Luận văn Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất Phenolic từ cây Alpinia pinnanensist.l.wu et senjen

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU . . . 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN . . 2 1.1. Khái quát về chi Alpinia (Zingiberaceae) . .2 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 2 1.1.2 Chi Alpinia (Zingiberaceae) ở Việt Nam 3 1.1.3 Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Zingiberaceae) . .5 1. 2 Các nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic chi Alpinia (Zingiberaceae) . 6 1.3 Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất khác từ chi Alpinia (Zingiberaceae) 21 CHƯƠNG 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25 2.1 Nhiệm vụ nghiên cứu . 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu . 25 2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết . . 25 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất . 26 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc . 26 2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học chống oxi hóa . 26 CHƯƠNG 3: PHẦN THỰC NGHIỆM . . 28 3.1 Thiết bị và hoá chất . . 28 3.2. Nguyên liệu thực vật . . 29 3.3. Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis 29 3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 30 3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1) . .30 3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2) 31 3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3) . 31 3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất . 31 3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (AP1) 31 3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2) 32 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) . .33 3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập . .34 3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính quét gốc tự do DPPH 36 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Đối tượng nghiên cứu . . . 38 4.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis . 38 4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết n-hexan (AP1) 40 4.3.1 Phân tích phần chiết n-hexan (AP1) . 40 4.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan (AP1) .42 4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết điclometan (AP2) 45 4.4.1 Phân tích phần chiết điclometan (AP2) . 45 4.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP1) . . 46 4.5 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết etyl axetat (AP3) 48 4.5.1 Phân tích phần chiết etyl axetat (AP3) 48 4.5.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) . 49 4.6 Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập 51 4.7 Thử hoạt tính cống oxi hóa . 60 KẾT LUẬN . 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO . .64 CÁC CHỮ VIẾT TẮT THƯỜNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN TLC : (Thin layer Chromatography): Sắc ký lớp mỏng CC : (Column Chromatography): Sắc ký cột thường FC : (Flash Chromatography): Sắc ký cột nhanh Mini-C : (Minicolumn Chromatography): Sắc ký cột tinh chế IR : (Infrared Spectroscopy): Phổ hồng ngoại GC-MS : (Gas Chromatography - Mass Spectrometry): Sắc ký khí khối phổ EI-MS : (Electron Impact Mass Spectroscopy): Phổ khối lượng va chạm điện tử 1H-NMR : (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13C-NMR : (Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ DEPT MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các loài Alpinia ở Việt Nam Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1) Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết điclometan (AP2) Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3) MỤC LỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1: Một số loài Alpinia (Zingiberaceae) của Việt Nam Hình 2: Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Zingiberaceae) Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) Sơ đồ 2: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1) Sơ đồ 3: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết điclometan (AP2) Sơ đồ 4: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết etyl axetat (AP3) Sơ đồ 5: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.18 Sơ đồ 6: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.22 Sơ đồ 7: Sự phân mảnh EI-MS của AP3.4 MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ IR của AP1.11 Phụ lục 2: Phổ EI-MS của AP1.15 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của AP1.15 Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR và DEPT của AP1.15 Phụ lục 5: Phổ EI-MS của AP1.18.3 Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR của AP1.18.3 Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR và DEPT của AP1.18.3 Phụ lục 8: Phổ EI-MS của AP1.22 Phụ lục 9: Phổ EI-MS của AP1.20.3.2 (= AP3.4) Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR của AP3.4 Phụ lục 11: Phổ 13C-NMR và DEPT của AP3.4 Phụ lục 12: Phổ EI-MS của AP2.18 Phụ lục 13: Phổ EI-MS của AP2.11.3.3 Phụ lục 14: Phổ EI-MS của AP2.16 Phụ lục 15: Phổ EI-MS của AP3.4 Phụ lục 16: Phổ EI-MS của AP3.13.3 LỜI MỞ ĐẦU Chi Riềng (Alpinia, Zingiberaceae) là một chi lớn, gồm khoảng 230 loài phổ biến khắp vùng Châu Á nhiệt đới và cận nhiệt đới, tạo thành một chi lớn nhất, phổ biến nhất và phức tạp về thực vật nhất của họ Zingiberaceae. Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi này là những cây thuốc cổ truyền trong Y học Việt Nam như Alpinia galanga, Alpinia oxyphylla, Alpinia conchigera Một số loài Alpinia cũng mới được phát hiện gần đây ở Việt Nam và được đưa vào chương trình nghiên cứu hóa học các loài thực vật họ Zingiberaceae của chúng tôi như Alpinia gagnepainii, Alpinia naponensis, Alpinia maclurei, Alpinia pinnanensis Nghiên cứu xác định các thành phần hoá học của chi này có ý nghĩa đóng góp vào các hiểu biết về sự phân loại thực vật theo hoá học của chi Alpinia cũng như các chức năng sinh học của các hợp chất được phân lập. Trong một nghiên cứu trước các cấu trúc tổng hợp (hybrid) thú vị giữa chalcon và điarylheptanoit cùng với các hợp chất phenolic (2′,4′-dihydroxy-6′-methoxychalcon, 4′,6′-dimethylchalconavingenin, alpinentin, naringenin 5-0-methyl ether và (3S,5S)-trans-3,5-dihydroxy-1,7-diphenyl-1-hepten) và phytosterol β-sitosterol, stigmasterol và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid đã được phát hiện từ loài Alpinia pinnanensis được thu thập tại Vĩnh Phúc [24]. Sau đó, cardamomin đã được phát hiện từ Alpinia conchigera là một tác nhân chống viêm đầy triển vọng qua các nghiên cứu sự ngăn chặn của hợp chất này lên các đường truyền tín hiệu của yếu tố phiên mã NF-kappa B [14]. Tiếp tục nghiên cứu các thành phần hóa học của loài Alpinia pinnanensis được thu thập tại Lào Cai trong nghiên cứu của Luận văn này, chúng tôi mong muốn đóng góp thêm những hiểu biết mới về hoá học và hoạt tính sinh học của loài Alpinia pinnanensis vào chi Alpinia (Zingiberaceae) của Việt Nam.

doc80 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 19/08/2013 | Lượt xem: 1771 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất Phenolic từ cây Alpinia pinnanensist.l.wu et senjen, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
g với năm hợp chất đã biết (62-66). Tất cả các chất được phân lập đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư THP-1, HL-60, A-375 và A-549. Hai hợp chất 60 và 61 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh [23]. 60 61 62 63 64 65 66 CHƯƠNG II NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nhiêm vụ nghiên cứu Luận văn này nghiên cứu thành phần hoá học của cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen) (Zingiberaceae) được thu thập ở Lào Cai. Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong luận văn này gồm có: 1. Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên có từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis; 2. Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết để định tính các phần chiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột; 3. Phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằng các phương pháp sắc ký điều chế; 4. Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ hiện đại. 5. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic nhận được. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết Mẫu thực vật sau khi được thu hái được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở 40oC và xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu thực vật được ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Phần chiết axeton nhận được được phân bố chọn lọc bằng phương pháp chiết hai pha lỏng lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần, n-hexan, điclometan và etyl axetat. 2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phần chiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểm tra độ sạch của các hợp chất phân lập. Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên. Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế lượng nhỏ (< 15 mg) chất hữu cơ. Phương pháp kết tinh để tinh chế các chất rắn. 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR); Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR); Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT. 2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Các hợp chất phenolic được phân lập đã được đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in vitro theo phương pháp quét gốc tự do DPPH của S. G. Olga et al. (2003). Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa được thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam. CHƯƠNG III PHẦN THỰC NGHIỆM 3.1 Thiết bị và hoá chất - Các phương pháp sắc ký Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm. Phát hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đó hơ nóng bản mỏng ở 1200 và đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm. Sắc ký cột thường (CC) Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 µm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Sắc ký cột nhanh (FC) Phân tách sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới áp suất nén. Chất hấp phụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μm và 63-100 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức). Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhau được sử dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách. Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) Phân tách sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C. Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫu trực tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký FC, CC và Mini-C. - Các phương pháp phổ Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) Phổ EI-MS được đo trên thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MS Engine và Waters Autospec Premier. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Các phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm. Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135. 3.2 Nguyên liệu thực vật Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen (Zingiberaceae) (20 kg) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 tại xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai. Mẫu sau đó được rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô trong bóng râm và sấy khô ở 40oC. Mẫu khô (1,6 kg) được xay thành bột mịn. 3.3 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis Mẫu bột khô thân rễ cây Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngâm chiết trong dung môi axeton ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu được dịch chiết axeton đầu tiên. Tiến hành lặp lại quá trình ngâm mẫu trong axeton thêm 4 lần nữa. Cuối cùng lọc bỏ bã thực vật thu được dịch chiết axeton. Dịch chiết sau 5 lần ngâm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để tránh làm biến chất cho đến khi thu được phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt. Hoà loãng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch nước nhận được với các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đó được cất loại kiệt dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được các phần chiết tương ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và AP3 (phần chiết etyl axetat). Quy trình điều chế các phần chiết được nêu trên Sơ đồ 1, Mục 4.2; Chương 4: Kết quả và Thảo luận. Xác định khối lượng các phần chiết và tính hiệu suất so với lượng mẫu khô ban đầu. Kết quả được trình bày ở Bảng 2. Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) 1 n-Hexan AP1 21,1 1,32 2 Điclometan AP2 49,2 3,01 3 Etyl axetat AP3 3,8 0,23 3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) trên nền nhôm. Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọn trong các hệ dung môi triển khai khác nhau để cho các sắc ký đồ phân giải tốt các hợp chất trong các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis. 3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1) Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Các kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan được trình bày ở Bảng 3, Mục 4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2) Phần chiết điclometan (AP2) được phân tích TLC với các hệ dung môi n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Các kết quả phân tích TLC được phần chiết điclometan trình bày trên Bảng 4, Mục 4.4.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3) Phần chiết etyl axetat (AP3) được phân tích với TLC với các hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với các tỷ lệ 20:19:1, 20:15:1 và 20:19:0,5, hệ etyl axetat-axit fomic-nước với tỷ lệ 30:2:3, và hệ etyl axetat-metanol-nước với tỷ lệ 30:5:4. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và FeCl3 5%. Các kết quả phân tích TLC được trình bày trên Bảng 5, Mục 4.5.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận. 3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất 3.5.1 Phân tách phần chiết n-hexan (AP1) Phần chiết n-hexan AP1 (10 g) được hoà tan trong CH2Cl2 sau đó được hấp phụ trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm). Khuấy đều cho đến khi silica gel hấp phụ đều hết dung dịch mẫu cho đến khi khô đều. Cho silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khí. Sau đó đổ silica gel ở dạng bột nhão vào cột sắc ký (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Cho dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nén đều cột đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định. Đưa mẫu đã tẩm trên silica gel lên cột CC. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v). Các phân đoạn được thu theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 24 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP1.1 đến AP1.24. Các nhóm phân đoạn AP1.11 (150 mg) và AP1.12 (670 mg) được rửa nhiều lần bằng n-hexan cho chất AP1.11 (101 mg) và AP1.12 (203 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Nhóm phân đoạn AP1.15 (44 mg) được rửa bằng n-hexan cho chất AP1.15 (25 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng nhạt. Nhóm phân đoạn AP1.18 (1,1 g) được phân tách sắc ký CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) với hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 6:1 đến 1:1 cho chất AP1.18.3 (321 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt. Nhóm phân đoạn AP1.20 (1,13 g) được cho chạy sắc ký cột CC (2 cm i.d. x 25 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm), hệ dung môi gradient n-hexan-axeton 7:1 và 5:1 cho năm nhóm phân đoạn chính sau các phân tích TLC từ AP1.20.1 đến AP1.20.5. Các nhóm phân đoạn AP1.20.3 và AP1.20.4 được gộp lại và phân tách CC (2 cm i.d. x 20 cm) với gradient n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1 (silica gel Merck cỡ hạt 40-63 µm). Kết quả thu được chất AP1.20.3.2 (356 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng ánh. Nhóm phân đoạn AP1.22 (190 mg) được rửa bằng axeton cho chất AP1.22 (23 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2) Phần chiết điclometan AP2 (4,1 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ CH2Cl2 và được tẩm trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) cho một hỗn hợp bột mịn màu vàng. Nhồi cột ướt silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 µm) vào cột phân tách CC (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa phần chiết tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v), thu các phân đoạn theo 50 ml/phân đoạn. Kiểm tra quá trình phân tách bằng TLC. Kết quả thu được 21 nhóm phân đoạn được ký hiệu từ AP2.1 đến AP2.21. Nhóm phân đoạn AP2.11 (200 mg) ở dạng gel được chạy CC (2 cm i.d. x 20 cm) trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) với hệ dung môi n-hexan-axeton 6:1, thu được chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp AP2.11.3 với cột CC (1,5 cm i.d. x 20 cm) với hệ điclometan-axeton 25:1, thu được chất AP2.11.3.3 (83 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Nhóm phân đoạn AP2.16 (150 mg) được kết tinh trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho chất AP2.16 (135 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Nhóm phân đoạn AP2.17 (18,7mg) và AP2.18 (18,7mg) được rửa bằng CH2Cl2 cho các chất AP2.17 (15,6 mg) và AP2.18 (3,1 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) Phần chiết etyl axetat AP3 (3,8 g) được hoà tan vừa đủ trong metanol và được tẩm với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 µm) cho một chất bột mịn màu vàng. Nhồi silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt vào cột tách CC (Φ = 2,5 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa mẫu tẩm silica gel lên cột, rửa giải gradient bằng hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic, thu các phân đoạn theo 20 ml/phân đoạn cho 13 nhóm phân đoạn chính được ký hiệu từ AP3.1 đến AP3.13. Chất AP3.4 (87 mg) được tách ra từ nhóm phân đoạn AP3.4 (96 mg) dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Nhóm phân đoạn AP3.13 (0,67 g) được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 (63 mg) dưới dạng bột vô định hình màu trắng. 3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập β-Sitosterol (AP1.11) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v). Hiện màu tím với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. IR (KBr): υmax cm-1 3427, 1637, 1461, 1379, 1056. 6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15) Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 200-202oC. Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 428 (M+., C29H48O2, 37,8), 413 (6,7), 227 (18,5), 152 (57,9), 81 (41,2), 69 (45,4), 55 (100). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 0,74 (3H, s, H3-18), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-26), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-27), 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H3-29), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H3-21), 1,38 (3H, s, H3-19), 2,37 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz, H-2a), 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4). 13C-NMR/DEPT (125 MHz, CDCl3, ppm): δ 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29), 18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q, C-19), 20,9 (t, C-11), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1 (t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8), 33,9 (t, C-22), 34,3 (t, C-7), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1), 38,0 (s, C-10), 38,6 (t, C-2), 39,6 (t, C-12), 42,5 (s, C-13), 45,9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d,C-17), 56,1 (d, C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,2 (s, C-3). trans-3S,5S-Đihidroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3) Tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đ.n.c. 75-77oC. Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 4:1, v/v). Hiện màu xanh lam với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 282, (M+., C19H22O2, <1), 264 (10,1), 135 (21), 133 (37,8), 104 (68,9), 91 (100), 77 (27,3), 55 (36,1). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 1,7-1,9 (4H, m, 2H-4, 2H-6), 2,67-2,83 (2H, m, 2H-7), 2,83 (1H, brs, OH), 2,95 (1H, brs, OH), 3,96 (1H, quintet, J = 6,5 Hz, H-5), 4,54 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-3), 6,21 (1H, dd, J = 6,5 Hz, 16 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1), 7,17-7,37 (10H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′, H-6′, H-2′′, H-3′′, H-4′′, H5′′, H-6′′). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm ): δ 31,7 (t, C-7), 39,7 (t, C-6), 43,5 (t, C-4), 71,6 (d, C-5), 73,6 (d, C-3), 125,9 (d, C-4′), 126,5 (d, C-2′, C-6’′), 127,8 (d, C-4′′), 128,4 (d, C-3′, C-5′), 128,5 (d, C-3′′, C-5′′), 128,6 (d, C-2′′, C-6′′), 130,2 (d, C-2), 131,9 (d, C-1), 136,6 (s, C-1′′), 141,9 (s, C-1′). Alpinentin (AP1.22 = AP3.13) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 15:15:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (26,9), 193 (54,5), 166 (100), 138 (56,3), 123 (19,3), 104 (54,7), 77 (28,3). Cardamomin (AP3.4 = AP1.20.3.2 = AP2.16) Bột vô định hình màu vàng. Rf = 0,14 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (54,7), 193 (100), 167 (34,4), 152 (46,8), 138 (15,1), 124 (12,8), 103 (31,1), 77 (45,4), 69 (37,8). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 3,88 (3H, s, 6′-CH3), 5,93 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3′), 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5′), 7,42-7,48 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,65 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hα), 7,71 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,5 Hz, H-2, H-6), 7,82 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hβ), 13,7 (1H, s, 5-OH). 13C-NMR/DEPT (DMSO-d6): δ 55,9 (q, 6′-OCH3), 91,7 (d, C-3′), 95,8 (d, C-5′), 127,5 (d, Cα), 128,2 (d, C-2, C-6), 128,9 (d, C-3, C-5), 130,1 (d, C-4), 134,9 (s, C-1), 141,6 (d, C-8), 162,6 (s, C-6′), 164,9 (s, C-4′), 166,1 (s, C-2′), 191,6 (C=O). β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.18) Bột vô định hình màu trắng. Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. EI-MS: m/z (%) 414 (46,7), 396 (68,0), 381 (20,7), 329 (23,3), 303 (27,3), 255 (29,3), 213 (33,3), 145 (41,3), 135 (100), 107 (41,3). 3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của S. G. Olga và cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH ) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng λ = 515 nm. Các mẫu có hoạt tính quét gốc tự do SC ≥ 50% sẽ được thử nghiệm để xác định giá trị SC50. Xác định giá trị SC50 (μg/ml); Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình Table Curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất khử. CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đối tượng nghiên cứu Thân rễ tươi cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (T. L. Wu et S. J Chen) (Zingiberaceae) đã được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bình (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) thu thập vào tháng 11 năm 2007 ở xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai. Mẫu tươi được xử lý và được sấy khô ở 40oC, sau đó nghiền nhỏ thành bột mịn. 4.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis Phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến việc phân tách lớp chất. Trong nghiên cứu này, một quy trình chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần đã được xây dựng. Mẫu sấy khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng (4 lần, mỗi lần trong ba ngày). Dịch chiết axeton nhận được sau khi cất loại dung môi được pha với nước cất và chiết lần lượt được với n-hexan, điclometan và etyl axetat. Cất loại kiệt dung môi các dịch chiết, ta thu được các phần chiết tương ứng, kí hiệu là AP1, AP2 và AP3. Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) được nêu trên Sơ đồ 1. Thân rễ tươi (20 kg) 1. Phơi khô, sấy ở 45-50oC 2. Xay thành bột mịn Bột khô xay mịn (1,6 kg) 1. Ngâm chiết với axeton ở nhiệt độ phòng 2. Cất loại axeton dưới áp suất giảm 3. Hoà phần chiết axeton bằng nước cất Dịch nước 1. Chiết bằng n-hexan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại n-hexan 1. Chiết bằng điclometan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại điclometan Phần chiết n-hexan (AP1, 21,1 g, 1,32%) 1. Chiết với etyl axetat 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại etyl axetat Phần chiết điclometan (AP2, 49,2 g, 3,01%) Dịch nước Phần chiết etyl axetat (AP3, 3,8 g, 0,23%) Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất hữu cơ từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis 4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết n-hexan (AP1) 4.3.1 Phân tích phần chiết n-hexan(AP1) Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung môi n-hexan-axeton. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi phân giải tốt được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1) Hệ dung môi n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu 19:1 1 0,81 tròn xanh 2 0,23 tròn tím 9:1 1 0,95 dẹp tím 2 0,88 dẹp xanh 3 0,33 tròn to tím 4 0,06 tròn nhỏ vàng 6:1 1 0,98 dẹp tím 2 0,94 tròn to xanh nhạt 3 0,60 tròn nhỏ tím 4 0,50 tròn tím 5 0,33 tròn tím 6 0,15 tròn vàng 3:1 1 0,95 dẹp tím 2 0,88 dẹp xanh nhạt 3 0,66 tròn tím 4 0,55 tròn tím 5 0,44 tròn cam 6 0,40 tròn xanh 7 0,32 tròn vàng 8 0,20 tròn tím nhạt 1:1 1 0,92 dẹp tím 2 0,90 dẹp xanh 3 0,60 tròn tím 4.3.2 Phân tách phần chiết n-hexan(AP1) Phần chiết n-hexan (AP1) được phân tách bằng sắc ký cột (CC) gradient trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với các hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1. Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP1 theo độ phân cực, từ AP1.1 đến AP1.8 (n-hexan-axeton 19:1, hiệu suất phân lập 37,8 %), từ AP1.9 đến AP1.12 (n-hexan-axeton 9:1, hiệu suất phân lập 6,0 %), từ AP1.13 đến AP1.15 (n-hexan-axeton 6:1, hiệu suất phân lập 5,1 %), từ AP1.16 đến AP1.20 (n-hexan-axeton 3:1, hiệu suất phân lập 44,6 %) và từ AP1.21 đến AP1.24 (n-hexan-axeton 1:1, hiệu suất phân lập 8,0 %). Các phân đoạn AP1.1, AP1.2, AP1.3 và AP1.4 chứa chủ yếu là các hợp chất dễ bay hơi từ thân rễ cây A. pinnanensis. Nhóm phân đoạn AP1.11 và AP1.12 được rửa bằng n-hexan cho các chất AP1.11 và AP1.12 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Các hợp chất đã được phân tích định tính bằng các phương pháp TLC so sánh và co-TLC cho thấy sự đồng nhất với mẫu chuẩn β-sitosterol. Như vậy β-sitosterol đã được phân lập với tổng hiệu suất là 1,3 % so với phần chiết n-hexan AP1. Nhóm phân đoạn AP1.15 được rửa bằng n-hexan cho hợp chất AP1.15 dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Nhóm phân đoạn AP1.18 được phân tách bằng CC (gradient, n-hexan-axeton 6:1, 5:1 và 3:1) cho chất AP1.18.3 dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Nhóm phân đoạn AP1.20 được phân tách bằng CC (gradient, n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1) cho chất AP1.20.3.2 dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng ánh. Nhóm phân đoạn AP1.22 được rửa bằng axeton cho chất AP1.22 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Tổng cộng, 5 chất AP1.11 (= AP1.12), AP1.15, AP1.18.3, AP1.20.3.2 và AP1.22 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AP1). Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1) được trình bày trên Sơ đồ 2. AP1 (10 g) CC gradient, silica gel n-hexan-axeton (19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1) 19:1 9:1 6:1 3:1 1:1 AP1.9 (0,64 g) AP1.13 (0,39 g) AP1.16 (0,93 g) AP1.21 (0,33 g) AP1.1 (1,10 g) AP1.2 (0,51 g) AP1.3 (0,62 g) AP1.4 (6,4 mg) AP1.5 (0,68 g) AP1.6 (22 mg) AP1.7 (0,38 g) AP1.8 (1,38 g) AP1.14 (78 mg) AP1.10 (0,38 g) AP1.17 (0,94 g) AP1.22 (0,19 g) b AP1.23 (0,16 g) AP1.18 (1,14 g) AP1.15 (44 mg) AP1.11 (0,15 g) b a AP1.24 (0,13 g) AP1.19 (0,33 g) AP1.12 (0,67 g) b AP1.20 (1,13 g) AP1.15 (25 mg) AP1.11 (101 mg) AP1.22 (23 mg) AP1.18.3 (321 mg) b AP1.12 (203 mg) 2 x a AP1.20.3.2 (356 mg) a: CC gradient, silica gel b: Rửa bằng n-hexan Sơ đồ 2: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1) 4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết điclometan (AP2) 4.4.1 Phân tích phần chiết điclometan (AP2) Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung môi n-hexan-axeton. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi phân giải tốt được trình bày ở Bảng 4. Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết điclometan (AP2) Hệ dung môi n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu 19:1 1 0,05 tròn nhỏ vàng đậm 9:1 1 0,31 tròn xanh 2 0,06 tròn tím 6:1 1 0,12 tròn tím đậm 2 0,07 tròn tím 3:1 1 0,95 dẹp vàng đậm 2 0,45 tròn vàng cam 3 0,40 tròn xanh nhạt 1:1 1 0,92 tròn xanh đậm 2 0,80 tròn tím 4.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (AP2) Phần chiết điclometan (AP2) được phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1. Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP2 theo độ phân cực, từ AP2.1 đến AP2.4 (n-hexan-axeton 9:1, hiệu suất phân lập 3,8 %), từ AP2.5 đến AP2.10 (n-hexan-axeton 6:1, hiệu suất phân lập 12,1 %), từ AP2.11 đến AP2.14 (n-hexan-axeton 3:1, hiệu suất phân lập 54,6 %) và từ AP2.15 đến AP2.2 (n-hexan-axeton 1:1, hiệu suất phân lập 9,5 %). Nhóm phân đoạn AP2.11 được phân tách bằng sắc ký cột CC (n-hexan-axeton 6:1) cho chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp AP2.11.3 bằng sắc ký cột Mini-C cho chất AP2.11.3.3 dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Nhóm phân đoạn AP2.16 được kết tinh trong hệ dung môi n-hexan-axeton cho chất AP2.16 dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Các nhóm phân đoạn AP2.17 và AP2.18 được rửa bằng CH2Cl2 cho các chất AP2.17 và AP2.18 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Tổng cộng, 3 chất AP2.11.3.3, AP2.16 và AP2.17 (= AP2.18) đã được phân lập từ phần chiết điclometan (AP2). Quá trình phân tách phần chiết điclometan (AP2) được trình bày trên Sơ đồ 3. AP2 (4,1 g) CC gradient, silica gel n-hexan-axeton(9:1, 6:1, 3:1, 1:1) 9:1 6:1 3:1 1:1 AP2.1 (1-3) (7 mg) AP2.20 (34-35) (15 mg) AP2.5 (11-13) (46 mg) AP2.16 (21-24) (2,93 g) c AP2.2 (4-7) (7 mg) AP2.17 (36) (23 mg) AP2.6 (14) (62 mg) AP2.13 (25-27) (22 mg) b AP2.3 (8-9) (23 mg) AP2.18 (37) (54 mg) AP2.7 (15) (10 mg) AP2.14 (28-30) (42 mg) AP2.4 (10) (11 mg) AP2.19 (38-39) (9 mg) AP2.11 (16-18) (0,2 g) AP2.15 (31-33) (15 mg) 2 x a AP2.21 (40-43) (32 mg) AP2.9 (19) (64 mg) AP2.10 (20) (21 mg) AP2.16 (135 mg) AP2.11.3.3 (83 mg) AP2.17 = AP1.18 (18,7 mg) a: CC gradient, silica gel b: Rửa bằng n-hexan (CH2Cl2) c : Kết tinh (n-hexan-axeton) Sơ đồ 3: Quá trình phân tách phần chiết điclometan (AP2) 4.5 Nghiên cứu thành phần hóa học phần chiết etyl axetat (AP3) 4.5.1 Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3) Phân tích TLC sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck) với hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic và etyl axetat-metanol-nước. Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%. Kết quả phân tích TLC được trình bày ở Bảng 5. Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3) Hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH STT Rf Dạng vệt Hiện màu 20:19:1 1 0,50 tròn vàng 2 0,46 dẹp xanh lam 3 0,32 tròn vàng 20:19:0,5 1 0,70 tròn vàng 2 0,65 tròn xanh nhạt 3 0,42 tròn nhỏ vàng 4 0,12 tròn nhỏ tím nhạt 20:15:1 1 0.45 tròn vàng 2 0,40 tròn xanh nhạt 3 0,28 tròn nhỏ vàng 4 0,20 tròn vàng nhạt 5 0,09 tròn tím nhạt 30:2:3 1 0,68 tròn to vàng 2 0,55 tròn nhỏ tím 30:2:1 1 0,75 vệt tròn vàng 4.5.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) Phần chiết etyl axetat (AP3) được phân tách sắc ký cột gradient CC trên chất hấp phụ silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 µm) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:0,5 và 20:15:1. Phân tách hệ thống đã phân bố các nhóm hợp chất trong AP3 theo độ phân cực, từ AP3.1 đến AP3.7 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:19:0,5, hiệu suất phân lập 15,8 %) và từ AP3.8 đến AP3.13 (n-hexan-EtOAc-HCOOH 20:15:1, hiệu suất phân lập 25,8 %). Nhóm phân đoạn AP3.4 được rửa bằng etyl axetat cho chất AP3.4 dưới dạng bột vô định hình màu vàng. Nhóm phân đoạn AP3.13 được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 dưới dạng bột vô định hình màu trắng và tan được trong MeOH. Tổng cộng, 2 chất AP3.4 và AP3.13 đã được phân lập từ phần chiết etyl axetat (AP3). Quá trình phân tách được trình bày trên Sơ đồ 4. AP3 (3,8 g) CC gradient, silica gel n-hexan-EtOAc-HCOOH (20:19:0,5, 20:15:1) 20:15:1 20:19:0,5 AP3.8 (15-18) (81 mg) AP3.1 (1-2) (25 mg) AP3.2 (3) (41 mg) AP3.9 (19-22) (54 mg) AP3.3 (4-5) (0,17 mg) AP3.10 (23-26) (30 mg) AP3.4 (87 mg) AP3.4 (6-7) (96 mg) AP3.11 (27-29) (55 mg) a AP3.12 (30-32) (86 mg) AP3.5 (8-9) (89 mg) AP3.6 (10-11) (97 mg) AP3.13 (33-50) (0,67 g) AP3.13 (63 mg) b AP3.7 (12-14) (86 mg) a: Rửa bằng etyl axetat b: Rửa bằng n-hexan và axeton Sơ đồ 4: Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat (AP3) 4.6 Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập Từ phần chiết n-hexan (AP1) các hợp chất β-sitosterol (AP1.11 và AP1.12), 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15) trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3), cardamomin (AP1.20.3.2) và alpinentin (AP1.22) đã được xác định cấu trúc. Từ phần chiết điclometan (AP2) các hợp chất trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP2.11.3.3), cardamomin (AP2.16) và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.17 và AP2.18) đã được xác định cấu trúc. Từ phần chiết etyl axetat (AP3) các hợp chất cardamomin (AP3.4) và alpinentin (AP3.13.3) đã được xác định cấu trúc. β-Sitosterol (AP1.11) Hợp chất AP1.11 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (AP1) (hiệu suất phân lập 10,1 mg/g phần chiết AP1) dưới dạng bột vô định hình màu trắng bằng sắc ký cột CC trên silica gel và kết tinh lại trong n-hexan. Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v). AP1.11 Hợp chất này đã được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở phân tích TLC, co-TLC và IR với mẫu chuẩn của chúng tôi. Phổ hồng ngoại của AP1.11 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hiđroxi ở υmax 3427 cm-1, nối đôi C=C ở υmax 1637 cm-1, nhóm metylen ở υmax 1461 cm-1và nhóm C-O ở υmax 1379 cm-1. β-Sitosterol là một phytosterol xuất hiện phổ biến trong thực vật và được sử dụng làm chất giảm lượng cholesterol trong máu. 6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15) Hợp chất AP1.15 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, đ.n.c. 200-202oC từ phần chiết n-hexan AP1 (hiệu suất phân lập 2,5 mg/g phần chiết AP1). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). AP1.15 Phổ EI-MS của hợp chất AP1.15 cho pic ion phân tử ở m/z 428 cho giả thiết một công thức phân tử C29H48O2 cho AP1.15. Phổ 1H-NMR của AP1.15 chỉ ra sự có mặt của các nhóm sau: - 6 nhóm metyl trong đó có hai nhóm metyl bậc ba (3H, s) (δH 0,74 và 1,38), ba nhóm metyl bậc hai (3H, d) (δH 0,82, 0,84 và 0,92) và một nhóm metyl bậc một (3H, t) (δH 0,85); - 2 proton của một nhóm metylen liền kề với một nhóm cacbonyl [δH 2,37 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz), 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz)]; - 1 nhóm oximetin [δH 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz)]; và - 1 proton vinylic cô lập của một nối đôi thế ba lần [δH 5,81 (1H, s)]. Phổ 13C-NMR và DEPT của AP1.15 cho 29 tín hiệu cacbon 13; các tín hiệu này bao gồm: - 6 nhóm metyl (6 q) (δC 11,9; 12,0; 18,7; 19,1; 19,5 và 19,8); - 10 nhóm metylen (10 t) (δC 20,9; 23,1; 24,2; 26,1; 28,2; 33,9; 34,3; 37,1; 38,6 và 39,6); - 9 nhóm metin (9 d) (δC 29,2; 29,8; 36,1; 45,9; 53,7; 55,9; 56,1; 73,3 và 126,3); và - 4 cacbon (4 s) (δC 38,0; 42,5; 168,6 và 200,2). Trong số các tín hiệu cacbon 13 có các tín hiệu của một nhóm cacbonyl liên hợp α,β không no [δC 200,2 (s), 168,6 (s) và 126,3 (d)] và một nhóm oximetin [δC 73,3 (d)]. Các tín hiệu này phù hợp với các tín hiệu proton của một nối đôi thế 3 lần ở δH 5,81 (1H, s) và của 1 nhóm oximetin δH ở 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz). Từ các dữ kiện phổ EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, chúng tôi đã giả thiết một cấu trúc stigmastan cho AP1.15. Từ giả thiết này, sự so sánh tiếp theo các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của AP1.15 với của mẫu chuẩn β-sitosterol đã cho thấy khả năng liên kết của một nhóm hiđroxi vào vị trí C-6 và sự định vị của nhóm cacbonyl α,β không no là 4-en-3-on. Điều này hoàn toàn phù hợp với các giá trị δ và J của H-2 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz) và 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz) và H-6 (δH 4,35). Hằng số tương tác của H-6 (dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz) cho thấy H-6 có sự định hướng α, do đó nhóm hiđroxi phải được định hướng β. Trên cơ sở các phân tích phổ này, cấu trúc của AP1.15 đã được xác định là 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on [8]. Stigmast-4-en-3,6-dion và stigmast-4-en-3,6-diol đã được phân lập trước đây từ Sambucus ebulus và Lagestroemia lancasterii, [15]. Hợp chất này lần đầu tiên được phát hiện trong một loài Alpinia (Zingiberaceae). trans-3S,5S-Đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3) Hợp chất AP1.18 đã được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt, đ.n.c. 75-77oC từ phần chiết n-hexan (AP1), (hiệu suất phân lập 32,1 mg/g phần chiết AP1). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 4:1, v/v). AP1.18.3 Phổ khối lượng (EI-MS) của hợp chất AP1.18.3 cho pic ion phân tử với cường độ yếu ở m/z 282 phù hợp với một công thức phân tử C19H22O2 (M+.). Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1.18.3 chỉ ra sự có mặt của các nhóm sau: 2 nhóm phenyl (10H, m) (δH 7,17-7,37); 2 nhóm oximetin (2 x 1H) [δH 3,96 (quintet, J = 6,5 Hz) và 4,54 (q, J = 6,5 Hz)]; một nối đôi thế 2 lần có cấu hình trans (J = 16,0 Hz) [δH 6,21 (dd, J = 16,0 Hz, 6,5 Hz) và 6,58 (d, J =16,0 Hz)]; và 3 nhóm metylen (3 x 2H) (δH 1,7-1,9 và 2,67-2,83). Phổ 13C-NMR và DEPT của AP1.18.3 cho 19 tín hiệu cacbon 13; các tín hiệu này bao gồm: 2 nhóm phenyl (δC 125,9; 126,5; 127,8; 128,4; 128,5; 128,6; 136,6; và 141,9); 2 nhóm oximetin (2d) (δC 71,6 và 73,6); một nối đôi thế 2 lần (2d) (δC 130,2 và 131,9); và 3 nhóm metylen (3t) (δC 31,7, 39,7 và 43,5). Từ các dữ kiện phổ EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT chúng tôi đã giả thiết một cấu trúc điphenylheptanoit cho hợp chất AP1.18.3. Mạch heptanoit của hợp chất này phải chứa một nối đôi và 2 nhóm hiđroximetin. Trình tự liên kết trong mạch heptanoit đã được xác định là 3,5-đihiđroxi-1-hepten dựa trên sự phân tích các hằng số tương tác J và độ chuyển dịch hóa học δ của các nhóm oximetin, metylen và nối đôi. Phổ EI-MS của AP1.18.3 cho sự phân mảnh ở m/z 264, 135, 133, 104, 91 (pic cơ sở) và 77 phù hợp với của trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten được phân lập từ Alpinia katsumadai [19]. Sự phân mảnh EI-MS của AP1.18.3 được biểu diễn trên Sơ đồ 5. Sơ đồ 5: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.18.3 Alpinentin (AP1.22 = AP3.13) Hợp chất AP1.22 và AP3.13 đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng tương ứng từ phần chiết n-hexan (AP1) (hiệu suất phân lập 2,3 mg/g phần chiết AP1 và phần chiết etyl axetat (AP3) (hiệu suất phân lập 16,6 mg/g phần chiết AP3). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 15:15:1, v/v). AP1.22 Phổ khối lượng (EI-MS) của hợp chất AP1.22 cho pic phân tử ở m/z 270 phù hợp với một công thức phân tử C16H14O4 (M+.). Các sự phân mảnh ở m/z 269, 193, 166 (pic cơ sở), 138, 123 và 104 trên phổ EI-MS của AP1.22 phù hợp với của mẫu chuẩn alpinentin. Sự phân mảnh của AP1.22 được biểu diễn trên Sơ đồ 6. RDA (retro-Diels Alder) Sơ đồ 6: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.22 Cardamomin (AP3.4 = AP1.20.3.2 = AP2.16) Hợp chất AP3.4 (= AP1.20 = AP2.16) đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng từ phần chiết etyl axetat (AP3) (hiệu suất phân lập 22,8 mg/g phần chiết AP3) và các phần chiết n-hexan (AP1.20) (hiệu suất phân lập 35,6 mg/g phần chiết AP1) và điclometan (AP2.16) (hiệu suất phân lập 32,9 mg/g phần chiết AP2). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,14 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v). AP3.4 Phổ khối lượng (EI-MS) của AP3.4 cho pic ion phân tử ở m/z 270 cho giả thiết một công thức phân tử C16H14O4 (M+.) cho hợp chất AP3.4. Phổ 1H-NMR của AP3.4 chỉ ra sự có mặt của các nhóm sau: - 1 nhóm metoxi liên kết với vòng thơm [δH 3,88 (3H, s)]; - 2 proton của một vòng benzen thế bốn lần 1′,2′,4′,6′ [δH 5,93 (1H, d, J = 2,5 Hz) và 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz)]; - 5 proton của một vòng benzen thế một lần [δH 7,42-7,48 (3H, m) và 7,71 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,5 Hz)]; và - 2 proton vinylic của một nối đôi thế hai lần, độ chuyển dịch hoá học của các tín hiệu proton này [δH 7,65 (1H, d, J = 16,0 Hz) và 7,82 (1H, d, J = 16,0 Hz)] cho thấy nối đôi này có thể được liên kết với một nhóm cacbonyl. Phổ 13C-NMR và DEPT của AP3.4 cho 16 tín hiệu cacbon 13; các tín hiệu này có thể chia làm 15 tín hiệu của một cấu trúc chalcon giả thiết và một tín hiệu của một nhóm metoxi và khẳng định cho các nhóm được xác định bằng phổ 1H-NMR. Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 bao gồm: - 1 nhóm cacbonyl (1s) (δC 191,6); độ dịch chuyển hoá học của tín hiệu cacbon 13 này cho thấy nó được liên hợp α,β với một nối đôi. - Một nối đôi thế 2 lần 1,2 (2d) (δC 127,5 và 141,6); - 1 nhóm metoxi (1q) (δC 55,9); - 7 nhóm CH vòng thơm (7d) (δC 91,7; 95,8; 128,2; 128,9 và 130,1), trong đó 2 tín hiệu cộng hưởng đầu thuộc về một vòng benzen thế bốn lần 1′,2′,4′,6′ và 5 tín hiệu cộng hưởng tiếp theo thuộc về một vòng benzen thế một lần; và - 4 C vòng thơm (4 s) (δC 134,9; 162,6; 164,9; và 166,1) của hai vòng benzen thế 4 lần 1′,2′,4′,6′ và một vòng benzen thế một lần. Trên cơ sở các dữ kiện phổ trên của AP3.4 một cấu trúc của chalcon đã được xác định. Vòng A của chalcon bị thế 1′,2′,4′,6′ và vị trí cacbon số 2′ bị chiếm bởi một nhóm hiđroxi; nhóm này tạo liên kết hiđro với nhóm cacbonyl (δH 13,7, 1H, s, 2′-OH). Vòng B của chalcon là một nhóm phenyl. Nối đôi của chalcon đã được xác định là có cấu hình trans do tương tác lớn (J = 16,0 Hz) của Hα và Hβ. So sánh các dữ kiện phổ của AP3.4 với các chalcon có cấu trúc tương tự đã xác định được cấu trúc của cardamomin của AP3.4 với nhóm metoxi liên kết với C-6′ [23]. Phổ khối lượng EI-MS của hợp chất AP3.4 cho sự phân mảnh ở m/z 270, 269, 193 (pic cơ sở), 138, 103 và 77 phù hợp với hợp chất cardamomin. Sự phân mảnh của AP3.4 được biểu diễn trên Sơ đồ 7. Sơ đồ 7: Sự phân mảnh EI-MS của AP3.4 β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.17 = AP1.18) Hợp chất AP2.17 đã được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng từ phần chiết điclometan (AP2) (hiệu suất phân lập 4,5 mg/g AP2) và phần chiết n-hexan (AP1.18). Hợp chất này cho giá trị Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v). AP2.18 Phổ khối lượng (EI-MS) của hợp chất AP2.17 không cho pic ion phân tử, tuy nhiên pic ở m/z 414 phù hợp với pic mất nhóm glucopyranozyl (M+., C32H52O2, - 162). Phổ EI-MS của AP2.17 cho sự phân mảnh ở m/z 414, 396, 381, 329, 303, 255, 213, 145, 135 (pic cơ sở) và 107 phù hợp với phổ mẫu chuẩn của β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit của chúng tôi. Phân tích định tính TLC và co-TLC với mẫu chuẩn cùng cho một giá trị Rf. 4.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa Oxi và các tiểu phần oxi hoạt động (ROS) là một trong các nguồn chất xúc tác chính khơi mào sự oxi hóa in vitro và in vitro. Các gốc tự do từ oxi như gốc anion supeoxit (O2-·) và các gốc hiđroxyl (˙OH) được cho là có liên quan đến sự bắt đầu của nhiều bệnh bao gồm ung thư và lão hóa. Một hợp chất có thể biểu hiện các hoạt tính chống oxi hóa bằng cách ức chế sự sản sinh ROS hoặc quét các gốc tự do. Các hợp chất phenolic từ thực vật được coi là có các cấu trúc cần thiết cho các chất quét gốc tự do; nhiều hợp chất này đã được thử nghiệm cho hoạt tính chống oxi hóa trong các nghiên cứu phát hiện các chất chống oxi hóa và dự phòng ung thư [14]. Các hợp chất phenolic được phân lập từ Alpinia pinnanensis alpinentin, cardamomin và trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten đã được thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa, sử dụng phương pháp có độ tin cậy cao DPPH (gốc 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl) [13]. Sự khử DPPH˙ bằng một chất chống oxi hóa (A) (DPPH˙ + A → DPPH-H +A˙) gây ra sự mất sự hấp thụ ở λ 515 nm. Các hợp chất được thử nghiệm trong Luận văn này bao gồm một flavanol (alpinentin), một chalcon (cardamomin) và một điarylheptanoit (trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten). Các kết quả thử cho thấy các hợp chất này đã không thể hiện hoạt tính quét gốc tự do, alpinentin và cardamomin chỉ cho các hoạt tính quét gốc tự do (cS) tương ứng là 5,48 ± 1,2 % và 3,28 ± 0,9% ở nồng độ thử nghiệm 50 µg/ml, trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten cho hoạt tính SC là 3,14 ± 0,2% ở nồng độ 100 µg/ml. Thử nghiệm này cho thấy sự thiếu các nhóm hiđroxi (đóng vai trò của chất cho hiđro trên vòng benzen của trans-3,5-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten) hoặc vòng B của flavonoit có thể là nguyên nhân gây ra sự không có hoạt tính quét gốc tự do mạnh của các hợp chất này. KẾT LUẬN Từ các kết quả nhận được trong quá trình thực hiện luận văn “Nghiên cứu phân lập,xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic từ cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Zingiberaceae)” chúng tôi đã rút ra các kết luận sau: 1. Đã xây dựng được quy trình chiết phân lớp các hợp chất hữu cơ theo độ phân cực tăng dần và phân bố các hợp chất hữu cơ từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Zingiberaceae) được thu thập tại xã Liêm Phú, Văn Bàn, Lào Cai vào các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3). Kết quả đã nhận được các phần chiết n-hexan (AP1, hiệu suất chiết 1,32% so với lượng mẫu nguyên liệu khô), điclometan (AP2, 3,01%) và etyl axetat (AP3, 0,23%). 2. Đã nghiên cứu các điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC, silica gel) để định tính các phần chiết nhận được. Đã định tính sơ bộ các hợp chất hữu cơ có trong các hỗn hợp và lựa chọn các hệ dung môi sắc ký cho sắc ký cột gradient. 3. Đã xây dựng các quy trình phân tách sắc ký cột gradient CC theo độ phân cực và các phương pháp tinh chế (sắc ký và kết tinh) để phân lập được 6 hợp chất thành phần chính từ các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) 4. Đã xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp sắc ký (β-sitosterol và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit, TLC và co-TLC và các phương pháp phổ (IR, EI-MS và NMR) là β-sitosterol, 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on, trans-3S,5S-đihiđroxi-1,7-điphenyl-1-hepten, alpinentin, cardamomin và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit. Các kết quả nghiên cứu hóa học đã xác định được các hợp chất thành phần chính trong phần chiết axeton từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis được thu thập ở Lào Cai là tinh dầu, các hợp chất steroit (β-sitosterol, 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranozit) và các hợp chất phenolic (alpinentin, cardamomin và trans-3,5-đihidroxi-1,7-điphenyl-1-hepten). Hợp chất 6β-hiđroxistigmast-4-en-3-on lần đầu tiên đã được phân lập từ một loài của chi Alpinia (Zingiberaceae). Thành phần phenolic cardamomin đã được chứng tỏ là một tác nhân chống viêm quan trọng qua một nghiên cứu gần đây của chúng tôi về tác dụng và cơ chế ức chế của hợp chất này đối với yếu tố phiên mã NF-kapa B [19]. Alpinia pinnanensis đã được phát hiện là một nguồn mới của hợp chất đang được coi là một tác nhân chống viêm quan trọng. 5. Các thử nghiệm hoạt tính DPPH đã cho thấy các hợp chất phenolic được phân lập từ Alpinia pinnanensis không có khả năng quét gốc tự do mạnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt 1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, 986-990, Nhà xuất bản Y học, TP Hồ Chí Minh. 2. Võ Văn Chuyên (1976), Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Phạm Hoàng Hộ (1997), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 379-381, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. Nguyễn Quốc Bình (2001), “Một số thay đổi danh pháp các loài trong chi Riềng (Alpinia) và bổ sung hai loài mới thuộc chi này trong họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam”, 36-37, Tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái học và tài nguyên sinh vật (1996-2000) của Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 6. Lê Huyền Trâm (2007), “Nghiên cứu các terpenoit, ancaloit và flavonoit từ một số loài cây có giá trị của Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội. II. Tiếng Anh 7. Acta Phytotax. Sin. (1978), 16 (3), 34. 8. Arai Y., Nakagana T., Hitosugi M., Shiojina K., Ageta H., Baser O. (1998) Phytochemistry, 48, 471-474. 9. An N., Zou Z. M., Tian Z., Luo X. Z., Yang S. L., Xu L. Z., (2008), “Diarylheptan oids from the rhizomes of Alpinia officinarum and their anticancer activity”, Fitoterapia, 79 (1), 27-31. 10. An N., Xu L. Z., Zou Z. M., Yang S. L. (2006), “Diarylheptanoids from Alpinia officinarum”, J. Asian Nat. Prod. Res., 8 (7), 637-641. 11. An N., Lin J., Yang S. L., Zou Z. M., Xu L. Z. (2006), “A new glycoside from Alpinia officinarum”, Yao Xue Xue Bao, 41 (3), 233-235. 12. Bu X., Xiao G., Gu L. (2000) “Study of Alpinia officinarum”, Zhong Yao Cai, 23 (2), 84-87. 13. Brand-Williams W., Cuveliver M. E., Berset C. (1995), “Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity”, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 28, 25-30. 14. Cai Y., Luo Q., Sun M., Corke H. (2004), “Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional chinese medicinal plants associated with cancer”, Life Sciences, 74, 2157-2184. 15. Dictionary of Natural Products, Chapman & Hall (2005). 16. Fan G. J., Kang Y. H., Han Y. N., Han B. H. (2007), “Platelet-activating factor (PAF) receptor binding antagonists from Alpinia officinarum”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17 (24), 6720-6722. 17. Huang H., Wu. D., Tian W. X., Ma X. F., Wu X. D. (2008), “Antimicrobial effect by extracts of rhizome of Alpinia officinarum Hance may relate to its inhibition of beta-ketoacyl-ACP reductase”, J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 23 (3), 362-368. 18. Kubota K., Someya Y., Yoshida R., Kobayashi A., Morita T., Koshino H. (1999), “Enantiomeric purity and odor characteristics of 2- and 3-acetoxy-1,8-cineoles in the rhizomes of Alpinia galanga Willd.”, J. Agric. Food Chem. 47 (2), 685-689. 19. Kuroyanagi M., Noro T., Fukushima S., Aiyama R., Ikuta A., Itokawa U.,Morita M. (1983), “Studies on the constituents of the seeds of Alpinia katsumadai Hayata”, Chem. Pharm. Bull., 31, 1544-1550. 20. Lee J. H., Jung H. S., Giang P. M., Jin X. J., Lee S. K., Son P. T., Lee D. H., Hong Y. S., Lee K., Lee J. J. (2006), “Blockade of nuclear factor-kB signaling pathway and anti-inflammatory activity of cardamomin, a chalcone analog from Alpinia conchigera”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 316, 271-278. 21. Lee H. J., Kim J. S., Ryu J. H. (2006), “Suppression of inducible nitric oxide synthase expression by diarylheptanoids from Alpinia officinarum”, Planta Med., 72 (1), 68-71. 22. Matsuda H., Ando S., Kato T., Morikawa T., Yoshikawa M. (2006), “Inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum on production of nitric oxide in ipopolysaccharide-activated macrophages and the structural requirements of diarylheptanoids for the activity”, Bioorg. Med. Chem., 14 (1), 138-142. 23. Matsuda H., Nakashima S., Oda Y., Nakamura S., Yoshikawa M. (2009), “Melanogenesis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells”, Bioorg. Med. Chem., 17 (16), 6048-6053. 24. Masayuki Y., Le X. C., Kato T., Hayashi S. (2009), “Isolation and purification of nootkatone from the essential oil of fruits of Alpinia oxyphylla Miquel. by high-speed counter-current chromatography”, Food Chemistry, 74 (25), 2354-2358. 25. Muangnoi P., Lu M., Lee J., Thepouyporn A., Mirzayans R., Le X. C., Weinfeld M., Changbumrung S. (2007), “Cytotoxicity, apoptosis and DNA damage induced by Alpinia galanga rhizome extract”, Planta Med., 73 (8), 748-754. 26. Murakami S., Matsuura M., Satou T., Kato T., Hayashi S., Koike K. (2009), “Effects of the essential oil from leaves of Alpinia zerumbet on behavioral alterations in mice”, Nat. Prod. Commun., 4 (1), 129-132. 27. Naramsetti R., Polepally P. R., Varanasi J. P. (2009), “Two new cytotoxic labdane diterpens from Alpinia zerumbet”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19 (10), 2265-2269. 28. Giang P. M., Son P. T., Matsunami K., Otsuka U. (2005), “New diarylheptanoids from Alpinia pinnanensis”, Chem. Pharm. Bull., 53, 1335-1337 29. Phitak T., Choocheep K., Pothacharoen P., Pompimon W., Premanode B. (2009),”The effects of p-hydroxycinnamaldehyde from Alpinia galanga extracts on human chondrocytes”, Phytochemistry, 70 (2), 237-243. 30. Rasadah M. A. (2009), “Essential oils of Alpinia conchigera Griff. and their antimicrobial activities”, Food Chemistry, 113 (2), 575-577. 31. Satoru T., Atsushi S., Masafumi K., Ying Y., Minoru Y., Masayuki Y., Tominori K., Motomasa K., Nobutoshi M. (2009), “New Rev-export inhibitor from Alpinia galanga and structure–activity relationship”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19 (9), 2555-2557. 32. Shen Q., Li W. (2000), ”The study on rhizome Alpinia officinarum and other herbs as penetration enhancer for the permeation of 5-fluorouacil”, Xu Zhong Yao Cai, 23 (11), 697-699. 33. Shu Z. H., Jian G. L., Xiao B. W., Jun S. W. and Ling Y. K. (2009), “Two novel monoterpene-chalcone conjugates isolated from the seeds of Alpinia katsumadai”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 19 (10), 2728-2730. 34. Shui G., Bao Y. M., Bo J., An L. J. (2006), “Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla on hydrogen peroxide-induced oxidative PC12 cell death”, Eur. J. Pharmacol., 538 (1-3), 73-79. 35. Subramanian K., Selvakkumar C., Vinaykumar K. S., Goswami N., Meenak- shisundaram S., Balakrishnan A., Lakshmi B. S. (2009),”Tackling multiple antibiotic resistance in enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) clinical isolates: a diarylheptanoid from Alpinia officinarum shows promising antibacterial and immunomodulatory activity against EPEC and its lipopolysaccharide-induced inflammation”, Int. J. Antimicrob. Agents, 33 (3), 244-250. 36. Sun Y., Tabata K., Matsubara H., Kitanaka S., Suzuki T., Yasukawa K. (2008), “New cytotoxic diarylheptanoids from the rhizomes of Alpinia officinarum”, Planta Med., 74 (4), 427-431. 37. Xu J., Tan N., Zeng G., Han H., Huang H., Ji C., Zhu M., Zhang (2009), “Studies on chemical constituents in fruit of Alpinia oxyphylla”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 34 (8), 990-993. 38. Yadav P. N., Liu Z., Rafi M. M. (2003) ”A diarylheptanoid from lesser galanga (Alpinia officinarum) inhibits proinflammatory mediators via inhibition of mitogen-activated protein kinase p44/42, and transcription factor nuclear factor-kappa B”, J. Pharmacol. Exp. Ther., 305 (3), 925-931. 39. Yang H. L., Chen S. C., Chen C. S., Wang S. Y., Hseu Y. C. (2008), “Alpinia pricei rhizome extracts induce apoptosis of human carcinoma KB cells via a mitochondria-dependent apoptotic pathway”, Food Chem. Toxicol., 46 (10), 3318-3324. 40. Ye Y., Li B. (2006), “1'S-1'-acetoxychavicol acetate isolated from Alpinia galanga inhibits human immunodeficiency virus type 1 replication by blocking Rev transport”, J. Gen .Virol., 87 (Pt 7), 2047-2053. 41. Yu Y. S., Hsu C. L., Yen G. C. (2009), ”Anti-inflammatory effects of the roots of Alpinia pricei Hayata and its phenolic compounds”, J. Agric. Food Chem, 17, 6048-6053. 42. Wang X. Q., Yang X. J., Li J. S., (2008), “Studies on chemical constituents of Alpinia katsumadai”, Zhong Yao Cai, 31 (6), 853-855. PHẦN PHỤ LỤC

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docNghiên cứu phân lập , xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất và khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất Phenolic từ câ.doc
Luận văn liên quan