Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio

............................................ 12 3.1.1 Hóa chất................................................................................................................ 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 13 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc ...................... 13 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc.......................................................................................................................... 16 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus ....... 18 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ............................................................ 20 3.4 Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................................... 20 4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc........... 22 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus................. 23 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. .......... 24 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................... 30 5.1 Kết luận........................................................................................................................ 30 5.2 Đề xuất......................................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 32 PHỤ LỤC............................................................................................................................... 35 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc............................ 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB ............................. 14 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch ............. 15 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng phương pháp đục lỗ thạch ........................................................................................ 17 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch ............................................................................................................... 19 Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch........................................................................ 21 Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn............................................................................ 26 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS ........................................................... 28 Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm.................................................................................... 28 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn ................................................................................... 29 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long CFU: Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) OD: Optical Density TSB: Tryptic Soya Broth TSA: Tryptic Soya Agar TCBS: Thiosulphate citrate bile salt agar NA Nutrient Agar V. harveyi Vibrio harveyi B. subtillis Bacillus subtillis B. cereus Bacillus cereus 1 Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chế phẩm vi sinh (probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việc nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme. Một số dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67,...được phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lựa nghiên cứu vì tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài: Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn nhau. 2 1.3 Nội dung đề tài: Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) giữa các dòng Bacillus chọn lọc. Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: Từ 09/2012 đến 12/2012. Tại phòng phân tích vi sinh - Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao,...phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtilis có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010). 2.1.2 Vai trò 4 Từ rất lâu Bacillus đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học giúp cải tiến chất lượng nước vì có một số đặc tính probiotic: + Enzym protease: Vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải tạo thành NH3 và các sản phẩm khác. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa, đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3). NH3 được chuyển hóa thành NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Các hợp chất nitrat lại chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ các nhóm vi khuẩn khử nitrat. Các vi khuẩn tham gia vào quá trình amon hóa là Bacillus mycoides, B. subtillis, B. cereus, Pseudomonas. Aerurinosa, P. flourescens… Như vậy, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh là các vi khuẩn thuộc giống Bacillus và Pseudomonas. + Enzym amylase: Các amylase có nguồn gốc khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối. Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn nhưng α-amylase chủ yếu tổng hợp từ Bacillus như Bacillus subtillis, B. licheniformis… Enzym amylase của Bacillus subtillis có khối lượng phân tử là 9. 900Da. Enzym amylase của Bacillus subtillis không đòi hỏi phải có chất hoạt hóa, pH tối ưu cho enzym amylase của Bacillus subtillis là 5,0-6,0. Enzym amylase của Bacillus subtillis được đông khô bền với canxi axetat và natri axetat. Enzym α-amylase được dùng cho giai đoạn thủy phân đầu tiên trong trao đổi chất của tinh bột. Các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym α-amylase cao. Ngày nay việc thu enzym α-amylase và protease từ các vi khuẩn chịu mặn chịu kiềm rất được quan 5 tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzym thu trong việc ứng dụng: bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm sinh học. + Enzym cellulase: Enzym này xúc tác sự phân hủy cellulose thành các sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose. Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân hữu cơ nhờ hệ enzym protease, amylase, cellulase là các acid amin và glucose. Đó là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước. Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên. Tính dễ sống, dễ tồn tại cũng là lợi thế để sử dụng Bacillus sản xuất chế phẩm sinh học. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus sp (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,...) dùng để làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas,.. Theo nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) thì nhóm vi khuẩn có lợi này bao gồm các cơ chế tác động như: có thể ngăn chặn sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh; cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vật nuôi; cung cấp một số enyme cần thiết làm nâng cao khả năng tiêu hóa của vật nuôi; và cuối cùng là các nhóm vi khuẩn có lợi này có thể hấp thu hoặc đẩy mạnh quá trình 6 phân hủy chất hữu cơ, các chất gây độc trong môi trường nước làm cải thiện chất lượng môi trường nước. 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi tôm trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Đa số các bệnh nhiễm khuẩn xảy ra là do tác nhân gây bệnh Vibrio spp (V. harveyi, V. splendida, V. alginolyticus, V. paraheamolyticus) và một số loài khác (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). Theo Đỗ Thị Hòa (2004) giống Vibrio spp thuộc họ Vibrionaceae, có một số đặc điểm chung như sau: có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3-0,5 µm x 1,4- 2,6 µm. Chúng không tạo bào tử và có khả năng di động bởi một hoặc nhiều roi. Là các vi khuẩn bắt màu gram âm, đa số phản ứng oxidase dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với (O/129). Hầu hết các giống Vibrio spp đều phân bố trong môi trường nước mặn. Môi trường Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp. Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường này, Vibrio spp được chia thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường TCBS. Nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội chúng tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuôi. Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh. Khi bị nhiễm vi khuẩn này tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh. Nếu môi trường tiếp tục xấu đi, hay số lượng vi khuẩn phát triển mạnh, tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành nhiễm khuẩn mãn tính. Để ngăn ngừa bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi. Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90% chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn 7 Thị Tĩnh và ctv, 2010). Ở Việt Nam đã phân lập được các loài V. alginolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. cholerae, V. mimicus trên cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et al., 1999). Những biểu hiện của bệnh bao gồm bơi lờ đờ, hoại tử mô và phụ bộ, tăng trưởng chậm, biến thái chậm, dị hình, phát sáng sinh học, đục cơ hoặc đốm đen trên thân (Aguirre-Guzman et al., 2001). Bệnh phát sáng trên tôm sú giai đoạn trứng, ấu trùng và tôm giống gây chết nhanh và hàng loạt, từ 80-100%. Tôm nhiễm bệnh thân có màu trắng đục, quan sát vào ban đêm thấy có hiện tượng phát sáng trong bể ương là do V. harveyi gây ra. V. harveyi là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở các loài tôm biển và tôm càng xanh, V. harveyi phát triển mạnh trong môi trường có độ mặn từ 20-30‰, mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt khi ở môi trường có nồng độ muối từ 5-7‰ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005). Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc (Moriarty, 1999). Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) một nhóm vi khuẩn thuộc giống Vibrio spp đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng. Bệnh phát sáng do một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V. splendida, V. orientalis, V. ifscheri, V. vulnificus. Ở Việt nam, những dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống. Khi vi khuẩn phát sáng hiện diện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành. Theo Đỗ Thị Hòa (1996) bệnh do vi khuẩn có thể gây ra 45,3% hiện tượng chết ở tôm nuôi, trong đó hai nhóm gây tác hại lớn nhất là nhóm vi khuẩn dạng sợi và nhóm Vibrio spp. Trong nhóm Vibrio spp, loài V. harveyi là loài quan trọng nhất gây ra bệnh phát sáng trong các trại giống và trong ao nuôi tôm. Kết quả phân lập các chủng Vibrio harveyi kháng kháng sinh từ ấu trùng tôm sú nhiễm bệnh trong các trại giống ở Ấn Độ của Karunasagar và ctv (1994) đã chứng minh các chủng vi khuẩn này đề kháng với bốn loại kháng sinh mạnh: co-trimoxazole, erythromycin, streptomycin 8 và chloramphenicol. Nhầm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh Vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhầm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất (trích dẫn bởi nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). 2.3 Một giải pháp mới thay thế kháng sinh - Probiotic Quá trình nuôi thâm canh với mật độ cao của tôm, cá sẽ dẫn đến sự tích lũy chất hữu cơ và vi khuẩn trong hệ thống nuôi do chúng được đưa vào cùng lượng lớn thức ăn. Theo nguyên lí về mặt sinh thái học, việc cung cấp chất hữu cơ không thường xuyên có khuynh hướng làm mất cân bằng hệ vi sinh theo hướng tăng tỉ lệ vi khuẩn cơ hội. Vì vậy việc quản lí hệ vi sinh là rất quan trọng trong nuôi trồng thủy sản nhất là trong hệ thống nuôi thâm canh. Trong các phương pháp thuộc chiến lược chung để kiểm soát hệ vi sinh trong ương nuôi của Vadstein và ctv (1993) thì việc sử dụng probiotic thay thế cho việc sử dụng kháng sinh đã trở nên đầy hứa hẹn. Thuật ngữ probiotic được đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng vi sinh vật hoặc các vi sinh vật khác. Năm 1969, R. Fuller định nghĩa rõ hơn: Probiotics hay vi sinh vật probitic là những vi sinh vật sống, bổ sung vào thức ăn có tác dụng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có tác dụng hữu ích cho động vật chủ.. Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống. Probiotic là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả 9 quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp hai lần so với đối chứng. Một số nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sinh học vào môi trường thủy sản cho kết quả rất khả quan, vừa có thể cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998). Ở Philippin, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999). Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi. Đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998, trích dẫn Mai Bé Túy, 2011). Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản mới chỉ bắt đầu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, việc sử dụng các chế phẩm này chủ yếu theo kinh nghiệm. Người ta cho rằng, bất kỳ một chế phẩm sinh học phải đạt được 3 quá trình sau: Khống chế sinh học: Những dòng vi khuẩn có ích trong chế phẩm có khả năng sinh các chất kháng khuẩn để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong ao. Tạo sức sống mới: Các vi khuẩn trong chế phẩm khi đưa vào ao sẽ phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và hoạt tính, có khả năng tồn tại cả trong môi trường và trong đường ruột, ảnh hưởng có lợi đối với vật nuôi. Xử lý sinh học: Khả năng phân giải các chất hữu cơ trong nước giải phóng axít amin, glucose, cung cấp thức ăn có vi sinh vật có ích, giảm thiểu thành phần nitơ vô cơ như amôni, nitrit, nitrat, giảm mùi hôi thối, cải thiện chất lượng nước. 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong thủy sản Kết quả đã phân lập từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh ở Sóc Trăng có 9 chủng Bacillus, 10 chủng Nitrosomonas và Nitrobacter. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa cho thấy 6 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus. 10 Kết quả giải trình tự cho thấy: B8, B9, B37, B38 đồng hình với dòng B. Cereus. Dòng B41 đồng hình với dòng B. Amyloliquefaciens và dòng B67 đồng hình với dòng B. Subtilis (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011). Năm 1992, Nogami et al. nghiên cứu và báo cáo rằng trong môi trường nước có độ mặn tương đối cao thì các nhóm vi khuẩn có lợi cũng có thể làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng cua, ngăn chặn sự sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh khác như nhóm Vibrio spp. Nhưng lại ít tác động đến các quá trình sinh trưởng của thực vật phù du. Theo Rengpipat và ctv (1998) các dòng chọn lọc Bacillus spp đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm chế sự lây nhiễm của các loài Vibrio. Một nghiên cứu của Rengpiat et al., (1998) khi ngâm tôm sú (PL30) 10 ngày với V. harveyi có sử dụng probiotic (Bacillus S11) cho thấy sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm là 100% cao hơn nhiều so với đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011). Theo Moriarty (1998) mầm bệnh do Vibrio sp. đã được xem là một trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt. Tuy nhiên, nghiên cứu tế bào Bacillus subtilis BT23 cho thấy hiệu quả cao trong việc chống lại sự tăng trưởng của V. harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của tôm giảm 90%. Nghiên cứu của Vaseehara và Ramasamy (2003) cho thấy mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực tế. Vijayabaskar et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhầm hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama và Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY-9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/mL. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveyi và tỉ lệ sống của tôm ở giai đoạn PL-10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi được cải thiện đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ 11 sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi. 12 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ Nước cất, cồn 96o, cồn 70o Nồi hấp tiệt trùng, máy li tâm Cân điện tử, vortex, bếp điện, micropipette 10-100 L, pipette 100-1000 L Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy Các dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống balcon, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, bình tam giác, bình định mức, ống đong, đầu cole... 3.1.1 Nguồn vi khuẩn Vi khuẩn Bacillus đã được phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng vào năm 2008. Sau khi phân lập vi khuẩn được lưu trữ trong 20% glycerol ở tủ đông (-80oC). Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng vi khuẩn Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67. Vi khuẩn Vibrio gồm 3 chủng: chủng Vibrio harveyi gồm 2 dòng (Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986) có nguồn gốc từ trung tâm khảo cứu Artermia (ARC) khoa nông nghiệp trường Đại học Gent của Bỉ và chủng Vibrio chưa định danh được phân lập từ nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ. 3.1.3 Môi trường nuôi Môi trường chuyên biệt cho Bacillus, môi trường TSB (Tryptic Soya Broth) (bổ sung 1,5 % NaCl), môi trường TSA (Tryptic Soya Agar) (bổ sung 1,5 % NaCl), Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose), Nutrient Agar (NA) (bổ sung 1,5 % NaCl). 13 3.1.1 Hóa chất NaCl, NaOH 0,1N, K2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, Na2SO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, FeSO4.H2O, CaCl2,... 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả năng tương thích (không đối kháng lẫn nhau). Chỉ có những dòng vi khuẩn tương thích mới có thể được sử dụng kết hợp lại trong cùng một hỗn hợp trong thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus. Phục hồi vi khuẩn Bacillus: 9 dòng vi khuẩn gồm B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 sau khi rã đông đã được phục hồi trong môi trường TSB trên máy lắc. Sau 24 giờ phục hồi trên máy lắc các dòng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong ống balcon để tiến hành thí nghiệm. 14 Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB (A, C: Phục hồi vi khuẩn trong ống nghiệm; B, D: Nuôi tăng sinh trong ống balcon.) D B A C 15 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch Phương pháp sử dụng là phương pháp đục lỗ thạch. Các dòng vi khuẩn Bacillus khảo sát được nuôi cấy trong môi trường TSB (Tryptic Soya Broth) (thêm 1,5% NaCl) trong 24 giờ trên máy lắc ở 35oC. Ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Thu sinh khối của dung dịch sau li tâm, Các dòng vi khuẩn khảo sát Bacillus thứ nhất Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 106 CFU/mL Cấy trãi trên môi trường TSA, để khô 5 phút Giữ ở 4oC trong 10 phút Các dòng vi khuẩn khảo sát Bacillus thứ hai Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 106 CFU/mL Đục lỗ thạch d = 6 mm (3lỗ/đĩa) Nhỏ 100 L dung dịch vào lỗ thạch Giữ ở 4oC trong 15 phút Ủ ở 30oC trong 24 giờ Kiểm tra vòng kháng khuẩn 16 đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và tiến hành pha loãng để có được mật độ là 106 CFU/mL. Các dòng vi khuẩn được khảo sát theo từng cặp. Dịch khuẩn của dòng vi khuẩn thứ nhất (mật độ 106 CFU/mL) được cấy trãi đều trên mặt thạch TSA (Tryptic Soya Agar) (thêm 1,5% NaCl). Sau khi chờ cho đĩa thạch thật khô, giữ đĩa ở 4oC trong 10 phút. Sử dụng đầu cole đã tiệt trùng có đường kính 6 mm đục ba giếng trên mỗi đĩa thạch. Nhỏ 100 L dịch khuẩn của dòng vi khuẩn thứ hai (với mật độ 106 CFU/mL) được cho vào các giếng đã đục sẵn trên mỗi đĩa thạch. Tiến hành ủ mẫu ở 4 oC trong 15 phút để dung dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó ủ trong 24 giờ ở 30 oC để đọc kết quả. Các dòng vi khuẩn được đánh giá là tương thích lẫn nhau khi chúng không tạo các vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch. Thí nghiệm được lập lại 3 lần để đảm bảo mức độ chính xác. 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh. Những dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn mới được tuyển chọn sử dụng trong thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus. Phục hồi và phân lập vi khuẩn Vibrio: 2 dòng vi khuẩn Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986 được phục hồi tương tự như đối với vi khuẩn Bacillus. Đối với chủng Vibrio chưa định danh đã được phân lập từ mẫu nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ. Mẫu nước đã được pha loãng từ 100 đến 10-2. Dùng Micropipete hút 100 L dung dịch vi khuẩn ở mỗi độ pha loãng cho vào đĩa thạch với hai loại môi trường là NA và TCBS rồi dùng que thủy tinh tán đều đến khi mẫu khô. Sau 24 giờ ủ mẫu ở 30oC tiến hành chọn khuẩn lạc rời để tách ròng trên môi trường TCBS cho đến khi vi khuẩn thuần. Sau đó nuôi tăng sinh tiến hành các thí nghiệm đục lỗ thạch. 17 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng phương pháp đục lỗ thạch Các dòng vi khuẩn khảo sát Bacillus Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 106 CFU/mL Cấy trãi trên môi trường TSA, để khô 5 phút Giữ ở 4oC trong 10 phút Dòng vi khuẩn chỉ thị Vibrio Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 105 CFU/mL Đục lỗ thạch d = 6 mm (3 lỗ/đĩa) Nhỏ 100 L dung dịch vào lỗ thạch Giữ ở 4oC trong 15 phút Ủ ở 30oC trong 24 giờ Kiểm tra vòng vô khuẩn 18 Phương pháp sử dụng là phương pháp đục lỗ thạch (tương tự như phương pháp khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus). Cấy trãi dịch khuẩn của dòng vi khuẩn chỉ thị Vibrio harveyi (mật độ 105 CFU/mL) trên môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl). Sau khi chờ cho đĩa thạch thật khô, giữ đĩa ở 4oC trong 10 phút. Sử dụng đầu cole đã tiệt trùng có đường kính 6 mm đục ba giếng trên mỗi đĩa thạch. Lấy 100µL dịch khuẩn các dòng vi khuẩn Bacillus (mật độ 106 CFU/mL) nhỏ vào mỗi giếng thạch của đĩa thạch đã được cấy trãi Vibrio (Hình 3.2) Tiến hành ủ mẫu ở 4oC trong 15 phút để dung dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó đĩa được ủ ở 30oC trong 24 giờ, đo đường kính các vòng kháng khuẩn (nếu có) tạo thành xung quanh các giếng thạch. Thí nghiệm được lập lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus Các hỗn hợp đã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng kháng Vibrio gây bệnh dựa trên khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn này. Các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn được kết hợp dựa vào đặc tính tương thích (xác định ở mục 3.3.1) với tỉ lệ, mật độ bằng nhau giữa các dòng trong cùng một hỗn hợp. Đánh giá khả năng kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp thông qua việc hình thành các vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch. 19 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch Phương pháp sử dụng là phương pháp đục lỗ thạch (tương tự như phương pháp khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus). Cấy trãi dịch khuẩn của dòng vi khuẩn chỉ thị Vibrio harveyi (mật độ 105 CFU/mL) trên Các dòng vi khuẩn khảo sát Bacillus Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 106 CFU/mL Cấy trãi trên môi trường TSA, để khô 5 phút Giữ ở 4oC trong 10 phút Dòng vi khuẩn chỉ thị Vibrio harveyi Nuôi trong môi trường TSB ở 35oC trong 24 giờ Ly tâm 10000v/phút trong 15 phút ở 4oC, thu sinh khối dung dịch Đo mật độ quang, pha loãng để được mật độ 105 CFU/mL Đục lỗ thạch d = 6 mm (3 lỗ/đĩa) Nhỏ 100 L dung dịch vào lỗ thạch Giữ ở 4oC trong 15 phút Ủ ở 30oC trong 24 giờ Kiểm tra vòng vô khuẩn Pha trộn các dòng vi khuẩn để được hỗn hợp 20 môi trường TSA (thêm 1,5% NaCl). Sau khi chờ cho đĩa thạch thật khô, giữ đĩa ở 4oC trong 10 phút. Sử dụng đầu cole đã tiệt trùng có đường kính 6 mm đục ba giếng trên mỗi đĩa thạch. Dịch khuẩn của các dòng vi khuẩn Bacillus (mật độ 106 CFU/mL) được pha trộn tạo hỗn hợp theo tỉ lệ bằng nhau. Lấy 100 µL hỗn hợp dung dịch các dòng vi khuẩn Bacillus đã pha trộn nhỏ vào mỗi giếng thạch của đĩa thạch đã được cấy trãi Vibrio harveyi (Hình 3.3). Tiến hành ủ mẫu ở 4oC trong 15 phút để dung dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó đĩa được ủ ở 30oC trong 24 giờ, đo đường kính các vòng kháng khuẩn (nếu có) tạo thành xung quanh các giếng thạch. Thí nghiệm được lập lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Mật độ vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD). Sử dụng máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm, khi đó mẫu trống (không có bổ sung vi khuẩn) được đo lần đầu tiên và kết quả được tự động chuyển sang không. OD đo lường có phạm vi từ 0.125-1.25. Theo tiêu chuẩn MacFarland (BioMérieux, Marcy I’Etoile, Pháp), mật độ quang của 1 tương ứng với 1.2 x 109 tế bào/mL. Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức: Mật độ vi khuẩn = 1200 x 106 x OD x Độ pha loãng Số lượng tế bào vi khuẩn trong mẫu nước được tính theo công thức: CFU (CFU/L) = Số khuẩn lạc trung bình x độ pha loãng x 10 3.4 Phương pháp xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Excel để tính các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. So sánh thống kê bằng phương pháp ANOVA trong phần mềm SPSS ở mức tin cậy P<0,05. 21 Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch (A, B: Đầu cole dùng để đục lỗ thạch; C: Sử dụng đầu cole đục 3 lỗ trên đĩa thạch; D: Dùng que cấy loại bỏ khối thạch đã được đục lỗ; E: Bơm dung dịch vi khuẩn vào lỗ thạch; F: Ủ vi khuẩn trong tủ ủ ở 30 oC.) C B A D E F 22 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa 9 dòng vi khuẩn Bacillus được thể hiện trong Bảng 4.1. Kết quả cho thấy đa số các dòng đều đối kháng (không tương thích) lẫn nhau. Có 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự tương thích: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Từ 4 nhóm vi khuẩn trên tìm đươc 9 hỗn hợp: H1 (B2, B7, B41), H2 (B2, B8, B41), H3 (B2, B7), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H6 (B7, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) để tiến hành chọn lọc và kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio. Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc B2 B7 B8 B9 B17 B37 B38 B41 B67 B2 + + - - - - + - B7 + - - - - - + - B8 + - - - - - + + B9 - - - - - - + - B17 - - - - - - - - B37 - - - - - - - - B38 - - - - - - - - B41 + + + + - - - - B67 - - + - - - - - Chú thích: +: Tương thích; -: Đối kháng Tính đối kháng là khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Hiện nay người ta đã xác định được nhiều chất có khả năng ức chế ức chế sự phát triển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, vi rút xâm nhiễm vi khuẩn,…Ngoài ra một số dòng vi khuẩn Bacillus như B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp riboflavin, làm cho chủng vi khuẩn này có khả năng cạnh tranh thức ăn với một số loài khác. Một số loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật Thêm vào đó một số nghiên cứu được xác định để giúp làm rõ mối quan hệ giữa những chất ức chế khác nhau. Vì vậy đa số các dòng vi khuẩn khảo sát thể hiện đặc tính đối kháng lẫn nhau mặc dù chúng cùng chung một chi Bacillus. Kết quả 23 nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv (2010) cho kết quả tương tự, đa số các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh Vibrio spp được phân lập từ ấu trùng tôm sú và cá chẽm đều đối kháng lẫn nhau. Nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền (2010) đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn Bacillus T3, T4, T9 không có khả ức chế kiềm hãm lẫn nhau để cho vào sản phẩm sinh học. 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus. Với mục tiêu lựa chọn các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio, các dòng này được thử hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi sinh vật kiểm định Vibrio gây bệnh. Sau thời gian 24 giờ kiểm tra vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch đã thu được kết quả như sau: Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus *Những giá trị trên cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biêt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Bảng 4.2 cho thấy đường kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng các chủng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus. Các dòng vi khuẩn Bacillus B2, B8, B9, B41, B67 thể hiện khả năng đối kháng Vibrio thông qua việc xuất hiện Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Kí hiệu dòng Vibrio harveyi 30953 Vibrio harveyi 0986 Vibrio V (x) B2 0,05±0,05a 0,07±0,03a 0,12±0,08a B7 - - - B8 0,15±0,05ab 0,23±0,03b 0,20±0,00a B9 0,22±0,03b 0,16±0,05ab 0,18±0,03a B17 - - - B37 - - - B38 - - - B41 0,47±0,06c 0,50±0,10c 0,43±0,06b B67 0,77±0,13d 0,67±0,14d 0,67±0,21c 24 vòng vô khuẩn tuy nhiên ở các mức độ khác nhau, trong đó B47, B67 có đường kính vòng vô khuẩn vượt trội hơn so với các dòng còn lại. Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có vòng vô khuẩn xung quanh các giếng thạch, kết luận các dòng này không có khả năng kháng Vibrio. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Huỳnh Hữu Điền (2012), dòng vi khuẩn Bacillus B37 không có khả năng đối kháng, dòng B67 và B41 có khả năng đối kháng Vibrio harveyi cao. Theo Trần Thị Thu Hiền (2010) vi khuẩn Bacillus trong quá trình phát triển có thể sản sinh ra các chất kiềm hãm, ức chế với các vi khuẩn gây bệnh thông qua một số cơ chế như cạnh tranh oxi, chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí và sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Một số nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng khống chế bệnh dịch bằng cách ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Vibrio, thúc đẩy quá trình thực bào, tăng hoạt động của Melanin và kháng khuẩn. Theo Hasting và nealon (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng khuẩn V. Harveyi và Moriaty (1998) khi sử dụng probiotic chứa chứa chủng Bacillus spp cũng hạn chế được mầm bệnh vi khuẩn phát sáng Vibrio spp. Nghiên cứu của Vaseehara và Ramasamy (2003) cho thấy mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực tế. Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi được cải thiện đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng. 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. Dựa trên hai tiêu chí: khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn này các hỗn hợp đã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh. Từ kết quả hai thí nghiệm trên đã tuyển chọn được 6 trong tổng số 9 hỗn hợp: H2, H4, H5, H7, H8, H9 để tiếp tục khả sát khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp. 25 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus * Những giá trị trên cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biêt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio thể hiện ở Bảng 4.3 cho thấy: Đối với chủng Vibrio harveyi 30953: Hỗn hợp H7 (0,90 cm) có đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất, tiếp theo là H2 (0,70 cm) tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Hỗn hợp H7 khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại; H2 khác biệt thống kê với H8, H9 (P<0,05) và không có ý nghĩa thống kê với H4, H5, H7 (P>0,05). Đối với chủng Vibrio harveyi 0986: Hỗn hợp H9 có đặc tính kháng khuẩn mạnh nhất (0,67 cm), tiếp theo là H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) tuy nhiên hỗn hợp H2 khác biệt không có ý nghĩa thống kê H5 và H9 (P>0,05) và khác biệt thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). Cả ba hỗn hợp H4, H7, H8 đều khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại. Đối với chủng Vibrio chưa định danh V(x): hỗn hợp H5 và H9 có khả năng kháng khuẩn vượt trội hơn so với các dòng khác với đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Kí hiệu dòng Vibrio harveyi 30953 Vibrio harveyi 0986 Vibrio V (x) H2 0,70±0,20ab 0,57±0,06ac 0,37±0,06a H4 0,40±0,10ac 0,18±0,03b 0,15±0,05b H5 0,46±0,05ac 0,48±0,03a 0,73±0,06c H7 0,90±0,10b 0,22±0,03b 0,30±0,10ab H8 0,20±0,10c 0,17±0,06b 0,37±0,06a H9 0,23±0,06c 0,67±0,06c 0,60±0,00c 26 lần lượt là 0, 73 cm và 0,60 cm. Tuy hai hỗn hợp này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05) nhưng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). Hỗn hợp H2, H7, H8 có khả năng kháng khuẩn ở mức trung bình tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê. H4 có khả năng kháng khuẩn thấp nhất, khác biệt không có ý nghĩa với H7 (P>0,05) và khác biệt thống kê với các hỗn hợp còn lại (P<0,05). 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 H2 H4 H5 H7 H8 H9 Đ ườ ng k ín h vò ng tr òn v ô kh uẩ n (c m ) Vh30953 Vh0986 V(x) Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn Sở dĩ có sự khác biệt kích thước đường kính vòng vô khuẩn giữa các chủng Vibrio vì có sự khác nhau về nguồn gốc vi khuẩn. Hai dòng Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986 có nguồn gốc từ trường Đại học Gent của Bỉ, chủng Vibrio chưa định danh V (x) được phân lập từ nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các chất ức chế do vi khuẩn tiết ra có khả năng ngăn cản sự sinh trưởng mạnh mẽ của các vi sinh vật gây bệnh. 27 Các chất này gồm nhiều loại như các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophore, lysozym, protease, hydroperoxit… chúng có thể tác động đơn lẻ phối hợp với nhau. Vì thế kết quả cho thấy một số hỗn hợp có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn so với từng dòng riêng lẻ, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược lại. Nhưng nhìn chung tác động phối hợp của các vi khuẩn trong hỗn hợp có đặc tính kháng khuẩn vượt trội hơn. 28 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS A: Vi khuẩn V (x) phát triển sau khi tán mẫu nước ao nuôi tôm trong 24 giờ; B: Tách ròng vi khuẩn Vibrio. Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm (A: Sinh khối vi khuẩn sau ly tâm lắng ở đáy ống balcon; B: Dịch khuẩn sau khi pha loãng với nước muối sinh lí) A B A B 29 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn (A: Không xuất hiện vòng vô khuẩn (không đối kháng); B, C, D: Các kích thước khác nhau của vòng vô khuẩn (đối kháng); E: Vi khuẩn mọc leo ra bên ngoài lỗ thạch; F: Đường kính vòng vô khuẩn) A F A B C D E 30 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Có 4 nhóm vi khuẩn (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67) thể hiện sự tương thích lẫn nhau. Từ 4 nhóm vi khuẩn tìm được 9 hỗn hợp H1 (B2, B7, B41), H2 (B2, B8, B41), H3 (B2, B7), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H6 (B7, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67). Có 5 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, trong đó B67 và B41 có đặc tính kháng khuẩn vượt trội. Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có khả năng đối kháng Vibrio. Dựa vào khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2, H4, H5, H7, H8, H9 để xác định khả năng kháng khuẩn. Cả 6 hỗn hợp được tuyển chọn đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ đối kháng là khác nhau. Trong đó khả năng đối kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,90 cm), H2 (0,70 cm); đối với Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại. 5.2 Đề xuất Những kết quả đạt được chỉ mới dừng lại ở mức độ một đề tài nghiên cứu khoa học, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất cần tiếp tục nghiên cứu những nội dung sau đây: Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng probiotic của các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có đặc tính đối kháng Vibrio vượt trội: thử hoạt tính proteaza, amylaza, cenllulaza,.. để sàn lọc và chọn ra những hỗn hợp có hiệu quả tối ưu. 31 Những hỗn hợp vi khuẩn Bacillus được tuyển chọn cần đưa vào thử nghiệm trên ao nuôi tôm, cá thực tế để kiểm tra hiểu quả của vi khuẩn. Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh từ những hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có đặt tính kháng khuẩn mạnh để đưa vào sản xuất đại trà nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của người dân. Định danh các dòng vi khuẩn Bacillus và chủng vi khuẩn Vibrio đã được phân lập từ mẫu nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm khoa Thủy sản để bổ sung vào bộ sưu tập các vi sinh vật có tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí nghiên cứu khoa học: 42-52. 2. Đỗ Thị Hòa, 1996. Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú (Penaeus monodon Fabricius 1798) nuôi ở khu vực Nam Trung Bộ. Luận án Phó Tiến sĩ. Khoa Nông nghiệp, trường Đại học Thủy sản Nha Trang. 3. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng Thủy sản, trường Đại học Nha Trang. 4. Huỳnh Hữu Điền, 2012. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh từ các dòng Bacillus chọn lọc ở ao nuôi tôm sú thâm canh. Luận văn đại học. Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. 5. Lê Đình Duẩn và Phạm Văn Tý, 2007. Nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm chế phẩm probiotic làm sạch nước tôm nuôi. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-Hà Nôi. 6. Mai Bé Túy, 2011. Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh lên chất lượng nước và vi sinh vật có hại trong xử lí nước thải ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn đại học. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 7. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Nguyễn Văn Thanh, Đặng Tố Vân Cầm, Vũ Hồng Như Yến, Trần Nguyễn Ái Hằng, 2010. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio sp nhầm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú. Đề tài thuộc chương trình công nghệ sinh học nông nghiệp, thủy sản. 33 8. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007. Giáo trình Vi sinh vật hữu ích. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 9. Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011. Nghiên cứu quần thể chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Luận án Tiến sĩ Thủy sản. Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. 10. Tăng Thị Chính và Đinh Thị Kim, 2006. Sử dụng chế phẩm vi sinh trong ao nuôi tôm cao sản. Viện công nghệ môi trường, viện Khoa học và công nghệ Việt Nam. 11. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 12. Trần Thị Thu Hiền, 2010. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản. Luận văn cao học. Viện công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm. Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 1. Aguirre-Guzman, G., Vazquez-Juarez, R., Ascencio, F., 2001. Differences in the susceptibility of American White Shrimp larval substages (Litopenaeus vannamei) to four Vibrio species. J Invert Pathol. 2. Karunasagar, I. Pai, R., Malathi, G.R., Karunasagar, I., 1994. Mass mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. 3. Oanh, D.T.H., 1999. Characterization anh Pathogenicity Studies on Vibrio Bacteria Isolated from Fish and Sellfish in Vietnam. College Aquaculture and Fisheries. Can Tho University 4. Moriarty, D.J.W., 1999. Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. 5. Rengpiat, S., S. Rukpratanporn, 1998. Probiotic in aquaculture: A case study of probiotic for larvae of the black tiger shrimp (Penaeus monodon). In Book of 34 Abstracs of the Fifth Asian Fisheries Forum-Indernational Conferece on Fisheries and Food Security Beyond the Year 2000. Asian Fisheries Society, Chiang Mai, Thailan. 6. Sung, H.-H., Song, Y.L., Kou, G.H., 1991. Potential ues of bacterin to prevent shrimp vibriosis. Fish & Shellfish Immun. 7. Vaseeharan, B., J. Lin and P. Ramsamy., 2003. Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilias BT23, a Possible Probiotic Treatment for Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon). 8. Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W., 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev. 9. Xiang-Hong, W., L. Jun, J. Wei-Shang, X. Huai-Shu, 1998. Application of Probiotics in Aquaculture. Ocean University of Qongdao. Qingdao. 35 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các công thức môi trường 1. Công thức môi trường chuyên biệt để xác định mật độ vi khuẩn Bacillus Chuẩn pH, sau đó tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút. Trong đó: 2. Công thức môi trường TSA (Bổ sung 1,5% NaCl) Dung dịch 1 50 mL Dung dịch 2 1 mL Dung dịch 3 1 mL Dung dịch 4 1 mL Dung dịch 5 1 mL Glucose 10 gam Glutamate 14,7 gam Yeast Extract 1 gam Agar 20 gam Nước cất 1000 mL K2HPO4 3 gam/50 mL KH2PO4 1 gam/50 mL NH4Cl 0.5 gam/50 mL Dung dịch 1 Na2SO4 0.1 gam/50 mL Dung dịch 2 MgSO4.7H2O 0.5 gam/50 mL Dung dịch 3 MnSO4.4H2O 0.005 gam/50 mL Dung dịch 4 FeSO4.H2O 0.05 gam/50 mL Dung dịch 5 CaCl2 0.25 gam/50 mL TSB (Tryptic Soya Broth) 30 gam NaCl 15 gam Agar 10 gam Nước cất 1000 mL 36 3. Công thức môi trường TSB (Bổ sung 1,5% NaCl) 4. Công thức môi trường NA (Bổ sung 1,5% NaCl) Phụ lục 2: Mật độ của vi khuẩn trong mẫu nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ TSB (Tryptic Soya Broth) 30 gam NaCl 15 gam Nước cất 1000 mL NA (Nutrient Agar) 15 gam NaCl 15 gam Nước cất 1000 mL Vi khuẩn CFU/L Vi khuẩn tổng 29 x 104 Vibrio 34 x 103