Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh ninh thuận bằng kỹ thuật rapd và aflp

PAGE  PAGE xii Lời Cảm Ơn ! Ngàn lời biết ơn xin gởi đến Cha Mẹ và Cô, người đã nuôi dạy con khôn lớn và có được những gì hôm nay. Em xin trân trọng gởi lòng biết ơn đến: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM Ban Giám Đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh Ban Chủ Nhiệm và Thầy - Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình giảng dạy em trong suốt quá trình học và thực hiện khóa luận. Em xin chân thành gởi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Bùi Minh Trí, thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo những điều kiện tốt nhất để em thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: Chị Hồ Bích Liên Chị Võ Thị Thúy Huệ Chị Huỳnh Kim Hưng Anh Hồ Viết Thế Và các anh, chị trong phòng Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận Xin cảm ơn các Chú, các anh ở Lâm trường, Ban Quản Lý rừng và những người dân trồng điều tại tỉnh Ninh Thuận đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thu thập mẫu Đồng chân thành cảm ơn đến tất cả các bạn trong và ngoài lớp Công nghệ Sinh học 27 thân yêu đã giúp đỡ, động viên tôi trong học tập và hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp. Thủ Đức, ngày 25 tháng 08 năm 2005 Phạm Văn Bình TÓM TẮT PHẠM VĂN BÌNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. “ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Acarnadium occidentale L.) HIỆN ĐƯỢC TRỒNG TẠI TỈNH NINH THUẬN BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP.” Giáo viên hướng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Đối tượng nghiên cứu là 55 mẫu điều được lấy nhiều nơi trên địa bàn tỉnh Ninh Thuận. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật RAPD, AFLP và dùng phần mềm NTSYS để phân tích kết quả và đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận, đồng thời tìm kiếm marker, làm cơ sở cho việc chọn, tạo giống cây điều. Kết quả đạt được: Ly trích 55 mẫu điều kết quả thu được 50 mẫu đạt tiêu chuẩn là vật liệu cho các kỹ thuật phân tử. Trong 50 mẫu ly trích được có 52% số mẫu đạt OD > 1,8; 80% số mẫu có DNA lớn hơn 50 ng/ul và 44% số mẫu vừa có OD > 1,8 vừa có DNA lớn hơn 50 ng/ul. Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR tốt nhất là chương trình nhiệt ở nghiệm thức 2 của thí nghiệm 3 (Bảng 3.5 trang 31) Chỉ thị RAPD với primer 2 và primer 9 không xuất hiện band trên gel điện di, primer 1 và primer 11 cho kết quả tốt. Với primer 11 thu được 13 band trong đó có 2 band đồng hình chiếm tỷ lệ 15,4% và 11 band đa hình chiếm tỷ lệ 84,6%. Hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 0,38 đến 1,00 và cây phát sinh chủng loại có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên từ 0,66 đến 1,00. Chỉ thị AFLP được kiểm tra trên 12 tổ hợp primer chọn lọc, cho tính đa hình cao nhất là 2 tổ hợp primer MseI-CAA với EcoRI-ACT và MseI-CAA với EcoRI-AGG. Các kết quả thu được cho thấy: Quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có quan hệ di truyền gần nhau nhưng lại có nguồn gene rất phong phú và có tính đa dạng khá cao. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Trang tựa Cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các bảng x Danh sách các hình xi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 2 1.2.1. Mục tiêu 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Giới hạn khóa luận 2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về cây điều 3 2.1.1. Nguồn gốc 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái 4 2.1.2.1. Thân và cành 4 2.1.2.2. Rễ 4 2.1.2.3. Lá và tán lá 4 2.1.2.4. Hoa 4 2.1.2.5. Hạt và quả điều 6 2.1.3. Đặc điểm sinh thái 6 2.1.3.1. Điều kiện khí hậu 6 2.1.3.2. Điều kiện đất đai 8 2.1.4. Sự phân bố 9 2.1.4.1. Vùng trồng điều ưu tiên I 9 2.1.4.2. Vùng trồng điều ưu tiên II 9 2.1.4.3. Vùng trồng điều ưu tiên III 9 2.1.5. Đa dạng sinh học cây điều 9 2.1.5.1. Xét về hình dạng cây 10 2.1.5.2. Xét về màu sắc lá 10 2.1.5.3. Xét về hoa 10 2.1.5.4. Xét về trái 10 2.1.5.5. Xét về hạt và năng suất hạt 11 2.2. Các phương pháp nghiên cứu tính đa dạng di truyền 11 2.2.1. Thông tin di truyền 11 2.2.2. Phương pháp chiết tách DNA 12 2.2.3. Các marker phân tử dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 13 2.2.3.1. RFLP 13 2.2.3.2. PCR 14 2.2.3.3. SSCP 16 2.2.3.4. Microsatellite 17 2.2.3.5. RAPD 18 2.2.3.6. AFLP 19 2.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 24 2.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước 24 2.3.2. Các nghiên cứu trong nước 24 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Thời gian và địa điểm 25 3.1.1. Thời gian 25 3.1.2. Địa điểm 25 3.2.Vật liệu 25 3.2.1. Các mẫu điều thí nghiệm 25 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 25 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA 25 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lượng DNA 26 3.2.2.3. Hóa chất dùng để chạy RAPD 26 3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả 26 3.2.2.5. Hóa chất dùng để chạy AFLP 26 3.2.2.6. Hóa chất dùng để đọc kết quả AFLP 26 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1. Phương pháp ly trích DNA 27 3.3.1.1. Quy trình ly trích 27 3.3.1.2. Định tính DNA bằng phương pháp điện di 27 3.3.1.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 28 3.3.2. Chạy RAPD 29 3.3.2.1. Primer 29 3.3.2.2. Bố trí thí nghiệm 29 3.3.3. Chạy AFLP 33 3.3.3.1. Cắt thử DNA (300 ng) và chạy kiểm tra trên gel agarose 1,5% 33 3.3.3.2. Chuẩn bị hỗn hợp enzyme 33 3.3.3.3. Thực hiện phản ứng cắt và gắn 33 3.3.3.4. Nhân bản tiền chọn lọc 34 3.3.3.5. Nhân bản chọn lọc 34 3.3.4. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 35 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Thu thập mẫu tại các vùng trồng điều thuộc tỉnh Ninh Thuận 36 4.2. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 36 4.3. Xác định quy trình RAPD – PCR và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận 39 4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình RAPD – PCR của Samal và ctv (2003) 39 4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD - PCR 40 4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố MgCl2, dNTP và primer lên phản ứng RAPD – PCR 40 4.3.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận với primer 11 41 4.3.5. Một vài điểm lưu ý khi thực hiện kỹ thuật RAPD 51 4.4. Kết quả bước đầu của việc sử dụng kỹ thuật AFLP trong nghiên cứu tính đa hình của một số mẫu 51 4.4.1. Kết quả phản ứng cắt và gắn 52 4.4.2. Kết quả khuếch đại tiền chọn lọc 53 4.4.3. Kết quả khuếch đại chọn lọc 53 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 CHƯƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SSR: Simple Sequence Repeat SSCP: Single- Strand Conformation Polymorphism DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine U: Unit bp: base pairs ng: nanogram mM: milimol/litre uM: micromol/litre ul: microlitre dNTP: Deoxyribonucleotide - 5- triphosphate ATP: Adenosine - 5’- triphosphate Ta: Nhiệt độ bắt cặp của primer và DNA trong phản ứng PCR Tm: Nhiệt độ chảy của primer OD: Optical Density BSA: Bovine serum albumine SDS: Sodium dodecyl sulfate CTAB: Cetyltrimethyl ammonium bromide EDTA: Ethylenediaminetetraacetate TE: Tris-HCl, EDTA TAE: Tris-Acetate-EDTA EB: Extraction Buffer (CTAB, NaCl, Tris-HCl, EDTA, 2-mercaptoethanol) MseI-CXX, EcoRI-AX, EcoRI-AXX: X là 1 trong 4 nucleotide (A,T,G,C) NP, NH, NS, BA: huyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn, Bác Ái DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 1 29 Bảng 3.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD–PCR của thí nghiệm 1 30 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 2 30 Bảng 3.4. Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 2 31 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD – PCR của các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 31 Bảng 3.6. Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR của thí nghiệm 3 31 Bảng 3.7. Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản tiền chọn lọc 34 Bảng 3.8. Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản chọn lọc 35 Bảng 4.1. Hệ số đồng dạng di truyền của 7 mẫu đại diện trong kỹ thuật RAPD 45 Bảng 4.2. Kết quả các cặp tổ hợp primer chọn lọc dùng trong AFLP 52 Bảng 4.3. Hệ số đồng dạng di truyền của 4 mẫu điều trong kỹ thuật AFLP 54 DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Cơ chế của phản ứng PCR 16 Hình 2.2. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR 18 Hình 2.3. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI 20 Hình 2.4. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI 20 Hình 2.5. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP 21 Hình 2.6. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP 22 Hình 2.7. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP 23 Hình 4.1. Quy trình ly trích DNA 37 Hình 4.2. Các mẫu DNA ly trích 38 Hình 4.3. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 ở thí nghiệm 2 40 Hình 4.4. Sản phẩm PCR của 6 nghiệm thức khi thực hiện với primer 1 và primer 11 ở thí nghiệm 3 (NT: Nghiệm thức) 40 Hình 4.5. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu được từ huyện Ninh Phước và Ninh Hải 41 Hình 4.6. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu được từ huyện Ninh Hải và Bác Ái 42 Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu được từ huyện Ninh Hải 42 Hình 4.8. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu được từ huyện Ninh Sơn 43 Hình 4.9. Sản phẩm PCR khi thực hiện với primer 11 với các mẫu thu được từ huyện Bác Ái 44 Hình 4.10. Xác định các band dưới dạng peak trong máy Geldoc 44 Hình 4.11. Cây phát sinh chủng loại của 24 mẫu thuộc nhóm điều Việt Nam tại tỉnh Ninh Thuận 46 Hình 4.12. Cây phát sinh chủng loại của 18 mẫu thuộc nhóm điều Ấn Độ tại tỉnh Ninh Thuận 47 Hình 4.13. Cây phát sinh chủng loại của 11 mẫu có tính trạng hạt to và năng suất cao tại tỉnh Ninh Thuận 48 Hình 4.14. Cây phát sinh chủng loại của 47 mẫu điều tại tỉnh Ninh Thuận 49 Hình 4.15. Sản phẩm phản ứng cắt và gắn 52 Hình 4.16. Sản phẩm PCR tiền chọn lọc 53 Hình 4.17. Các band thể hiện dưới dạng peak trong kết quả điện di trên máy giải trình tự DNA 53 Hình 4.18. Cây phát sinh chủng loại của 4 mẫu trong kỹ thuật AFLP 54