Nghiên cứu sự ảnh hưởng của malachite green lên sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hoá và tồn lưu trong cá tra (pangasius hypophthalmus) giai đoạn giống

hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol (DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40 ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng. Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus. Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL-1 sau 24 giờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL-1 thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µgL-1 và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 9 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu : 3.1.1 Địa điểm: Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ 3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m3 Xô nhựa, cân tiểu ly Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao) Pipet, ống đong Máy ly tâm, máy so màu quang phổ (Thermo, Anh sản xuất) Dụng cụ, thiết bị, phương tiện dùng trong thí nghiệm được sử dụng từ phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ. Hóa chất thí nghiệm: Malachite Green 80% hoạt chất (Merck) Từ kết quả khảo sát thực tế tại Thốt Nốt, Cần thơ, người nuôi cá thường sử dụng MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 1- 2ppm trong thời gian 30-60 phút mục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra. Ngoài ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong thời gian 30-60 phút hoặc kết hợp với CuSO4 0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút. Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1 ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm. Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước. - Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước - Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít nước. 3.2.2 Cá thí nghiệm Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu sắc sáng, khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật . Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 10 3.2.3 Bố trí thí nghiện Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít nước, mỗi bể bố trí 50 con. Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12 giờ. Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1 giờ. Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green. 3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục. Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là 28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h) . Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 giờ 1 lần trong 2 ngày đầu thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG. ü Thu mẫu phân tích sự tồn lưu của MG trong cá tra theo thời gian Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60 Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước ü Thu mẫu phân tích sự biến đổi thành phần sinh hoá trên não, gan cá tra dưới tác động của MG theo thời gian. Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG Nhiễm Không nhiễm Nhiễm Không nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 11 Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG Mẫu nước sau khi thu được trữ đông -20 độ cho đến khi phân tích. Mẫu cá được giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6. Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg. 88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb. 3.2.5 Chuẩn bị mẫu Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá Cân trọng lượng mẫu (A) Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH2PO4/K2HPO4 50mM (pH=7.5) (1:5 w/v) Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B) Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) Mẫu phân tích LPO(C) Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4oC) Trữ -80oC đến khi phân tích Lấy phần nổi (trữ -80oC đến khi phân tích ) 3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu: Phân tích Acetylcholinestrease (AchE) Nguyên tắc: Hoạt tính của AchE được xác định theo phương pháp của Ellman và ctv (1961). Phương pháp này sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của AchE. ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi AchE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường độ màu dần đậm theo thời gian và hoạt tính của AchE được đo bằng máy so màu quang phổ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 12 Phương trình phản ứng minh họa Acetylthiocholine iodide AchE thiocholine + acetae Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate sản phẩm có màu vàng Quá trình phân tích: Chuẩn bị hóa chất: - DTNB 167µM: 66.1mg/ml sodium phosphate 50mM, pH = 7.5 - Acetylthiocholine iodine (cơ chất) 30mM: 8,67mg Acetylthiocholine iodine/1ml sodium phosphate, pH = 7.5 Bảng 2: Quá trình phân tích AchE Hóa chất Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl) DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800 Sodium phosphate 150 100 Mẫu / 50 Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50 Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5 phút Công thức tính Abs * pha loãng R = ---------------------------------------------------- (thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml) R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein 0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate. Lipid peroxidation Nguyên tắc LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5% và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15 phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang phổ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 13 Chuẩn bị đường chuẩn: sử dụng malondialdehyde (MDA) làm đường chuẩn và chuẩn bị như sau: Bảng 3: Cách chuẩn bị đường chuẩn MDA Nồng độ MDA Thể tích pha loãng Dung dịch chuẩn 500µM 1 100µM 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước 2 50µM 2ml dung dịch 1 + 2ml nước 3 10µM 1ml dung dịch 2 + 4ml nước 4 5µM 2ml dung dịch 3 + 2ml nước 5 2.5µM 2ml dung dịch 4 + 2ml nước 6 1.25µM 2ml dung dịch 5 + 2ml nước 7 0.625µM 2ml dung dịch 6 + 2ml nước 8 0µM nước Sau đó lấy 1ml thể tích pha loãng ở các nồng độ của MDA làm đường chuẩn. Sử dụng đường chuẩn với malondialdehyde (MDA) cho phép xác định được LPO thể hiện qua nmole MDA tương đương/g mẫu. Glutathione S-transferase Nguyên tắc GST được phân tích theo phương pháp của (Habig và ctv, 1974). Để đo hoạt tính của GST cơ chất được sử dụng là 1-chloro-2,4-, dinitrobenzen (CDNB), một hợp chất có tính kỵ nước. Nhìn chung CDNB có ái lực với enzyme phân tích hơn các cơ chất khác và nó cũng là đồng cơ chất trong quá trình chuyển hóa của nhiều enzyme đồng đẳng với GTS. Ngoài ra glutathion (GSH) cũng là đồng cơ chất trong phản ứng. CDNB + GSH CDNB – GS + HCl Hoạt tính của đựoc đo bằng máy so màu quang phổ thông qua độ hấp phụ của cơ chất (CDNB-GSH) ở bước sóng 340nm trong 3 phút Quá trình phân tích: Chuẩn bị hóa chất: - HEPES: cách pha HEPES - 50mM CDNB : 50.5mg CDNB/5ml ethanol). - 50mM GSH: 76,83mg/5ml dung dịch HEPES, pH = 7.5 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 14 Bảng 4: Quá trình phân tích GST Hóa chất (µl) Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl) HEPES 700 700 CDNB ( nồng độ cuối 1.5mM ) 30 30 H2O 240 220 GSH 30 30 Mẫu / 20 Công thức tính: Hoạt tính của GST = (A340/min – Ablank) x độ pha loãng x coff.ExMol CDNBcoeff = 9.6mM-1cm-1 9.6mM-1cm-1 hệ số CDNB chuyển thành CDNB – GS + HCl dưới tác dụng của GST Đơn vị tính của GST là nmol/mg protein/phút Glucose-6-phosphate dehydrogenase ( G6DPH) Nguyên tắc: D- glucose-6-phosphat + NAD(P) ó D-gluconod-lactone-6-phosphat + NAD(P)H2 Quá trình phân tích Chuẩn bị hóa chất: - Tris- HCl buffer 1M, pH = 7.8: 121g Tris- HCl /1000ml H 2O - MgCl2 0.2M : 10,15g/250ml H2O - Nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate (NADP) 50mM: 76,5mg NADP/2ml H2O - Hỗn hợp G6PDH bao gồm: 2,36 ml Tris- HCl 1M, pH = 7.8 + 1,2ml MgCl2 0.2M + 0,48ml NADP 50mM + 15,96ml H2O. - 17,89mM G6P (D-glucose 6 phosphate) : 12,16mg G6P/2ml H 2O Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH Hóa chất Mẫu trắng hiệu chỉnh máy Mẫu trắng hiệu chỉnh mẫu Mẫu G6PDH mix (µl) 600 600 600 H2O (µl) 400 390 360 Mẫu (µl) / 10 10 G6P (µl) / 30 Hoạt tính G6PDH được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 340 nm trong 3 phút. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15 Cách tính: AOD ( AOD Test-AOD blank) x tổng thể tích(ml)x hệ số pha loãng 6.22 x 1.0 x thể tích mẫu (ml) Đơn vị tính của G6PD là nmol NADPH/phút/mg protein Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần, pha loãng mẫu bằng dung dịch đệm potasium phosphate 50mM Catalase (CAT) Nguyên tắc : Catalse là enzyme hiện diện trong peroxisom của hầu hết các tế bào hiếu khí và có chức năng bảo vệ tế bào chống lại độc chất hydrogen peroxide bằng việc phân huỷ H2O2: 2H2O2 2H2O + O2 CAT được xác định theo phương pháp của Baudhuin và ctv, 1964 có bổ sung. Trước tiên, dung dịch đầu BC được chuẩn bị gồm 1 g (BSA); 100 ml Imidazol buffer 0.2M, pH 7.0 . Sau đó, một lượng H2O2 30% thích hợp được sử dụng là 40 µl H2O2 30% cho vào 250 ml of BC tạo thành dung dịch SC. Chuẩn bị 0.75 ml TiOSO4 vào 1.25 ml SC và đọc ở bước sóng 420 nm. Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0.75 và 0.95. Hỗn hợp phản ứng gồm 1250µl SC, 25µl Triton X-100 0.02%, 12.5µl mẫu, được ủ khoảng 6 phút ở 0o C. Sau đó, 750µl of TiOSO4 được thêm vào để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đo ở 420 nm bằng máy so màu quang phổ. Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra sự phân huỷ 90% cơ chất trong một phút. Quá trình phân tích: Bảng 6: Quá trình phân tích CAT Hoá chất Mẫu (µl) Mẫu trắng 1 (µl) Mẫu trắng 2 (µl) SC 1250 / / BC / 1250 1250 Triton X- 100 25 25 25 Phosphate buffer 12.5 25 12.5 Mẫu 12.5 / / Ủ mẫu trong 6 phút ở Oo C TiSO4 750 750 750 Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút Đơn vị tính hoạt tính CAT là U/mgprotein. Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần Hoạt tính của G6PD = Trung tâm Học liệu ĐH Cần T ơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 16 Cách tính CAT(U/mg protein)= logSC-log(hấpthụ)*V(ml) phản ứng/V(ml) SC/V(ml) mẫu/T(phút) phản ứng * độ pha loãng/mg protein Prôtêin Nguyên tắc: Protein được phân tích theo phương pháp Lowry, 1951 sử dụng Albumine bovine làm đường chuẩn. Trong môi trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi chất folin phenol được đưa vào, folin phenol sẽ kết dính với protein. Phản ứng này là phản ứng khử và chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh. Quá trình phân tích: Chuẩn bị hóa chất: - BSA: 10mg/mlH2O - Hỗn hợp A :150ml Na2CO3 2% + 1,5ml CuSO4 1% + 1,5ml NaK Tartrate 2%. - Folin : 10ml Folin + 10ml H2O Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin Hóa chất Đường chuẩn Mẫu 0 mg protein 0.05 mg protein 0.1mg protein 0.2 mg protein 0.5 mg protein BSA 0µl 5 µl 10 µl 20 µl 50 µl / Mẫu / / / / / 10 H2O 500 µl 495 µl 490 µl 480 µl 450 µl 490 µl NaOH 1N 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Ủ trong 30 – 120 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660nm Hoạt tính protein được đọc ở bước sóng 660nm bằng máy so mày quang phổ. Đơn vị tính của protein là mg protein/ml 3.3. Xử lí số liệu Tất cả số liệu về sinh hóa như AchE, LPO, GST, CAT, G6DP được kiểm tra dạng phân phối trước khi xử lý thống kê. Số liệu phân phối chuẩn được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai one-way ANOVA và dùng Post hoc, Duncan test so sánh với đối chứng. Phần mềm Satistica 5.0 được dùng để xử lý thống kê. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm Malachite Green Các chỉ tiêu nhiệt độ, oxy hoà tan, pH được ghi nhận trong quá trình tiến hành thí nghiệm trong thời gian hai ngày tính từ khi gây nhiễm với MG, ghi nhận các chỉ tiêu 2 giờ 1 lần sau đó lấy trung bình giữa buổi sáng và buổi chiều để xem ảnh hưởng của chúng đến quá trình biến đổi MG trong cơ thể cá. Nhiệt độ Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG Ngày 1 Ngày 2 Nghiệm thức Sáng Chiều Sáng Chiều Trung bình 2 ngày Đối chứng 29,1±0,,19 29,8±0,45 29,2±0,10 30,4±0,06 29,5±0,22 0,1 ppm 28,7±0,20 29,8±0,28 29,2±0,06 30,3±0,00 29,4±0,25 1 ppm 29,1±0,07 30,4±0,41 29,8±0,06 30,2±0,06 29,6±0,35 Qua bảng 8 cho thấy nhiệt độ trung bình dao động trong khoảng 29,4±0,25 đến 29,6±0,35oC. Nhiệt độ buổi chiều (30,4±0,41oC) luôn cao hơn buổi sáng (28,7±0,20oC) do ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời. Toàn bộ hệ thống thí nghiệm bố trí trong mái che nên nhiệt độ khá ổn định và khoảng chênh lệch trung bình giữa 2 buổi là 1,2 oC. Nhiệt độ trung bình ngày vào khoảng 29,5oC thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cá tra. Theo Đỗ Thị Bích Ly (2004) cá tra có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở 26-30oC. Giữa các nghiệm thức sự khác biệt về nhiệt độ nằm trong giới hạn không lớn hơn 1oC. Điều này cho thấy nhiệt độ hầu như đồng nhất trong quá trình thí nghiệm. Ngoài ra độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004). Theo Bill và ctv (1977) độc tính của MG tác động lên cá sẽ tăng theo sự tăng của nhiệt độ. Cá nheo giống (Italurus punctatus) ở pH là 7,5 thời gian thí nghiệm là 6 giờ, LC50 ghi nhận được ở nhiệt độ 12oC là 0,96mg/l trong khi đó ở nhiệt độ 22oC là 0,23mg/l. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 18 pH Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG Ngày 1 Ngày 2 Nghiệm thức Sáng Chiều Sáng Chiều Trung bình 2 ngày Đối chứng 6,89±0,4 6,32±0,96 6,42±0,02 6,26±0,14 6,47 ± 0,38 0,1 ppm 6,87±0,43 6,35±0,86 6,48±0,02 6,19±0,01 6,47 ± 0,33 1 ppm 7,26±0,23 6,48±0,89 6,46±0,01 6,42±0,15 6,66 ± 0,32 Giá trị pH trong cùng nghiệm thức hay giữa các nghiệm thức dao động không lớn hơn 1 đơn vị từ 6,47 ± 0,33 đến 6,66 ± 0,32. Giá trị pH trung bình trong buổi sáng (thấp nhất là 6,42±0,02 và cao nhất là 7,26±0,23) và buổi chiều (thấp nhất là 6,19±0,01 và cao nhất là 6,48±0,89) tuy có sự chênh lệch nhưng vẫn nằm trong khoảng thích hợp. Theo Dương Nhật Long (2002) thì khoảng pH thích cho mô hình nuôi cá thâm canh trong ao đất là 6,0 - 8. Giá trị pH ảnh hưởng trực tiếp đến độc tính của MG, pH càng cao thì độc tính của MG càng tăng (Bill và ctv, 1977). Cá nheo giống (Italurus punctatus) ở nhiệt độ 12oC thời gian thí nghiệm là 6 giờ, LC50 ghi nhận được ở pH 8,0 là 1,72 mg/l trong khi đó ở pH 9,5 là 0,52 mg/l. Oxy hoà tan Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhiễm MG Ngày 1 Ngày 2 Nghiệm thức Sáng Chiều Sáng Chiều Trung bình 2 ngày Đối chứng 4,71±0,25 2,96±0,17 2,72±0,04 4,41±0,35 3,77 ± 0,20 0,1 ppm 4,85±0,19 3,02±0,08 3,65±1,24 4,43±0,06 3,95 ± 0,16 1 ppm 4,31±0,53 2,85±0,22 2,67±0,18 4,17±0,12 3,76 ± 0,41 Oxy hoà tan (DO) giữa các nghiệm thức thí nghiệm không có sự khác biệt lớn nhưng có sự chênh lệch giữa buổi sáng và buổi chiều. Buổi sáng DO cao hơn buổi chiều khoảng 1 mg/l, trung bình DO trong ngày dao động trong khoảng 3,76 ± 0,41 mg/l – 3,95 ± 0,16 mg/l. Theo Trần Bình Tuyên (2000) hàm luợng DO phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cá khoảng 2,2-4,56 mg/l, DO thích hợp cho ao nuôi thâm canh là 3,5-6,5 ppm (được trích dẫn Đỗ Thị Bích Ly, 2004). Nguyễn Văn Công và ctv (2006) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ (24- 30-34oC) và oxy hoà tan ( DO 5 mg/l) lên khả năng ức chế hoạt tính cholinesterase (ChE) của Basudin 50EC (diazinon) ở cá lóc giống (Channa striata) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 19 có trọng lượng trung bình 18,47±2,49g. Kết quả cho thấy trong điều kiện bình thường nhiệt độ, DO không làm ảnh hưởng đến hoạt tính ChE. Trong môi trường có Basudin thì DO không làm ảnh hưởng đến mức độ ức chế ChE mà chỉ có nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến ức chế này, nhiệt độ càng cao thì mức độ ức chế càng tăng (ngoại trừ gan). Kết quả cho thấy cá lóc có nhiều nguy cơ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi việc sử dụng Basudin dưới điều kiện môi trường trên đồng ruộng Nhìn chung các yếu tố nhiệt độ, DO, pH đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cá tra, giữa các nghiệm thức không có sự chênh lệch nhiều. Do đó nhiệt độ, DO, pH không phải là điều kiện ảnh huởng đến các hoạt động sinh lý, sinh hoá của cá tra. 4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green Tổng lượng tồn lưu của MG và LMG được trình bày ở bảng 11 và hình 1 Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Ngày 0 (µg/kg) Ngày 7 (µg/kg) Ngày 30 (µg/kg) Ngày 60 (µg/kg) 0,1 ppm 1003±54,7 107±43,0 6,28±3,04 2,01±1,88 1 ppm 2569±402 110±22,98 10,6±4,70 1,50±2,59 Kết quả phân tích cho thấy tổng lượng tồn lưu MG và LMG trong cá vào ngay thời điểm kết thúc gây nhiễm MG (Ngày 0) tương ứng là 1003±54,7 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) và 2569±402 µg/kg (nồng độ 1ppm). Kết quả cho thấy sự tồn lưu MG và LMG ngay sau khi sử dụng là rất cao. Sự tồn lưu của MG và LMG giảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 60 sau khi kết thúc gây nhiễm thì tổng hàm lượng MG và LMG còn lại trên cá là 2,01±1,88 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (nồng độ 1ppm) trong đó hàm lượng LMG không được phát hiện trong mẫu cá. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 20 M a la c h it e g r e e n + L e u c o M a la c h it e g r e e n 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 N g à y 0 N g à y 7 N g à y 3 0 N g à y 6 0 N g à y pp b 0 , 1 p p m 1 p p m M a la c h it e g r e e n + L e u c o M a la c h it e g r e e n 6 . 2 8 3 2 . 0 1 1 0 . 6 1 1 . 5 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 N g à y 3 0 N g à y 6 0 N g à y pp b 0 , 1 p p m 1 p p m Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm Qua các dữ liệu trên cho thấy có sự đào thải của MG và LMG ra khỏi cơ thể cá theo thời gian. Tuy nhiên kết quả phân tích mẫu nước sau 7 ngày thí nghiệm thì không phát hiện được MG và LMG trong mẫu nước phân tích với giới hạn phân tích của phương pháp là 1 ng/ml (1ppb) Các quốc gia trong khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 21 hiện diện của bất kỳ 1 dư lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005). Kết quả thí nghiệm sau 60 ngày cho thấy vẫn còn sự hiện diện của MG ( 2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb). Ba mẫu trong sáu mẫu phân tích xác định có hàm lượng MG cao hơn mức giới hạn 2 ng/g. Điều này cho thấy sau thời gian 60 ngày gây nhiễm thì hàm lượng MG vẫn còn tồn lưu trong cá. Kết quả ở nghiệm thức gây nhiễm với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12h là 2,01±1,88ppb cao hơn so với mức giới hạn quy định của Liên minh Châu Âu và Châu Úc trong khi đó ở nghiệm thức gây nhiễm với nồng độ 1ppm trong thời gian 1h thì sau 60 ngày hàm lượng MG tồn lưu trung bình là 1,50±2,59ppb, thấp hơn so với mức giới hạn của Liên minh Châu Âu và Châu Úc. Cả hai mức tồn lưu này đều không được chấp nhận theo quy định của FDA Hoa Kì. Theo Nguyễn Chính (2005) một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang cho biết không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện diện đến 10/64 mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002). 4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Ngày 0 (µg/kg) Ngày 7 (µg/kg) Ngày 30 (µg/kg) Ngày 60 (µg/kg) 0,1 ppm 821±54 22,22±2,72 3,64±0,43 2,01±1,88 1 ppm 2106±157 29,01±1,18 7,41±4,04 1,50±2,59 Kết quả phân tích (Bảng 12) cho thấy sau khi gây nhiễm MG với nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12 giờ và nồng độ 1 ppm trong thời gian 60 phút cho thấy sự tồn lưu MG tương ứng là 821±54 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) và 2106±157 µg/kg (nồng độ 1ppm). Kết quả cho thấy sự tồn lưu MG ngay sau khi sử dụng là rất cao. Tuy nhiên sau 7 ngày gây nhiễm sự tồn lưu của MG giảm xuống còn 22,22±2,72 µg/kg(nồng độ 0,1ppm) và 29,01±1,18 µg/kg (nồng độ 1ppm). Sự tồn lưu của MG giảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 60 sau khi gây nhiễm thì hàm lượng MG còn lại trên cá là 2,01±1,88 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) 1,50±2,59 µg/kg (nồng độ 1ppm). Sự giảm dần tồn lưu MG trong cá tra theo thời gian được thấy rõ hơn trong hình 2. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 22 M a la c h it e g r e e n & L e u c o M a la c h it e g r e e n 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 N g à y 0 N g à y 7 N g à y 3 0 N g à y 6 0 N g à y p p b M G 0 , 1 p p m M G 1 p p m L M G 0 , 1 p p m L M G 1 p p m Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Ngày 0 Ngày 7 Ngày 30 Ngày 60 0,1 ppm 182±3,45 84,7±41,1 2,88±2,23 0,00±0,00 1 ppm 156±31,9 80,7±21,8 2,92±1,07 0,00±0,00 Qua bảng 13 cho thấy sau khi gây nhiễm MG với nồng độ 0,1 ppm trong thời gian 12 giờ và nồng độ 1 ppm trong thời gian 60 phút cho thấy có sự chuyển hoá của MG thành LMG tồn lưu trong cơ thể cá. Hàm lượng LMG được chuyển hoá từ MG ngay sau khi gây nhiễm tương ứng là 182±3,45 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) và 156±31,9 µg/kg (nồng độ 1ppm). Kết quả cho thấy sự chuyển hoá nhanh chóng từ MG sang LMG ngay sau khi sử dụng là rất cao. Tuy nhiên sau 30 ngày gây nhiễm sự tồn lưu của LMG giảm xuống nhanh chóng 2,88±2,23 µg/kg (nồng độ 0,1ppm) và 2,92±1,07 µg/kg (nồng độ 1ppm). Sự tồn lưu của LMG giảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 60 sau khi gây nhiễm thì hàm lượng LMG không còn phát hiện trong mẫu cá với giới hạn phân tích của hệ thống phân tích là 1 µg/kg (1ppb). Hình 2 cho thấy rõ hơn sự giảm dần tồn lưu LMG trong cá tra theo thời gian. Kết quả vẫn chưa được khẳng định hoàn toàn rằng LMG sau 60 ngày gây nhiễm thì được đào thải hoàn toàn nguyên nhân chính là do phương pháp phân tích chỉ dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với đầu dò huỳnh quang nên giới hạn phát hiện (LOD) chỉ đến 1ppb trong khi đó nếu phân tích bằng hệ thống sắc kí lỏng khối phổ thì giới hạn phát hiện LOD rất thấp (0,01 ppb). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 23 4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm. 4.3.1 Hoạt tính của Acetylcholinestrease (AChE) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AChE (nmole/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 2103 ± 774 2317 ± 35 2392 ± 111 2349 ± 86 0,1ppm 2353 ± 137 ns 2050 ± 251ns 1847 ± 246ns 1897 ±137ns 1ppm 2031 ± 495ns 2054 ± 72* (11%) 1404 ± 208* (41%) 1340 ±103* (43%) Gan Đối chứng 1722 ± 304 1909 ± 367 1680 ± 134 1212 ± 44 0,1ppm 1548 ± 292ns 1054 ± 37* (45%) 1609 ± 148ns 1097 ± 128ns 1ppm 1909 ± 367ns 1488 ± 31ns 1487 ± 464ns 1177 ± 37ns Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. Số liệu trong ngoặc là tỷ lệ ức chế (%) Acetylcholinestrease (AChE) là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961). Kết quả của bảng 14 cho thấy hoạt tính của AChE ở cá tra trong não 2103 ± 774 (nmole/phút/mg protein) cao hơn ở gan 1722 ± 304 (nmole/phút/mg protein) ở trạng thái không chịu tác động của MG (Lần 1). Sau khi có sự tác động của MG thì hoạt động của AChE bị ức chế một cách đáng kể và mức độ ức chế này còn phụ thuộc vào nồng độ của MG trong thí nghiệm, thời gian gây nhiễm với MG. Hoạt động AChE bị ức chế thể hiện rõ nét ở não, đặc biệt ở nồng độ gây nhiễm 1 ppm trong thời gian 60 phút 2054 ± 72 (nmole/phút/mg protein) giảm 11% và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với đối chứng, trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1 ppm trong thời gian 12 giờ thì không khác biệt so với đối chứng. Sau khi chuyển cá ra môi trường nước không chứa MG, nghiệm thức 1ppm MG, hoạt động AChE vẫn bị ức chế và không có dấu hiệu hồi phục, 1404 ± 208 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 41 % so với đối chứng) ở 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm (lần 3) và 1340 ± 103 (nmole/phút/mg protein) ( ức chế 43 % so với đối chứng) ở 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm đều khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Trong khi đó hoạt động của AChE trong gan thì không chịu ảnh hưởng bởi sự tác động của MG ở nồng độ 1ppm trong thời gian 60 phút. Hoạt động của AChE trong gan chỉ bị tác động của MG ở nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12giờ gây nhiễm, 1054 ± 37(nmole/phút/mg protein), ức chế 45% so với đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). Tuy nhiên sự ức chế của AChE trong gan không diễn ra lâu mà đã có sự phục hồi hoạt động của AChE từ 1054 ± 37 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 24 (nmole/phút/mg protein) (ức chế 45 % so với đối chứng) tăng lên 1609 ± 148 (nmole/phút/mg protein) không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05) sau 12giờ và 4 ngày kể từ khi kết thúc gây nhiễm. Gan là cơ quan có chức năng quan trọng trong suốt quá trình giải độc sau khi xâm nhập vào cơ thể, nhiều loại men có chức năng oxy hóa hay giải độc của đa số sinh vật đều do gan sản sinh ra. Thời gian gây nhiễm ngắn (1giờ) dù ở nồng độ cao (1 ppm) sự ức chế hoạt tính AChE ở gan đã không xảy ra trong khi đó mặc dù với nồng độ thấp 0,1 ppm nhưng cá tiếp xúc với MG trong thời gian dài (12 giờ) thì hoạt tính AChE bị ức chế. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh sự biến đổi của AChE khi bị tác động bởi một tác nhân hoá học. Trichlorfon là một loại thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ được dùng trong nuôi trồng thuỷ sản để diệt ngoại kí sinh. Thí nghiệm ảnh hưởng của Trichlorfon ở 2 nồng độ 0,25mg/L trong thời gian 1 giờ và 0,5mg/L trong thời gian 24 giờ lên hoạt tính AChE ở não cá chép gần trưởng thành. Kết quả cho thấy hoạt động AChE ở thời gian gây nhiễm 24 giờ giảm 55-57% so với đối chứng và phục hồi lại trạng thái bình thường sau 7 ngày (Aruni Udara Chadrasekara và Asoka Pathiratne, 2005). Nguyễn Văn Công và ctv (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của Diazon lên hoạt tính của men cholinesterase (ChE) ở ba mức nồng độ 0,016mg/l, 0,079mg/l và 0,35mg/l trong 4 ngày trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục. Kết quả cho thấy Diazon làm giảm hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l. Sự ức chế này gia tăng theo sự gia tăng của nồng độ. Hoạt tính ChE chỉ phục hồi hoàn toàn ở nồng độ 0,016mg/l khi kết thúc thí nghiệm T. Balint và ctv (1995) nghiên cứu ảnh hưởng thuốc trừ sâu Methidathion (MD) và Deltamethein (DM) làm biến đổi hoạt tính AChE ở não loài cá chép trưởng thành (Cyprinus Carpio L), ở nồng độ trị bệnh 2 mg/l MD sau 5 ngày gây nhiễm làm giảm 70-90% hoạt tính AChE ở cơ quan não, trong khi đó ở nồng độ 2 mg/l DM sau 3 ngày không thâý được sự biến đổi của hoạt tính AChE. Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003) thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan lên hoạt động AChE trên não của cá Lepomis macrochius. Thí nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96 giờ và 1 tuần ở nồng độ 1,0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá Lepomis macrochius là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AChE trong não giảm theo sự gia tăng của thời gian gây nhiễm tương ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%. Theo Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ thấp 10,6 – 32,0 ng/l Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm giảm hoạt tính của men Acetylcholinesterase (AChE). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu ọc tập và nghiên cứu 25 Silva và ctv (1993) cho rằng hoạt tính AChE trong huyết tương cá Callichthys bị hoá chất bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ methy parathium (ở nồng độ dưới mức gây chết ) ức chế 90% sau 4 giờ gây nhiễm và duy trì mức ức chế này trong 4 ngày, sau đó khôi phục ở 8-10 ngày kế tiếp và đạt 80-90% mức bình thường sau 35 ngày. Như vậy hoạt động AchE trong não cá tra nhạy hơn ở gan hay số lượng men AchE có sẵn trong não nhiều hơn ở gan. Ở nồng độ gây nhiễm 1ppm trong thời gian 1giờ hoạt động AchE trong não cá tra không thể phục hồi trở lại có thể do thời gian để giải phóng men này khỏi sự ức chế là lớn hơn thời gian cơ thể cá tái tạo một men mới. 4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO (nmol TBARS /g mẫu) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu. Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 4,3 ± 1,04 2,64 ± 0,67 3,95 ± 0,84 4,12 ± 1,27 0,1ppm 3,44 ± 0,89 ns 8,81 ± 0,43 * 10,89 ± 2,06 * 13,9 ± 3,99* 1ppm 2,64 ± 0,67ns 10,4 ± 3,53 * 13,9 ± 1,33 * 10,0 ± 2,62* Gan Đối chứng 27,03 ± 1,7 27,00 ± 5,88 29,6 ± 1,97 26,61 ± 1,97 0,1ppm 19,76 ± 2,76 ns 32,43 ± 8,33ns 33,38 ± 4,84ns 33,38 ± 4,84ns 1ppm 27,00 ± 5,88 ns 26,76 ± 7,51ns 27,95 ± 3,97ns 27,95 ± 3,97ns Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. Lipid peroxidation là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh (Jollon và ctv, 1974). Vào thời điểm kết thúc quá trình gây nhiễm và 12h và 4 ngày kể từ khi kết thúc quá trình gây nhiễm hàm lượng LPO trong não cá tăng lên đáng kể và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng lần lượt là 8,81 ± 0,43; 10,89 ± 2,06 và 13,9 ± 3,99 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhiễm là 0,1ppm và 10,4 ± 3,53; 13,9 ± 1,33; 10,0 ± 2,62 (nmol TBARS /g) mẫu ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm. Đối với gan, tác động gây nhiễm MG không ảnh hưởng đến hàm lượng LPO trong gan, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng qua từng giai đoạn. Khi gây nhiễm MG với cá trong thời gian 12h ở nồng độ 0,1 ppm; 1ppm trong 1h thì hoạt tính LPO trong não tăng lên. Do não là cơ quan trung ương cho tất cả hoạt động sống trong cơ thể cá khi tiếp xúc trực tiếp với MG thì não bị ảnh hưởng nhanh nhất làm cho cá bị streess. Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23-50g/con), khi gây nhiễm với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa so với Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 26 đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Trong thí nghiệm này hoạt tính LPO trong gan cá tra không khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Kết quả này tương tự Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4-D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus). Kết quả cho thấy cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydation 4.3.3 Hoạt tính của men Glutathione-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST (nmol/mg protein/phút) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu. Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 723 ± 112 691 ± 140 723 ± 162 563 ± 37 0,1ppm 730 ± 102ns 1068 ± 94* 790 ± 49ns 616 ± 93ns 1ppm 691 ± 140ns 1005 ± 104* 773 ± 164ns 779± 112ns Gan Đối chứng 499 ± 34 558. ± 31 548 ± 36 517 ± 144 0,1ppm 569 ± 48ns 559 ± 14ns 791 ± 40* 512 ± 97ns 1ppm 558 ± 31ns 583 ± 20ns 693 ± 105ns 506 ± 40ns Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. GST là men xúc tác phase II quan trọng trong quá trình làm giảm Glutathione (GSH) tiếp hợp lên tế bào làm phá huỷ tế bào do sự tấn công của ROS dẫn đến sự làm giảm độc tính của chúng (Storey, 1996). Hoạt động của men GST trong não cá vào thời điểm kết thúc gây nhiễm ở hai nồng độ gây nhiễm 0,1ppm và 1ppm lần lượt là 1068± 94, 1005 ± 104 (nmol/mg protein/phút) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng (P<0,05). Tuy nhiên 12 giờ và 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm thì hoạt tính GST trong não cá không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức so với đối chứng (P>0,05). GST hoạt động trong gan tương đối chậm. Ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm trong thời gian 60 phút thì không biểu hiện thay đổi của men GST trong khi đó ở nồng độ gây nhiễm 0,1ppm trong thời gian 12 giờ thì men GST chỉ hoạt động sau khi kết thúc gây nhiễm 12 giờ là 791± 40 (nmol/mg protein/phút) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng. Do tác dụng của MG lúc này chưa ảnh hưởng làm biến đổi hoạt tính GST, 12 giờ kết thúc gây nhiễm GST có biển đổi và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng ở nồng độ 0,1 ppm có thể là ở não các men giải độc sinh ra không đủ khả năng để trung hoà độc tính của MG, sau một khoảng thời gian (12 giờ kết thúc gây nhiễm) tác dụng của MG đến gan, sau đó các men giải độc ở gan được sinh ra. Đó có thể là nguyên nhân làm cho GST tăng lên. Trung tâm Học liệu ĐH Cầ Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 27 Hoạt tính này tăng có thể do khi gây nhiễm với MG cá tăng cường trao đổi chất chúng gia tăng trao đổi chất qua mang để lấy đủ oxy cho nhu cầu của cơ thể. Đây là điều kiện làm cho MG hoà tan vào nước có nhiều cơ hội tiếp xúc với mang và xâm nhập vào cơ thể đặt biệt là ở não khi đó cơ thể mới sản sinh ra men GST để giải độc. Elif Ozcan Orue và Nevin Uner (2000) nghiên cứu tác động 2,4-D ở nồng độ 27 ppm và thuốc trừ sâu azinphosmethy ở nồng độ 0,03 ppm ảnh hưởng đến hoạt tính của men GST và lipid peroxidation trên cá rô phi, trong cả hai trường hợp sử dụng riêng lẻ và kết hợp tắm cá ở các thời gian 24, 48, 72, 96 giờ cho thấy hoạt tính CAT, GST và mức độ MDA trong gan loài cá O. niloticus không có sự biến đổi. Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus. Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µg/L sau 24 giờ. Kết quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µg/L thì LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5µg/L và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm. Tương tự nghiên cứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ endosulfan lần lượt là (10,6; 16,0; 3,2ng/l) sau 21 ngày gây nhiễm qua các giai đoạn thu mẫu ở các ngày 1, 8, 15, 21 cho thấy có sự biến đổi sinh hoá, sinh lý trong cơ thể Macrobrachium malcolmsoii giai đoạn giống làm tăng hoạt tính của enzim GST so với đối chứng. 4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD (nmol NADPH/phút/mg protein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu. Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 31,16 ± 2,48 32,14 ± 3,61 30,02 ± 4,19 20,71 ± 4,46 0,1ppm 29,02 ± 7,93ns 32,22 ± 6,81ns 21,73 ± 2,49* 21,81 ± 5,59ns 1ppm 32,14 ± 3,61ns 31,60 ± 7,82ns 23,83 ± 8,91ns 15,81 ± 3,32ns Gan Đối chứng 75,61 ± 17,72 75,84 ± 9,16 79,31 ± 7,50 73,40 ± 22,3 0,1ppm 83,44 ± 0,46ns 65,57 ± 5,88ns 64,88 ± 4,13ns 62,24 ± 11,17ns 1ppm 75,84 ± 9,16ns 62,03 ± 13,66ns 72,11 ± 20,33ns 59,25 ± 8,94ns Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. Từ kết quả bảng 17 cho thấy hoạt động của men G6PD trong não, gan của cá tra ở cả 2 nghiệm thức 0,1 ppm và 1 ppm vào thời điểm kết thúc gây nhiễm không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (P > 0,05). Ở thời điểm 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm, hoạt động của G6PD trong não có sự biến đổi 21,73 ± 2,49 (nmol NADPH/phút/mg protein) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng, trong Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 28 khi ở nồng độ gây nhiễm 1ppm trong 1giờ thì không có sự khác biệt của G6PD so với đối chứng. Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4-D và azinphosmethyl lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03 ppm azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ. Kết quả cho thấy hoạt tính G6PD tăng so với đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể. 4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm. Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT (U/mgprotein) trong não, gan theo thời gian qua các đợt thu mẫu. Cơ quan Nghiệm thức Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Não Đối chứng 0,0038 ± 0,0003 0,0028 ± 0,0004 0,003 ± 0,001 0,0038 ± 0,0003 0,1ppm 0,0035 ± 0,0006ns 0,0039 ± 0,0002 * 0,0047 ± 0,0011ns 0,0035 ± 0,0006ns 1ppm 0,0031 ± 0,0001ns 0,0021 ± 0,0001 * 0,0038 ± 0,0004ns 0,0021 ± 0,0001ns Gan Đối chứng 0,0266 ± 0,0023 0,0237 ± 0,0062 0,0226 ± 0,0029 0,0266 ± 0,0023 0,1ppm 0,0285 ± 0,005ns 0,0136 ± 0,0101ns 0,0198 ± 0,0011ns 0,0285 ± 0,005ns 1ppm 0,0237 ± 0,0062ns 0,0243 ± 0,0025ns 0,0186 ± 0,0003 ns 0,0237 ± 0,0062ns Kết quả trình bày trung bình ± SD. Dấu sao (*) chỉ sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (P<0,05). ns chỉ không sai khác so với đối chứng. Catalase là một men trong cơ thể có tác dụng biến đổi hydroperoxyl một trong các sản phẩm được thảy ra trong quá trình trao đổi chất thành nước và khí oxy. Hydrogen peroxide được sinh ra trong quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể và là tiền thân của các phân tử gốc tự do làm tổn hại đến tế bào bằng cách tạo ra các phản ứng oxy hoá (Winston và Di Giulio, 1991). Vào thời điểm kết thúc gây nhiễm hoạt tính của CAT trong não cá có sự biến đổi khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với đối chứng; 0,0039 ± 0,0002 (U/mg protein) ở nồng độ gây nhiễm 0,1ppm và 0,0021 ± 0,0001 (U/mg protein) ở nồng độ gây nhiễm 1ppm. Kết quả Jungueira và ctv (1988) khi gây nhiễm với 10-4 thiram làm tăng hoạt tính CAT trong khi ở nồng độ 10-6 và 10-8 thiram thì hoạt tính này giảm. Theo Dimitrova và ctv (1994) cho rằng hoạt tính của CAT tăng khi bị tác động bởi kẽm và chì sau 24h và 10 ngày ở cá chép C.carpio. Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC- RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus. Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µg/L sau 24 giờ. Kết quả Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 29 cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µg/L thì CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm này cho thấy hoạt tính CAT ở gan không bị ảnh hưởng ở cả hai nồng độ gây nhiễm. Kết quả này gần giống với kết quả của Gallagher và Di Giulio (1991) nghiên cứu ảnh hưởng sử dụng kết hợp 2,4-D và picloram trị bệnh trên cá chép C. carpio, không làm biến đổi hoạt tính men CAT. Dưới tác dụng của MG hoạt tính CAT ở não cá tra tăng lên ở cả hai nồng độ thí nghiệm. Chứng tỏ men CAT được sinh ra ở não thông qua cơ chế giải độc hay trung hoà tác nhân oxy hoá. Nhưng cả hai nồng độ này không làm biến đổi hoạt tính CAT của cá tra. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 30 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả thí nghiệm sau 60 ngày cho thấy vẫn còn sự hiện diện của MG (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb) Hoạt tính của các men trong não gan của cá Tra đều bị biến đổi. Khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. MG gây ức chế AchE trong não trong thời gian dài ở nồng độ 1ppm (2031 ± 495 (nmole/phút/mg protein) trước khi gây nhiễm 1340 ±103 (nmole/phút/mg protein) ở 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm. Ở nồng độ 0,1ppm AchE không bị ức chế trong khi ở gan AchE bị ức chế ở nồng độ 0,1ppm trong thời gian 12h và không bị ức chế ở nồng độ 1ppm trong 1h. Hàm lượng LPO ở não tăng ở cả hai nồng độ gây nhiễm là 8,81 ± 0,43 (nmol TBARS /g mẫu) ở nồng độ 0,1ppm và 10,4 ± 3,53 (nmol TBARS /g mẫu) ở nồng độ gây nhiễm là 1ppm, trong khi ở gan thì không có sự biến đổi. Hoạt tính của các men GST và CAT ở não tăng lên ở cả hai nồng độ gây nhiễm trong khi ở gan thì không có sự biến đổi đối với CAT, GST chỉ bị biến đổi sau khi kết thúc gây nhiễm 12h là 791± 40 (nmol/mg protein/min). Men G6PD không bị tác động khi gây nhiễm MG ngoại trừ nồng độ 0,1 ppm thì có sự biến đổi sau 12h gây nhiễm là 21,73 ± 2,49 (nmol NADPH/phút/mg protein) trong khi nghiệm thức đối chứng là 30,02 ± 4,19 (nmol NADPH/phút/mg protein). 5.2 Đề xuất Tiến hành thí nghiệm với thời gian dài hơn nhằm mục đích xác định chính xác thời gian đào thải hoàn toàn MG và LMG Sử dụng phương pháp phân tích MG và LMG bằng sắc kí lỏng khối phổ. Tiếp tục nghiên cứu các chỉ tiêu sinh hóa ở mức độ quần thể nhằm tìm ra phương pháp chuẩn đoán nhanh mức độ nhiễm MG trong quần thể. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Aruni Udara Chandrasekara and Asoka pathiratne, 2005. Effect of low concentrations of Trichlorfon on haematological parameters and brain acetylcholinesterase activity in common carp, Cyprinus carpio L. Aquaculture Research 144. 2. Bùi Quang Tề, 1998. Giáo trình bệnh cá của Động Vật Thủy Sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội 3. Cục Quản Lý Chất Lượng, ATVS & TYTS (NAFIQAVED), 2003, 2004. Báo cáo kết quả chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi. 4. CFIA, July, 2005. Update on the Canadian Food Inspection Agency Monitoring Activities for Malachite Green. 5. Cục thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005. Thông báo tình hình kinh tế xã hội và kết quả điều tra thuỷ sản. 6. Đỗ Thị Bích Ly, 2004. Khảo sát sự tương quan giữa các yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (Pangasius hypopthamus) thâm canh. Luận Văn Tốt Nghiệp Đại Học. 7. Dương Nhật Long, 2003. Giáo trình kĩ thuật nuôi thuỷ sản nước ngọt. 8. Elif Ozcan Orue, Nevin Uner, 2000. Combined effects of 2,4-D and azinphosmethyl on antioxidant enzymes and lipid peroxidation in liver of Oreochromis niloticus. Comparative Biochemistry and Physiology PartC 127, Elsevier Science Ine. Ellman, G.L., K.D. Courtney, V.Andres and R.M. Featherstone(1961). A new and rapid colorimetric determination of AchE activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95 9. Fatima, M., Ahmad, I., Sayeed, I., Athar, M., and Raisuddin, S. (2000). Pollutant-induced over-activation of phagocytes is concomitantly associated with peroxidative damage in fish tissues. Aquat. Toxicol. 49, 243–250 10. Food and Environonental Hygiene Dapartment Hongkong, Malachite Green in food, August 2005. 11. Hiran M. Dutta, D. A. Arends, 2003. Effects of endosunlfan on brain actycholinesterase activity in juevenile bluegill sunfish. Environmetal Research 91, 157-162. 12. Nguyễn Thượng Chánh, 22/12/2005. Cá basa và chất Malachite Green. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 13. Tác hại xanh Malachte chất có thể thay thế Malachite, 2/2/2005 14. MGTam Cargill. Hiểm hoạ Malachite Green. 15. Jimena cazenave, Maria de los Angeles Bistoni, Silvia Fabiana pesce and Daniel Albeto Wunderlin, 2006. Diffrential detoxification and antioxidant response in diverse argan of corydoras paleatus experimentally exposed to microcytin-RR. Aquatic Toxicological. 16. Jinfei Zhang, Hua Shen, Xiaorong Wang, Jichun Wu, Yuqun Xue, 2004. Effect of chronic exposure of 2,4-dichlorophenol on the antioxidant system in liver of freshwater fish Carassius auratus. Chemosphere 55, 167-174. 17. Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2005. Bài giảng thuốc và hóa chất trong Nuôi Trồng Thủy Sản. Khoa Thủy Sản- Đại Học Cần Thơ 18. Nguyễn Bạch Loan, 2000. Giáo trình Ngư Loại I. Khoa Thủy Sản - Đại Học Cần Thơ. 19. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Nuôi Trồng Thủy Sản. 20. Nguyễn Thị Kim Liên, 1998. Ảnh hưởng của thuốc Basudin 40ND lên các chỉ tiêu sinh lý, huyết học và hoạt tính của men Acetylcholineterase của cá rô phi và cá mè vinh. 21. Nguyễn Thị Phương Nga, 2004. Phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản tại Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Luận văn thạc sỹ ngành Nuôi Trồng Thủy Sản Đại Học Cần Thơ. 22. Nguyễn Văn Công, Nguyễn Xuân Lộc, Lư Thị Hồng Ly và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Ảnh hưởng của Basudin 50EC lên hoạt tính enzym cholinterase và tăng trọng của cá lóc (Channa striata). Tạp chí nghiên cứu khoa học thuỷ sản 2006, 1-12. 23. Nguyễn Văn Công, Trần Sỷ Nam, Phan Ngọc Thanh Hùng, Nguyễn Thanh Phương, 2006. Ảnh hưởng của nhiệt độ và oxy hoà tan lên độc tính Basudin 50EC ở cá lóc (Channa striata). Tạp chí nghiên cứu khoa học thuỷ sản 2006, 1-12. 24. P.S. Bhavan and P. Geraldine, 2000. Alteration in concentration of protein, carbohydrate, glycogen, free sugar, and lipid in the praw Macrobrachium malcolmsonii on exposure to sublethal concentrations of endosulfan, pestic. Biochem. Physiol. 58, 59. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 25. Phan Thanh Tuấn, 2004. Khảo sát bước đầu về tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản trong nghề nuôi cá tra công nghiệp ở tỉnh Đồng Tháp. 26. Raoul V. Kuiper, Peter Scherpenisse and Alder A.Bergwerff, 2000. Persistence of residues of Malachite green in Euro eel (Auguilla Anguila) after water – borne exposure ofjuvenice eels. 27. S. Pandey, I. Ahmad, S. Parvez, B. Bin. Hafeez, R.Haque, S. Raisuddin, 2000. Department of Medical Elemcatology and Toxicology, Tamia Hamdard (Hamdard University), New Delhi 110062, India. 28. Shivaji Srivastava, Ranjana Sinha, D. Roy, 2004. Toxicological effect of Malachite green. Aquatic toxicology 66, 319-329. 29. Sở ngư nghiệp An giang, Tác hại xanh Malachte chất có thể thay thế Malachite, 2/2/2005. 30. T. Balint, T. Szegletes, Z. Szegletes, K. Halasy, J. Nemcsok, 1995. Biochemical and sublellular changes in carp exposed to the organophosphorus methidathion and the pyrethriod deltamethrin. Aquatic Toxicology 33, 297-295. 31. Tạp chí khoa học số đặc biệt chuyên đề thuỷ sản, 2006. 13-23 32. Trần Bình Tuyên, 2000. Ảnh hưởng của các phương thức và tần số cho ăn đối với sự tăng trưởng của cá tra bần. Luận Văn Tốt Nghiệp Đại Học. 33. Võ Văn Ninh, 2001. Kháng sinh trong thú y. NXB trẻ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu