Khóa luận Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP - VT2eB trên thỏ

chung một nhóm quyết định A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn (Hình 2.8C). 18 2.7. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero[5] Dòng tế bào vero (Vervet Monkey Origin) được Y. Yasumura và Y. Kawakita ở đại học Chiba, Nhật Bản thiết lập vào năm 1962, khởi đầu từ nuôi cấy tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Cercopithecus aethiops). Sau một số lần cấy truyền, dòng tế bào này được chuyển đến Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ - American Type Culture Collection (ATCC). Vào năm 1979, ngân hàng tế bào tiên phát được thành lập từ một ống tế bào cấy truyền lần thứ 124. Ngân hàng tế bào tiên phát được dùng để sáng lập ngân hàng tế bào đang làm việc (Manufacturer's Working Cells Bank – MWCBs). Dòng tế bào này được thử nghiệm nhiều lần để tiếp tục sử dụng cho việc sản xuất vaccin virus. Thậm chí, lấy dịch nuôi cấy tế bào tiêm vào chuột không có tuyến ức (mất khả năng đề kháng), kết quả nhận được là âm tính, không hình thành khối u. Thử nghiệm DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ở lần cấy truyền 169, kết quả cho thấy lượng DNA tồn dư không đáng kể. Chính vì thế, lần cấy truyền 137 được dùng cho MWCB và lần cấy truyền 142 được dùng để sản xuất tế bào nuôi. Môi trường nuôi cấy tế bào chia làm hai loại, môi trường phát triển và môi trường duy trì. Môi trường phát triển chứa hàm lượng huyết thanh cao 8 – 10%, có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào. Huyết thanh bào thai bê là thích hợp nhất để thúc đẩy sự phát triển của tế bào vì nó không chứa các yếu tố ức chế tế bào. Hình 2.8: Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977) 19 Tế bào vero tăng trưởng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) có bổ sung thêm huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal Bovine Serum). Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH bằng sodium bicarbonate và ủ trong tủ ấm CO2 để duy trì pH 7.2 –7.4. Tế bào vero được nuôi cấy ở 37OC, 5% CO2. 2.7.2. Độc tố VT2e[4][9] Vào năm 1977, Konowalchuk và các cộng sự đã đặt tên verotoxin (VT) cho một độc tố do một dòng E. coli tiết ra và gây chết tế bào nuôi cấy. Trong một nghiên cứu trên 136 mẫu phân lập E. coli, 7 trong 10 trường hợp VT dương tính đã kéo theo bệnh tiêu chảy xảy ra ở người và một trường hợp kéo theo bệnh tiêu chảy ở heo. Trong một báo cáo vào năm 1982, O΄ Brient và các cộng tác viên đã cho rằng một vài chủng E. coli gây bệnh đường ruột đã tiết ra một độc tố gây chết tế bào Hela. Cũng giống như các độc tố do Shigella tiết ra và gây độc làm chết tế bào Hela nuôi cấy, các độc tố này ức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào Hela và gây chết chuột. Vì thế, các độc tố này được gọi là Shiga-like toxin (SLT). Vào năm 1983, O΄Brient và LaCeck đã tinh chế SLT và đã chứng minh rằng Shiga toxin do Shigella dysenteriae tiết ra và SLT được tiết từ chủng E. coli H30 là giống nhau về các đặc tính lý hoá và hoạt tính hoá học. Độc tố SLT-II variant (Shiga-like toxin IIv, SLT-IIv) hay VT2e là một độc tố có đặc trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. Độc tố SLT-IIv là một phân tử gồm 2 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị A khoảng 33 kDa và 5 tiểu đơn vị B khoảng 7.7 kDa/đơn vị. Tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme, trong khi tiểu đơn vị B chịu trách nhiệm cho sự liên kết các SLT với thụ thể có bản chất là glycolipid. Thụ thể cho SLT- IIv là Globotetraosyl ceramide (Gb4) trên màng tế bào vero. Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (Elongation Factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome, do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào. 20 2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero Khi kháng thể đặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố, do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thể động vật. Phản ứng đó được gọi là phản ứng trung hòa độc tố. Trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ thể đặc hiệu (Gb4) có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào và gây chết tế bào. Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào người ta có thể biết được là tế bào chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng độc tố ở liều TCID50 người ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2e vào thỏ thì cơ thể thỏ sẽ tạo ra một cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể và sản xuất kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờ đó đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ. 21 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian: từ 14/02/2005 đến 30/07/2005. Địa điểm thực hiện: ƒ Trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. ƒ Phòng miễn dịch viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. ƒ Phòng kiểm định vaccin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ. 3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1. Thú thí nghiệm: 5 con thỏ, trọng lượng từ 1,5 – 2 kg. 3.3.2. Vật liệu và hoá chất ƒ Dung dịch Ammonium Sulfate 100%S ƒ Dung dịch Ammonium Sulfate 45%S ƒ Dung dịch PBS 1X ƒ Dung dịch PBS++ ƒ Dung dịch PBS- ƒ Dung dịch Sodium azide NaN3 5% ƒ Tá chất Aluminum hydroxide Al(OH)3 ƒ Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ƒ Dung dịch Versene 0,2% ƒ Dung dịch Trypsin 0,5% ƒ Huyết thanh bào thai bê (FBS – Fetal Bovine Serum) ƒ Dung dịch Formol 3,7% ƒ Dung dịch Borat 0,01M, pH 8.5 ƒ Dung dịch Methylene Blue 1% ƒ Dịch chiết canh cấy chủng E. coli H28: VT2e+ 22 ƒ Dịch chiết canh cấy chủng E. coli DH5α: VT2e- ƒ Thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2% 3.3.3. Môi trường Môi trường DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) (Gibco). 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ƒ Máy khuấy từ CAT M6/1 ƒ Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments ƒ Tủ cấy vô trùng ƒ Tủ ấm 37oC ƒ Chai nuôi cấy tế bào 25, 80 cm2 ƒ Phiến polystyren 96 giếng ƒ Tấm plastic dán phiến polystyren 96 giếng ƒ Pipette 8 kênh ƒ Pipette tự động ƒ Pipette 100 µl ƒ Đầu côn vàng tiệt trùng ƒ Máng nhựa tiệt trùng ƒ Ống nghiệm thuỷ tinh 3 ml ƒ Kính hiển vi soi ngược IOD3 ƒ Xi lanh loại 1 ml, 20 ml ƒ Ống ly tâm 50 ml ƒ Eppendoft 1,5 ml ƒ Buồng đếm hồng cầu GASSALEM. ƒ Tủ lạnh 2 – 8oC. ƒ Cân phân tích Explorer OHAUS ƒ Màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo 2 quy trình. Vị trí tiêm: tiêm dưới da 23 ƒ Quy trình ngắn ngày (theo R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [13] Thí nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml. - Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng) - Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 5: tiêm 1 ml với liều 75 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 9: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1) - Ngày 10: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 14: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2) - Ngày 15: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 19: lấy 1 ml (mũi nhắc lại 3) - Ngày 20: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 25: lấy 40 ml máu - Ngày 30: lấy 40 ml máu - Ngày 35: lấy máu tim ƒ Quy trình dài ngày (quy trình viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh) Thí nghiệm trên 3 con thỏ, 28 ngày tiêm 1 lần, tiêm 6 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB giảm dần từ 100 µg/ml xuống 50 µg/ml. - Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng) - Ngày 1: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 28: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 42: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1) - Ngày 56: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 70: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2) - Ngày 84: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml. - Ngày 98: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 3) - Ngày 112: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 126: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4) - Ngày 140: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 154: lấy máu tim 24 3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm ƒ Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng. ƒ Pha protein tái tổ hợp với dung dịch Al(OH)3 để đạt hàm lượng 50 µg, 75 µg và 100 µg MBP-VT2eB/ml. ƒ Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 1 ml/chai, bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm. 3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh Lấy máu (40 ml/con, 50 ml/con): ¾ Trước khi lấy máu, tráng ống bằng nước muối sinh lý 0,85%. o Vnước muối sinh lý = 0,2% Vmáu ¾ Lấy máu ở tĩnh mạch tai thỏ vào ống 50 ml. ¾ Sau khi lấy máu xong, dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống. ¾ Để qua đêm ở 4oC, ly tâm tách kháng huyết thanh chia làm hai phần: - Phần 1: có bổ sung NaN3, VNaN3 = 0,05% Vmáu, bảo quản ở 4oC. - Phần 2: không bổ sung NaN3, bảo quản ở -20oC. 3.4.4.Xử lý kháng huyết thanh 3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ƒ Nguyên tắc[10][12] Phương pháp kết tủa protein được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng muối vô cơ như ammonium sulfate, potassium sulfate, sodium sulfate. Khi ammonium sulfate hoà tan, một số lượng lớn các phân tử nước sẽ bám xung quanh các phân tử ammonium sulfate. Khi số lượng các phân tử ammonium sulfate trong dung dịch tăng lên thì số lượng các phân tử nước kết hợp với protein sẽ giảm xuống. Cuối cùng, không còn đủ nước kết hợp với protein để tạo thành dung dịch hoà tan và protein bắt đầu kết tủa. Đây còn được gọi là tiến trình mất nước của protein. Sau khi nhỏ từ từ hết ammonium sulfate 100%S, tiếp tục khuấy 45 – 60 phút để hoà tan hoàn toàn ammonium sulfate. 25 ƒ Tiến hành 3.4.4.2. Hòa tan kháng thể Kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S được phục hồi bằng phương pháp thẩm tích. ƒ Nguyên tắc[12] Một trong những phương pháp dùng để loại muối ammonium sulfate 45%S là sử dụng bao thẩm tích. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ, chúng cho phép các phân tử muối nhỏ dễ dàng di chuyển qua lại nhưng không cho phép các Ly tâm lạnh tách kháng huyết thanh Cho dung dịch PBS 1X vào mỗi chai kháng huyết thanh (lượng PBS1X gấp ba lần lượng kháng huyết thanh) Tủa kháng huyết thanh thỏ bằng cách nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S vào hỗn hợp kháng huyết thanh và PBS 1X trên máy khuấy từ ở 4oC. Thể tích (NH4)2SO4 100%S sử dụng bằng tổng thể tích của kháng huyết thanh thỏ và PBS 1X Tiếp tục khuấy trong 45 – 60 phút ở 4oC Để qua đêm ở 4oC Ly tâm lạnh tách kết tủa Rửa tủa 3 – 4 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45%S Bảo quản kháng thể trong (NH4)2SO4 45%S ở 4oC Sơ đồ 3.1: Quy trình tách kháng thể với ammonium sulfate 100%S 26 phân tử protein lớn di chuyển qua lại. Khi những phân tử muối khuếch tán ra khỏi bao và đi vào dung dịch đệm, nồng độ ion của dung dịch protein giảm xuống. Quá trình này vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích ngang bằng nhau (sau 5 – 6 giờ). Tiếp tục đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm mới, thực hiện khoảng 3 lần. Phương pháp này không chỉ loại bỏ được muối mà cũng loại bỏ được các phân tử biến dưỡng nhỏ như ATP, coenzyme. ƒ Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích được cho vào cốc chứa EDTA 0,5M và đun sôi trong nửa giờ. Sau đó đổ bỏ dung dịch EDTA. Lập lại tiến trình trên nhưng thay thế dung dịch EDTA bằng nước cất (khoảng 8 lần). ƒ Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S vào bao thẩm tích đã được xử lý, dùng kẹp kẹp hai đầu bao thẩm tích lại. Đặt bao thẩm tích vào dung dịch đệm PBS-, để 5 – 6 giờ ở 4oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích như trên, thu kháng thể để xác định hiệu giá. Hình 3.1: Bao thẩm tích (Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977) 27 3.5. Đánh giá 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) ƒ Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. ƒ Chuẩn bị thạch 1,5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. ƒ Chuẩn bị mẫu - Mẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. - Mẫu kháng huyết thanh chưa pha loãng. - Mẫu protein tái tổ hợp MBP-VT2eB nồng độ 1,588 mg/ml được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. - Mẫu kháng huyết thanh được pha loãng theo tỉ lệ ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32. ƒ Thực hiện – đánh giá Hút kháng nguyên và kháng thể vào các giếng tương ứng, đặt thạch vào buồng ẩm ở 4oC. Khoảng 24 – 48g sau quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Hình 3.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Phản ứng (+): xuất hiện đường tủa ở một trong hai trường hợp (a hoặc b). Phản ứng (-): không xuất hiện đường tủa ở cả hai trường hợp a và b. (a) (b) Đường tủa 28 3.5.2. Định lượng: Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) ƒ Chuẩn bị độc tố VT2e Vi khuẩn E. coli 0139 K82 (H28) có gen quy định độc tố VT2e được nuôi cấy trong môi trường LB, ở 37oC, lắc 150 vòng/phút trong 24g. Dịch nuôi cấy đem ly tâm 10.000 vòng trong 30 phút. Thu dịch trong để thử độc tố trên tế bào vero. ƒ Chuẩn bị tế bào vero Tế bào vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FBS), 2 mM gentamycin trong các chai nuôi cấy 25 cm2, ở 37oC, 5%CO2. Các tế bào được chuyển vào phiến 96 giếng theo các bước sau - Đổ bỏ môi trường trong chai. - Hút 3,5 ml versene 0,2% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trong versene có EDTA sẽ làm phân tách tế bào. - Hút 2,5 ml trypsin 0,5% cho vào chai, tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2, trypsin sẽ loại bỏ protein có trong môi trường cũ. - Sau đó cho huyết thanh bào thai bê (FBS) và môi trường DMEM vào, hút 0,2 ml đem đếm nồng độ tế bào. Tiếp tục pha loãng đến nồng độ tế bào là 300.000 tế bào/ml và nồng độ huyết thanh là 10%. - Hút 100 µl tế bào vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24g. ƒ Xác định liều TCID50 - Đối chứng (-)1: giếng chỉ chứa môi trường nuôi cấy tế bào DMEM. - Đối chứng (-)2: giếng chứa dịch lọc canh khuẩn E. coli DH5α. 29 - Đánh giá kết quả: Nồng độ TCID50 là nồng độ gây chết 50% tế bào vero trong giếng nuôi cấy tế bào. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do độc tố verotoxin tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định kết quả bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng (-)2. Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng (-)2. Dịch thu từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli 0139 K82 được pha loãng theo tỉ lệ ½,1/20, 1/200, 1/2000, ... Hút 100 µl dịch lọc canh khuẩn ở mỗi nồng độ pha loãng trên vào mỗi giếng từ cột 1 đến cột 11 trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero. Hút 100 µl dịch lọc canh cấy vi khuẩn E. coli DH5α vào 4 giếng ở cột 12 trên phiến 96 giếng làm đối chứng (-)2, 4 giếng còn lại là đối chứng (-)1 Ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 – 48g Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược vào những thời điểm 24 –48g. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào. Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định liều TCID50 Sơ đồ 3.2: Quy trình xác định liều TCID50 30 ƒ Nhuộm tế bào Đổ bỏ môi trường, tráng một lần bằng dung dịch đệm PBS++ Cho vào mỗi giếng 200 µl formol 3,7%, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g Đổ bỏ formol. Tráng hai lần các giếng bằng dung dịch đệm borat 0,01 M, pH 8,5. Cho vào mỗi giếng 100 µl thuốc nhuộm blue methylene 1% được pha loãng trong dung dịch đệm borat 0,01 M, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 1g Đổ bỏ thuốc nhuộm. Tráng 5 lần bằng nước khử ion. Để phiến khô ở 37oC trong 1g Đọc độ hấp thu bằng máy spectrophotomer ở bước sóng 620 nm Sơ đồ 3.3: Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm Phiến 96 giếng đã nuôi cấy tế bào. 31 ƒ Công thức tính liều TCID50 Liều TCID50 được tính dựa trên phương pháp Reed – Muench[11]. o )log(%50 t xy xA −×− −= o aAbTCID =−= log50 o Hiệu giá kháng thể trung hoà = a10 1 Trong đó: - x: % tế bào chết dưới 50% - y: % tế bào chết trên 50% - t: Bậc pha loãng. - a: TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50). - b: Độ pha loãng có % tế bào chết dưới 50%. 3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ƒ Nguyên tắc Độc tố VT2e mất khả năng gây độc trên tế bào vero do bị trung hoà bởi kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. ƒ Tiến hành Kháng huyết thanh pha loãng bậc hai được ủ với một liều độc tố xác định VT2e+ ở 37oC trong một giờ và ở 4oC qua đêm. Cấy hỗn hợp kháng huyết thanh - độc tố đã ủ vào phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g. Tiếp tục nuôi tế bào vero ở 37oC thêm 2 ngày. Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày và ghi nhận kết quả trong 2 ngày. ƒ Phản ứng trung hoà độc tố - Đối chứng (+): là những giếng chỉ có tế bào vero. - Đối chứng (-): là những giếng được ủ với 100 µl dịch lọc vi khuẩn có nồng độ TCID50 đã xác định ở trên. - Đối chứng tế bào: là những giếng được ủ với 100 µl kháng huyết thanh chưa pha loãng. 32 - Đánh giá kết quả: Quan sát sự huỷ hoại tế bào do verotoxin không bị trung hoà hàng ngày tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm và xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp Reed – Muench. Những giếng có kết quả dương tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào dưới 50% so với giếng đối chứng huyết thanh. Những giếng có kết quả âm tính là những giếng có sự huỷ hoại tế bào trên 50% so với giếng đối chứng huyết thanh. Hút 100 µl môi trường DMEM vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng Hút 100 µl kháng huyết thanh vào cột 1 trên phiến 96 giếng. Tiếp tục pha loãng kháng huyết thanh từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2048 Thêm 100 µl dịch lọc vi khuẩn ở liều 3TCID50 vào mỗi giếng Ủ ở 37oC trong 1giờ, 4oC qua đêm Hút 100 µl hỗn hợp trên cho vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng chứa tế bào vero đã nuôi cấy 24g Ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 – 48g Quan sát dưới kính hiển vi, tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả và xác định hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e Sơ đồ 3.4: Quy trình trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 33 3.6. CHỈ TIÊU THEO DÕI ƒ Hiệu giá kháng thể cho kết quả dương tính trong phản ứng kết tủa khuếch tán kép trong thạch. ƒ Xác định liều TCID50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli. ƒ Xác định hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e ở liều 3TCID50. 3.7. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU Xử lý số liệu bằng Excel và đánh giá kết quả dựa trên các kết quả thu nhận trong suốt quá trình thí nghiệm. 34 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP- VT2eB BẰNG KỸ THUẬT OUCHTERLONY 4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng Kháng huyết thanh được thu nhận sau mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4 để đánh giá khả năng gây miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thông qua phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch. Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 1 của thỏ 4 (quy trình dài ngày) với protein MBP-VT2eB có nồng độ 1,588 mg/ml theo 2 cách sau: - Cách 1: pha loãng kháng nguyên (protein MBP-VT2eB), kết quả được minh hoạ qua hình 4.1(A). - Cách 2: pha loãng kháng thể (kháng huyết thanh), kết quả được minh hoạ qua hình 4.1(B). Sau 2 ngày, quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Hình 4.1: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 1) Đường tủa (A) ƒ Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32. ƒ Giếng 7 chứa 10 µl kháng huyết thanh. (B) ƒ Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µl kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32. ƒ Giếng 7 chứa 10 µl protein MBP- VT2eB. (B) (A) 35 Nhận xét: Chỉ xuất hiện đường kết tủa ở hình A (sơ đồ pha loãng protein MBP-VT2eB), vị trí đường kết tủa xuất hiện nằm gần về phía giếng chứa kháng huyết thanh và không có đường tủa trong hình B (sơ đồ pha loãng kháng huyết thanh). Quan sát sự xuất hiện đường tủa, chúng tôi nhận thấy đường tủa xuất hiện ở vị trí lệch về phía giếng chứa kháng thể, kháng thể yếu hơn kháng nguyên. Trong hình B đường tủa không xuất hiện chứng tỏ rằng không có sự tương đồng tỉ lệ giữa kháng nguyên và kháng thể. Từ đó, chúng tôi quyết định thực hiện phản ứng khuếch tán kép trên thạch theo cách 1 (pha loãng kháng nguyên) với các mẫu huyết thanh thu được từ hai quy trình dài ngày và ngắn ngày để theo dõi khả năng gây miễn dịch của protein MBP-VT2eB trong hai quy trình trên đối tượng thí nghiệm là thỏ. 4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình ngắn ngày và dài ngày 4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày Nghiên cứu được thực hiện trên hai thỏ: thỏ 10 và thỏ 11. Kháng huyết thanh thu được sau mũi nhắc lại 1 của thỏ 1 và thỏ 2 được dùng để thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với protein MBP-VT2eB. Kết quả cho thấy có đường kết tủa xuất hiện ở mẫu kháng huyết thanh của thỏ 2 (hình 4.2), nhưng ở mẫu của thỏ 1 không thấy xuất hiện đường kết tủa. Kết quả: mũi nhắc lại 1 của thỏ 2 dương tính, mũi nhắc lại 1 của thỏ 1 âm tính. Tuy nhiên mẫu kháng huyết thanh thu được sau mũi nhắc lại 2 của thỏ 1 lại cho kết quả dương tính (hình 4.3). Hình 4.2: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc lại 1) Đường tủa 36 Tiến hành phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu huyết thanh đối chứng (thu nhận trước khi gây miễn dịch) và mẫu kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2 của thỏ 1 và thỏ 2 để kiểm tra độ tin cậy của kết quả trong hai xét nghiệm trên (hình 4.2 và 4.3), kết quả được minh hoạ qua hình 4.4 và 4.5. Kết quả cho thấy chỉ xuất hiện đường tủa ở giếng chứa kháng huyết thanh, kết quả dương tính, nhưng ở giếng chứa huyết thanh đối chứng không xuất hiện đường tủa, kết quả âm tính. Với các kết quả đạt được ở trên, chúng tôi có thể kết luận rằng quy trình gây miễn dịch ngắn ngày có hiệu quả. 4.1.2.2. Quy trình dài ngày Trong quy trình gây miễn dịch dài ngày có ba thỏ được sử dụng trong thí nghiệm: thỏ 3, 4, 5. Các mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 1 của những thỏ này được xét nghiệm kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng phương pháp kết tủa khuếch tán kép trên thạch. Sau 2 ngày, đường kết tủa xuất hiện ở Hình 4.3: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc lại 2) Đường tủa Hình 4.4: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng + kháng huyết thanh) Hình 4.5: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa • Giếng 1 chứa 50 µl kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. • Giếng 2 chứa 50 µl huyết thanh đối chứng. • Giếng 3 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB ở nồng độ pha loãng 1/8. 37 mẫu của thỏ 4 và thỏ 5, không xuất hiện đường tủa ở mẫu của thỏ 3. Kết quả: mũi nhắc lại 1 của thỏ 4, thỏ 5 dương tính; mũi nhắc lại 1 của thỏ 3 âm tính. Tái kiểm tra mẫu kháng huyết thanh của thỏ 3 thu sau mũi nhắc lại 2, kết quả cho thấy có sự tạo thành kháng thể (hình 4.8). Tiếp tục thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch với mẫu huyết thanh đối chứng và mẫu kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 3 của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 để xác nhận sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB của các xét nghiệm ở trên, kết quả được minh hoạ qua hình 4.9, 4.10, 4.11. Hình 4.6: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 1) Hình 4.7: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 1) Đường tủa Hình 4.9: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng + kháng huyết thanh) Hình 4.10: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa Hình 4.8: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 2) Đường tủa 38 Với kết quả trên, chúng tôi có thể kết luận quy trình gây miễn dịch dài ngày có hiệu quả. 4.1.3. Nhận xét Khi quan sát các kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trong thạch, chúng tôi nhận thấy rằng các đường kết tủa nằm gần về phía giếng chứa kháng huyết thanh hơn các giếng chứa protein MBP-VT2eB, điều đó cho thấy kháng thể được tạo ra không mạnh bằng kháng nguyên. Và khi quan sát sơ bộ các đường kết tủa của hai quy trình, chúng tôi nhận thấy quy trình dài ngày tạo đáp ứng miễn dịch mạnh hơn quy trình ngắn ngày. Ở từng cá thể thỏ ghi nhận được trong: ¾ Quy trình ngắn ngày: - Thỏ 1: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 2. - Thỏ 2: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1. ¾ Quy trình dài ngày: - Thỏ 3: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 2. - Thỏ 4: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1. - Thỏ 5: có kết quả dương tính ở mũi nhắc lại lần 1. Từ kết quả trên có thể kết luận cả hai quy trình gây miễn dịch ngắn và dài ngày đều tạo đáp ứng miễn dịch, kích thích cơ thể thỏ tạo kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Mặt khác, khả năng đáp ứng miễn dịch của các cá thể là không như nhau đối với cùng một yếu tố kháng nguyên. Tóm lại cả hai quy trình đều gây miễn dịch có hiệu quả ở trên thỏ. • Giếng 1 chứa 50 µl kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. • Giếng 2 chứa 50 µl huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. • Giếng 3 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB ở nồng độ pha loãng 1/8. Hình 4.11: Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng + kháng huyết thanh) Đường tủa 39 Quy trình Thỏ Đối chứng Mũi nhắc lại 1 Mũi nhắc lại 2 Ngắn ngày 1 2 - - - + + + Dài ngày 3 4 5 - - - - + + + + + Ở cả hai quy trình dài ngày và ngắn ngày, phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch đều cho phản ứng dương tính với kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 2. Bảng 4.1: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của 2 quy trình gây miễn dịch 40 Quy trình ngắn ngày (Thỏ 2 ) Quy trình dài ngày (Thỏ 5) a d b e c f Hình 4.12: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch của 2 quy trình gây miễn dịch a: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 1. b: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 2. c: Mẫu thỏ 2 mũi nhắc lại 3. d: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 1. e: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 2. f: Mẫu thỏ 5 mũi nhắc lại 3. • Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6 chứa 10 µl protein MBP-VT2eB pha loãng từ nồng độ ban đầu đến nồng độ 1/32. • Giếng 7 chứa 10 µl kháng huyết thanh. 41 4.2. XÁC ĐỊNH LIỀU TCID50 Trong các thí nghiệm nghiên cứu hoạt lực của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, đầu tiên cần xác định liều TCID50 trên môi trường tế bào vero. Độc tố VT2e được thu nhận từ huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli H28 trong 24g. Huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn E. coli DH5α trong 24g được sử dụng làm đối chứng (-)2. Độc tố VT2e được pha loãng bậc 10 từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2.105 trong môi trường DMEM. Sau đó tiến hành ủ độc tố đã pha loãng với tế bào vero trong 24 – 48g ở 37oC, 5% CO2. Chúng tôi thực hiện phản ứng trung hoà độc tố với dịch độc tố VT2e và dịch canh khuẩn DH5α đã được lọc bằng màng lọc 0.45 µm. Sau 48g, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược, chúng tôi thấy tế bào vero bị độc tố VT2e huỷ hoại. Những giếng dương tính là những giếng có sự phân tách tế bào. Tế bào bị huỷ hoại có hình tròn nhỏ, sậm màu hơn so với tế bào vero bình thường tuy nhiên với các giếng có độ pha loãng độc tố thấp, chúng tôi quan sát thấy dưới đáy giếng vẫn còn nền tế bào bên dưới. Tiến hành nhuộm tế bào, đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm. Nồng độ OD620 nm % tế bào sống ½ 0,1228 11,187 1/20 0,1563 14,239 1/2x102 0,4185 38,139 1/2x103 0,9838 89,652 1/2x104 1,052 95,872 1/2x105 1,056 96,236 Đối chứng tế bào 1,0973 Bảng 4.2: Kết quả đo OD620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e 42 Từ các kết quả đo OD620, chúng tôi xác định được liều TCID50 dựa vào phương pháp Reed – Muench. =−×− −−= ))2/1log(( 139.38652.89 139.3850)102log( 250 xTCID 0.25314 Nồng độ của độc tố VT2e gây chết 50% tế bào = 340/1 10 1 25314.0 = Chuẩn độ độc tố 0 50 100 150 1/2 1/200 1/20000 Nồng độ độc tố pha loãng % tế b ào số ng Vậy liều TCID50 của dịch lọc vi khuẩn E. coli 0139: K82 nuôi cấy trong môi trường LB trong 24g là ở nồng 1/340. Vậy liều 3TCID50 là 3/340, chúng tôi sử dụng liều 3TCID50 trong phản ứng trung hoà độc tố verotoxin trên môi trường tế bào vero. 4.3. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO Dựa vào kết quả của phản ứng chuẩn độ độc tố VT2e, chúng tôi thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero. 4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero Kháng huyết thanh sau khi thu hoạch phải được giữ ở -20oC mới giữ được sự ổn định của kháng thể trong một thời gian dài, để bảo quản kháng huyết thanh ở điều kiện đơn giản hơn, ở 4oC cần bổ sung NaN3 vào kháng huyết thanh với nồng độ 0,05%. Tuy nhiên cần phải kiểm tra khả năng gây độc của NaN3 đối với tế bào vero để tránh kết quả sai trong phản ứng trung hoà độc tố VT2e. Biểu đồ 4.1: Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e 43 4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh có chứa NaN3 với nồng độ 0,05%. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g. ™ Thời điểm 24g Các giếng đối chúng tế bào phát triển bình thường, tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết với hình thái chết do độc tố, một số tế bào chết với hình dạng co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dưới. Các giếng chứa kháng huyết thanh pha loãng với liều 3TCID50: kết quả chưa rõ ràng, tế bào chết nhiều, co tròn và tụ thành cụm, vẫn còn thảm tế bào bên dưới. ™ Thời điểm 48g Các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển bình thường, toàn bộ tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt với hình thái chết do độc tố. Các giếng chứa kháng huyết thanh pha loãng: tế bào trong tất cả các giếng chết hàng loạt, co tròn, có màu sậm, thảm tế bào bên dưới chết hoàn toàn. Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy có thể tế bào vero chết do các nguyên nhân sau: - Tác động của NaN3. - Kháng huyết thanh chưa bất hoạt. Để tìm ra nguyên nhân gây chết tế bào, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trung hoà độc tố với mẫu kháng huyết thanh này nhưng có bất hoạt ở 56oC trong 30 phút. 4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh có chứa NaN3 với nồng độ 0,05% và bất hoạt ở 56oC trong 30 phút. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g. 44 ™ Thời điểm 24g Các giếng đối chúng tế bào phát triển bình thường, tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết với hình thái chết do độc tố, một số tế bào chết với hình dạng co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dưới. Các giếng chứa kháng huyết thanh: có hiện tượng tế bào chết hàng loạt, thảm tế bào dưới đáy giếng vẫn còn. ™ Thời điểm 48g Các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển bình thường, toàn bộ tế bào trải đều thành một lớp dưới đáy giếng. Các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt với hình thái chết do độc tố. Các giếng chứa kháng huyết thanh pha loãng: sau 48g nuôi cấy tế bào chết hàng loạt. Mặc dù kháng huyết thanh đã được bất hoạt nhưng tế bào vero vẫn chết, do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3. 4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 Tiến hành ủ kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 có nồng độ 0,05% với tế bào vero. Sau 24g, tế bào vero chết hàng loạt với các đặc điểm: tế bào co tròn nhưng có đường kính lớn hơn so với tế bào chết co tròn do độc tố, tụ thành từng cụm, thảm tế bào chết hoàn toàn. Qua những thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy tế bào vero chịu tác động của cả hai nguyên nhân: tác động của NaN3 và kháng huyết thanh chưa bất hoạt. Từ những kết quả trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mẫu kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt. 4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với mẫu kháng huyết thanh thỏ 4 (lấy vào ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) không bổ sung NaN3 và có bất hoạt ở 56oC trong 30 phút. Ghi nhận kết quả tại các thời điểm 24g và 48g. Sau 48g, tiến hành nhuộm tế bào và đọc kết quả bằng máy spectrophotometer ở bước sóng 620 nm. 45 ¾ Hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm 24 – 48g ™ Thời điểm 24g Ở các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển tốt. Ở các giếng đối chứng độc tố (đối chứng (-)), tế bào chết co tròn, rải rác, sậm màu hơn so với thảm tế bào. Ở các giếng chứa kháng huyết thanh, tế bào có chết nhưng hình thái vẫn chưa rõ ràng. ™ Thời điểm 48g Ở các giếng đối chứng tế bào: tế bào phát triển tốt. Ở các giếng đối chứng độc tố: tế bào chết hàng loạt, co tròn, sậm màu hơn so với thảm tế bào còn ít bên dưới. Ở các giếng chứa kháng huyết thanh có hiện tượng tế bào chết giống như các giếng đối chứng (-). Ở các giếng có nồng độ pha loãng kháng huyết thanh cao, tế bào được bảo hộ chống lại tác động của độc tố nhiều hơn các giếng có độ pha loãng kháng huyết thanh thấp. ¾ Chỉ số OD 620 nm Nồng độ OD620 % tế bào sống ½ 1,118 88,24 ¼ 1,089 85,95 1/8 1,1 86,82 1/16 1,039 82 1/32 0,8685 68,55 1/64 0,6885 54,34 1/128 0,4675 36,89 Đối chứng tế bào 0,8697 Đối chứng huyết thanh 1,267 Đối chứng độc tố 0,1287 Bảng 4.3: Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) 46 Từ trên những chỉ số đo OD620 trên, ta xác định được nồng độ kháng huyết thanh ở đó 50% tế bào được bảo vệ (TCID50) là 8819.1))2/1log(( 0341.54 050)128log(50 =−×− −−=TICD Hiệu giá kháng thể trung hoà = 76/1 10 1 8819.1 = 0 20 40 60 80 100 1/2 1/4 1/8 1/1 6 1/3 2 1/6 4 1/1 28 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % T ế bà o số ng 4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero Tiến hành thực hiện phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero với các mẫu kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt. Do toàn bộ mẫu kháng huyết thanh thu nhận từ quy trình ngắn ngày đều có chứa NaN3 nên chúng tôi dùng mẫu kháng thể đã qua thẩm tích trong dung dịch PBS- để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e. Đối với quy trình dài ngày, chúng tôi sử dụng mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 3 và nhắc lại 4 để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố VT2e. Sử dụng liều độc tố VT2e là 3 TCID50. Trong quá trình tiếp tục tiến hành thí nghiệm, mặc dù các mẫu thí nghiệm đã được lọc bằng màng lọc 0,45µm nhưng các kết quả thu nhận được mẫu bị nhiễm. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lại với những mẫu đã bị nhiễm hoàn toàn, các mẫu này đuợc lọc qua màng lọc 0,2µm. Sau 48g thì nhận thấy các mẫu không bị nhiễm, đo OD620 và đánh giá kết quả. Biểu đồ 4. 2: Đồ thị trung hoà độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero 47 4.3.2.1. Quy trình dài ngày Thỏ 4 Thỏ 5 Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 Nồng độ OD620 % Tế bào sống OD620 % Tế bào sống 1/20 1,079 102,76 0,3585 75,79 1/40 1,0325 98,33 0,3975 84,04 1/80 0,8135 77,47 0,413 87,32 1/160 0,715 68,09 0,444 93,87 1/320 0,631 60,09 0,3855 81,5 1/640 0,596 56,76 0,198 41,86 1/1280 0,4865 46,33 0,16 33,83 1/2560 0,498 47,43 0,138 29,18 1/5120 0,364 35,67 0,13 27,48 1/10240 0,336 32 0,123 26,004 Đối chứng tế bào 0,9765 0,3253 Đối chứng huyết thanh 1,05 0,473 Đối chứng độc tố 0,2355 0,0818 Bảng 4.4: Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 48 Từ những chỉ số đo OD620 trên, ta xác định được nồng độ kháng huyết thanh ở đó 50% tế bào được bảo vệ (TCID50) là - Mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) 0017.3))2/1log(( 33.4676.56 33.4650)1280log(50 =−×− −−=TICD Hiệu giá kháng thể trung hòa = 1004/1 10 1 0017.3 = - Mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ))2/1log(( 005.51 050)2048log(50 −×− −−=TICD = 3.018 Hiệu giá kháng thể trung hòa = 1041/1 10 1 018.3 = Thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) Nồng độ OD620nm % Tế bào sống 1/2 0,7865 100,13 1/4 0,79 100,57 1/8 0,856 108,98 1/16 0,789 100,45 1/32 0,934 118,91 1/64 0,837 106,56 1/128 0,586 74,60 1/256 0,6055 77,08 1/512 0,5035 64,1 1/1024 0,401 51,05 1/2048 0 0 Đối chứng tế bào 0,738 Đối chứng độc tố 0,34625 Đối chứng huyết thanh 0,7855 Bảng 4.5: Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) 49 - Mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) 74458.2))2/1log(( 86.46501.81 86.4650)640log(50 =−×− −−=TICD Hiệu giá kháng thể trung hòa = 555/1 10 1 74457.2 = 0 20 40 60 80 100 120 140 ½ ¼ 1/8 1/1 6 1/3 2 1/6 4 1/1 28 1/2 56 1/5 12 1/1 02 4 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế b ào số ng 0 20 40 60 80 100 120 1/2 0 1/4 0 1/8 0 1/1 60 1/3 20 1/6 40 1/1 02 4 1/2 04 8 1/5 12 0 1/1 02 40 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế b ào số ng thỏ 4 thỏ 5 Biểu đồ 4.3: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero Biểu đồ 4.4: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero 50 4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày Thỏ 2 Nồng độ OD620nm % Tế bào sống 1/2 N / 1/4 N / 1/8 N / 1/16 N / 1/32 N / 1/64 0,5325 61,43 1/128 0,445 51,33 1/256 0,438 50,53 1/512 0,235 27,11 1/1024 0,4085 47,12 Đối chứng tế bào 0,645 Đối chứng độc tố 0,2015 Đối chứng huyết thanh 0,86688 N: tế bào chết do nhiễm Từ các kết quả trên ta có thể tính được hiệu giá kháng huyết thanh bảo vệ 50% tế bào là: - 416.2))2/1log(( 109.27526.50 109.2750)512log(50 =−×− −−=TCID - Hiệu giá kháng thể trung hòa = 261/1 10 1 416.2 = Bảng 4.6: Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 2 51 0 20 40 60 80 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Nồng độ kháng huyết thanh pha loãng % tế b ào số ng Về mặt lý thuyết hiệu giá kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 4 cao hơn hoặc bằng hiệu giá kháng huyết thanh thu sau mũi nhắc lại 3. Nhưng trên thực tế, chúng tôi thấy hiệu giá kháng huyết thanh trung hoà độc tố VT2e ở liều 3TCID50 của mẫu kháng huyết thanh thu nhận sau mũi nhắc lại 3 cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh của mũi nhắc lại 4. Điều này chứng tỏ đã có những yếu tố khác ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của các thú thí nghiệm. Trong suốt quá trình nuôi, thú thí nghiệm đã nhiễm một số bệnh như - Bệnh ghẻ - Bệnh do nấm - Bệnh cầu trùng - Bệnh viêm hô hấp Các biện pháp điều trị bằng thuốc kháng viêm nhóm corticoid và các phản ứng stress do bệnh có thể đã ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú. Biểu đồ 4.5: Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero 52 • Nhận xét Các kết quả thu nhận của toàn bộ thí nghiệm cho thấy ¾ Quy trình gây miễn dịch dài ngày tạo kháng thể có hiệu giá cao hơn quy trình gây miễn dịch ngắn ngày. ¾ Đáp ứng miễn dịch của từng thú thí nghiệm chịu ảnh hưởng rất lớn từ ƒ Sức khoẻ thú. ƒ Cơ địa của từng con thú. ¾ Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo). Hiệu giá kháng thể trung hoà Quy trình Thỏ Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 3 x 1/1041 4 1/1004 x Dài ngày 5 x 1/555 Ngắn ngày 2 x 1/261 Bảng 4.7: Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch 53 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Qua toàn bộ quá trình và các kết quả thu nhận được của đề tài : “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB”, chúng tôi đưa ra kết luận và đề nghị. • Kết luận - Cả hai quy trình đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả. - Hiệu quả của quy trình dài ngày cao hơn quy trình ngắn ngày. - Thời gian gây miễn dịch của quy trình dài ngày khá dài, chi phí cao, khó đảm bảo sức khoẻ cho thú thí nghiệm. - Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. • Đề nghị - Sử dụng các tá chất khác để tăng hiệu quả gây miễn dịch. - Cần có một địa điểm nuôi thú thí nghiệm tốt để đảm bảo sức khoẻ thú, tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch. 54 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Văn Hùng, 2002.Giáo trình miễn dịch học thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, 192 trang. 2. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Miễn dịch học cơ sở. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 337 trang. 3. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hoá sinh miễn dịch. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 316 trang. 4. Trần Ngọc Phương, 2004. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất độc tố VT2eB tái tổ hợp. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Bùi Thị Cẩm Thuý, 2002. Nghiên cứu thu nhận virus dại từ nuôi cấy tế bào vero dòng thường trực. Khoá luận cử nhân khoa học ngành Sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG NƯỚC NGOÀI 6. Copper, Terrance G., 1977. The tools of Biochemistry. John Willey & Sons, New York. 256 – 307, 355 – 405. 7. Gentry, Mary K., Joel M. Dalrymple, 1980. Quantitative microtiter cytotoxicity assay for Shigella toxin. Journal of Clinical Microbiology, 12, 361 – 366. 8. Harlow, Ed, David Lane, 1988. Antibodies, a laboratory manual. Coid Spring Harbor Laboratory. 92 – 137, 286 – 299, 18.1 – 18.48. 9. Konowalchuk, J., J. I. Speirs, S. Stavric, 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. American Society for Microbiology. 18, 775 –779. 10. Mahler, Henry R., Eugene H. Cordes, 1967. Biological Chemistry. Harper & Row, New York. 36 – 69. 11. Meslin, F. X., M. M. Kaplan, H. Koprowski, 1996. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization, Geneva. 371 – 372. 55 12. Sussman, M., 1985. The virulence of Escherichia coli. Society for General Microbiology, New York, USA. 14, 345 –353. 13. Tizard, Ian R., 1984. Immunology. Saunders College Publishing, 527 trang. 14. Tyler, S. D., W. M. Johnson, H. Lior, G. Wang, K. R. Rozee, 1991. Identification of verotoxin type 2 variant B subunit genes in Escherichia coli by the Polymerase Chain Reacton and Restriction Fragment Length Polymorphism analysis. Journal of Clinical Microbiology, 29, 1339 – 1343. 15. Veir, D. M., LA. Henzenberg, Caroline Black Well, Leonone A. Henzenberg. Applications of Immunological Methods. Black well scientific publications. 1, 8.1 – 8.18. 16. Veir, D. M., LA. Henzenberg, Caroline Black Well, Leonone A. Henzenberg. Applications of Immunological Methods. Black well scientific publications. 4, 113.1 – 113.13. 56 PHỤ LỤC CÁCH CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT ™ Dung dịch ammonium sulfate 100%S Pha 767 g (NH4)2SO4 trong 1 l nước cất, vừa khuấy vừa đun nóng cho đến khi hoà tan hoàn toàn. Lọc dung dịch (NH4)2SO4, bảo quản ở nhiệt độ phòng. ™ Dung dịch ammonium sulfate 45%S Pha 45 ml (NH4)2SO4 100%S trong 55 ml PBS 1X. ™ Dung dịch PBS 1X - Pha dung dịch PBS 10X: NaCl 84,738 g NaH2PO4.H2O 8,961 g Na2HPO4 20,5842 g NaN3 5 g Nước cất vừa đủ 1 l - Pha 10 ml PBS 10X với 90 ml nước cất. ™ Dung dịch PBS++ - Pha dung dịch A NaCl 8 g KCl 0,2g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vừa đủ 800 ml - Pha dung dịch B 0,1 g MgCl2.6H2O trong 100 ml nước cất - Pha dung dịch C 0,1 g CaCl2 trong 100 ml nước cất - Pha từng dung dịch rồi trộn lẫn với nhau. 57 ™ Dung dịch PBS- NaCl 8 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vừa đủ 1 l ™ Dung dịch sodium azide NaN3 5% Pha 5 g NaN3 trong 100 ml nước cất ™ Dung dịch borat 0,01 M, pH 8,5 - Pha dung dịch borat 0,1 M, pH 8,5 1,2366 g acid boric trong 200 ml nước cất, điều chỉnh pH bằng NaOH - Pha 10 ml dung dịch borat 0,1 M, pH 8,5 với 90 ml nước cất. ™ Dung dịch trypsin 0,25% NaCl 0,8 g Na2HPO4 1,141 g KCl 0,02 g EDTA 0,02 g Phenol red 0,002 g Trypsin 0,25 g Nước cất vừa đủ 100 ml Khử trùng bằng lọc chân không vô trùng nếu số lượng lớn hoặc lọc bằng lọc syringe khi cần lọc với thể tích nhỏ. ™ Dung dịch versen 0,2% NaCl 8 g Na2HPO4 1,141 g KCl 0,2 g EDTA 0,2 g Nước cất vừa đủ 1 l Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121oC trong 30 phút. 58 MÔI TRƯỜNG DMEM AMINOACIDS L-Glutamine 584 mg/l L-Valine 94 mg/l L-Tyrosine + 2Na + 2H2O 103,79 mg/l L-Tryptophan 16 mg/l L-Threonine 95 mg/l L-Serine 42 mg/l L-Phenylalanine 66 mg/l L-Methionine 30 mg/l L-Lysine + HCl 146 mg/l L-Leucine 105 mg/l L-Isoleucine 105 mg/l L-Histidine + HCl + H2O 42 mg/l L-Cystine + 2HCl 62,6 mg/l L-Arginine + HCl 84 mg/l Glycine 30 mg/l INORGANIC SALTS Sodium chloride 6400 mg/l Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous 109 mg/l Postassium chloride 400 mg/l Magnesium sulfate anhydrous 97,67 mg/l Ferric nitrate Nonahydrate 0,1 mg/l Calcium chloride dihydrate 265 mg/l VITAMINS Thiamine + HCl 4 mg/l Riboflavine 0,4 mg/l Nicotinamide 4 mg/l Myo-inositol 7 mg/l 59 Folic acid 4 mg/l D-Ca pantothenate 4 mg/l Choline chloride 4 mg/l Pyridoxal + HCl 4 mg/l OTHER COMPONENTS Pyruvic acid.Na 110 mg/l Phenol red 15,9 mg/l D-Glucose 4500 mg/l 60 Hình 1: Tế bào vero. Hình 2: Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e 61 Hình 3: Thú thí ngiệm Hình 4: Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ 62 Hình 6: Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S Hình 5: Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ 63 BẢNG SỐ LIỆU OD620 CỦA PHẢN ỨNG CHUẨN ĐỘ ĐỘC TỐ VT2e 1 2 3 4 5 6 7 E 0,101 0,179 0,502 1,093 1,130 1,130 1,007 F 0,106 0,149 0,445 0,936 1,006 0,967 1,060 G 0,087 0,147 0,374 1,015 1,017 1,042 1,194 H 0,197 0,150 0,353 0,891 1,055 1,085 1,128 Cột 1 → cột 6: Độc tố pha loãng từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/2x105 Cột 7: Đối chứng tế bào 64 BẢNG SỐ LIỆU OD620 CỦA PHẢN ỨNG TRUNG HÒA ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO Mẫu kháng huyết thanh thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 1,116 1,146 1,153 1,022 0,856 0,676 0,417 1,267 0,145 0,922 B 1,120 1,032 1,047 1,056 0,881 0,701 0,518 0,138 1,011 C 0,103 0,676 Cột 1 → cột 6: Kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ ½ đến nồng độ 1/128 ủ với độc tố VT2e Cột 8: Đối chứng huyết thanh Cột 9: Đối chứng độc tố Cột 10: Đối chứng tế bào 65 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A 1,135 1,007 0,804 0,717 0,564 0,553 0,383 0,425 0,270 0,298 1,006 0,224 B 1,023 1,058 0,823 0,713 0,698 0,639 0,590 0,571 0,458 0,374 1,094 0,247 C 0,922 D 1,031 E 0,383 0,356 0,498 0,436 0,358 0,196 0,134 0,134 0,119 0,120 0,498 0,314 0,077 F 0,334 0,439 0,328 0,452 0,413 0,200 0,186 0,142 0,141 0,126 0,448 0,329 0,079 G 0,281 0,069 H 0,377 0,102 Hàng A → D: Mẫu kháng huyết thanh thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) Cột 1 → cột 10: Kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ 1/20 đến nồng độ 1/10240 ủ với độc tố VT2e Cột 11: Đối chứng huyết thanh Cột 12: - Hàng A, B: Đối chứng độc tố - Hàng C, D: Đối chứng tế bào Hàng E → H: Mẫu kháng huyết thanh thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) Cột 1 → cột 10: Kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ 1/20 đến nồng độ 1/10240 ủ với độc tố VT2e Cột 11: Đối chứng huyết thanh Cột 12: Đối chứng tế bào Cột 13: Đối chứng độc tố 66 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A 0,785 0,845 0,911 0,899 0,919 0,885 0,575 0,609 0,541 0,405 0,914 0,785 0,326 B 0,788 0,735 0,801 0,676 0,949 0,789 0,597 0,602 0,466 0,397 0,657 0,739 0,326 C 0,643 0,323 D 0,785 0,410 E N N N N N 0,526 0,457 0,493 0,110 0,401 N 0,695 0,198 F N N N N N 0,539 0,433 0,383 0,360 0,416 N 0,704 0,184 G 0,619 0,214 H 0,562 0,210 Hàng A → D: Mẫu kháng huyết thanh thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) Hàng E → H: Mẫu kháng huyết thanh thỏ 2 Cột 1 → cột 10: Kháng huyết thanh pha loãng từ nồng độ 1/20 đến nồng độ 1/102408 ủ với độc tố VT2e Cột 11: Đối chứng huyết thanh Cột 12: Đối chứng tế bào Cột 13: Đối chứng độc tố