Nghiên cứu kỹ thuật phân tích gene S.O.D1 ở tế bào ối của bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down

ĐẶT VẤN ĐỀ Nền y học hiện đại đã phát hiện và điều trị được rất nhiều bệnh, nâng cao chất lượng sức khỏe của con người. Nhưng bên cạnh đó còn nhiều bệnh nan y chưa tìm ra phương pháp chữa trị, trong đó các bệnh di truyền vẫn là một trong những bài toán khó giải đối với nền y học. Một trong những bệnh di truyền đang được quan tâm rất nhiều hiện này là hội chứng Down ( Down syndrome ). Hội chứng Down là hội chứng hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể. Các hậu quả do hội chứng Down gây ra cho con người là rất lớn : sảy thai, sinh con mang dị tật, trẻ sơ sinh chết sớm, trí tuệ chậm phát triển và vô sinh. Những người mang hội chứng Down cũng đã trở thành những gánh nặng rất lớn cho gia đình và xã hội. Hiện nay y học vẫn chưa tìm ra được phương pháp chữa trị hội chứng Down mà mới chỉ có thể hạn chế trẻ mang hội chứng Down bằng phương pháp chẩn đoán trước sinh. Phương pháp để phát hiện hội chứng Down phổ biến nhất ở Việt Nam hiện nay là sử dụng Tripple test và siêu âm thai nhi, sau đó lập karyotype để xác định trisome 21 ( tam nhiễm nhiễm sắc thể 21 ). Nhưng phương pháp này hiện nay thường cho kết quả để phát hiện hội chứng Down với độ chính xác chưa đạt được 100% [2]. Với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật hiện nay, kỹ thuật PCR đang được áp dụng rất rộng rãi trong nền y học hiện đại. Kỹ thuật PCR được Kary Mullis tìm ra đã giúp các nghiên cứu về DNA nói riêng, về sinh học phân tử nói chung đạt được những thành tựu đáng kinh ngạc. Nhờ phản ứng này, một đoạn DNA ở một vùng bất kỳ trong bộ gene được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn DNA đó đã biết. Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng 2 sợi đơn. Chúng được sử dụng làm mồi để tổng hợp DNA trong in vitro nhờ enzyme DNA polymerase. Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng DNA làm khuôn ban đầu rất nhỏ (khoảng 10 -3 µg). Điều này đặc biệt quan trọng và có ý nghĩa đối với việc phát hiện những mẫu DNA ít như chẩn đoán nhiễm khuẩn trong y học, xác định tội phạm gây án trong kỹ thuật hình sự, khi mà DNA thu được từ các mẫu thường rất ít. Hiện nay chúng ta đã tìm ra được rất nhiều gene nằm trên nhiễm sắc thể 21 có liên quan đến hội chứng Down, trong đó có 1 gene rất quan trọng là gene SOD1 ( Superoxide Dismutase 1 hay Cu/Zn Superoxide Dismutase ). gene SOD -1 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 21, quy định tổng hợp enzyme SOD -1. Enzym SOD -1 nằm trong bào tương của các tế bào Eukaryota, có chức năng chống oxi hóa bằng cách chuyển O2 thành H2O2 , sau đó enzym Catalase hoặc Glutathione peroxidase (GPx) sẽ chuyển H2O2 thành O2 và H2O. Người mắc hội chứng Down có thêm 1 nhiễm sắc thể 21, nên lượng enzyme SOD -1 được tổng hợp nhiều hơn bình thường (gấp 1,5 lần), do đó lượng sản phẩm chuyển hóa của nó cũng tăng theo. MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHưƠNG I : TỔNG QUAN 3 1. Bệnh sử của hội chứng Down .3 1.1. Lịch sử nghiên cứu hội chứng Down .3 1.2. Nguyên nhân hội chứng Down .3 1.3. Tỷ lệ mắc bệnh .6 1.4. Triệu chứng lâm sàng .7 1.5. Tiên lượng 7 1.6. Chẩn đoán hội chứng Down .8 2. Tình hình nghiên cứu hội chứng Down 10 2.1. Trên thế giới .10 2.2. Tại Việt Nam 13 3. Gene SOD1 .14 3.1. Cấu tạo gene SOD1 15 3.2. Sự liên quan của gene SOD1 đến hội chứng Down .16 4. Phương pháp và kỹ thuật phân tích nghiên cứu gene SOD1 từ tế bào ối .18 4.1. Nguyên lý của phương pháp tách chiết DNA từ tế bào ối .18 4.2. Phản ứng PCR 19 4.2.1. Nguyên lý của phản ứng PCR .19 4.2.2. Các chất tham gia phản ứng PCR 21 4.2.3. Một số kỹ thuật PCR thường dùng 23 4.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down bằng phương pháp chọc ối bà mẹ mang thai có nguy cơ cao 26 CHưƠNG II : ĐỐI TưỢNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 1. Đối tượng nghiên cứu .27 2. Phương pháp nghiên cứu 29 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối .30 2.1.1. Dụng cụ và hóa chất 30 2.1.2. Quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối .31 2.1.3. Một số thử nghiệm thay thế .33 2.2. Một số kỹ thuật đánh giá kết quả tách chiết DNA .34 2.2.1. Đo mật độ quang học .34 2.2.2. Điện di DNA tổng số .35 2.2.3. Đánh giá bằng PCR sử dụng mồi GAPDH 37 2.3. Phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR .39 CHưƠNG III : KẾT QUẢ 41 1. Kết quả đo mật độ quang học của các dịch DNA tách chiết từ tế bào ối .41 2. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ tế bào ối trước và sau khi thay đổi quy trình 42 3. Kết quả chạy PCRcho GAPDH với DNA khuôn là các mẫu 3,4,5 43 4. Kết quả chạy điện di Primer 3 gene SOD1 với DNA của 3 mẫu 3,4 và 5 .44 CHưƠNG IV : BÀN LUẬN .47 1. Về kỹ thuật tách chiết DNA từ tế bào ối nuôi cấy bằng hóa chất tự pha .47 2. Về sản phẩm PCR gene GAPDH .48 3. Về sản phẩm PCR exon 3 gene SOD-1 49 CHưƠNG V : KẾT LUẬN .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

pdf21 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 03/06/2013 | Lượt xem: 2182 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu kỹ thuật phân tích gene S.O.D1 ở tế bào ối của bà mẹ mang thai nghi hội chứng Down, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
LỄ BẢO VỆ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC BỘ MÔN HOÁ SINH Hà Nội -2009 © www.kythuatyhoc.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC DŨNG CHUẨN HOÁ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH GENE SOD1 Ở TẾ BÀO ỐI BÀ MẸ MANG THAI NGHI HỘI CHỨNG DOWN LUẬN VĂN CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn: TS. Đặng Thị Ngọc Dung Hà Nội -2010 © www.kythuatyhoc.com ĐẶT VẤN ĐỀ CĐTS: Vấn đề cả xã hội quan tâm nhằm nâng cao CLDS KT hỗ trợ: Nhiều KT trong đó có KT PCR, CĐ bệnh DT ở mức độ phân tử HC Down: Là 1 trong số các bệnh DT hay gặp Có nhiều cách CĐTS HC Down, thông qua TB ối là phương pháp phổ biến hiện nay © www.kythuatyhoc.com MỤC TIÊU 1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA từ tế bào ối của phụ nữ mang thai. 2. Tối ưu hóa phản ứng PCR với gene SOD1 ở BN mang hc Down với BN chứng. © www.kythuatyhoc.com TỔNG QUAN HC Down: Là BTBS hay gặp trong các bệnh RL NST Dị tật ở tim (46%), bất thường về ống tiêu hóa (7%), bệnh Leukemia cấp (3%), 10% động kinh, 11% Alzheimer’s ở tuổi 50 và 77% ở tuổi 70, IQ< 50 Khoảng 92% thể 3 nhiễm 21 thuần, 2%-3% thể khảm, 4%-5% thể chuyển đoạn © www.kythuatyhoc.com TỔNG QUAN CĐTS HC Down: Thông dụng : triple test, siêu âm, sinh thiết tua rau,… Hiện nay : phân tích TB ối cho kết quả chính xác và độ tin cậy cao bằng cách nhuộm băng NST và PCR phân tích gene SOD-1. © www.kythuatyhoc.com ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC 1. Đối tượng NC Bà mẹ mang thai BT ( 4 mẫu ). Bà mẹ mang thai đã được chẩn đoán trước sinh thai bị Down ( 1 mẫu ). Các mẫu TB ối này đều lấy từ các phụ nữ trong độ tuổi từ 37-43, được nuôi cấy và bảo quản ở -200C tại Bộ môn Di truyền Trường ĐHYHN © www.kythuatyhoc.com ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC 2. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả Hoá chất: Lysis Buffer, pH7,5 Dung dịch K, pH8 Proteinase K: 10 mg/ml SDS: 10% Phenol: Chloroform: Isoamyl (25: 24: 1) Chloroform: Isoamyl (24:1) Natriacetat: 3 M, 100ml © www.kythuatyhoc.com ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC Ethalnol: 100% và 70% Thạch Agarose Nước cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Taq polymerase dNTP Primer Loading eye 6X Ethidium Bromide Dung dịch hòa tan DNA © www.kythuatyhoc.com ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC Quy trình tách chiết DNA: B1: Rửa TB ối B2: Phá vỡ màng TB ối B3: Thu DNA B4: Tủa DNA B5: Làm sạch, hòa tan DNA và bảo quản © www.kythuatyhoc.com ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC Kỹ thuật đánh giá kết quả tách chiết: Đo mật độ quang: Độ tinh sạch và [DNA] Điện di DNA tổng số: Chất lượng DNA Chạy PCR với mồi của gene GAPDH: Chất lượng, độ đặc hiệu của DNA Phương pháp SHPT sử dụng kỹ thuật PCR: Tiến hành chạy PCR với primer của gene SOD-1 © www.kythuatyhoc.com MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁCH DNA ĐiỆN DI DNA TỔNG SỐ PCR VỚI GENE GAPDH PCR VỚI GENE SOD-1 ĐiỆN DI SẢN PHẨM PCR ĐiỆN DI SẢN PHẨM PCR HÌNH ẢNH THU ĐƯỢC NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH ĐO OD HÌNH ẢNH THU ĐƯỢC HÌNH ẢNH THU ĐƯỢC KẾT LUẬN © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Sau khi đã điều chỉnh quy trình : Điều chỉnh số vòng ly tâm Chuyển từ ly tâm thường sang điều kiện ly tâm lạnh Chúng tôi thu được một số kết quả sau © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng đo mật độ quang DNA Giá trị OD Mẫu 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 87 98 137 120 124 Độ tinh sạch (OD260/OD280) 0,9667 0,9635 0,9831 0,9756 0,9818 © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 2. Kết quả điện di DNA tổng số 1 2 3 4 5 © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi GAPDH 1 2 3 M © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4. Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với primer SOD-1 lần 1 : 3 4 5 M © www.kythuatyhoc.com KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN • 4. Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với primer SOD-1 lần 2 : 3 4 5 M © www.kythuatyhoc.com KẾT LUẬN 1. KT tách chiết DNA từ TB ối theo quy trình trên đã có sự thay đổi là rất phù hợp, vì lượng DNA thu được nhiều hơn mà vẫn giữ được chất lượng của DNA. © www.kythuatyhoc.com KẾT LUẬN 2. Việc tối ưu hóa phản ứng PCR đã cho kết quả phân tích exon 3 của gene SOD-1 rõ ràng, dễ dàng, góp phần phục vụ chẩn đoán trước sinh hội chứng Down. © www.kythuatyhoc.com © www.kythuatyhoc.com

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfKL Thuyet Trinh.pdf
  • pdfBia.pdf
  • pdfLVD0509.pdf
  • pdfTai lieu tham khao.pdf