Luận văn Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1

lden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009) Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet 9 potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy et al, 2009). 2.1.4. RNAi và cơ chế kháng bệnh bằng phƣơng pháp chuyển gen virus RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu. Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide. Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có 10 chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo nguyên tắc bổ sung. Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn. 2.1.5. Một số thành tựu của cây trồng chuyển gen kháng virus ở Việt Nam Virus là nguyên nhân gây hại tới nhiều loại cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Hầu hết các bệnh thực vật do virus gây ra cho tới nay chưa có thuốc đặc trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiều nghiên cứu tại nước ta. Từ năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học phối hợp với 5 nước trong khu vực ASEAN tham gia vào chương trình nghiên cứu phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus : PRSV) do tổ chức ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech Application) tài trợ. Trong khuôn khổ đề tài nhóm thực hiện đã phân lập được g en CP của một số chủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bộ . Gen CP được sử dụng để thiết kế các cấu trúc chuyển gen vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus đốm vòng . Một số dòng cây đu đủ chuyển gen đã biểu hiện tính kháng virus sau khi thử nhiễm bệnh nhân tạo (Lâm Đại Nhân, 2000; Lê Trần Bình, 2008) Thời gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và TS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus . Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện KH &CN Việt Nam được tiến hành 11 trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Hình 1.2: Dòng thuốc lá T-CMV-49 biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn và cây đối chứng WT2-1 sau 3 lần lây nhiễm Tiếp đó , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn” (KC.04.03/06-10) đã thiết kế thành công 2 đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen CP , Nib và HC -pro của PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoạn gen đa đoạn RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn lụi (Citrus tristeza virus, CTV) và thiết kế thành công những cấu trúc RNAi mang các gen đa đoạn này . Thử nghiệm tính kháng với các dòng đu đủ và cam chuyển gen mang cấu trúc RNAi trên cho thấy sự có mặt của vir us gây bệnh trên các dòng cây chuyển gen nhưng không thấy cây có biểu hiện bệnh (Chu Hoàng Hà, 2010). 12 Hình 1.3: Dòng đu đủ biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn(hình A) và cây đối chứng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà khoa học Việt Nam và mở ra khả năng ứng dụng công nghệ RNAi đối với các đối tượng cây trồng khác. 2.2. Cây thuốc lá- mô hình nghiên cƣ́u tạo cây trồng chuyển gen khá ng virus 2.2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thuộc họ (Family) : Solanaceae (họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L. Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ, 14 phân chi và 65 loài. Trong số 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia trong đó loài N. tabacum thuộc phân chi Genuinae là được gieo trồng thương mại trên khắp thế giới. Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam (Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống từng bước được nâng cao với thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm. Thuốc lá có giá trị kinh tế cao, ngoài việc tiêu dùng trong nước nó còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, 13 cây thuốc lá còn được coi là mô hình để tiến hành nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản về chức năng , vai trò cũng như cơ chế hoạt động của các gen cũng như được sử dụng làm mô hình thử nghiệm và phát triển những nghiên cứu ứng dụng như biểu hiện các protein tái tổ hợp có giá trị. 2.2.2. Tình hình bệnh virus hại thuốc lá Hiện nay, bệnh virus là một trong những nguyên nhân làm gi ảm năng suất và chất lượng cây thu ốc lá nguyên liệu. Trong đó , virus khảm thuốc lá (TMV) và virus khảm dưa chuột (CMV) là hai virus gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất (Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam). Bệnh khảm lá xuất hiện khá sớm ngay sau khi cây phục hồi ho àn toàn với tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng , từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% như ở xã Lâu Thượng , tỉnh Thái Nguyên; trong đó giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV và CMV chủ yế u là K326. Thiệt hại do virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng (Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích, 2008) Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV gây ra nói riêng hiện vẫn chưa có loại thuốc hóa học nào khả dĩ có thể phòng trị được một cách hữu hiệu , do đó các biện pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dụng các hạt giống sạch bệnh để trồng , không sử dụng các hạt giống từ các ruộng trước đó đã bị bệnh nói trên để làm giống cho vụ sau . Thường xuyên kiểm tra đồng ruộng để phát hiện và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút như bọ cách tơ , bọ phấn, rệp muội…bằng các loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan . Khi phát hiện các triệu chứng bệnh trên đồng ruộng cần tập trung nhổ cây , đem ra khỏi ruộng tiêu hủy để tránh lây lan. 2.2.3. Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV) TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998). 14 TMV là virus hình que có chiều dài 300 A0, đường kính từ 150-170 A0 có cấu tạohình ống rỗng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm. TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn. Dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành một vòng xoắn. (Stryer Lubert, 1988). Genome của TMV gồm 6400 nucleotide được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs). RNA của TMV có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp 68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987). Tiếp theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kích thước tương ứng là 183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982). Đây là protein có vai trò quan trọng trong quá trình sao chép của virus. Vùng mã hóa thứ 3 mã hoá cho protein cần thiết cho sự di chuyển qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có khối lượng phân tử khoảng 30 kDa. Protein vỏ (CP) có khối lượng phân tử 17,5kDa nằm trong vùng mã hóa thứ 4. Hình 1.4. Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998) Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật. Kích thước của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc. Vỏ protein với kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4. Các đặc điểm của hệ gen và các subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới. Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot, trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993). Tại đầu 3‟ của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyển (tRNA) có thể được aminoacyl hóa. CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có thể điều khiển sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al., 15 1990; Kawakami et al., 2004). Vai trò của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyển gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007) TMV có thể gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ (Shew and Lucas, 1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đồng đều xen lẫn nhau , hình loang lổ như da ếch , hay còn gọi là dạng khảm. TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua các vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ. TMV rất bền như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm. Trong nhiều trường hợp TMV phối hợp với virus X khoai tây (PVX) cùng gây hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi (double virus streak hay là Mixed virus streak). Bệnh nặng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999). 16 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1 Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thƣ̣c vật: Hạt thuốc lá Nicotiana tabacum L. (giống K326) thế hệ T1 chuyển gen mang cấu trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp 2.1.2. Hóa chất, máy móc, thiết bị - Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K2PO4, KH2PO4, SiC, HCl, NaOH, MgCl2, Etanol 70%, nước Javen, nước khử ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA polymerase và các hóa chất thông dụng khác - Máy móc, thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm , cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khử trùng hạt thuốc lá 2.2.1.1. Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng pippet khử trùng. Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ. Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy bằng pippet, rửa hạt 4-5 lần bằng nước cất khử trùng. 2.2.1.2. Khử trùng hạt bằng khí Clo 17 Hạt thuốc lá được cho vào từng ống eppendorf, mở nắp và cho vào bình Pyrex dung tích 250ml. Mở hé ¼ nắp bình Pyrex có chứa hạt thuốc lá và đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa 100ml dung dịch Javel. Dùng pipet thủy tinh hút lấy 3ml HCl đặc cho vào cốc thủy tinh đựng Javel để tạo khí Clo sau đó đậy kín bình khử trùng và dán parafin. Sau 3-9h tháo parafin và mở hé ¼ nắp bình khử trùng trong khoảng 2 phút để bay hết khí, sau đó vặn chặt nắp bình Pyrex và lấy ra ngoài. Mở nắp bình Pyrex trong box cấy 30 phút để bay hết khí và cấy hạt trên môi trường. 2.2.2. Phân tích sƣ̣ phân ly của gen chuyển Gieo hạt và đánh giá tỉ lệ kháng kanamycine - Gieo hạt trên đĩa nhựa chứa môi trường MS - Sau khi cây con mọc cao khoảng 1cm thì chuyển sang bình tam giác 250ml chứa môi trường MS + kanamycine 50mg/l. Mỗi dòng chuyển 80 cây và đặt 10 cây/ bình tam giác - Sau 3-4 tuần quan sát, đánh giá số lượng cây sống sót trên môi trường có kanamycine 2.2.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phƣơng pháp PCR 2.2.3.1. Tách ADN tổng số: - Nghiền mẫu lá (khoảng 50 mg) trong ống eppendorf 2 ml bằng nitơ lỏng - Thêm 500 l “Shorty Buffer” (0,2 M Tris-HCl pH9; 0,4 M LiCl; 25 mM EDTA; 1% SDS và nước đề ion khử trùng ) - Ly tâm 13000 v/p - Hút 350 l dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml có sẵn 350 l isopropanol - Đảo nhẹ và ly tâm 13000 v/p - Loại dịch nổi, làm khô cặn - Bổ sung 50-100 l nước đề ion khử trùng để hòa tan cặn. - DNA được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. 18 2.2.3.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR được tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri với trình tự như sau: TMV-Fi: 5‟- CACCATGAAACCTTCACCACA-3‟ TMV-Ri: 5‟- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3‟ Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 10,1 2 Buffer PCR (NH + 4) 2 3 MgCl2 2 4 dNTPs 1,6 5 Primer – Fi 0,8 6 Primer – Ri 0,8 7 Taq polymerase 0,2 8 Template 2,5 Tổng 20 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ ( O C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 50 1 phút 25 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.2.4. Phƣơng pháp lây nhiễm virus nhân tạo 19 Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm được kiểm tra tính kháng virus nhân tạo của Herbers và các cộng sự (1996) có cải tiến. Các bước tiến hành như sau: - Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong 20 ml buffer) với pH = 7. - Lá lây nhiễm được gây tổn thương nhẹ bằng SiC. - Cho dịch virus lên phần lá đã gây xước, sau vài phút rửa lá bằng nước. - 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây. - Có thể lây nhiễm thêm nếu sau khi lây nhiễm lần 1 không thấy bệnh biểu hiện trên cây WT. - Đánh giá kiểu hình của các cây lây nhiễm nhân tạo sau 10-20 ngày 2.2.5. Phƣơng pháp ELISA - Lấy 200 mg lá non (lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống) nghiền thành dịch đồng nhất với 2 ml đệm PBST (16 mM Na2HPO4, 3,9 mM Na H2PO4, 127 mM NaCl và 0,05 % Tween 20 (pH 7,2)) có chứa 0,1 % albumin bò (Sigma). - Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4 oC, 10 phút. - Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên). Từ đĩa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng nguyên vào mỗi giếng và ủ 37 oC khoảng 1 h. - Sau khi, rửa 3 lần với đệm PBST, kháng thể (IgG) kháng CMV, TMV và PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thích hợp, sẽ được bổ sung vào những giếng có kháng nguyên và ủ 37 oC trong 1 h. - Đĩa được rửa lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp đoạn F(ab‟)2 đã tinh sạch từ IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa 0,1 % albumin bò. 20 - Đĩa được ủ một lần nữa ở 37 oC trong 1 h. Sau khi rửa, đệm nền (10 % diethaolamine, 3 mM NaN3, pH 9,6) chứa 0,1 % disodium p-nitrophenyl phosphate, được bổ sung vào các giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 30-40 phút. - Giá trị OD được đo ở 405 nm bởi một microplate reader. Phản ứng màu được tạo ra bằng việc các mẫu kiểm tra được so sánh với giếng đối chứng âm đã biết. - Một cây kiểm tra được xác định là dương tính khi giá trị OD trung bình lớn hơn hai lần giá trị trung bình của đối chứng âm 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhằm ứng dụng công nghệ RNAi trong nghiên cứu tạo giống cây trồng kháng virus tại Việt Nam, các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành phân lập gen CP mã hóa cho protein vỏ của virus gây bệnh khảm lá (TMV), thiết kế vector RNAi mang chính đoạn gen CP đó theo cả 2 chiều xuôi-ngược rồi chuyển vào cây thuốc lá. Ở thế hệ ban đầu (T0) đã thu được 17dòng cây chuyển gen có tính kháng TMV lớn hơn 90%. Tiếp tục phát triển những nghiên cứu trên, đề tài đã tiến hành những nghiên cứu ở thế hệ T1 với mục đích: - Phân tích sự phân ly của dòng thuốc lá chuyển gen TMV_RNAi ở thế hệ T1 - Phân tích khả năng kháng virus của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo - Đánh giá sự tồn tại của TMV trong dòng thuốc lá chuyển gen bằng phương pháp ELISA 3.1. Phƣơng pháp khử trùng hạt thuốc lá 17 dòng T0 có tính kháng virus cao được giữ lại trồng trong nhà lưới sau khoảng 4 tháng tiến hành thu hoạch hạt từ các dòng cây này và cho nảy mầm trong điều kiện in vitro phục vụ cho những phân tích tiếp theo. Khử trùng hạt thuốc lá trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro gặp một số khó khăn sau: - Hạt thu trong điều kiện nhà lưới mang nhiều nấm mốc - Kích thước hạt nhỏ nên khó thao tác, rất dễ mất một lượng lớn hạt trong quá trình khử trùng Do vậy lựa chọn phương pháp khử trùng thích hợp cho hạt không bi nhiễm nấm mốc trở lại nhưng tỉ lệ nảy mầm cao là yêu cầu đầu tiên trong thí nghiệm của đề tài. Dung dịch Javel thương phẩm và khí clo được sử dụng như 2 loại chất tẩy rửa 22 khác nhau nhằm tìm kiếm phương pháp khử trùng cho tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ hạt nảy mầm cao đồng thời không tốn thời gian thao tác thí nghiệm. Bảng 3.1 Hiệu quả khử trùng hạt thuốc lá Phƣơng pháp Tỉ lệ nảy mầm (%) Tỉ lệ nhiễm (%) Tổng thời gian khử trùng (h) Thời gian thao tác (h) 10%Javel /20ph 95 95 3 3 20%Javel /20ph 95 95 3 3 30%Javel /20ph 90 6 3.5 3.5 Khí Clo/3h 91 35 3.5 0.5 Khí Clo/6h 88 3 6.5 0.5 Khí Clo/9h 24 1 9.5 0.5 Tiến hành thử nghiệm khử trùng mỗi lô 100 hạt thuốc lá bằng các dung dịch Javel 10%, 20% và 30% trong 20 phút cho thấy dung dịch 10% và 20% Javel thương phẩm không thể khử trùng hạt thuốc lá, tỉ lệ nhiễm lại đạt tới hơn 90%. Dung dịch Javel 30% tỉ lệ nảy mầm hạt cao nhưng tỉ lệ mẫu bị nhiễm lại cũng giảm đáng kể (bảng 3.1). Thí nghiệm khử trùng bằng khí clo được tiến hành tương tự, 100 hạt thuốc lá mỗi lô được đem vào khử trùng bằng luồng khí clo trong 3h, 6h và 9h. Đối với thời gian khử trùng khí Clo 3h hạt vẫn nảy mầm nhưng không diệt được nấm mốc, còn ở thời gian 9h nấm mốc không còn mọc trên môi trường nảy mầm nữa nhưng hiệu quả nảy mầm khá thấp, chỉ còn ít hơn 10%. Xử lí hạt bằng luồng khí clo trong 6h cho hiệu suất nảy mầm cao nhất với 88%, tỉ lệ hạt nhiễm lại thấp nhất (bảng 3.1). Cây con phát triển tốt sau khi khử trùng (hình 3.1). Như vậy, hạt thuốc lá có thể khử trùng hoàn toàn bằng dung dịch Javel 30% trong 15 phút hoặc luồng khí clo trong 6h. Tuy nhiên, xử lí hat bằng khí clo có ưu thế về thời gian thao tác khi chỉ mất khoảng nửa tiếng (bảng 3.1) mà vẫn đảm bảo lượng hạt còn lại sau khử trùng tốt hơn. 23 A B Hình 3.1: Hình ảnh hạt thuốc lá (A) và cây con (B) trên môi trường nảy mầm theo phương pháp khử trùng khí clo trong 6h. 3.2. Phân tích khả năng phân ly của gen chuyển Trong qúa trình tái sinh cây chuyển gen, việc sử dụng các gen có khả năng chọn lọc đi kèm với gen đích là hết sức cần thiết nhằm tách ra được số lượng ít ỏi các tế bào chuyển gen trong vô số các tế bào không mang gen chuyển. Các gen kháng các loại kháng sinh như kanamycine, hygromycine; kháng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ hoặc mã hóa cho khả năng sử dụng một số loại đường như manose thường đươc sử dụng làm gen chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật. Trong những nghiên cứu trước đây, vector RNAi TMV-CPi có bộ khung chứa gen nptII mã hóa cho gen kháng kanamycin đã được chuyển vào giống thuốc lá K326 và thu được những dòng cây T0 kháng virus. Kiểm tra bằng phương pháp PCR đã cho thấy những dòng T0 này mang cả gen nptII và gen đích TMV-CPi. Do vậy, đối với những dòng cây ở thế hệ T1 tiếp theo, những dòng cây thuốc lá sinh trưởng được trên môi trường có kanamycine được coi là mang gen đích và có thể đánh giá khả năng di truyền ở thế hệ tiếp theo của gen đích thông qua hoạt động của gen nptII. Thí nghiệm đã được tiến hành bằng cách gieo các hạt của 17 dòng thuốc lá T1chuyển gen trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá khả năng nảy mầm và phát triển cây sau 4 tuần. Kanamycine có vai trò ức chế hoạt 24 động của ribosome trong tế bào thực vật, kiểu hình thường thấy của các cây mẫn cảm với kanamycine là vàng lá, rễ không phát triển và chết (hình 3.2). Hình 3.2: Sàng lọc thuốc lá chuyển gen T1 RNAi TMV-CPi. TMV2.6: Cây thuốc lá chuyển gen T1 trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-1: Cây thuốc lá không chuyển gen trên môi trường có Kan 50mg/l; WT-2: Cây thuốc lá không chuyển gen trên môi trường không có Kan. Mũi tên chỉ hình ảnh một số cây không kháng kanamycine trên môi trường chọn lọc. Trong các phương pháp được sử dụng hiện nay, chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens được coi là biện pháp dễ áp dụng với chi phí thấp mà lại rất hiệu quả. Do được thiết kế gắn vào đoạn Ti plasmid nên gen đích phần lớn sẽ được gắn vào genome của thực vật tại một hoặc vài điểm. Số điểm gắn này thường được định nghĩa là số lượng bản sao hay bản copy của gen đích. Nếu cây chuyển gen có 1 bản copy, gen đích sẽ được di truyền theo định luận Menđen theo tỷ lệ phân ly 3:1 và có khả năng chọn lọc những dòng cây đồng hơp tử của gen đích ở thế hệ tiếp theo. Chọn lọc cây đồng hợp tử nhằm tạo cơ sở gen đích được di truyền và hoạt động một cách ổn định qua nhiều thế hệ là một trong những yêu cầu quan trọng trong nghiên cứu phát triển cây chuyển gen thành giống. Vì những lí do đó, trong nghiên cứu tiếp theo của đề tài đánh giá tỷ lệ phân ly của gen nptII trong 17 dòng cây chuyển gen RNAi TMV-CPi. Gieo 80 hạt của mỗi dòng cây trên môi trường có bổ sung 50mg/l kanamycine và đánh giá tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm sau 4 tuần. Hai lô thí nghiệm đối chứng cũng được tiến hành song song. Lô thứ nhất (WT-1) hạt thuốc lá K326 không chuyển gen được gieo trên môi trường MS có bổ sung 50mg/l kanamycine và lô thứ 2 (WT-2) hạt được gieo trên môi trường MS không có kháng sinh. Lô WT-1 vàng dần và chết sau 4 tuần ngược lại lô WT-2 cây con sinh trưởng và phát triển tốt. Những cây chuyển gen cũng có kiểu hình WT-2 WT-1 TMV2.6 25 tương tự WT-2 được đánh giá là kháng kanamycine còn kiểu hình tương tự WT-1 được coi là mẫn cảm (hình 3.1). Kết quả thu được có 4 dòng tỷ lệ cây kháng/cây mẫn cảm không rõ ràng (bảng 3.2); 2 dòng có tỷ lệ 2:1 và 9 dòng cây có tỷ lệ là 3:1 (bảng 3.2). Theo tính toán lý thuyết thống kê, nếu giá trị 2 quan sát bé hơn 3.84 (~p>=0.05) thì sự sai khác giữa giá trị quan sát và giá trị tính toán lý thuyết là không có ý nghĩa. ( Trong 9 dòng cây có tỉ lệ 3:1 thu được, giá trị 2 nằm trong khoảng 0-1.6. Điều này có nghĩa là giá trị quan sát phù hợp với giá trị tính toán dưới định luật Mendel. Bảng 3.2: Kết quả phân tích tính kháng Kan của các cây thuốc lá chuyển gen T1 mang cấu trúc RNAi TMV-CPi TT Dòng cây Tổng số hạt Cây kháng Cây mẫn cảm Tỷ lệ 2 test 1 TMV2.3 80 69 11 - - 2 TMV2.4 80 80 0 - - 4 TMV2.6 80 65 15 3:1 1.667 5 TMV2.7 80 60 20 3:1 0 6 TMV2.10 80 59 21 3:1 0.067 7 TMV2.12 80 80 0 - - 8 TMV2.13 80 55 25 2:1 0.156 9 TMV2.15 80 51 29 2:1 0.306 10 TMV2.18 80 60 20 3:1 0 11 TMV2.22 80 58 22 3:1 0.267 12 TMV2.23 80 63 17 3:1 0.6 26 13 TMV2.29 80 63 17 3:1 0.6 14 TMV2.30 80 58 22 3:1 0.267 15 TMV2.31 80 58 22 3:1 0.267 16 TMV2.43 80 78 2 - - 17 TMV2.44 80 79 1 - - 3.3. Xác định gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1 bằng PCR PCR là kỹ thuật phổ biến nhất để sàng lọc các dòng cây chuyển gen dương tính (Vikrant Nain, 2005). PCR sẽ kiểm tra sự tồn tại của gen chuyển trong genome thực vật chuyển gen. Trong nghiên cứu này, 9 dòng thuốc lá chuyển gen có sự phân ly tính kháng Kan theo tỷ lệ Mendel 3:1 sẽ tiếp tục được phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen chuyển TMV-Fi/TMV-Ri. Để thực hiện phản ứng PCR, đầu tiên mẫu DNA tổng số từ các mẫu lá thuốc lá chuyển gen T1 được tách chiết theo phương pháp của Accotto và cộng sự (2000). Hình 3.3: DNA tổng số của một số dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang gen virus TMV Lá thuốc lá có rất nhiều nhựa nên có thể gây khó khăn trong việc tách chiết DNA. Tuy nhiên, để khắc phục nhược điểm này, chúng tôi đã nghiền thật nhanh mẫu lá trong nitơ lỏng và bổ sung ngay đệm chiết, bước này được tiến hành nhanh làm cho các chất 27 polyphenol không kịp oxi hóa nên chất lượng DNA tổng số vẫn đảm bảo. Phương pháp của Accotto và cộng sự (2000) có đặc điểm là đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với những thí nghiệm có số lượng mẫu nhiều nhưng vẫn đảm bảo chất lượng DNA cho phản ứng PCR. Kết quả điện di DNA tổng số của một số dòng thuốc lá chuyển gen trên gel agarose 0,8% thể hiện trên hình 3.3 đã cho thấy chất lượng và hàm lượng DNA tổng số tương đối tốt, đảm bảo cho thí nghiệm PCR tiếp theo. DNA tổng số của các dòng cây chuyển gen T1 đã được làm khuôn cho phản ứng PCR. Song song, plasmid mang cấu trúc RNAi TMV-CPi và nước cất deion cũng được sử dụng làm đối chứng dương và âm cho phản ứng. Với plasmid RNAi TMV-CPi chúng tôi đã nhân được một sản phẩm PCR có kích thước khoảng 300bp, tương đương với tính toán lý thuyết của đoạn TMV-CPi là 313bp. Đối chứng âm không xuất hiện băng sản phầm nào. 100% dòng kiểm tra cho sản phẩm PCR tương đương với đối chứng dương (Hình 3.4). Điều này chứng tỏ, cấu trúc chuyển gen RNAi TMV-CPi đã có mặt trong các cây chuyển gen T1. Hình 3.4. Kiểm tra sự có mặt gen TMV-CPi trong một số dòng thuốc lá chuyển gen T1 bằng phương pháp PCR WT1, WT2: cây không chuyển gen; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; TMV2.7, TMV2.18, TMV 2.6, TMV2.10, TMV2.22 : các dòng cây chuyển gen 28 3.4. Đánh giá tính kháng bệnh của các dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang cấu trúc RNAi TMV-CPi bằng lây nhiễm nhân tạo virus Điều quan trọng nhất của nghiên cứu này là chọn tạo được những dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus TMV ổn định. Vì vậy, để kiểm tra tính kháng, 20 cây thuốc lá chuyển gen T1 kháng Kan 50mg/l của mỗi dòng thuốc lá đã được sàng lọc trên môi trường kháng sinh cho tỷ lệ 3:1 và 10 cây đối chứng WT1 không chuyển gen đã được lây nhiễm nhân tạo virus TMV theo phương pháp của Herbers và cộng sự (1996). Sau khi lây nhiễm virus, các dòng thuốc lá được quan sát sự biểu hiện bệnh virus bằng cảm quan so sánh với cây WT2 không chuyển gen không lây nhiễm virus. Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh qua lây nhi ễm nhân tạo virus TMV đối với các dòng thuốc lá chuyển gen T1 mang cấu trúc RNAi TMV -CPi và cây đối chứng WT STT Cây T1 Ra cây nhà lƣới Bio- test Số cây kháng Số cây nhiễm bệnh Mức độ nhiễm bệnh 1 TMV2.06 20 20 18 2 ++ 2 TMV2.07 20 20 20 0 - 3 TMV2.10 20 20 20 0 - 4 TMV2.18 20 20 20 0 - 5 TMV2.22 20 20 20 0 - 6 TMV2.23 20 20 20 0 - 7 TMV2.29 20 20 20 0 - 8 TMV2.30 20 20 20 0 - 9 TMV2.31 20 20 20 0 - 29 10 WT1 10 10 0 10 ++, +++ 11 WT2 10 - 10 0 - Ghi chú: (-): không nhiễm bệnh, (++) và (+++) lần lượt là mức độ biểu hiện bệnh trung bình và nặng. Kết quả đánh giá tính kháng virus được thống kê trên bảng 3.3. Sau khi lây nhiễm, chỉ có 2/9 dòng/180 cây có biểu hiện nhiễm bệnh TMV ở mức độ nhiễm bệnh trung bình với các vết khảm loang lổ nhỏ trên khắp bề mặt 1 đến 2 lá non. 178 cây còn lại (99%) không có biểu hiện bệnh. Trong khi đó, cây WT1 có 10/10 cây có biểu hiện bệnh ở mức độ trung bình đến nặng, các vết khảm loang lổ to xuất hiện trên khắp bề mặt các lá non và cây còi cọc. Những cây chuyển gen có biểu hiện bệnh có thể do cây mang gen chuyển dị hợp tử, nên vẫn kháng được trên môi trường sàng lọc Kan 50mg/l nhưng không kháng được virus. Còn những cây có biểu hiện kháng hoàn toàn là do mang gen chuyển đồng hợp tử. Hình 3.5: Biểu hiện bệnh TMV sau khi lây nhiễm nhân tạo virus TMV lần 1 3.5. Xác định sự có mặt của phân tử virus trên các dòng thuốc lá chuyển gen sau khi lây nhiễm virus nhân tạo bằng ELISA T1TMV2.06-10 T1TMV2.06-10 T1TMV2.06-6 WT1-1 30 RNAi trong cây chuyển gen sẽ phân hủy RNA của virus xâm nhập dẫn tới không hình thành các phân tử virus mới hoặc hàm lượng phân tử virus sẽ bị giảm đáng kể. Để kiểm tra sự có mặt của phân tử TMV, 5 cây/dòng thuốc lá T1 có biểu hiện kháng hoàn toàn virus TMV sau lây nhiễm được lựa chọn ngẫu nhiên tham gia phản ứng ELISA. Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra ELISA các dòng thuốc lá T1 sau khi lây nhiễm TMV Dòng thuốc lá T1 Giá trị OD ở 405 nm sau 12 giờ Dòng thuốc lá T1 Giá trị OD ở 405 nm sau 12 giờ Dòng thuốc lá T1 Giá trị OD ở 405 nm sau 12 giờ OD KL OD KL OD KL TMV 2.06-1 0.105 - TMV 2.22-1 0.11 6 - TMV 2.31- 1 0.10 5 - TMV 2.06-2 0.106 - TMV 2.22-2 0.11 2 - TMV 2.31- 2 0.11 2 - TMV 2.06-3 0.103 - TMV 2.22-3 0.10 1 - TMV 2.31- 3 0.11 8 - TMV 2.06-4 0.109 - TMV 2.22-4 0.10 2 - TMV 2.31- 4 0.12 4 - TMV 2.06-5 0.112 - TMV 2.22-5 0.11 8 - TMV 2.31- 5 0.13 2 - TMV 2.07-1 0.117 - TMV 2.23-1 0.11 1 - WT2.1 0.12 2 - TMV 2.07-2 0.103 - TMV 2.23-2 0.10 2 - WT2.2 0.11 2 - TMV 2.07-3 0.105 - TMV 2.23-3 0.09 2 - WT2.3 0.20 2 - 31 TMV 2.07-4 0.114 - TMV 2.23-4 0.09 7 - WT2.4 0.18 6 - TMV 2.07-5 0.108 - TMV 2.23-5 0.11 5 - WT2.5 0.19 9 - TMV 2.10-1 0.102 - TMV 2.29-1 0.11 3 - TMV 2.10-2 0.112 - TMV 2.29-2 0.14 1 - WT1.1 1.40 9 + TMV 2.10-3 0.118 - TMV 2.29-3 0.12 5 - WT1.2 1.38 5 + TMV 2.10-4 0.098 - TMV 2.29-4 0.10 3 - WT1.3 1.07 5 + TMV 2.10-5 0.112 - TMV 2.29-5 0.11 6 - WT1.4 1.27 1 + TMV 2.18-1 0.114 - TMV 2.30-1 0.09 6 - WT1.5 1.93 6 + TMV 2.18-2 0.105 - TMV 2.30-2 0.11 3 - TMV 2.18-3 0.111 - TMV 2.30-3 0.11 2 - Đ/c dương 1.14 8 + TMV 2.18-4 0.089 - TMV 2.30-4 0.11 9 - TB đ/c âm 0.09 2 - TMV 2.18-5 0.114 - TMV 2.30-5 0.12 4 - 2x TB đ/c âm 0.18 4 Ghi chú: (1) TB đ/c âm là trung bình giá trị OD của 4 mẫu đối chứng âm (cây khỏe không nhiễm TMV); (2) Các mẫu được phản ứng dương là mẫu có giá trị OD (optical density = mật độ quang) > 2 lần giá trị trung bình của đối chứng âm; (3) KL là kết luận; (-) âm tính, không có virus; (+) dương 32 tính, có mặt virus trên cây. ELISA là phương pháp phát hiện nhanh sự có mặt của phân tử virus trên cây trồng dựa vào phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu cho virus. ELISA có khả năng phát hiện sự có mặt của virus trên cây ngay cả khi sự biểu hiện bệnh trên cây không thể phát hiện bằng cảm quan. Trong nghiên cứu này, khi giá trị OD405>0,184 thì phản ứng ELISA cho kết quả dương tính với màu vàng xuất hiện trên bản kiểm tra ELISA (Hình 3.5). Lượng virus càng cao thì màu vàng xuất hiện càng đậm. Hình 3.6: Hình ảnh ELISA kiểm tra sự có mặt của virus trên một số dòng thuốc lá chuyển gen RNAi TMV-CPi ở thế hệ T1 có biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn sau ba lần lây nhiễm virus. Phân tích ELISA được thống kê trên bảng và thể hiện trên hình đã cho thấy có 100% dòng thuốc lá chuyển gen kiểm tra ELISA đều cho OD405<0,184, chứng tỏ những dòng thuốc lá này không có mặt virus TMV trong cây hay sau khi lây nhiễm virus đã bị bất hoạt bằng cơ chế RNAi. Điều này cũng có nghĩa là hoạt động của cấu trúc RNAi TMV-CPi trong những dòng thuốc lá T1 là khá tốt. Như vậy, có thể kết luận chúng tôi đã chọn được những dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 mang cấu trúc RNAi TMV-CPi có khả năng kháng virus TMV. 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Sử dụng khí Clo sau 6h thích hợp cho khử trùng hạt thuốc lá. 2. Chọn lọc được 9 dòng thuốc lá T1 có tỷ lệ phân ly 3:1 theo định luật Mendel. 3. Toàn bộ cây T1 phát triển trên môi trường có kanamycine đều mang gen chuyển. 4. 99% cây T1 đều có biểu hiện kháng virus TMV sau 1 lần lây nhiễm. 5. Những dòng thuốc lá T1 có biểu hiện kháng hoàn toàn đều cho kết quả âm tính khi kiểm tra sự có mặt của virus bằng ELISA ĐỀ NGHỊ Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục sàng lọc và chọn tạo được dòng thuốc lá chuyển gen ưu thế có khả năng kháng TMV để tạo dòng thuần. 2. Sử dụng các cấu trúc RNAi thiết kế được để chuyển vào những giống cây trồng có giá trị khác (cây họ cà, họ bầu bí, họ đậu… ) đang chịu thiệt hại nặng nề bởi virus tương ứng nhằm tạo ra những giống cây trồng có khả năng kháng bệnh virus. 34 Tài liệu tham khảo Vikrant Nain, Rajani Jaiswal, Monika Dalal, Bandarupalli Ramesh and Polumetla A. Kumar (2005) Polymerase chain reaction analysis of transgenic plants contaminated byAgrobacterium. Plant Molecular Biology Reporter 23(1): 59-65) Accotto GP, Navas-Castillo J, Noris E, Moriones E, Louro D (2000) Typing of Tomato yellow leaf curl viruses in Europe. Eur J Plant Path 106: 179-186. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Chu Hoàng Hà (2010) Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài „Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn”, mã số KC.04.03/06-10 Lâm Đại Nhân (2000) Luận văn thạc sỹ sinh học “Thiết kế vector mang gen CP của virus đốm vòng Việt Nam PRSV nhằm tạo cây chuyển gen kháng bệnh” Lê Trần Bình (2008) Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” (giai đoạn 2007-2008) Lê Trần Bình (2006) Báo cáo tổng kết đề tài Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” (giai đoạn 2005-2006) Lê Trần Bình (2009) Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và Công nghệ Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc lá nguyên liệu” Báo cáo khoa học. Công ty TNHH Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam: Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6 (4A): 679- 687 Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật. Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V, Sundaresan V (2005) Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana.Genome Res. 15(1): 78-91 Aswath CR, Mo SY, Kim DH, Park SW (2006) Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase. Plant Cell Rep 5: 92–99 35 Banttari EE, Ellis PJ, Khurana SMP (1993) Management of diseases caused by viruses and viruslike pathogens. Pages 127-133 in Rowe, R.C. ed. Potato health management. APS Press. St. Paul, MN Bartel B, Bartel DP (2003) MicroRNAs: at the root of plant development? Plant Physiol. 132(2): 709-17 Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell 116(2): 281-97 Bartel DP (2009) MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.Cell 136(2): 215-33 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431(7006): 356-63 Baulcombe D (1996) Mechanisms of Pathogen-Derived Resistance to Viruses in Transgenic Plants. The Plant Cell 8: 1833-1844 Beachy RN, Loesch-Fries S, Tumer NE (1990) Coat protein-mediated resistance against virus infection. Annu Rev Phytopathol 28: 451-474 Beachy RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354: 659-664 Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 20(6): 717-26 Boscariol RL, Almeida WAB, Derbyshire MTVC, Mour˜ao Filho FAA, Mendes BMJ (2003) The use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck). Plant Cell Rep 22:122–128 Braun CJ, Hemenway CL (1992) Expression of amino-terminal portions or full-length viral replicase genes in transgenic plants confers resistance to potato virus X infection. Plant Cell 4: 735-744 Brunt A. (1997) Plant Viruses Online: vide/ descr837.htm Carr JP, Marsh LE, Lomonossoff GP, Sekiya ME, Zaitlin M (1992) Resistance to tobacco mosaic virus induced by the 54-kDa gene sequence requires expression of the 54-kDa protein. Mol Plant-Microbe Interact 5: 397-404 Chicas A and Macino G (2001) Characteristic of post-transcriptional gene silencing. EMBO reports 111: 992-6 Collmer CH, Vogt VM, Zaitlin M (1983) H protein, a minor protein of TMV virions, contains sequences of the viral coat protein. Virology 126: 429. de Lange P, van Blokland R, Kooter JM, Mol JN (1995) Suppression of flavonoid flower pigmentation genes in Petunia hybrida by the introduction of antisense and sense genes. Curr Top Microbiol Immunol. 197: 57-75 36 di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res. 14(6): 989-94 Ecker JR, Davis RW (1986) Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(15):5372-5376. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391(6669): 806-11 Genus Nicotiana, Goelet P, Lomonossoff GP, Butler PJ, Akam ME, Gait MJ, Karn J (1982) Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 79 (19): 5818-5822 Goldbach R, Bucher E, Prins M (2003) Resistance mechanisms to plant viruses: an overview. Virus Res. 92(2): 207-212 Goldback R and Wellink J (1996) Comoviruses: Molecular biology and replication, in The plant Viruses, vol. 5 (Harrison B.D. and Murant A.F., eds.) Plenum, New York, pp 35-76 Goldberg NP (1999) Tomato Spotted Wilt Virus: pubs/ _h/ h-242.html Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogen-derived resistance and practical approaches to plant virus disease control. Adv Virus Res. 75:161-83 He L, Hannon GJ (2004) MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.Nat Rev Genet. 4 (7): 522-31 He Z, Duan Z, Liang W, Chen F, Yao W, Liang H, Yue C, Sun Z, Chen F, Dai J (2006) Mannose selection system used for cucumber transformation. Plant Cell Rep 25(9): 953–958 Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases. Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol Breed 4:111–117 Jones-Rhoades MW, Bartel DP (2004) Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol Cell. 14(6): 787-99 Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B (2006) MicroRNAS and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 57:19-53 Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8): 1283-8 37 Kidner CA, Martienssen RA (2005) The developmental role of microRNA in plants. Curr Opin Plant Biol. 8(1): 38-44 Kim JY, Jung M, Kim HS, Lee YH, Choi SH, Lim YP, Min BW, Yang SG, Harn CH (2002) A new selection system for pepper regeneration by mannose. J Plant Biotechnol 4(3):129–134 Kormelink R, de Haan P, Peters D, Goldbach R (1992) Viral RNA synthesis in tomato spotted wilt virus- infected Nicotiana rustica plants. Journal of General Virology (73): 687-693 Kormelink R (1994) Expression and Subcellular Location of the NSM Protein of Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), a Putative Viral Movement Protein. Virology 200: 56-65 Lomonossoff GP (1995) Pathogen-derived resistance to plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 33, 323- 343. Meister G and Tuschl T (2004) Mechanism of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 43: 343- 349 Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, Matzke MA, Matzke AJ (2000) Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J.19(19): 5194-201 Miles JS, and Guest JR (1984) Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli. Gene 32: 41-48 Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990) Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2(4): 279- 289. Niu QW, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH (2006) Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol. 24(11):1420- 8. Erratum in: Nat Biotechnol. 2007 25(2): 254. O’Kennedy MM, Burger JT, Botha FC (2004) Pearl millet transformation system using the positive selectable marker gene phosphomannose isomerase. Plant Cell Rep 22: 684–690 Pfleger FL, Zeyen RJ (2008) Tomato-Tobacco Mosaic Virus Disease. Poche LA (2002) Perique tobacco: Mystery and history Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants. J Virol. 81(12): 6690-9 Ramesh SA, Kaiser BN, Franks T, Collins G, Sedgley M (2006) Improved methods in Agrobacterium- mediated transformation of almond using positive (mannose/pmi) or negative (kanamycin resistance) selection-based protocols. Plant Cell Rep 25(8): 821–828 38 Reddy DV, Sudarshana MR, Fuchs M, Rao NC, Thottappilly G (2009) Genetically engineered virus- resistant plants in developing countries: current status and future prospects. Adv Virus Res. 75:185- 220 Register JCIII, Nelson RS (1992) Early events in plant virus infection: relationships with genetically engineered protection and host gene resistance. Semin Virol 3: 441-451 Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen- derived resistance in transgenic plants. Plant Physiol 102: 7-12 Schubert J, Matousek J, Mattern D (2004) Pathogen-derived resistance in potato to Potato virus Y- aspects of stability and biosafety under field conditions. Virus Res. 100: 41-50. Sigareva M, Spivey R, Willits MG, Kramer CM, Chang YF (2005) An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants. Plant Cell Rep 23: 236–245 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead of print Takeda A, Sugiyama K, Nagano H, Mori M, Kaido M, Mise K, Tsuda S, Okuno T (2002) Identification of a novel RNA suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Letters 532: 75-79 Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res. 102(1): 85-96 Todd R, Tague GW (2001) Phosphomannose isomerase: a versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana germ-line transformation. Plant Mol Biol Rep 19: 307–319 Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA-interference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17(5): 897-904 van den Boogaart T, Lomonossoff GP, Davies JW (1998) Can we explain RNA-mediated virus resistance by homology-dependent gene silencing? MPMI (11) 7: 717-23 van der Krol AR, Mur LA, Beld M, Mol JN, Stuitje A (1990) Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression.Plant Cell 2(4):291-9. Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dose-dependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop cassava. Plant Mol Biol. 70(3):265-72 Voinnet O (2001) RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet. 17(8): 449-59 39 Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 297(5588):1833-7. Wang AS, Evans RA, Altendorf PR, Hanten JA, Doyle MC, Rosichan JL (2000) A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts. Plant Cell Rep 19:654–660 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64. Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90 Wright M, Dawson J, Dunder E, Suttie J, Reed J, Kramer C, Chang Y, Novitzky R, Wang H, Artim-Moore L (2001) Efficient biolistic transformation of maize and wheat using the phosphomannose isomerase gene, pmi as the selectable marker. Plant Cell Rep 20:429–436 Yin Y, Chory J, Baulcombe D (2005) RNAi in transgenic plants. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 26: Unit 26.6. Zhang P, Puonti-Kaerlas J (2000) PIG-mediated cassava transformation using positive and negative selection. Plant Cell Rep 19:1041–1048 Zhu YJ, Agbayani R, McCafferty H, Albert HH, Moore PH (2005) Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system. Plant Cell Rep 24:426–432 Zilberman D, Cao X, Jacobsen SE (2003) ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation.Science 299(5607):716-9. Zitter TA and Daughtrey ML (1989) Tomato Spotted Wilt Virus Fact Sheet Page: 735.90 Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus. Transgenic Res. 16(3): 385-98 40