 NT1 100 500 UI+1mg não 180 100 100 NT2 100 500 UI+1.5mg não 200 100 100 NT3 160 500 UI+2mg não 60 0 160 ðC 100 0 180 2500 UI+4mg não 36 Phụ lục 5aẢnh hưởng của kích dục tố LHRH-a lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1A 83 43 15 NT1B 95 50 15 NT1C 92 82 47,6 8.568 15 NT1 90 58.33 15 6.24 20.79 0.00 NT2A 90 37 15 NT2B 95 62 15 NT2C 87 7 53,42 10.684 15 NT2 90.67 35.33 15 4.04 27.54 0.00 NT3A 85 8 15 NT3B 98 13 15 NT3C 85 21 41,2 6.592 15 NT3 89.33 14 15 7.51 6.56 0.00 ðC1 95 26 15 ðC2 50 12 31,87 5.737 15 ðC 72.5 19 15 31.82 9.90 0.00 Phụ lục 6: Khối lượng cá và lượng kích dục tố HCG + não trong kích thích cá Trê vàng đực sinh sản ở đợt 2 Nghiệm thức TW cá đực(g) Lượng KDT TW cá cái(g) Lương KDT NT1 100 500 UI+1mg não NT2 100 500 UI+1.5mg não 200 NT3 100 500 UI+2mg não 180 0 120 0 ðC 100 0 140 2500 UI+4mg não Phụ lục 6a.Ảnh hưởng của kích dục tố HCG+não lên các chỉ tiêu sinh sản cá Trê vàng TLTT(%) TLN(%) SSSTT (trứng/g cá cái) Số trứng sinh sản(trứng) TGHU(giờ) NT1 73 99 NT2 67 97 45,06 9.015 15 NT3 38 58 DC 89 99 51,14 7.160 15 37 II.Xử lý thống kê tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở Phụ lục 7.Thí nghiệm 1_ðợt 1 Tỷ lệ thụ tinh Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 3.00 3 55.6667 2.00 3 63.3333 1.00 3 69.3333 Sig. .087 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Tỷ lệ nở Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 2 3 3.00 3 22.3333 2.00 3 38.0000 1.00 3 55.0000 Sig. 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Phụ lục 8.Thí nghiệm 1_ðợt 2 Tỷ lệ thụ tinh Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 1.00 2 31.5000 2.00 2 46.0000 3.00 2 77.5000 Sig. .081 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. 38 Tỷ lệ nở Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 2.00 2 20.5000 3.00 2 54.0000 1.00 2 96.5000 Sig. .138 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. Phụ lục 9.Thí nghiệm 3_ðợt 1 Tỷ lệ thụ tinh Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 2.00 3 82.3333 1.00 3 88.6667 3.00 3 88.6667 Sig. .142 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Tỷ lệ nở Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 2 3 1.00 3 32.6667 2.00 3 53.0000 3.00 3 72.6667 Sig. 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Phụ lục 10.Thí nghiệm 3_ðợt 2 39 Tỷ lệ nở Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 1.00 2 95.5000 3.00 2 96.0000 2.00 2 99.0000 Sig. .322 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. Tỷ lệ thụ tinh Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 3.00 2 97.5000 2.00 2 98.5000 1.00 2 99.0000 Sig. .081 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000. Phụ lục11.Thí nghiệm 2_ðợt 1 Tỷ lệ thụ tinh Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 3.00 3 89.3333 1.00 3 90.0000 2.00 3 90.6667 Sig. .804 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 40 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Tỷ lệ nở Duncan Subset for alpha = .05 NT N 1 2 3.00 3 14.0000 2.00 3 35.3333 35.3333 1.00 3 58.3333 Sig. .245 .214 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. III. Một số yếu tố mơi trường Phụ lục 12. Nhiệt độ Thí nghiệm 1 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC Sáng 26,83±0,29 26,83±0,29 26,83±0,29 27 1 Chiều 27,83±0,29 28,5±0,50 28,17±0,29 28,5 Sáng 27±0,71 27,25±0,35 27±0,00 26,5 2 Chiều 28,5±0,71 28,75±0,35 29±0,00 29 Thí nghiệm 2 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC Sáng 26.83±0,29 26.5±0,50 26.83±0,29 26.67±0,29 1 Chiều 27.83±0,29 28.67±0,29 28.83±0,29 28.67±0,29 Sáng 27 26,5 26,5 27 2 Chiều 29 28,5 29 29 Thí nghiệm 3 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 27.17±0,29 26.67±0,29 27±0,50 27 Chiều 28.67±0,29 28.67±0,29 29±0,00 28.5 2 Sáng 27,25±0,35 26,75±0,35 27±0,71 27 Chiều 28,75±0,35 28,75±0,35 28,25±0,35 28,5 41 Phụ lục 13. pH Thí nghiệm 1 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 6,83±0,06 6,9±0,10 6,93±0,06 6,9 Chiều 6,77±0,06 6,87±0,06 6,87±0,06 6,8 2 Sáng 7,15±0,07 6,95±0,07 7±0,00 7,1 Chiều 7,1±0,28 7,15±0,07 7,05±0,35 7 Thí nghiệm 2 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 6,9±0,10 7±0,10 7,03±0,15 7,1 Chiều 7,13±0,15 6,97±0,12 7±0,10 7,2 2 Sáng 6,9 7,1 6,8 6,9 Chiều 7,1 7,2 7 7,1 Thí nghiệm 3 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 6,97±0,12 7±0,10 7±0,10 6,9 Chiều 6,8±0,10 6,9±0,15 6,93±0,15 7 2 Sáng 7,25±0,07 7,15±0,07 7,1±0,00 7,1 Chiều 7,3±0,00 7,25±0,07 7,2±0,00 7,2 Phụ lục 14.Oxy hịa tan Thí nghiệm 1 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 5,67±0,58 5,33±0,58 5±0,00 5 Chiều 6±0,00 5,67±0,58 5,33±0,58 6 2 Sáng 5,5±0,71 5±0,00 5±0,00 5 Chiều 6±0,00 5,5±0,71 5,5±0,71 5 Thí nghiệm 2 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 6±0,00 5,33±0,58 5±1,00 5 Chiều 5,67±0,58 5±1,00 5,33±0,58 5 2 Sáng 5 6 5 6 Chiều 6 6 6 5 42 Thí nghiệm 3 ðợt Buổi NT1 NT2 NT3 NTðC 1 Sáng 4,33±0,58 5,33±0,58 5,67±0,58 5 Chiều 4,67±0,58 5±0,00 5,33±0,58 5 2 Sáng 6±0,00 5±0,00 5,5±0,71 6 Chiều 5,5±0,71 5,5±0,71 6±0,00 6 43 Quy trình sản xuất giống cá Trê vàng

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdftran_thi_thuy_an_8895.pdf
Luận văn liên quan