Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cây an điền hai hoc hedyotis biflora (l.) họ cà phê (rubiaceae)

Trang nhan đề Lời cảm ơn MỤC LỤC Số trang Lời cảm ơn Lời mở đầu Danh mục các hình ảnh, sơ đồ, bảng biểu Danh mục các chữ viết tắt Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT 02 1.1.1. Mô tả thực vật cây An điền hai hoa 02 1.1.2. Vùng phân bố 02 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1. Hedyotis biflora (L.) Lam 02 1.2.2. Một số cây cùng chi 03 1.2.3. Tác dụng dược tính của một số hợp chất cô lập từ chi Hedyotis 05 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 1.3.1. Hedyotis biflora (L.) Lam 07 1.3.2. Một số cây cùng chi 07 Chương 2: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 2.1. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Thu hái và xử lý mẫu 20 2.1.2. Xác định độ ẩm 20 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 20 2.3. TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY AN ĐIỀN HAI HOA 24 2.3.1. Kết tinh phân đoạn tinh thể khi điều chế cao eter dầu hỏa A 24 của Sơ đồ 2.1 2.3.2. Sắc ký cột trên cao eter dầu hỏa B của Sơ đồ 2.1 24 2.3.3. Sắc ký cột trên cao cloroform của Sơ đồ 2.1 27 2.3.4. Sắc ký cột trên cao acetat etyl B của Sơ đồ 2.1 32 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 32 2.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-ETER11 32 2.4.2. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-ETER2 33 2.4.3. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-ETER3 35 2.4.4. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-CLORO1 37 2.4.5. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-CLORO2 43 2.4.6. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-CLORO3 45 2.4.7. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-CLORO4 47 2.4.8. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-AE2 52 2.4.9. Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất BIFL-AE3 55 Chương 3: KẾT LUẬN Cô lập các hợp chất hữu cơ 62 Các hướng nghiên cứu tiếp theo 66 Chương 4: THỰC NGHIỆM 4. Trích ly, cô lập một số hợp chất hữu cơ 67 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO

pdf42 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 1758 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cây an điền hai hoc hedyotis biflora (l.) họ cà phê (rubiaceae), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
i tiếp tục thực hiện sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này. Phân đoạn 2 (762 mg) được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ eter dầu hỏa đến cloroform. Kết quả thu được 4 phân đoạn, trong đó phân đoạn 2 (lọ 15-18) có khối lượng 110 mg tiếp tục được sắc ký cột, sắc ký điều chế nhiều lần, thu được 4 mg một chất màu vàng, tan trong cloroform, ký hiệu là BIFL-ETER2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER2 được trình bày trong Hình 2.4. Trần Văn Thắng Trang 24 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.2.2. Khảo sát phân đoạn 3 của Bảng 2.2 Khi cô quay thu hồi dung môi của các lọ thuộc phân đoạn 3 của Bảng 2.2, thu được một kết tủa màu trắng. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi cloroform, kết quả thu được một chất có tinh thể hình kim, màu trắng, ký hiệu là BIFL-ETER3. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL- ETER3 được trình bày trong Hình 2.3. Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao eter dầu hỏa B của Sơ đồ 2.1 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (mg) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-109 E E:C (1:1) 800 Vết dài. Không khảo sát 2 110-189 E:C (1:1) 762 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-ETER2 3 190-289 E:C (1:1), C (100%) 420 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-ETER3 4 290-310 C:M (95:5), (9:1), (8:2), (1:1), M 1030 Vết dài. Không khảo sát . Tổng lượng cao thu được: 3,012 g Thu suất: 83,20% Ghi chú: E: eter dầu hỏa C M: metanol : cloroform Trần Văn Thắng Trang 25 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả EB E3 EA E11 Hình 2.3: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất Hình 2.2: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER3 BIFL-ETER11 Dung môi giải ly: cloroform Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) EB: Cao eter dầu hỏa B EA: Cao eter dầu hỏa A E3 : BIFL-ETER3 E11 : BIFL-ETER11 (a) (b) EB E2 EB E2 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hình 2.4: Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-ETER2 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. EB : Cao eter dầu hỏa B E2 : BIFL-ETER2 Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) (a) Không phun xịt dung dịch H2SO4 50%. (b) Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Trần Văn Thắng Trang 26 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.3. Sắc ký cột trên cao cloroform của Sơ đồ 2.1 Cao cloroform (17,49 g) có màu xanh đen. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho 1 vết chính và nhiều vết mờ, vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel. Cao cloroform được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ eter dầu hỏa đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc ký lớp mỏng. Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.3. 2.3.3.1. Khảo sát phân đoạn 1 của Bảng 2.3 Phân đoạn 1 của Bảng 2.3 (5,083g) có một vết chính màu hồng cánh sen và nhiều vết mờ khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.4. Phân đoạn 2 của Bảng 2.4 có sắc ký lớp mỏng cho một vết màu hồng cánh sen. Khi cô quay thu hồi dung môi các lọ thuộc phân đoạn này, thu được một chất kết tủa màu trắng, tan tốt trong dung môi cloroform. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi cloroform, kết quả thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO2. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO2 được trình bày trong Hình 2.5 Phân đoạn 3 của Bảng 2.4 (180 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết trong đó có một vết màu vàng và một vết màu tím. Tiến hành sắc ký cột nhiều lần rồi sắc ký điều chế, kết tinh lại trong cloroform, thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO1 (10 mg). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong Hình 2.6. Phân đoạn 4 của Bảng 2.4 (759 mg) có sắc ký lớp mỏng cho một vết có màu vàng cam. Tiến hành sắc ký cột nhiều lần rồi sắc ký điều chế, kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform:metanol (9:1), thu được một chất có tinh thể hình kim ngắn, Trần Văn Thắng Trang 27 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả màu trắng, ký hiệu là BIFL-CLORO4 (10 mg). Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong Hình 2.7. 2.3.3.2. Khảo sát phân đoạn 3 của Bảng 2.3 Phân đoạn 3 (1,201 gam) của Bảng 2.3 có sắc ký lớp mỏng cho một vết màu tím chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.5. Khi cô quay thu hồi dung môi của các lọ thuộc phân đoạn 4 của Bảng 2.5, thu được một kết tủa màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol và kém tan trong cloroform. Tiến hành gạn lọc nhiều lần, sau đó sắc ký cột, kết tinh lại trong dung môi metanol, kết quả thu được một chất có tinh thể màu trắng, ký hiệu là BIFL- CLORO3. Kết quả sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO3 được trình bày trong Hình 2.8. Bảng 2.3: Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao cloroform của Sơ đồ 2.1 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (g) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-39 E, E:A (8:2) 5,083 Lựa chọn để khảo sát tiếp. 2 40-250 E:A (8:2) 10,410 Vết dài. Không khảo sát 3 251-369 E:A (8:2), E:A (1:1) 1,201 Lựa chọn để khảo sát tiếp. 4 370-460 E:A (1:1) 0,898 Vết dài. Không khảo sát 5 461-500 E:A (1:1), A, M 0,872 Vết dài. Không khảo sát Thu suất: Tổng lượng cao thu được: 15,464 g. 88,42% RGhi chú: E: eter dầu hỏa A M: metanol : aceton Trần Văn Thắng Trang 28 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.4: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 1 của Bảng 2.3 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-9 C 252 Vết dài. Không khảo sát Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO2 2 10-26 C 3118 Có 2 vết chính. Sắc ký điều chế thu được hợp chất 3 27-72 C 180 BIFL-CLORO1 Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO4 4 73-200 C 759 201- 340 C, C:M (9:1), (8:2), (1:1), M 218 Vết dài. Không khảo sát 5 Tổng lượng cao thu được: 4,527 g. Thu suất: 89,06% Bảng 2.5: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 4 của Bảng 2.3 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-6 C, C:M (98:2) 59 Vết dài. Không khảo sát 2 7-83 C:M (98:2) 240 Vết dài. Không khảo sát C:M (98:2), (95:5) 3 84-93 68 Vết dài. Không khảo sát Có 1 vết chính. Thu được hợp chất BIFL-CLORO3 4 94-101 C:M (95:5), (9:1) 432 5 102-217 C:M (9:1), (8:2), (1:1), M 218 Vết dài. Không khảo sát Tổng lượng cao thu được: 1,017 g. Thu suất: 84,68% C M: metanol: cloroformGhi chú: Trần Văn Thắng Trang 29 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả C C2 C C1 Hình 2.5: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất Hình 2.6: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO1 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C1: BIFL-CLORO1 BIFL-CLORO2 Dung môi giải ly: cloroform:aceton (9:1) C: Cao cloroform C2: BIFL-CLORO2 C C3 Hình 2.8: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO3 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C3: BIFL-CLORO3 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hình 2.7: Sắc ký lớp mỏng của hợp chất BIFL-CLORO4 Dung môi giải ly: cloroform:metanol (9:1) C : Cao cloroform C4: BIFL-CLORO4 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. C C4 Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Hiện hình: dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản. Trần Văn Thắng Trang 30 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.6: Kết quả sắc ký cột silica gel cao acetat etyl B của Bảng 2.1. Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-32 C, C:M (95:5), (9:1) 285 Vết dài. Không khảo sát. 2 33-40 C:M (9:1) 121 Vết dài. Không khảo sát. 3 41-51 C:M (9:1) 98 2 vết chính. Khảo sát 4 52-137 C:M (9:1), (8:2) 568 Vết dài. Không khảo sát. 5 138-224 C:M (8:2), (1:1), M 1125 Vết dài. Không khảo sát. Tổng lượng cao thu được: 2,197 g Thu suất: 93,49% Ghi chú: M: metanol C: cloroform Bảng 2.7: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn 3 của Bảng 2.6 Phân Số thứ Dung môi Trọng lượng Nhận xét đoạn tự lọ giải ly cao (mg) (bằng sắc ký lớp mỏng) 1 1-10 C, C:M (95:5) 2 Vết dài. Không khảo sát. 2 11-25 C:M (95:5) 6 Vết dài. Không khảo sát. 3 26-40 C:M (95:5) 8 Vết dài. Không khảo sát. Sắc ký điều chế thu được BIFL-AE2 và BIFL-AE3. 4 41-60 C:M (95:5) 80 Tổng lượng cao thu được: 96 mg. Thu suất: 97,96% Ghi chú: C M: metanol : cloroform Trần Văn Thắng Trang 31 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.3.4. Sắc ký cột trên cao acetat etyl B của Sơ đồ 2.1 Cao acetat etyl B (2,35 g) có màu vàng cam. Kết quả sắc ký lớp mỏng cho một vết chính, vì vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel. Cao acetat etyl C được nạp vào đầu cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc ký lớp mỏng. Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.6. Phân đoạn 3 của Bảng 2.6 (98 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết, trong đó có một vết màu tím và một vết màu đen khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký cột silica gel trên phân đoạn này, giải ly lần lượt bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol. Kết quả sắc ký cột được trình bày trong Bảng 2.7. Phân đoạn 4 của Bảng 2.7 (80 mg) có sắc ký lớp mỏng cho hai vết, trong đó có một vết màu tím và một vết màu đen khi chấm sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng. Do vậy, chúng tôi tiến hành sắc ký điều chế và sắc ký cột nhiều lần trên phân đoạn này, thu được hai hợp chất, ký hiệu là BIFL- AE2 và BIFL-AE3. 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHÂT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-ETER11 Hợp chất BIFL-ETER11 thu được từ cao eter A, có đặc điểm như sau: Tinh thể hình kim màu trắng. ¾ 0¾ Điểm nóng chảy: 145-148 C (Kết tinh trong cloroform). ¾ Sắc ký lớp mỏng, giải ly bằng hệ dung môi cloroform, hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu nâu đỏ, sau chuyển xanh đen, có giá trị Rf = 0,33 (Hình 2.2) 1 HPhổ H – NMR, (CDCl3), (Phụ lục 1), δ ppm: 5,35 (3H, t, J=3 & 2Hz, =C -, H-6, H-6’); 5,15 (1H, dd, J =8,5 & 15Hz, =CH-, H-22); 5,01 ( 1H, dd, J=8,5 & 15Hz, =CH-, H-21); 3,55 (3H, m, -CH-OH, H-3, H-3’). Trần Văn Thắng Trang 32 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Biện luận cấu trúc Kết quả sắc ký lớp mỏng hợp chất BIFL-ETER11 cho một vết màu nâu đỏ khi hiện hình bởi dung dịch acid H2SO4 50% (Hình 2.2) nên đây có thể là một sterol hoặc triterpen. 1 Phổ H–NMR có ba proton tại δ ppm 5,35 (=CH-) và hai proton tại δ ppm 5,15 (dd, =CH-); 5,01 (dd, =CH-) ngoài ra còn một nhóm >CH-OH. Đây là những mũi proton đặc trưng của các hợp chất stigmasterol và β-sitosterol. Như vậy, hợp chất BIFL-ETER11 là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol. Nếu gọi x là số proton hydrogen của stigmasterol và x’ là số proton hydrogen của β-sitosterol thì khảo sát một số diện tích tích phân một số tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H – NMR của hợp chất BIFL-ETER11, nhận thấy như sau: H6 + H6’ = 3 H22 + H23 = 2 H3 + H3’ = 3 Kết quả tính toán cho thấy hợp chất BIFL-ETER11 là hỗn hợp hai hợp chất stigmasterol và β-sitosterol với tỉ lệ 2:1. Stigmasterol β–Sitosterol (BIFL-ETER11) 2.4.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-ETER2 Hợp chất BIFL-ETER2 thu được từ cao eter dầu hỏa B có đặc điểm sau: ¾ Là chất rắn, màu vàng, tinh thể hình kim (Kết tinh trong cloroform). ¾ Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi cloroform:aceton (9:1), hiện hình một vết màu vàng, hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu hồng nhạt, sau đó hóa đỏ cam, có giá trị Rf = 0,33 (Hình 2.3). Trần Văn Thắng Trang 33 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả ¾ Phổ MS-ESI (Phụ lục 2) cho mũi ion phân tử với m/z=314,9 [M+H]+ (ghi nhận ion dương) và m/z=313,0 [M-H]─ (ghi nhận ion âm), phù hợp với công thức phân tử C17H14O6 (M=314). 1¾ Phổ H–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 3), δ ppm: 8,1 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-8); 8,0 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-4); 7,3 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-3); 7,2 (1H, d, J=8,5Hz, =CH-, H-7); 6,5 (1H, s,-O-H); 4,0 (3H, s, -OCH3, H-15); 3,99 (3H, s, -OCH3, H-16); 3,98 (3H, s, -OCH3, H-17). 13C–NMR, (CDCl¾ Phổ 3), (Phụ lục 4), kết hợp với DEPT – NMR 90 và 135 (Phụ lục 5) cho thấy hợp chất BIFL-ETER2 có 17 carbon. Độ dịch chuyển hóa học của các carbon được trình bày trong Bảng 2.8. ¾ Phổ HSQC (Phụ lục 6) và HMBC (Phụ lục 7). Biện luận cấu trúc 1Phổ H–NMR cho thấy có 8 tín hiệu cộng hưởng, trong đó có một mũi đơn tại δ ppm 6,59, theo phổ HSQC thì proton này không tương quan với carbon nào, nên đây là proton của nhóm -OH; bốn mũi đôi, mỗi mũi một proton, tại δ ppm 8,10; 8,07; 7,32; 7,25 đều có cùng J=8,5Hz, theo phổ HSQC thì bốn proton này là của bốn =CH- vòng thơm có mũi cộng hưởng 13C tại δ ppm 116,01; 120,09; 125,01và 125,54, vì vậy có 2 cặp proton vòng thơm ở vị trí orto với nhau. Ngoài ra, phổ 1H–NMR còn có ba mũi đơn, mỗi mũi ba proton tại δ ppm 4,01; 3,99 và 3,98, theo phổ HSQC thì các proton này là của ba nhóm –OCH 133 có mũi cộng hưởng C tại δ ppm 56,32; 61,34 và 62,28. Phổ 13C kết hợp DEPT–NMR cho thấy có 17 carbon, trong đó có hai mũi của carbon tứ cấp tại δ ppm 181,94; 181,75, đây là hai mũi đặc trưng của hai carbon carbonyl trong khung antraquinon. Theo phổ HMBC, proton của nhóm hydoxyl có tương quan với carbon tại δ ppm 120,09; 154,87. Theo phổ HSQC, carbon tam cấp tại δ ppm 120,09 tương quan với proton tại δ ppm 7,32. Ngoài ra, theo phổ HMBC, proton tại δ ppm 8,07; 8,11 lần lượt tương quan với carbon tại δ ppm 181,75; 181,94, điều này đưa đến kết luận có hai cặp =CH- tại vị trí 3, 4 và 7, 8 của khung antraquinon. Mặt khác, theo phổ HSQC, proton tại δ ppm 8,07 tương quan với Trần Văn Thắng Trang 34 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả carbon tại δ ppm 125,53, theo phổ HMBC thì proton này tương quan với carbon tại δ ppm 154,87. Do đó, carbon tại δ ppm 154,87 có gắn nhóm hydroxyl ở vị trí C-2, ba nhóm –OCH3 gắn trên carbon ở vị trí C-1, 5, 6. Khối phổ cho mũi m/z=313,0 [M-H]─ hoặc 314,9 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C17H14O6 (M=314). Vì vậy, cấu trúc của hợp chất BIFL-ETER2 được đề nghị là 1,5,6-trimetoxy- 2-hydroxy-9,10-antraquinon có cấu trúc hóa học như sau. Đây là chất mới, đã được xác định bằng phần mềm Scifinder tại Đại Học Dược Kobe, Nhật Bản ngày 29 tháng 09 năm 2009. 1,5,6-Trimetoxy-2-hydroxy-9,10-antraquinon (BIFL-ETER2) 2.4.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-ETER3 Hợp chất BIFL-ETER3 thu được từ cao eter dầu hỏa B có đặc điểm sau: ¾ Là dạng bột màu trắng, kết tinh trong dung môi cloroform. ¾ Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi cloroform:aceton (9:1), hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu hồng cánh sen có giá trị Rf = 0,50 (Hình 2.4) Trần Văn Thắng Trang 35 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.8 : Số liệu phổ NMR của hợp chất BIFL-ETER2 Hợp chất BIFL-ETER2 (CDCl3) Loại carbon № δ HMBC δH C (ppm, J Hz) (ppm) (1H → 13C) 1 145,96 ≥C-O- 2 154,88 ≥C-O- 7,33 (d, 8,5) 3 120,09 1, 2, 14 ≥CH 8,07 (d, 8,5) 4 125,54 2, 10, 13 ≥CH 5 149,20 ≥C-O- 6 158,83 ≥C-O- 7,26 (d, 8,5) 7 116,01 5, 6, 12 ≥CH 8,11 (d, 8,5) 8 125,01 6, 9, 11 ≥CH 9 >C=O 181,94 10 >C=O 181,76 11 >C= 126,58 12 >C= 128,47 13 >C= 125,32 14 >C= 129,27 15 CH3-O 4,02 (s) 62,28 1 16 CH3-O 3,99 (s) 56,32 6 17 CH3-O 3,99 (s) 61,34 5, 6 C2─OH 6,59 (s) 2, 3 1H–NMR, (CDCl¾ Phổ 3), (Phụ lục 8), δ ppm: 5,27 (1H, t, J=4,0Hz, =CH-, H-12); 3,22 (1H, dd, J=4,5 & 11,0Hz, -CH-OH, H-3); 2,82 (1H, dd, J=4 & 13,5Hz, >CH-, H-18); 1,9-0,7 (các mũi proton loại CH H3, C 2, CH). (Bảng 2.9) 13¾ Phổ C–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 9), kết hợp với DEPT – NMR 90 và 135 (Phụ lục 10) cho thấy BIFL-ETER3 có 30 carbon với các mũi đặc trưng tại δ ppm 183,18 (-COOH); 143,63 (>C=); 122,68 (=CH-); 79,08 (-CH-OH). Độ dịch chuyển hóa học của các carbon được trình bày trong Bảng 2.9. Trần Văn Thắng Trang 36 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Biện luận cấu trúc Dựa vào phổ 1H–NMR cho thấy hợp chất BIFL-ETER3 có một proton của 13carbon olefin, phổ C–NMR, tại δ ppm 183,18 là mũi đặc trưng của carbon nhóm –COOH. Tiếp tục, phổ 13C – NMR cho cặp mũi tại δ ppm 143,63 (>C=); 122,68 (=CH-) và mũi tại δ ppm 79,08 (>CH-OH) là các mũi đặc trưng của các triterpen, acid triterpen có khung sườn ursan và oleanan. Ngoài ra, dựa vào phổ DEPT–NMR 90 & 135, hợp chất BIFL-ETER3 có năm carbon >CH-, mười carbon –CH2- và bảy carbon –CH3, vì vậy, chúng tôi chọn phổ của acid oleanolic [10] để so sánh, kết quả trình bày trong Bảng 2.9. Sau khi đối chiếu các dữ liệu phổ cho thấy có sự trùng khớp giữa hợp chất BIFL-ETER3 với acid oleanolic. Vậy hợp chất BIFL-ETER3 là acid oleanolic. Acid oleanolic (BIFL-ETER3) 2.4.4. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-CLORO1 Hợp chất BIFL-CLORO1 thu được từ cao cloroform có đặc điểm như sau: ¾ Dạng bột màu trắng, kết tinh trong dung môi cloroform. ¾ Sắc ký lớp mỏng, hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy ở 1100C cho một vết có màu xanh hóa đỏ rồi đen với Rf=0,33 trong hệ dung môi cloroform:aceton (8:2). (Hình 2.6) Trần Văn Thắng Trang 37 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.9: So sánh số liệu phổ NMR (CDCl3) của hợp chất BIFL-ETER3 với acid oleanolic [10] Hợp chất BIFL-ETER3 (CDCl3) Acid oleanolic Thứ tự carbon Loại carbon (CDClδH ppm (J, Hz) δ 3) C ppm δppm C 1 -CH2- 1,56 & 0,87 38,47 38,5 a: 1,72 (dd, 4 & 8,5) 2 -CH2- 27,74 28,2 b: 1,60 3 >CH-OH 3,22 (dd, 4,5 & 11) 79,08 79,1 4 >C< 37,14 37,1 0,73 (brs) 5 >CH- 55,29 55,3 6 -CH2- 18,34 18,4 7 -CH2- 32,49 32,5 8 >C< 39,34 39,4 9 >CH- 1,56 47,69 47,7 10 >C< 38,79 38,8 a: 1,98 (dt, 4 & 13,5) 11 -CH2- 23,44 23,5 b: 1,89 (dt, 3,5 & 11) 5,28 (t, 4) 12 =CH- 122,69 122,4 13 =C< 143,64 143,9 14 >C< 41,66 41,7 a: 1,75 (dd, 4,5 & 13) 15 -CH2- 27,23 27,8 b: 1,60 a: 1,89 (dt, 3,5 & 11) 16 -CH2- 22,98 23,2 b: 1,60 17 >C< 46,57 45,9 2,83 (dd, 4 & 13,5) 18 >CH- 41,06 41,4 19 -CH2- 1,62 & 0,98 45,94 45,9 20 >C< 30,69 30,8 1,17 (dd, 2 & 4,5) 21 -CH2- 33,86 33,9 1,09 (dd, 3 & 14) a: 1,78 (dd, 4,5 & 14) 22 -CH2- 32,68 32,8 b: 1,56 0,92 (s) 23 -CH 28,14 28,2 3 0,99 (s) 24 -CH 15,56 15,7 3 1,13 (s) 25 -CH 15,35 15,4 3 0.90 (s) 26 -CH 17,18 16,9 3 27 -CH2- 0,93 (s) 25,96 26,0 28 -COOH 183,19 178,2 0,76 (s) 29 -CH 33,08 33,2 3 0,78 (s) 30 -CH 23,60 23,6 3 Trần Văn Thắng Trang 38 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 1¾ Phổ H–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 11), δ ppm: 5,31 (1H, t, J=3,5Hz, =CH-, H-12); 4,53 (1H, s, -CH-OH, H-6); 3,16 (1H, dd, J=2 & 10Hz, -CH-OH, H-3); 2,82 (1H, dd, J=4 & 14Hz, >CH-, H-18); 2,03-0,7 (các mũi proton loại CH H H3, C 2, C ); 0,74 (1H, s, >CH-, H-5). (Bảng 2.10) 13¾ Phổ C–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 12) kết hợp với phổ DEPT – NMR 90 & 135 (Phụ lục 13) cho thấy hợp chất BIFL-CLORO1 có 30 carbon với các mũi đặc trưng tại δ ppm 183,74 (-COOH); 142,82 (>C=); 122,82 (=CH-); 79,16 (-CH-OH); 68,66 (-CH-OH). Độ dịch chuyển hóa học của các carbon được trình bày trong Bảng 2.10. ¾ Phổ COSY (Phụ lục 14), phổ HSQC (Phụ lục 15), phổ HMBC (Phụ lục 16) (Bảng 2.10) Biện luận cấu trúc 13C–NMR, hợp chất BIFL-CLORO1 có δPhổ C = 183,74 là tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của carbon nhóm –COOH. Ngoài ra, phổ 13C–NMR cho cặp tín hiệu cộng hưởng tại δ ppm 142,82 (>C=); 122,82 (=CH-) và tín hiệu cộng hưởng tại δ ppm 79,16 (>CH-OH) là các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các triterpen, acid triterpen có khung sườn oleanan, ngoài ra, tại δ ppm 68,66 còn có thêm tín hiệu cộng hưởng của carbon loại >CH-OH. Dựa vào phổ DEPT–NMR 90 & 135, hợp chất BIFL-CLORO1 có sáu carbon >CH-, chín carbon –CH2– và bảy carbon –CH3. Các số liệu trên cho thấy BIFL-CLORO1 là một acid oleanolic có một nhóm –CH2– bị biến đổi thành nhóm >CH-OH. Nhóm >CH-OH này có proton và 13C cộng hưởng ở δHx=4,53 ppm và δCx=68,67 ppm. Phổ HMBC cho thấy proton H-5 có tương quan với carbon CX này và phổ COSY cho thấy proton H-5 kề bên HX. Vậy tại C-6 có gắn thêm một nhóm –OH. Xét về cấu hình của các carbon C-3 và C-6. Tín hiệu cộng hưởng của H-3 có dạng mũi đôi-đôi với hằng số ghép J=5,0Hz & 10,0Hz, cho thấy nhóm –OH của C-3 ở vị trí β mà không phải ở vị trí α . Trần Văn Thắng Trang 39 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Nếu -OH ở vị trí α Nếu -OH ở vị trí β Jea = Jee = 2-4 Hz Jaa = 5-10 Hz Jae = 2-4 Hz Tín hiệu cộng hưởng của H-6 là một mũi bầu nhọn. Nếu nhóm –OH tại C-6 ở vị trí xích đạo, thì proton H-6 sẽ bị các proton H-5, H-7a, H-7e chẻ thành các mũi đôi với hằng số ghép lần lượt khoảng Jaa, Jaa và Jae, trong đó Jaa = 5-10Hz. Điều này không phù hợp với mũi H-6 là mũi bầu nhọn. Vậy nhóm –OH tại C-6 ở vị trí trục. Với vị trí này các proton H-5, H-7a, H-7e cũng chẻ proton H-6 thành các mũi đôi, với Jae, Jaa và Jee, trong đó Jee = Jae = 2-4Hz. H-6 với sự chẻ mũi theo lý thuyết là đôi-đôi-đôi với giá trị J nhỏ khoảng 2-4Hz sẽ khiến cho mũi cộng hưởng có dạng bầu nhọn. Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng của H-7e là mũi đôi, với hằng số ghép J=2,0Hz và tín hiệu cộng hưởng của H-7a là mũi đôi-đôi với hằng số ghép J=2,0Hz & 14Hz điều này góp phần xác định nhóm –OH của C-6 ở vị trí β mà không phải ở vị trí α . Nếu -OH ở vị trí α Nếu -OH ở vị trí β Jaa = 5-10 Hz Jea = Jee = 2-4 Hz Jae = 2-4 Hz Sau khi đối chiếu các dữ liệu, chúng tôi đề nghị hợp chất BIFL-CLORO1 là acid 3 , 6β -dihydroxyloleanolic. β Trần Văn Thắng Trang 40 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.10: Số liệu NMR (CDCl3) của hợp chất BIFL-CLORO1 so sánh với acid oleanolic [10] Hợp chất BIFL-CLORO1 (CDCl3) Acid oleanolic Loại HMBC № carbon δH δ COSY C (1H→ ppm (J, Hz) ppm (H→H) 13C) (CDCl3) a: 1,58 (dd, 4 & 7,5) 2a 5, 10 1 -CH - 40,60 38,5 2 b: 0,96 (dd, 5 & 13,5) 2b 5, a: 1,70 (dd, 4 & 13) 1a, 2b 2 -CH - 27,37 28,2 2 b: 1,62 (dd, 6,5 & 12) 1b, 3 3, 10 3,16 (dd, 5 & 10) 3 >CHOH 79,16 2b 4, 23, 24 79,1 4 >C< 39,58 37,1 5 >CH- 0,74 (brs) 55,75 6 4, 6, 10, 23, 24 55,3 4,53 (brs) 6 >CHOH 68,67 5, 7a, 7b 8, 10 18,4 26 a: 1,64 (d, 2) 6, 7b 7 -CH - 40,37 6, 8, 9, 26 32,5 2 b: 1,51 (dd, 2 & 14) 6, 7a 8 >C< 38,43 39,4 8, 14, 10, 26 1,58 (dd, 4 & 7,5) 9 >CH- 47,70 11a, 11b 47,7 10 >C< 36,55 38,8 a: 2,04 (dt, 3 & 7) 9, 11b, 12 9, 12, 13 11 -CH - 25,33 23,5 2 b: 1,94 (dt, 4 & 7,5) 9, 11a, 12 8, 12, 13 5,32 (t, 3,5) 12 -CH= 122,83 11a, 11b 9, 14 122,4 13 =C< 142,83 143,9 14 >C< 42,29 41,7 a: 1,72 (dd, 4,5 & 10,5) 15b, 16a, 16b 27 15 -CH - 27,65 27,8 2 b: 1,58 (dd, 4 & 7,5) 15a, 16a 8, 13, 17 a: 2,00 (dd, 4 & 16,5) 16 -CH - 23,08 15a, 15b, 16b 45,9 2 Trần Văn Thắng Trang 41 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả b: 1,58 (dd, 4 & 7,5) 15b, 16b 17 17 >C< 46,54 45,9 12, 13, 14, 17 2,84 (dd, 4 & 14) 18 >CH- 40,96 19a, 19b 41,4 18, 20, 29, 30 a: 1,64 (dd, 2 & 7,5) 18, 19b 19 -CH - 45,97 45,9 2 b: 1,15 (dd, 2 & 4,5) 18, 19a 17, 21 20 >C< 30,68 30,8 a: 1,36 (dd, 4 & 14) 21b, 22a, 22b 30 21 -CH - 33,90 33,9 2 b: 1,23 (d, 15) 21a, 22a, 22b 27 16, 17, 21, 30 a: 1,75 (dd, 4 & 13,5) 21a, 21b, 22b 22 -CH - 32,31 32,8 2 b: 1,58 (dd, 4 & 7,5) 21a, 21b, 22a 18 1,07 (s) 23 -CH 27,95 5, 24 28,2 3 1,18 (s) 24 -CH 17,09 4, 5, 23 15,7 3 25 -CH3 1,30 (s) 16,99 1, 5, 9, 10 15,4 1,07 (s) 26 -CH 18,28 9 16,9 3 27 -CH3 1,10 (s) 25,99 8, 13, 14, 15 26,0 28 -COOH 183,75 178,0 29 -CH3 0,90 (s) 33,07 19, 21, 30 33,2 30 -CH3 0,92 (s) 23,57 19, 20, 29 23,6 Acid 3β , 6β -dihydroxyloleanolic (BIFL-CLORO1) Trần Văn Thắng Trang 42 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 2.4.5. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-CLORO2 Hợp chất BIFL-CLORO2 thu được từ phân đoạn 2 của bảng 2.4 (cao cloroform) có đặc điểm như sau: ¾ Là dạng bột màu trắng, kết tinh trong dung môi cloroform. ¾ Nhiệt độ nóng chảy: 286oC. ¾ Sắc ký lớp mỏmg giải ly bằng hệ dung môi cloroform:aceton (9:1), hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 50%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu hồng cánh sen có giá trị Rf = 0,50 (Hình 2.5) 1¾ Phổ H–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 17), δ ppm: 5,14 (1H, s, H-12); 3,1 (1H, t, -CH-OH, H-3); 2,1 (1H, d, J=10,5Hz, >CH-, H-18); 1,9-0,7 (các mũi proton loại CH H H3, C 2, C ). (Bảng 2.11) 13¾ Phổ C–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 18), kết hợp với DEPT – NMR 90 và 135 (Phụ lục 19) cho thấy BIFL-CLORO2 có 30 carbon với các mũi đặc trưng tại δ ppm 180,44 (-COOH); 138,17 (>C=); 125,55 (=CH-); 78,87 (-CH-OH). Độ dịch chuyển hóa học của các carbon được trình bày trong Bảng 2.11. ¾ Phổ COSY (Phụ lục 19), HSQC (Phụ lục 20), HMBC (Phụ lục 21) Biện luận cấu trúc 13Dựa vào phổ C–NMR cho thấy hợp chất BIFL-CLORO2 có mũi đặc trưng của carbon carboxyl –COOH. Ngoài ra, phổ 13C–NMR cho cặp mũi tại δ ppm 138,17 (>C=); 125,55 (=CH-) và mũi tại δ ppm 78,87 (>CH-OH) là các mũi đặc trưng của các triterpen, acid triterpen có khung sườn ursan. Ngoài ra, dựa vào phổ DEPT–NMR 90 & 135, hợp chất BIFL-CLORO2 có bảy carbon >CH-, chín carbon –CH2- và bảy carbon –CH3. Vì vậy, chúng tôi chọn phổ của acid ursolic để so sánh. Kết quả trình bày trong Bảng 2.11. Sau khi đối chiếu các dữ liệu phổ cho thấy có sự trùng khớp giữa hợp chất BIFL-CLORO2 với acid ursolic. Vậy hợp chất BIFL-CLORO2 là acid ursolic. Trần Văn Thắng Trang 43 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.11: Số liệu NMR (CDCl3 +CD3OD) của hợp chất BIFL-CLORO2 với acid ursolic [10] Hợp chất BIFL-CLORO2 Acid ursolic Loại carbon № δ δδ CH C ppm ppm (J, Hz) ppm 1 -CH2- 38,64 38,8 2 -CH2- 26,91 27,3 3,12 (t, 8,5) 3 >CH-OH 78,88 78,8 4 >C< 39,07 38,8 5 >CH- 0,64 (d, 11,5) 55,31 55,4 6 -CH2- 18,28 18,4 7 -CH2- 33,06 33,0 8 >C< 39,53 39,6 9 >CH- 47,81 47,5 10 >C< 36,95 37,0 1,85 (dd, 3,5 & 8,5) 11 -CH2- 23,24 23,3 5,18 (t, 3,5) 12 =C< 125,55 125,5 13 =CH- 138,17 138,0 14 >C< 42,08 42,0 1,82 (dd, 4,5 & 14) 15 -CH2- 27,98 28,2 1,93 (dt, 3 & 13,5) 16 -CH2- 24,19 24,3 17 >C< 47,61 48,1 2,14 (d, 11,5) 18 >CH- 52,86 52,8 19 >CH- 38,87 39,1 20 >CH- 38,70 38,8 21 -CH2- 30,63 30,7 22 -CH2- 36,75 36,7 0,89 (s) 23 -CH 28,03 28,2 3 0,83 (s) 24 -CH 15,28 15,5 3 0,68 (s) 25 -CH 15,43 15,7 3 0,72 (s) 26 -CH 16,86 16,9 3 0,95 (s) 27 -CH 23,42 23,6 3 28 -COOH 180,45 178,7 0,86 (d, 5,5) 29 -CH 16,83 16,9 3 0,77 (d, 5,5) 30 -CH 20,93 21,2 3 Trần Văn Thắng Trang 44 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Acid ursolic (BIFL-COLRO2) 2.4.6. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-CLORO3 Hợp chất BIFL-CLORO3 thu được từ phân đoạn cao 4 bảng 2.5 (cao cloroform) có một số đặc điểm sau: ¾ Tinh thể hình kim, màu trắng. 0¾ Nhiệt độ nóng chảy 192-193 C (kết tinh trong hỗn hợp dung môi cloroform:metanol (1:1)). ¾ Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất có Rf = 0,33 với hệ dung môi: cloroform:metanol (9:1), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50% cho một vết tím sau chuyển thành màu xám đậm. (Hình 2.8) 1H–NMR (pyridin-d¾ Phổ 5) (Phụ lục 22), δ ppm: 5,33 (1H, br, >C=CH-); 4,25 (1H, d, J=11,5Hz); 4,11 (1H, dd, J=5,5 & 11,5Hz); 4,05 (1H, t, J=9Hz); 3,93 (1H, t, J=8,5Hz); 3,80 (3H, t, J=7,5Hz); 2,62 (1H, d, J=11,5Hz); 2,43 (1H, t, J=11Hz); 2,09-0,62 (các mũi proton loại CH3, CH2, CH). (Bảng 2.12) 13¾ Phổ C–NMR (pyridin-d5) (Phụ lục 23) kết hợp với phổ DEPT–NMR 90 và 135 (Phụ lục 24), cho thấy hợp chất BIFL-CLORO3 có 35 carbon, trong đó có ba carbon tứ cấp (một carbon loại >C= tại δ ppm 140,92); 13 carbon tam cấp (một carbon loại =CH- tại δ ppm 121,53); 12 carbon loại –CH2– (một carbon loại –CH2– OH tại δ ppm 62,10) và 6 carbon –CH3. (Bảng 2.12) ¾ Phổ COSY (Phụ lục 25), phổ HSQC (Phụ lục 26) và phổ HMBC (Phụ lục 27) Trần Văn Thắng Trang 45 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.12: Số liệu NMR (pyridin-d5 ) của hợp chất BIFL-CLORO3 với các chất β-sitosterol[22] và D-glucose[25] BIFL-CLORO3 Chất Thứ tự carbon Loại carbon δ δH C β-Sitosterol ppm (J, Hz) ppm 1 -CH - 1,73 (d, 11,0) & 0,99 37,24 37,1 2 a: 2,09 (d, 5,5) 29,75 31,5 2 -CH - 2 b: 1,73 (d, 11,0) 3,79 (t, 7,5) 3 >CH-O- 78,77 71,5 a: 2,63 (dd, 2,5 & 13,0) 38,92 42,1 4 -CH - 2 b: 2,43 (t, 12,5) 5 =C< 140,92 140,1 5,33 (d, 2,0) 6 =CH- 121,53 121,1 a: 1,87 (d, 2,5) 31,85 31,8 7 -CH - 2 b: 1,35 (d, 6,5) 8 >CH- 1,48 31,89 31,8 0,84 (t, 7,5) 9 >CH- 50,25 50,1 10 >C< 36,65 36,3 11 -CH2- 1,39 & 1,04 21,00 21,0 a: 1,93 (t, 12,5) 39,79 39,6 12 -CH2- b: 1,08 (t, 9,5) 13 >C< 42,28 42,1 0,94 (d, 7,0) 14 >CH- 56,72 56,5 15 -CH2- 1,56 & 1,04 24,15 24,2 16 -CH2- 1,79 & 1,25 28,08 28,1 1,08 (t, 9,5) 17 >CH- 56,18 55,8 0,62 (s) 18 -CH3 11,67 11,2 0,91 (s) 19 -CH3 19,56 19,3 20 >CH- 1,35 35,93 36,0 21 -CH2- 1,35 & 1,04 34,05 33,8 1,19 (m) 22 -CH2- 26,50 26,0 0,94 (d, 7,0) 23 >CH- 45,96 45,6 0,94 (d, 7,0) 24 -CH3 18,74 18,7 1,60 (sept, 7,0) 25 >CH- 29,48 29,0 0.82 (d, 7,0) 26 -CH3 19,06 19,0 0.82 (d, 7,0) 27 -CH3 18,99 19,7 1,25 & 1,19 (m) 28 -CH2- 23,26 23,0 0,85 (d, 7,5) 29 -CH3 11,82 11,9 D-glucose 4,81 (d, 7,5) 1’ -O-CH-O- 101,87 104,0 3,79 (t, 7,5) 2’ >CH-OH 74,39 74,1 4,04 (t, 9,0) 3’ >CH-OH 77,43 76,8 3,92 (t, 9,5) 4’ >CH-OH 71,05 70,6 3,74 (m) 5’ >CH-OH 77,18 76,8 a: 4,25 (dd, 2,5 & 12,0) 62,10 61,8 6’ -CH -OH 2 b: 4,10 (dd, 5,5 & 12,0) Trần Văn Thắng Trang 46 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Biện luận cấu trúc 1 13H – NMR kết hợp với phổ Phổ C – NMR và DEPT – NMR cho thấy các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của H-1’, H-6, C-1’, C-5, C-6 của hợp chất β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid nên chọn phổ của hợp chất β-sitosterol và D-glucose để so sánh và đối chiếu. Kết quả được trình bày trong Bảng 2.13 cho thấy có sự trùng khớp. Vậy hợp chất BIFL-CLORO3 là hợp chất β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid có cấu trúc hóa học như sau: β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (BIFL-CLORO3) 2.4.7. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-CLORO4 Hợp chất BIFL-CLORO4 thu được từ phân đoạn 4 bảng 2.4 (cao cloroform) có đặc điểm như sau: ¾ Tinh thể hình kim chụm lại như nở hoa, màu trắng. ¾ Kết tinh trong hệ dung môi CHCl3:MeOH (9:1). ¾ Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất có Rf = 0,33 với hệ dung môi: cloroform:metanol (9:1), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50% cho một vết vàng cam sau chuyển thành màu cam đậm. (Hình 2.7). ¾ Phổ MS (Phụ lục 28), cho mũi ion phân tử ở m/z=448,4 [M]+, tương ứng với công thức phân tử C29H52O3 (M = 448) 1¾ Phổ H–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 29), δ ppm: 4,04 (1H, m, -CH-OH, H-3); 3,47 (1H, brs, -CH-OH, H-6); 2,05 – 0,70 (các mũi proton loại >CH-, -CH2-, - CH3). (Bảng 2.13) Trần Văn Thắng Trang 47 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 13¾ Phổ C-NMR, (CDCl3), (Phụ lục 30) kết hợp với DEPT 90 & 135–NMR, (CDCl3), (Phụ lục 31) cho thấy hợp chất có 29 carbon bao gồm 3 carbon tứ cấp (75,50; 42,66; 38,10), trong đó có một carbon gắn nhóm –OH; 9 carbon tam cấp (75,78; 67,27; 56,13; 55,93 45,78; 45,56; 36,09; 30,21; 29,11), trong đó có 2 carbon mang nhóm –OH; 11 carbon -CH2- và 6 carbon –CH3. (Bảng 2.13) ¾ Phổ COSY (Phụ lục 32), HSQC (Phụ lục 33), HMBC, (CDCl3), (Phụ lục 34) Biện luận phổ 1 Phổ H-NMR có 2 tín hiệu cộng hưởng tại δH # 5 ppm, mỗi tín hiệu có dạng mũi đôi-đôi đặc trưng của proton olefin tại C22-C23 của stigmasterol, tuy nhiên tích phân của hai proton nầy chỉ có 0,2 so với tín hiệu tại δ = 4,03 (tích phân là 1) và δH H = 3,47 (tích phân là 1). Cũng tương tự, trên phổ 13C-NMR có nhiều tín hiệu cộng hưởng nhưng phân thành hai loại cường độ, có những tín hiệu với cường độ nhỏ, cao khoảng 1 cm và có những tín hiệu cao từ 2-4 cm (nghĩa là có cường độ từ gấp đôi đến gấp bốn). Từ các quan sát nầy, hợp chất BIFL-CLORO4 chưa tinh chất hoàn toàn mà có lẫn một sterol khác, vì vậy trong phần biện luận nầy, chỉ chọn những tín hiệu có cường độ mạnh để khảo sát. 13Phổ C kết hợp với DEPT-NMR cho thấy hợp chất BIFL-CLORO4 có 29 tín hiệu cường độ mạnh, tập trung ở vùng từ trường cao từ 75,77 -11,80 ppm. Hợp chất BIFL-CLORO4 có các loại carbon và độ dịch chuyển hóa học tương hợp với các số liệu của hợp chất β-sitosterol[33] nhưng khác là không có chứa nối đôi C5=C6, bù lại, nếu β-sitosterol chỉ có một carbon carbinol tại C-3 thì BIFL-CLORO4 có đến 3 carbon carbinol tại: δ = 75,77 ppm (loại CH-OH), δC C = 75,49 ppm (loại C OH ) và δC = 67,27 ppm (loại CH-OH). Phổ HSQC cho thấy tín hiệu cộng hưởng δC 75,77 tương ứng với proton với δ = 3,47 (1H, mũi bầu nhọn) và tín hiệu cộng hưởng δH C 67,27 tương ứng với proton với δ = 4,02 (1H, mũi đa). Phân tích tín hiệu mũi đa ở δH H = 4,02, thấy đó là mũi đôi-đôi-đôi-đôi (J=11,0 và 5,5 Hz), phù hợp với trường hợp nhóm -CH-OH tại Trần Văn Thắng Trang 48 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả C-3, là vị trí hầu như luôn luôn gặp trong hợp chất sterol. Hằng số ghép lớn nên nhóm -OH phải ở vị trí xích đạo β. Nếu -OH (tại C-3) ở vị trí α Nếu -OH (tại C-3) ở vị trí β Jea = Jee = 2-4Hz Jaa = 5-10 Hz Jae = 2-4 Hz Trong β-sitosterol, C-3 có độ dịch chuyển hóa học δC 71,7 còn trong hợp chất BIFL-CLORO4 C-3 có độ dịch chuyển hóa học lệch về vùng từ trường cao hơn là δC 67,27 ppm, điều nầy cho phép suy đoán rằng proton H-3 đã bị che chắn bởi sự hiện diện của một hoặc những nhóm có mang nhiều đôi điện tử tự do ở các carbon gần kề bên C-3. Nhờ sự hiện diện thêm một carbon carbinol tứ cấp (δCx 75,49; loại C OH ), một carbon carbinol tam cấp [δCy 75,77 với δHy 3,47 (1H, mũi bầu nhọn)] và phổ HMBC lại cho thấy Hy có tương quan với Cx nên có thể cho rằng nối đôi tại C5=C6 trong β-sitosterol đã được hydroxyl hóa để thành một glycol. Vậy, δC5 là 75,50 ppm; δC6 là 75,78 ppm và δH6 là 3,48 (1H, mũi bầu nhọn) Tương quan HMBC Hình trình bày bên dưới cho thấy H-6 phải ở vị trí xích đạo (nghĩa là C6-OH ở vị trí trục) mới thoả điều kiện tín hiệu cộng hưởng của H-6 là mũi bầu nhọn, do chỉ có các hằng số ghép là Jea và Jee # 2-4 Hz. Trần Văn Thắng Trang 49 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.13: Số liệu NMR (CDCl3 + CD3OD) của hợp chất BIFL-CLORO4 với β-Sitosterol [34] Hợp chất BIFL-CLORO4 (CDCl3 + CD3OD) β- Sitosterol Loại carbon HMBC № δ COSY δH C (1H→ (CDCl ) ppm (J, Hz) ppm (H→H) 313C) 3, 2, 5, 10, 18 a: 1,55 (dd, 4,5 & 10) 1b, 2a 37,2 1 -CH - 32,23 2 b: 1,37 (dd, 2 & 11,5) 1a, 2a 3, 5, 10, 18 a: 1,83 (dd, 3 & 6) 1a, 1b, 2b 2, 10 2 -CH - 30,41 31,6 2 b: 1,51 (dd, 4,5 & 10,5) 1b, 2a 1 4,03 (sept, 5,5) 3 >CHOH 67,27 2a, 4a, 4b 71,7 a: 2,03 (d, 12) 3, 4b 3 4 -CH - 40,06 42,2 2 b: 1,51 (dd, 4,5 & 10,5) 3, 4a 1 5 >COH 75,50 140,4 3,48 (brs) 6 >CHOH 75,78 7a, 7b 5, 8, 10 121,1 a: 1,65 (dd, 3 & 7) 6, 7b 8, 9 7 -CH - 34,11 31,9 2 b: 1,58 (d, 2) 6, 7a 9 1,72 (dt, 3,5 & 12,5) 8 >CH- 30,21 7b, 9 31,9 1,26 (dd, 5,5 &11) 5, 11, 12, 18 45,56 8, 11a 50,1 9 >CH- 10 >C< 38,10 36,5 a: 1,37 (dd, 2 & 11,5) 11b, 12a 9, 12 11 -CH - 21,08 21,0 2 b: 1,02 (d, 7) 11a, 12b 12 11, 14, 17 a: 2,00 (d, 13) 11a, 12b 39,8 12 -CH - 39,94 2 b: 1,14 (d, 9,5) 13, 17, 19 12a 13 >C< 42,66 42,3 Trần Văn Thắng Trang 50 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 1,09 (dd, 4,5 & 9,5) 14 >CH- 56,13 8, 15 56,1 a: 1,58 (d, 2) 14, 15b, 16a 13 15 -CH - 24,03 24,3 2 b: 1,09 (dd, 4,5 & 9,5) 15a, 16b 8, 17 a: 1,83 (dd, 3 & 6) 15a, 16b 13 16 -CH - 28,15 28,2 2 b: 1,23 (dd, 7 & 14) 15b, 17 19 1,09 (dd, 4,5 & 9,5) 17 >CH- 55,93 15a, 16b 15 56,0 18 -CH3 1,16 (s) 12,01 1, 5, 9, 10, 11 11,6 19 -CH3 0,70 (s) 16,55 12, 13, 17 19,0 1,34 (m) 20 >CH- 36,09 21a, 21b, 24 22 36,1 17, 20, 22 0,92 (d, 6,5) 21 -CH 18,61 20 18,8 3 a: 1,32 (dt, 3,5 & 12) 20, 22b, 23 17 22 -CH - 33,86 33,8 2 b: 1,02 (d, 7) 20, 22a, 23 17, 20 23 -CH - 1,64 (t, 8) 26,11 22a, 22b, 24 25, 28 26,1 2 24 >CH- 0,92 (m) 45,78 23 20, 22, 29 45,8 1,65 (m) 25 >CH- 29,11 26, 27 26, 28 29,1 0,83 (d, 3,5) 26 -CH 19,66 25 23, 25 19,6 3 0,81 (d, 2) 27 -CH 18,91 25 23, 26 19,0 3 28 -CH - 1,26 (m) 22,99 29 23, 25 23,0 2 0,85 (d, 1,5) 29 -CH 11,83 28 23, 28 11,9 3 Nếu -OH (tại C-6) ở vị trí α Nếu -OH (tại C-6) ở vị trí β Jaa = 5-10 Hz Jea = Jee = 2-4 Hz Jae = 2-4 Hz Trần Văn Thắng Trang 51 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Vậy cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-CLORO4 là stigmasta-3β,5α,6β- triol, với công thức phân tử C29H52O (M = 448), thỏa với phổ MS cho mũi ion phân 3 tử với m/z = 448,4 [M]+ và mũi ion căn bản với m/z = 413,4 [M – 2H2O + H]+ Stigmast-3β,5α,6β-triol (BIFL-CLORO4) 2.4.8. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-AE2 Hợp chất BIFL-AE2 thu được từ phân đoạn cao acetat etyl C có đặc điểm như sau: ¾ Dạng dầu, không màu, tan trong dung môi metanol. ¾ Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất có Rf = 0,3 trong hệ dung môi cloroform:metanol (85:15), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50% cho một vết vàng sau chuyển thành màu đen. ¾ Phổ MS (Phụ lục 36), cho mũi m/z = 438,7 [M+Na+H]+, phù hợp với công thức phân tử C16H30O12 (M = 414). 1¾ Phổ H–NMR, (MeOD), (Phụ lục 37), δ ppm: 5,30 (1H, brs, >CH-OH, H- 1”); 4,84 (1H, d, J=3,5Hz, >CH-OH, H-1’); 4,48 (1H, dd, J=1 & 5,5Hz, -CH2-OH, H-5”); 4,09 (1H, dd, J=1 & 7Hz, -CH2-O-, H-3a); 3,90 (1H, t, J=1,5Hz, >CH-OH, H-3’); 3,86 – 3,5 (các mũi proton loại CH H2, C ) và 1,27 (3H, t, J=7Hz, H-3’”). (Bảng 2.14) 13¾ Phổ C–NMR , (MeOD), (Phụ lục 38) kết hợp với phổ DEPT–NMR 90 & 135 (Phụ lục 39) cho thấy hợp chất BIFL-AE2 có 16 carbon với 10 carbon loại >CH-O- (tại δ ppm 103,78; 100,15; 78,16; 74,94; 73,21; 72,68; 72,32; 71,59; 71,12; Trần Văn Thắng Trang 52 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 70,26); 5 carbon loại -CH2-O- (tại δ ppm 73,8; 66,46; 64,52; 64,46; 62,77) và 1 nhóm –CH3 tại δ ppm 15,26. (Bảng 2.14) ¾ Phổ COSY (Phụ lục 40), phổ HSQC (Phụ lục 41) và HMBC, (MeOD), (Phụ lục 42). Biện luận cấu trúc 13 Phổ C kết hợp với phổ DEPT–NMR cho thấy có 16 carbon, trong đó có xuất hiện hai mũi đặc trưng của carbon anomer của glycosid tại δ ppm 103,78 và 100,15 (-O-CH-O-), đồng thời còn 8 mũi của carbon loại >CH-O- và 5 mũi của carbon loại -CH2-O-, cho thấy hợp chất BIFL-AE2 có hai phân tử đường và một dây carbon đơn giản. Phổ HSQC cho thấy carbon tại δC 103,78 tương quan với proton tại δH 5,30, phổ HMBC cho thấy proton tại δ 5,30 ppm có tương quan với carbon –CHH 2-O- tại δ ppm 66,46 và hai carbon loại –CH-OH tại δC 78,16 và 74,95 ppm. Tiếp theo, phổ COSYGP cho thấy proton tại δH 5,30 ppm tương quan mạnh với proton tại δH 3,39 ppm và proton này có tương quan với carbon tại δC 72,69 trên phổ HSQC, do đó có thể nhận định carbon tại δ ppm 66,46 liên kết với oxygen của carbon anomer và ở ngoài vòng glycosid. Trên phổ HMBC, tín hiệu proton của carbon tại δC 66,46 ppm là δ 4,08 ppm có tương quan với δH C 73,21 ppm là tín hiệu cộng hưởng của carbon tam cấp có dạng >CH-O-. Ngoài ra, trên phổ HSQC, carbon tại δC 73,21 ppm có tương quan với proton tại δH 3,50 ppm, đồng thời proton này có tương quan với carbon anomer của glycosid thứ hai tại δ 100,15 ppm và carbon dạng –CH – tại δC 2 C 73,86 ppm. Phổ HMBC còn cho thấy tương quan của carbon tại δC 73,86 ppm với proton tại δH 3,54 ppm là tín hiệu cộng hưởng của proton của carbon loại –CH2–O– tại δ 64,46 ppm và carbon này có tương quan với proton của nhóm metyl tại δC H 1,26 ppm. Do đó, carbon tại δC 73,21 ppm thì liên kết với oxygen của carbon anomer trong phân tử glycosid thứ hai và carbon tại δC 73,86 ppm thì liên kết với oxygen của nhóm etoxy. Trần Văn Thắng Trang 53 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Trên phổ HMBC, proton tại δH 4,84 ppm có tương quan với carbon loại –CH2- tại δC 64,52 ppm, do đó glycosid thứ hai là L-arabinose. Tín hiệu cộng hưởng của H-2’ trong phân tử đường L-arabinose có dạng đôi-đôi với hằng số ghép J = 3,5 & 5,0 Hz cho thấy nhóm –OH tại carbon anomer ở vị trí α mà không ở vị trí β. C1’ –OH ở vị trí α C1’ –OH ở vị trí β Jaa = 5-10 Hz Jaa = 5-10 Hz Jae = 2-4 Hz Kết hợp các số liệu phổ NMR, đề nghị hợp chất BIFL-AE2 là hợp chất 1-Etoxy-2α-L-arabinopyranosyl-3α-D-glucopyranosylpropan. Kết quả này phù hợp với phổ mass với m/z = 438,7 [M+Na+H]+, phù hợp với công thức phân tử C16H30O12 (M = 414). Đây là chất mới, đã được xác định bằng phần mềm Scifinder tại Đại Học Dược Kobe, Nhật Bản ngày 29 tháng 09 năm 2009. Trần Văn Thắng Trang 54 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 1-Etoxy-2α-L-arabinopyranosyl-3α-D-glucopyranosylpropan (BIFL-AE2) 2.4.9. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất BIFL-AE3 Hợp chất BIFL-AE3 thu được từ phân đoạn cao acetat etyl B có đặc điểm như sau: ¾ Tinh thể mịn, màu trắng, tan trong dung môi MeOH. ¾ Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất có Rf = 0,3 trong hệ dung môi cloroform:metanol (75:25), hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50% cho một vết màu đen. ¾ Phổ MS-ESI (A) (Phụ lục 44a), cho mũi m/z = 495,3 và sau khi đã giải phổ NMR, đề nghị phòng phân tích cấu trúc ghi phổ lại với yêu cầu giảm cường độ eV bắn phá ion, đã cho phổ sau. ¾ Phổ MS-ESI (B) (Phụ lục 44b), cho mũi ion giả phân tử với m/z = 751,8 [M+Na+H]+, tương ứng với công thức phân tử C41H77O9N (M = 727). 1¾ Phổ H–NMR, (CD3OD), (Phụ lục 45), δ ppm: 5,79 (1H, dt, J=6,5 & 15Hz, - CH=, H-5); 5,54 (1H, dd, J=7 & 15,5Hz, -CH=, H-4); 5,46 (1H, t, J=5Hz, -CH=, H-8); 5,39 (1H, t, J=4,5Hz, -CH=, H-9); 4,30 (1H, d, J=8Hz, -O-CH-O-, H-1”) và các tín hiệu cộng hưởng của proton khác được trình bày trong Bảng 2.15. 13¾ Phổ C–NMR , (CD3OD), (Phụ lục 46) kết hợp với phổ DEPT–NMR (Phụ lục 47) cho thấy hợp chất BIFL-AE3 có 41 carbon với 1 carbon tứ cấp loại >C=O tại δ ppm 177,23; 4 carbon sp2 (tại δ ppm 134,37; 131,39; 130,66; 129,96); 1 carbon anomer của glycosid tại δ ppm 104,72; 6 carbon tam cấp liên kết với oxygen (tại δ ppm 77,99; 77,95; 75,01; 73,10; 72,88; 71,61); 2 carbon nhị cấp liên kết với oxygen Trần Văn Thắng Trang 55 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.14: Số liệu NMR (CD3OD) của hợp chất BIFL-AE2 so với phổ mô phỏng O -CH O O CH O - Hợp chất BIFL-AE2 (CD3OD) Phổ mô phỏng HMBC № δ COSY Loại carbon δH C ppm (J, Hz) ppm (H→H) (1 δH→ C 13 ppm C) 64,4 1 -CH -O- 3,68 (dd, 1,0 & 7,0) 73,86 2 2 2 >CH-O- 3,50 (brs) 73,21 1, 1’ 79,0 a: 4,09 (dd, 1,0 & 7,0) 3 3b 68,8 -CH -O- 66,46 2, 1” 2 b: 3,68 (dd, 1,0 & 7,0) 3a 1’ 4,84 100,16 2’, 5’ 112,0 73,8 3,82 (dd, 3,0 & 6,0) 2’ >CHOH 72,32 1’, 3’ 1’, 3’ 77,2 3,90 (dd, 1,5 & 2,5) 3’ >CHOH 71,12 4’ 4’ 70,5 3,77 (dd, 3,5 & 5,0) 4’ >CHOH 70,26 3’ 2’ a: 3,82 (dd, 3,0 & 6,0) -O- -CH 5’b; 4’ 2’, 3’ 2 66,5 5’ 64,52 b: 3,54 (dd, 1,0 & 4,0) 5’a 4’ 112,3 5,30 (s) 1” 103,78 2” 3, 3”, 5” 73,8 3,39 (brs) 2” >CHOH 72,69 1” 5” 76,8 4,48 (dd, 1,0 & 5,5) 3” >CHOH 78,16 1”, 5” 71,5 3,77 (dd, 3,5 & 5,0) 4” >CHOH 71,59 3” 5” >CH-O- 3,63 (brs) 74,95 6” 1”, 3” 81,5 a: 3,73 (dd, 1,5 & 6,0) 62,2 6” -CH OH 62,77 5” 5” 2 b: 3,60 (dd, 1,0 & 5,0) a: 3,82 (dd, 3,0 & 6,0) 1’”b; 2”’ 66,9 1’” -CH -O- 64,46 1, 2’” 2 b: 3,54 (dd, 1,0 & 4,0) 1’”a; 2”’ 15,2 1,26 (t, 4,0) 2’” -CH 15,26 1’”a; 1’”b 1’” 3 Trần Văn Thắng Trang 56 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả (tại δ ppm 69,74; 62,71); 1 carbon tam cấp gắn với nitrogen tại δ ppm 54,66 và các carbon -CH2-, -CH3 tại δ ppm từ 35,87 – 14,43. (Bảng 2.15) ¾ Phổ COSY (Phụ lục 48), phổ HSQC (Phụ luc 49) và phổ HMBC , (CD3OD), (Phụ luc 50). Biện luận cấu trúc Phổ HSQC cho thấy carbon anomer của glycosid có tương quan với proton tại δ ppm 4,30 và trên phổ COSY, proton này có tương quan với proton tại δH H ppm 3,23 (có tương quan với carbon tại δ ppm 75,01 trên phổ HSQC). Trên phổ HMBC, proton tại δ ppm 4,30 có tương quan với carbon tại δC ppm 69,74 và 77,99. Do đó, nhận định carbon tại δ ppm 69,74 liên kết với oxygen của carbon anomer. C Tiếp theo, phổ HSQC cho thấy carbon tại δ ppm 69,74 có tương quan với 2 proton tại δ ppm 4,14 và 3,76. Phổ COSY cho thấy proton tại δ ppm 4,14 và 3,76 có tương quan với proton tại δ ppm 4,02 và trên phổ HSQC, proton này có tương quan với carbon tại δ ppm 54,66. Đồng thời trên phổ COSY, proton tại δ ppm 4,02 có tương quan với proton tại δ ppm 4,17, proton này lại tương quan với proton tại δ ppm 5,54 (có tương quan với carbon sp2 tại δ ppm 131,39 trên phổ HSQC). Dựa vào phổ HSQC, HMBC, COSY chúng tôi thấy có một nhánh dây carbon dài bắt đầu từ carbon tại δ ppm 54,66 với một carbon gắn nhóm –OH cùng 4 carbon olefin gồm một nối đôi cấu hình trans- (có J=15,5Hz) và một cấu hình cis- (có J=5Hz) xen kẽ bởi 2 carbon loại –CH2– và kết thúc tại carbon có δ ppm 14,43. 13Phổ C-NMR cho thấy có một carbon cacbonyl tại δC 177,23 ppm, carbon này có tương quan với proton tại δH 1,59 ppm, là tín hiệu của proton của carbon loại –CH2– tại δC 35,87 ppm. Ngoài ra, tín hiệu proton thứ hai của carbon tại δC 35,87 Trần Văn Thắng Trang 57 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Nối đôi cấu hình trans- Nối đôi cấu hình cis- J=12 – 18 Hz J=6 – 12 Hz ppm là proton tại δH 1,76 ppm thì có tương quan với proton tại δH 4,02 ppm (có dạng mũi đôi-đôi với hằng số ghép J = 4,0 & 7,0 Hz). Trên phổ HSQC, proton tại δH tương quan với carbon carbinol tại δC 73,10 ppm. Thông thường, tín hiệu proton của carbon carbinol ở vùng từ trường # 3,8 ppm. Tuy nhiên, tín hiệu cộng hưởng của proton của carbon tại δC 73,10 ppm lại ở vùng từ trường thấp hơn. Điều này cho thấy cabon này ở gần một hay nhiều nhóm rút điện tử, do đó, carbon tại δC 73,10 ppm liên kết với carbon carbonyl tại δ 177,23 ppm và carbon tại δ 35,87 ppm. C C Dựa vào số liệu phổ NMR (CD3OD), đề nghị hợp chất BIFL-AE3 là một hợp chất thuộc loại alcamid với hai dây carbon dài. Phổ MS lần nhất cho mảnh m/z = 495,3 và phổ MS ghi lại với cường độ bắn phá ion nhỏ hơn để ghi được mảnh ion phân tử với m/z = 751,8. Các hợp chất ceramid khi ghi phổ MS thường hay bị đứt mảnh tại nối amid, vì thế, hai lần ghi phổ đã giúp biết được hai mảnh ceramid như sau Trần Văn Thắng Trang 58 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Mảnh aminoalcol đường (M ) 1 M1 = C H6 11O + C H O N + C H + (CH )5 5 8 2 4 6 2 9 + CH3 = 163 + 114 + 54 + 126 + 15 = 472 Ứng với mảnh m/z = 495,3 [M1+Na]+ Ngoài ra, cũng thấy trên phổ MS-ESI (A) mảnh acylalcol (M2) M2 = C2H2O2 + (CH2)13 + CH3 = 58 + 182 + 15 = 255 Ứng với mảnh m/z = 260,5 [M2+Na─H2O]+ Vậy, mảnh ion phân tử M = M1 + M2 = 472 + 255 = 727 Ứng với mảnh ion phân tử m/z = 751,8 [M+Na+H]+, tương ứng với công thức phân tử C41H77O9N (M = 727) Kết hợp các số liệu phổ NMR, đề nghị hợp chất BIFL-AE3 là (4E,8Z)-1-O- β-D-glucopyranosyl-2-(2’-hydroxyhexadecanoylamino)nonadeca-4,8-dien-3-ol. Trần Văn Thắng Trang 59 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả Bảng 2.15: Số liệu phổ NMR (CD3 OD) của hợp chất BIFL-AE3 so sánh với phổ của (2S,3S, 4E,8E)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2N-[(2’R)-2’-hydroxyhexadecanoylamino] octadeca-4,8-dien-3-ol (A)[21] Hợp chất BIFL-AE3 (CD3OD) Phổ chất (A) (pyridin -d Loại carbon HMBC № δ COSY δH C (1H→ ppm (J, Hz) ppm (H → H) 13C) 5) a: 4,14 (q, 5,5 & 11,5) 1b 2,3,1” 70,3 1 -CH -O 69,74 2 b: 3,76 (dt, 3,5 & 11,5) 1a; 2 4,02 (p, 3,5 & 7,5) 2 1b; 3 1, 3 54,6 >CH-N 54,66 4,17 (dt, 3,5 & 7,5) 3 2; 4 1,2,4,5 72,4 >CHOH 72,88 5,54 (dt, 7,0 & 15,5) 4 3; 5 3,6 132,1 -CH= 131,39 5,79 (dt, 6,5 & 15) 5 4; 6 3,7 131,2 -CH= 134,37 6 2,12 5 5 33,1 -CH - 33,66 2 2,14 (t, 6,0) 7 8 4 32,9 -CH - 27,88 2 5,39 (t, 4,5) 8 7 130,0 -CH= 129,96 5,46 (t, 5,0) 9 10 10 131,2 -CH= 130,66 10 2,01 9 8,9 33,1 -CH - 33,07 2 10,11, 19 23,2- 32,3 11- 17 30,86- 1,31 10; 18 -CH - 2 30,29 18 1,31 17; 19 14,5 -CH - 23,72 2 0,92 (t, 7,0) 19 18 -CH 14,43 3 1’ 175,7 >C=O 177,23 4,02 (p, 3,5 & 7,5) 2’ 1,59; 1,76 3’, 4’ 72,6 >CHOH 73,10 a: 1,76 (m) 2’; 3’b; 4’ 1’, 4’ 35,8 3’ -CH - 35,87 2 b:1,59 (m) 2’; 3’a; 4’ 1,44 (brs) 4’ 3’a; 3’b; 5’ 26,1 -CH - 26,20 2 5’- 1,31 4’; 16’ 16’ 23,2--CH - 30,86- 2 Trần Văn Thắng Trang 60 Hedyotis biflora Nghiên cứu và kết quả 32,3 15’ 30,29 0,92 (t, 7,0) 16’ 15’ 14,5 -CH 14,43 3 4,30 (d, 8,0) 1” 2” 1, 3” 104,72O-CH-O 104,0 3,23 (dd, 8,0 & 9,0) 2” 1”; 3” 1”, 3” >CHOH 75,01 74,1 3,38 (t, 9,0) 3” 2”; 4” 2”, 4” >CHOH 77,95 76,8 3,31 (dd, 2,0 & 5,0) 4” 3” 3”, 6” >CHOH 71,61 70,6 2”, 3”, 6” 3,31 (dd, 2,0 & 5,0) 5” 6”a; 6”b >CHOH 77,99 76,8 a: 3,90 (d, 11,5) 5”; 6”b 6” 4”, 5” -CH OH 62,71 61,8 2 b: 3,71 (dt, 5,0 & 12,0) 5”; 6”a (4E,8Z)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-(2’-hydroxyhexadecanoylamino) nonadeca-4,8-dien-3-ol (BIFL-AE3) Trần Văn Thắng Trang 61

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf8.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf11.pdf
  • pdf12.pdf
  • pdf13.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf9.pdf
Luận văn liên quan