Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể thông đỏ (taxus wallichiana zucc.) tại Lâm Đồng bằng kỹ thuật sinh học phân tử

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT --------------------------------------------------------- iii DANH MỤC CÁC BẢNG --------------------------------------------------------------------- iv DANH MỤC CÁC HÌNH ----------------------------------------------------------------------- v ĐẶT VẤN ĐỀ ------------------------------------------------------------------------------------ 1 1. TỔNG QUAN ------------------------------------------------------------------------------ 3 1.1 Thông đỏ Lâm Đồng - Taxus wallichiana Zucc. (Himalayan Yew) ------------------------------------ 3 1.1.1 Đặc điểm sinh học----------------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái ------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh --------------------------------------------------------------------------------- 3 1.1.1.3 Điều kiện sinh thái ------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.2 Phân bố ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 4 1.1.3 Hệ thống phân loại --------------------------------------------------------------------------------------- 5 1.1.4 Giá trị sử dụng --------------------------------------------------------------------------------------------- 6 1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam--------------------------------------------- 7 1.2 DNA lục lạp (cpDNA) ở thực vật ------------------------------------------------------------------------------ 9 1.2.1 Bộ gen lục lạp --------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể ----------------------------10 1.3 Sự đa dạng di truyền ---------------------------------------------------------------------------------------------10 1.3.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền ---------------------------------------------------------------11 1.3.2 Dòng chảy của gen ---------------------------------------------------------------------------------------12 1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng -----------------------------------------------------------------------12 1.3.4 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền ---------------------------------------------------------------------13 1.4 Marker phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền---------------------------------------------------14 1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker ----------------------------------------15 1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker-----------------------------------16 1.4.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) marker -----------------------------------17 1.4.4 SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat) marker -------------------------------------17 2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU------------------------------------- 19 2.1 Vật liệu, hóa chất & trang thiết bị-----------------------------------------------------------------------------19 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu --------------------------------------------------------------------------------------19 2.1.2 Dụng cụ & thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu:------------------------------------------------19 -ii- 2.1.2.1 Dụng cụ-------------------------------------------------------------------------------------------------19 2.1.2.2 Thiết bị -------------------------------------------------------------------------------------------------19 2.2 Phương pháp -------------------------------------------------------------------------------------------------------21 2.2.1 Chiết tách và tinh sạch DNA---------------------------------------------------------------------------21 2.2.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)-------------------------------------------------------------------------------------22 2.2.2.1 Phản ứng RAPD-PCR---------------------------------------------------------------------------22 2.2.2.2 Phân tích kết quả đa hình từ RAPD-PCR---------------------------------------------------24 2.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RFLP-PCR vùng giữa hai gen trnL-trnF của DNA lục lạp -------------------------------------------------------------------------------24 2.2.3.1 Phản ứng PCR khuyếch đại vùng trnL-trnF lục lạp --------------------------------------24 2.2.3.2 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR -----------------------------------------------------------26 2.2.3.3 Phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn – RFLP --------------------------------------------26 2.2.3.4 Giải trình tự đoạn giữa hai gen trnL-trnF---------------------------------------------------28 3. KẾT QUẢ & BÀN LUẬN -------------------------------------------------------------- 29 3.1 Đa dạng di truyền thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật RAPD--------------------------29 3.1.1 Kết quả đa hình thu được sau phản ứng RAPD-PCR---------------------------------------------29 3.1.1.1 Sàng lọc mồi --------------------------------------------------------------------------------------29 3.1.1.2 Kết quả khuyếch đại DNA với mồi ngẫu nhiên -------------------------------------------29 3.1.2 Tương quan di truyền giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) -------------------------------------------------------------------------------------------------------------35 3.1.3 Phân nhóm di truyền các mẫu thông đỏ khảo sát --------------------------------------------------36 3.1.4 Tính đa dạng và cấu trúc di truyền của các quần thể được khảo sát ---------------------------39 3.2 Đa dạng di truyền của thông đỏ Lâm Đồng qua khảo sát bằng kỹ thuật RFLP-PCR trên vùng trnL-trnF của DNA lục lạp (cpDNA)---------------------------------------------------------------------------------40 3.2.1 Kết quả PCR-RFLP vùng giữa hai gen trnL-trnF -------------------------------------------------40 3.2.2 Trình tự vùng giữa hai gen trnL-trnF của DNA lục lạp thông đỏ------------------------------41 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ------------------------------------------------------------- 46 4.1 Kết luận -------------------------------------------------------------------------------------------------------------46 4.2 Đề nghị--------------------------------------------------------------------------------------------------------------47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ----------------------------------------------------------------------- 1

pdf38 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 1603 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể thông đỏ (taxus wallichiana zucc.) tại Lâm Đồng bằng kỹ thuật sinh học phân tử, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ 3.1.1. SỰ PHÁT SINH RỄ TRỰC TIẾP TỪ LÁ VÀ TRỤ HẠ DIỆP 3.1.1.1. Sự nuôi cấy lá và trụ hạ diệp Bảng 1: Ảnh hưởng của các auxin trên sự tạo rễ ở mảnh cắt lá sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ Trọng lượng tươi (mg) Chiều dài rễ (mm) Đối chứng (MS) 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a MS + IAA 0,1 mg/l 71,4 ± 14,3b 1,5 ± 0,2b 1,3 ± 0,1ab 11,0 ± 1,0b MS + IBA 0,1 mg/l 80,9 ± 4,8b 1,6 ± 0,2b 2,5 ± 0,4b 15,9 ± 3,0b MS + NAA 0,1 mg/l 98,3 ± 1,5c 3,4 ± 0,6c 10,0 ± 1,3c 9,1 ± 1,1b MS + 2,4-D 0,1 mg/l 61,7 ± 7,3b 1,7 ± 0,3b 0,3 ± 0,1b 1,0 ± 0,1a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Mảnh cắt lá Nhàu in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các loại auxin khác nhau như IAA, IBA, NAA, 2,4-D ở cùng nồng độ (0,1 mg/l) đều kích thích sự tạo rễ. Môi trường có bổ sung NAA có tỷ lệ tạo rễ, số lượng và trọng lượng rễ cao nhất. 2,4-D 0,1 mg/l cũng kích thích sự hình thành rễ nhưng rễ không thể kéo dài (<1 mm) (bảng 1, ảnh 3). 23 Ảnh 3: Mảnh cắt lá Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung IAA (B), IBA (C), NAA (D), 2,4-D (E) 0,1 mg/l. E1,6 cm D1,5 cm C1,5 cm 1,6 cm B1,5 cm A 24 Bảng 2: Tỷ lệ ra rễ và số cụm rễ của lá Nhàu in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số cụm rễ 0 0,0 ± 0,0a 0,0± 0,0 a 0,1 94,4 ± 5,2c 5,3 ± 0,6 c 0,5 96,6 ± 3,2c 4,7 ± 0,6 bc 1 100,0 ± 0,0c 3,9 ± 0,5 b 1,5 61,7 ±7,3b 4,3 ± 0,4 bc Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. NAA ở nồng độ từ 0,1 mg/l đến 1,5 mg/l đều kích thích sự tạo rễ tại các vết cắt trên lá sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường MS không bổ sung NAA, lá không có khả năng tạo rễ. Mô cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l hoặc 0,5 mg/l đều có tỷ lệ ra rễ và số cụm rễ tốt nhất. NAA ở nồng độ cao (1 và 1,5 mg/l) làm mẫu cấy có hiện tượng hóa đen và chết dần (bảng 2, ảnh 4). Như vậy, trong số các auxin ngoại sinh, NAA kích thích sự tạo rễ tốt nhất. NAA ở nồng 0,1 mg/l đã có thể kích thích mạnh sự ra rễ mà không gây chết mẫu cấy. Vì thế, chúng tôi sử dụng NAA nồng độ 0,1 mg/l trong các thí nghiệm tạo rễ về sau. 25 Ảnh 4: Lá Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung NAA 0,1 mg/l (B), 0,5 mg/l (C), 1 mg/l (D), 1,5 mg/l (E). E 1,5 cm 1,5 cm D C 1,5 cm B 1,5 cm A1,5 cm 26 Bảng 3: Tác động của NAA 0,1 mg/l trên sự phát sinh rễ từ lá và trụ hạ diệp của cây in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy. Vật liệu thực vật Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ Chiều dài rễ (mm) Trụ hạ diệp 75,1 ± 20,2 12,2 ± 3,1 3,1 ± 0,2 Lá 71,4 ± 14,3 23,6 ± 4,3 6,9 ± 0,5 T-Test − + + +, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. −, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trụ hạ diệp và lá Nhàu in-vitro đều có sự tạo mô sẹo tại các vết thương song song với sự phát sinh rễ khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Ở trụ hạ diệp, sự tạo mô sẹo là chủ yếu, trong khi ở lá, sự tạo rễ chiếm ưu thế hơn. Số rễ và chiều dài rễ ở lá đều cao hơn so với trụ hạ diệp (bảng 3, ảnh 5). Ảnh 5: Trụ hạ diệp (A) và lá (B) 4 tuần tuổi trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l. B1,5 cm A1,5 cm 27 3.1.1.2. Các thay đổi hình thái tế bào trong sự phát sinh rễ trực tiếp Ở lá và trụ hạ diệp, sự tạo sơ khởi rễ bắt đầu từ tuần 1 (ảnh 6A và 6B) và sự kéo dài rễ bắt đầu ở tuần 2 (ảnh 6C và 6D). Ở trụ hạ diệp, rễ bất định có nguồn gốc từ vùng chu luân giữa hai bó mạch (ảnh 6A). Ở lá, rễ bất định cũng có nguồn gốc từ nhu mô chu luân (ảnh 6B). Ảnh 6: Sơ khởi rễ ở trụ hạ diệp (A), lá (B) Nhàu 1 tuần trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l và rễ bất định ở trụ hạ diệp (C), lá (D) Nhàu 2 tuần trên môi trường MS + NAA 0,1 mg/l. C 420 µm D 420 µm 400 µm BA330 µm 28 3.1.1.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong sự phát sinh rễ Bảng 4: Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/giờ) của lá và trụ hạ diệp qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) Vật liệu thực vật 0 1 2 3 4 Lá 5,7 ± 0,6a 13,0 ± 0,8c 18,7 ± 0,8d 20,8 ± 1,3d 13,7 ± 0,8c Trụ hạ diệp 8,4 ± 0,3b 7,4 ± 0,2ab 13,7 ± 0,6c 4,9 ± 0,6a 6,0 ± 1,5ab T-Test + + + + + Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. +, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. −, Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Dưới tác động của NAA, cường độ hô hấp ở lá tăng sớm ở tuần 1, cao nhất ở tuần 2, 3 và giảm ở tuần 4, trong khi ở trụ hạ diệp có cường độ hô hấp tăng chậm hơn, bắt đầu ở tuần 2 và giảm mạnh ở tuần 3 (bảng 4, hình 2). 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 0 1 2 3 4 Thời gian (tuần) C ườ ng đ ộ hô h ấp (µ m ol O ₂/g T LT /g iờ Lá (NAA) Trụ hạ diệp (NAA) Hình 2: Sự thay đổi cường độ hô hấp ở lá và trụ hạ diệp theo thời gian khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. 29 3.1.1.4. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong sự phát sinh rễ Bảng 5: Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong trụ hạ diệp qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) 0 1 2 4 IAA (mg/l) 3,03 ± 0,37b 4,16 ± 0,28c 3,74 ± 0,39c 3,81 ± 0,45c Zeatin (mg/l) 0,46 ± 0,02a 2,26 ± 0,23c 1,58 ± 0,21cb 0,22 ± 0,04a ABA (mg/l) 1,77 ± 0,00a 3,40 ± 0,43b 3,59 ± 0,65b 3,70 ± 1,03b GA3 (mg/l) 17,33 ± 0,44c 3,67 ± 1,03a 4,23 ± 0,96a 11,33 ± 0,23b Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Bảng 6: Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong lá qua các tuần khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l. Thời gian (tuần) 0 1 2 4 IAA (mg/l) 2,57 ± 0,20a 5,12 ± 0,11c 3,91 ± 0,19b 3,04 ± 0,29a Zeatin (mg/l) 1,42 ± 0,24a 1,66 ± 0,09ab 2,12 ± 0,13b 2,07 ± 0,10b ABA (mg/l) 5,34 ± 0,77ab 3,30 ± 0,33a 7,15 ± 0,65b 5,87 ± 0,65b GA3 (mg/l) 5,27 ± 0,92a 3,70 ± 0,10a 9,70 ± 0,49b 15,87 ± 0,33c Các số trung bình trong hàng với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Dưới tác động của NAA 0,1 mg/l, hoạt tính IAA ở lá và trụ hạ diệp đều tăng mạnh ở tuần 1 nhưng sau đó hoạt tính trong lá giảm ở tuần 2, trong khi ở trụ hạ diệp hoạt tính này vẫn duy trì đến tuần 4. Hoạt tính zeatin nội sinh trong lá và trụ hạ diệp bắt đầu tăng ở tuần 1 nhưng sau đó hoạt tính trong trụ hạ diệp bắt đầu giảm ở tuần 2, trong khi lá vẫn tiếp tục duy trì hoạt tính này đến tuần 4. Hoạt tính ABA ở trụ hạ diệp tăng ở tuần 1 và không đổi suốt 4 tuần nuôi cấy trong khi hoạt tính ABA giảm nhẹ trong tuần đầu tiên ở lá, sau đó tăng mạnh từ tuần 2 và duy trì đến tuần 4. Hoạt tính GA3 ở lá tăng mạnh ở tuần 2 cho đến tuần 4. Hoạt tính GA3 sẵn có trụ hạ diệp cao, khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l, hoạt tính này giảm mạnh ở tuần 1 và tăng trở lại ở tuần 4 (bảng 5 và 6). 30 3.1.2. SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ LÁ 3.1.2.1. Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo Bảng 7: Sự thay đổi trọng lượng tươi và cường độ hô hấp của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 4 và 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (mg) Cường độ hô hấp (µmol O₂/g TLT/giờ) 2 56,5 ± 3,4a 5,97 ± 0,12c 4 106,7 ± 6,1b 2,13 ± 0,03b 8 179,4 ± 8,6c 1,70 ± 0,06a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trong điều kiện tối hoàn toàn, các mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l hình thành mô sẹo sau một tuần. Mô sẹo xuất hiện tại những vết cắt ngang gân chính. Sau đó, kích thước và trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần đặc biệt là khối mô sẹo tiếp xúc trực tiếp với môi trường. Mô sẹo từ tuần 1 đến tuần 4 có màu vàng sáng, bở. Mô sẹo này bắt đầu chuyển dần sang màu nâu và trở nên chặt hơn ở tuần 8 (bảng 7, ảnh 7). 31 Ảnh 7: Mô sẹo từ lá sau 1 (A), 2 (B), 4 (C) và 8 (D) tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. D1 cm C1,2 cm B1 cm A1 cm 32 3.1.2.2. Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l, vùng biểu bì ở gân chính của cả 2 mặt lá có sự kéo dài và bắt đầu phân chia theo hướng tiếp tuyến. Ở tuần thứ 2, các tế bào mô sẹo ở ngoài cùng tách rời nhau làm mô sẹo trở nên bở. Các nhóm tế bào này tiếp tục duy trì sự phân chia và có tế bào chất chuyển dần sang màu nâu ở tuần 8 (ảnh 8). Ảnh 8: Sự phân chia ở vùng biểu bì lá (A), mô sẹo từ lá sau 2 (B), 4 (C) và 8 (D) tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l. A400 µm D82 µm C82 µm B167 µm 33 3.1.2.3. Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng của mô sẹo Bảng 8: Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo có nguồn gốc từ lá trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l sau 2, 4 và 8 tuần nuôi cấy. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 2 1,82 ± 0,08a 0,27 ± 0,06a 1,42 ± 0,24a 0,66 ± 0,31a 4 1,50 ± 0,07b 0,23 ± 0,01a 1,33 ± 0,33a 0,35 ± 0,09a 8 1,08 ± 0,07c 0,20 ± 0,03a 3,00 ± 0,27b 0,57 ± 0,13a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Không có sự thay đổi về hoạt tính cytokinin và giberelin nội sinh trong mô sẹo theo thời gian. IAA nội sinh có xu hướng giảm theo thời gian trong khi hoạt tính ABA tăng mạnh ở tuần thứ 8 ứng với sự sậm màu của mô sẹo (bảng 8, ảnh 8D). 34 3.1.3. SỰ PHÁT SINH RỄ TỪ MÔ SẸO 3.1.3.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo trong sự phát sinh rễ từ mô sẹo Bảng 9: Sự hình thành rễ ở mô sẹo 2, 4 và 8 tuần tuổi sau 4 tuần chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tuổi mô sẹo (tuần) Thời gian hình thành rễ (tuần) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ 2 - 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 4 2 3,3 ± 0,3b 0,2 ± 0,1a 8 1 100,0 ± 0,0c 4,5 ± 1,3c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Sau khi được chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, mô sẹo 2 tuần tuổi có nguồn gốc từ lá Nhàu không phát sinh rễ sau 4 tuần; mô sẹo 4 tuần tuổi bắt đầu xuất hiện rễ ở tuần thứ 2, trong khi mô sẹo 8 tuần tuổi phát sinh rễ sớm hơn (ở tuần thứ 1) với tỉ lệ tạo rễ và số rễ cao nhất (bảng 9). 35 3.1.3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh trong sự hình thành rễ từ mô sẹo Bảng 10: Sự phát sinh rễ từ mô sẹo 8 tuần tuổi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D, NAA, BA riêng lẻ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau. Nghiệm thức Thời gian hình thành rễ (tuần) Tỷ lệ tạo rễ (%) Số rễ MS 1 100,0 ± 0,0e 4,1 ± 0,5bc MS + NAA 0,1 mg/l 1 81,0 ± 1,0d 6,9 ± 1,0c MS + BA 0,2 mg/l 1 70,0 ± 5,0c 2,7 ± 0,6b MS + 2,4-D 0,1 mg/l - 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a MS + NAA 0,1 mg/l BA 0,1 mg/l 1 83,3 ± 3,3d 4,3 ± 0,5bc MS + NAA 0,1 mg/l BA 0,2 mg/l 1 41,0 ± 4,9b 4,2 ± 0,8bc Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Mô sẹo chuyển sang các môi trường MS không bổ sung 2,4-D đều cho sự tạo rễ sau 1 tuần nuôi cấy, trong khi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,1 mg/l thì mô sẹo lại tiếp tục tăng trưởng mà không phát sinh rễ. Tỷ lệ phát sinh rễ từ mô sẹo cao nhất trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tỷ lệ này giảm nhẹ khi bổ sung NAA 0,1 mg/l và giảm nhiều hơn khi bổ sung BA 0,2 mg/l. Số rễ trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật hoặc có bổ sung NAA 0,1 mg/l riêng lẻ hay phối hợp với BA ở các nồng độ cao hơn trên môi trường chỉ bổ sung BA 0,2 mg/l. 36 Ảnh 9: Mô sẹo 8 tuần tuổi sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật (A) hoặc có bổ sung 2,4-D 0,1 mg/l (B), NAA 0,1 mg/l (C), BA 0,2 mg/l (D), BA 0,1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (E) và BA 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l (F). E1,2 cm D1,2 cm F1,2 cm A1,5 cm B1 cm C1,5 cm 37 3.1.3.3. Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ từ mô sẹo Sau 1 tuần chuyển các khối mô sẹo sang môi trường MS không bổ sung 2,4- D, trên mô sẹo có thể quan sát thấy nhiều nhóm tế bào đang phân chia và xuất hiện cùng lúc các giai đoạn phân hóa khác nhau của các nhóm mô sẹo này. Ban đầu các tế bào mô sẹo phân chia trong một mặt phẳng, tạo thành các chuỗi gồm nhiều tế bào liên kết với nhau (ảnh 10). Sau đó, các tế bào ở 1 đầu của chuỗi phân chia theo nhiều hướng, tạo thành các khối hình cầu (ảnh 11). Các khối này có kích thước tăng dần, tẩm suberin ở lớp ngoài cùng và tạo thành các nốt tròn trong mô sẹo. Các nốt này có sự phân hóa mạch dẫn bên trong với các mạch mộc và libe (ảnh 12A). Ở nhiều nốt, sơ khởi rễ xuất hiện gần các mạch dẫn (ảnh 12B) và kéo dài (ảnh 13). Trên môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l, sau 2 tuần, bên trong mô sẹo vẫn chứa nhiều các nốt hình cầu ở trạng thái chưa hình thành rễ (ảnh 14A). Ở các nốt đã phân hóa, song song với sự hình thành rễ, các nhóm tế bào ngoài cùng của chúng tiếp tục tăng sinh và tạo các tế bào mô sẹo dạng kéo dài (ảnh 14B). Ảnh 10: Tế bào mô sẹo đang phân chia trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, để nguyên (A) hoặc được nhuộm với acetocarmine (B). 36 µm B36 µm A 38 Ảnh 11: Sự hình thành các khối tế bào hình cầu trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, để nguyên (A) hoặc được nhuộm với acetocarmine (B). 82 µm B 82 µm A 39 Ảnh 12: Các nốt có sự phân hóa mạch (A) và tạo sơ khởi rễ (B) trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 1 tuần (Mũi tên chỉ vị trí xuất hiện sơ khởi rễ). 100 µm A 52 µm B 40 Ảnh 13: Rễ được hình thành từ các nốt trong mô sẹo (A) và sự kéo dài rễ (B) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. 92 µm B 72 µm A 41 Ảnh 14: Mô sẹo chứa nhiều nốt tròn (A) và sự phân chia để tiếp tục hình thành mô sẹo ở vùng ngoài cùng của các nốt này (B) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l. 50 µm B 167 µm A 42 3.1.3.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong sự phát sinh rễ từ mô sẹo Bảng 11: Cường độ hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo 8 tuần tuổi sau 0, 1 và 2 tuần cấy chuyền sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 Cường độ hô hấp (µmol O₂ /g TLT/giờ) 0 1,08 ± 0,07a 0,20 ± 0,01a 3,00 ± 0,27b 0,57 ± 0,13a 1,70 ± 0,06a 1 1,32 ± 0,07b 0,23 ± 0,02b 1,75 ± 0,14a 0,91 ± 0,18b 2,23 ± 0,03b 2 1,40 ± 0,03b 0,25 ± 0,01b 1,50 ± 0,29a 1,49 ± 0,20c 3,83 ± 0,07c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Bảng 12: Cường độ hô hấp và hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong mô sẹo 8 tuần tuổi sau 0, 1 và 2 tuần cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 Cường độ hô hấp (µmol O₂ /g TLT/giờ) 0 1,08 ± 0,07a 1,70 ± 0,06a 3,00 ± 0,27c 0,57 ± 0,13a 1,70 ± 0,06a 1 1,30 ± 0,05b 2,23 ± 0,03b 1,00 ± 0,15b 0,43 ± 0,10a 2,43 ± 0,09b 2 1,90 ± 0,03c 3,83 ± 0,07c 0,17 ± 0,06a 1,15 ± 0,20b 3,43 ± 0,13c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trên môi trường có hoặc không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp của mô sẹo tăng dần trong 2 tuần nuôi cấy. Hoạt tính IAA và zeatin trong mô sẹo 8 tuần tuổi được chuyển sang môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/l và BA 0,2 mg/l gia tăng mạnh hơn ở mô sẹo được chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Hoạt tính GA3 trong các mô sẹo cũng tăng dần trong khi hoạt tính ABA giảm dần qua các tuần (bảng 11, 12). 43 3.1.4. SỰ PHÁT SINH CHỒI TRỰC TIẾP 3.1.4.1. Sự nuôi cấy lá và trụ hạ diệp Bảng 13: Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau và zeatin 1 mg/l trên sự hình thành chồi bất định từ trụ hạ diệp và lá in-vitro sau 4 tuần nuôi cấy. Thời gian xuất hiện chồi (tuần) Tỷ lệ tạo chồi (sau 4 tuần) (%) Số chồi (Sau 4 tuần) Nghiệm thức Lá Trụ hạ diệp Lá Trụ hạ diệp Lá Trụ hạ diệp Đối chứng (MS) - 8 0 0,0 ± 0,0a 0 0,0 ± 0,0a MS + BA 1 mg/l - 3 0 19,8 ± 4,4b 0 0,3 ± 0,1a MS + BA 2 mg/l - 3 0 79,2 ± 8,3d 0 2,2 ± 0,6b MS + BA 3 mg/l - 3 0 59,7 ± 5,0c 0 1,4 ± 0,3b MS + zeatin 1 mg/l - 2 0 96,5 ± 3,1e 0 3,6 ± 0,2c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trụ hạ diệp trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l xuất hiện chồi sớm nhất (ở tuần 2) với tỷ lệ tạo chồi và số chồi cao nhất ở tuần 4. Lá đặt trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l không phát sinh chồi sau 8 tuần (bảng 13, ảnh 15). Ảnh 15: Trụ hạ diệp Nhàu 4 tuần tuổi trên môi trường MS không (A) hoặc có bổ sung zeatin 1 mg/l (C) và lá Nhàu 8 tuần tuổi trên môi trường MS không (B) hoặc có bổ sung zeatin 1 mg/l (D). B 1 cm 1,4 D 0,6 cm C 0,6 cm A 44 Bảng 14: Ảnh hưởng của NAA 0,1 mg/l và zeatin 1 mg/l trên sự hình thành chồi bất định từ trụ hạ diệp in-vitro sau 5 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Thời gian xuất hiện sẹo (tuần) Thời gian xuất hiện chồi (tuần) Thời gian xuất hiện rễ (tuần) Tỷ lệ tạo chồi sau 5 tuần (%) Tỷ lệ tạo rễ (%) Đối chứng (MS) 5 5 - 30,0 ± 14,1a 0,0 ± 0,0a MS + zeatin 1 mg/l 1 2 - 93,4 ± 6,6b 0,0 ± 0,0a MS + NAA 0,1 mg/l + zeatin 1 mg/l 1 5 3 10,6 ± 6,8a 63,5 ± 16,5b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Sự phối hợp giữa NAA 0,1 mg/l và zeatin 1 mg/l giúp trụ hạ diệp dễ hình thành rễ nhưng tạo chồi chậm hơn với tỷ lệ thấp hơn môi trường MS bổ sung zeatin 1 mg/l sau 5 tuần nuôi cấy (bảng 14, ảnh 16B). Ảnh 16. Trụ hạ diệp Nhàu trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l sau 5 tuần nuôi cấy (A) và NAA 0,1 mg/l + zeatin 1 mg/l sau 8 tuần nuôi cấy (B). B0,6 cm 0,6 cm A 45 3.1.4.2. Các thay đổi hình thái trong sự phát sinh chồi trực tiếp từ trụ hạ diệp trên môi trường có bổ sung zeatin 1 mg/l Có sự khác biệt trong cấu trúc của trụ hạ diệp trước (ảnh 17) và sau khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung zeatin 1 mg/l. Dưới tác động của zeatin, các tế bào nhu mô dưới biểu bì bắt đầu phân chia (ảnh 18) ở tuần thứ nhất và hình thành các trung tâm phân chia ở tuần thứ 2 (ảnh 19, 20). Sự phân chia cũng xảy ra trên khắp vùng nhu mô vỏ (ảnh 21) để sau đó phân hóa thành hệ thống mạch dẫn (ảnh 22) nối liền các chồi ở ngoại vi với hệ thống mạch dẫn của trụ hạ diệp ban đầu (ảnh 23, 24). Ảnh 17. Phẫu thức ngang trụ hạ diệp trước khi nuôi cấy. 200 µm 46 Ảnh 18. Các tế bào nhu mô dưới biểu bì trụ hạ diệp đang phân chia sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 19. Các tế bào nhu mô dưới biểu bì trụ hạ diệp phân chia mạnh sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. 42 µm 36 µm 47 Ảnh 20. Các trung tâm phân chia được hình thành ở vùng ngoại vi sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 21. Sự phân bào xảy ra trên khắp nhu mô vỏ của trụ hạ diệp sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. 52 µm 48 µm 48 Ảnh 22. Các nhóm tế bào trong nhu mô vỏ của trụ hạ diệp đang phân hóa mạch (mũi tên) sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Ảnh 23. Sự nối mạch giữa các sơ khởi chồi ở ngoại vi và trụ trung tâm ở trụ hạ diệp sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. 43 µm 178 µm 49 Ảnh 24. Phẫu thức ngang (A) và dọc (B) qua trụ hạ diệp sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l thể hiện sự nối mạch của chồi và trụ trung tâm thông qua sự lắp ráp các đoạn mạch dẫn đã được tạo ra trước đó. 178 µm B 178 µm A 50 3.1.4.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong sự phát sinh chồi từ trụ hạ diệp Bảng 15: Cường độ hô hấp của trụ hạ diệp sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Thời gian (tuần) Cường độ hô hấp (µmol O₂/g TLT/giờ) 0 5,90 ± 0,90a 1 8,43 ± 0,33b 2 10,41 ± 1,07c 4 8,97 ± 1,02a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l, cường độ hô hấp ở trụ hạ diệp bắt đầu tăng mạnh ở tuần thứ 1, cao nhất ở tuần thứ 2 và giảm ở tuần 4 (bảng 15). 3.1.4.4. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong sự phát sinh chồi từ trụ hạ diệp Bảng 16: Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong trụ hạ diệp sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Hoạt tính (mg/l) Thời gian (tuần) IAA Zeatin ABA GA3 Tỷ lệ cytokinin /auxin 0 3,03 ± 0,37b 0,46 ± 0,02a 1,77 ± 0,00a 17,33 ± 0,44b 0,15 1 2,08 ± 0,26a 0,61 ± 0,07b 6,19 ± 0,93b 4,47 ± 0,44a 0,29 2 2,19 ± 0,47a 0,80 ± 0,11c 6,60 ± 0,06b 4,73 ± 0,12a 0,37 4 2,01 ± 0,44a 0,49 ± 0,05a 1,36 ± 0,01a 5,67 ± 0,41a 0,24 Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%. Hoạt tính zeatin và ABA tăng mạnh trong 2 tuần đầu, và giảm xuống ở tuần 4. Hoạt tính auxin giảm ở tuần 1 và duy trì không đổi qua các tuần. Tỷ lệ cytokinin/auxin gia tăng trong 2 tuần đầu. Hoạt tính giberelin giảm mạnh ngay tuần đầu tiên (bảng 16). 51 3.2. THẢO LUẬN 3.2.1. SỰ PHÁT SINH RỄ TRỰC TIẾP Ở CÂY NHÀU 3.2.1.1. Ảnh hưởng của các loại auxin ngoại sinh trong sự phát sinh rễ Auxin cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin kích thích sự tạo rễ, hoạt hóa cơ quan, chủ yếu trong sự cảm ứng (Võ Thị Bạch Mai, 2004; Taiz và Zeiger, 2002). Vì thế, các auxin ngoại sinh như 2,4-D, IAA, IBA, NAA ở nồng độ 0,1 mg/l đều kích thích sự phát sinh rễ từ lá Nhàu. Tuy nhiên, sự hình thành rễ dưới tác động của các loại auxin này không giống nhau vì sự đáp ứng của mẫu cấy trong sự phát sinh hình thái phụ thuộc nhiều vào bản chất của auxin sử dụng (Tabei và cộng sự, 1990). 2,4-D ở nồng độ 0,1 mg/l tuy cũng kích thích sự phát sinh rễ nhưng số rễ ít và rễ không thể tăng trưởng (các rễ có chiều dài nhỏ hơn 1 mm, Bảng 1, ảnh 3). Điều này là do 2,4-D là một auxin mạnh, kích thích quá trình phân chia tế bào mạnh mẽ dẫn đến sự tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt, 2000). Trong khi trên môi trường MS có bổ sung NAA ở nồng độ 0,1 mg/l, mẫu cấy có tỷ lệ tạo rễ, số lượng và trọng lượng rễ cao nhất. Việc xử lý auxin chỉ có tác dụng kích thích tăng trưởng khi nồng độ của nó bằng nồng độ tối hảo thường gặp trong bản thân cơ thể thực vật, ở nồng độ cao trái lại sẽ ức chế tăng trưởng và có thể thành độc tố (Thimann, 1937). Do đó, đối với lá Nhàu, NAA ở nồng 0,1 mg/l đã có thể kích thích mạnh sự ra rễ, trong khi các nồng độ cao như 1 mg/l, 1,5 mg/l lại ức chế sự phát triển của rễ, mẫu cấy bị đen và chết dần (Bảng 2, ảnh 4). 52 3.2.1.2. Sự thay đổi hình thái trong sự phát sinh rễ từ lá và trụ hạ diệp Ở cây Nhàu, lá và trụ hạ diệp đều có thể phát sinh rễ dưới tác động của NAA 0,1 mg/l. Có ít nhất 2 giai đoạn trong sự hình thành rễ bất định, giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hay chu luân, và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự, 1980). Sự tạo rễ bất định ở cây Nhàu cũng trải qua 2 giai đoạn như vậy. Trên môi trường NAA 0,1 mg/l, có sự hình thành một nhóm tế bào phân chia mạnh tại vùng nhu mô chu luân ở lá và trụ hạ diệp (ảnh 6A và 6B). Ngay sau đó, các nhóm tế bào này tiếp tục phát triển để hình thành sơ khởi rễ tại vùng chu luân giữa các bó mạch dẫn ở trụ hạ diệp và vùng chu luân gần libe ở lá. Nhờ đó, sơ khởi rễ dễ dàng nhận được nhiều chất dinh dưỡng cũng như các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh cho các giai đoạn phát triển tiếp theo. Chính sự gần gũi của sơ khởi rễ với mạch dẫn đã giúp cho việc thiết lập đường nối mạch giữa cơ quan mẹ và rễ mới hình thành được dễ dàng. Điều này cũng phù hợp với nhận định trước đây về nguồn gốc phát sinh rễ của Esau (1972). Cuối cùng, các sơ khởi rễ này tiếp tục kéo dài và có cấu trúc hoàn chỉnh trước khi mọc xuyên qua vùng vỏ và lớp biểu bì (ảnh 6C và 6D). 3.2.1.3. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ Trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1 mg/l, cường độ hô hấp bắt đầu tăng mạnh trong tuần thứ nhất ở lá, ứng với thời điểm xuất hiện các sơ khởi rễ đầu tiên. Đồng thời, dưới tác động của NAA, hoạt tính IAA nội sinh trong mô lá và trụ hạ diệp đều tăng mạnh. Các auxin ngoại sinh như NAA hoặc IBA đã được chứng minh có tác động kích thích sự hình thành rễ bất định và tăng tích lũy IAA nội sinh trong suốt quá trình này (Liu và cộng sự, 1998), do đó các chất kìm hãm sự vận chuyển IAA (như TIBA) sẽ làm giảm số lượng sơ khởi rễ và số tế bào trong một sơ khởi rễ bất định (Bruce, 1972). Như vậy, chính NAA được bổ sung vào môi trường đã gây ra sự tích tụ IAA nội sinh trong mô cấy từ đó kích thích quá trình khử phân hóa của các tế bào nhu mô chu luân gần mạch để trở về trạng thái sinh mô. 53 Ngoài ra, ở tuần thứ nhất, hoạt tính của zeatin nội sinh cũng tăng mạnh. Cytokinin được biết có khả năng kích thích sự ngăn vách trong quá phân chia của tế bào và thường được sử dụng kết hợp với các auxin khác trong nuôi cấy. Do đó, sự phân chia thấy được ở vùng nhu mô chu luân của lá và trụ hạ diệp Nhàu có lẽ chủ yếu chịu tác động của zeatin vì trong nhiều trường hợp mô cấy thiếu cytokinin nội sinh, auxin chỉ kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, mà không có sự phân vách (Bùi Trang Việt, 2000). Dưới tác động của cytokinin nội sinh, các nhóm tế bào đã được cảm ứng bởi NAA sẽ có hoạt tính phân chia mạnh, có nhu cầu năng lượng cao để tạo mới các chất, tạo thêm các bào quan. Điều này giải thích sự tăng mạnh cường độ hô hấp trong giai đoạn hình thành sơ khởi rễ ở lá và trụ hạ diệp Nhàu. Tuy sự thay đổi hình thái và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở trụ hạ diệp và lá trong tuần đầu tiên khá tương đồng nhưng những thay đổi sinh lý sau đó rất khác biệt nhau. Đối với mẫu cấy là trụ hạ diệp, hoạt tính IAA tiếp tục được duy trì ở mức cao đến tuần thứ 4 trong khi hoạt tính zeatin giảm dần trong các tuần 2, 3 và 4. Có lẽ điều này đã hạn chế sự phân bào của các nhóm tế bào vùng nhu mô chu luân, cản sự hình thành những sơ khởi rễ mới và do đó dẫn đến sự giảm mạnh cường độ hô hấp ở tuần thứ 3. Ngược lại, đối với mẫu cấy là lá, hoạt tính zeatin tiếp tục giữ ở mức cao nên cường độ hô hấp vẫn tăng mạnh đến tuần thứ 3, trong khi hoạt tính IAA lại giảm nhanh từ tuần thứ 2. Như vậy, nhờ sự gia tăng cytokinin nội sinh trong lá, các nhóm tế bào đã được khử phân hóa trước đó bởi auxin nội sinh tiếp tục phân chia để tạo nhiều sơ khởi rễ hơn ở trụ hạ diệp. Đồng thời, sự giảm sớm hoạt tính IAA nội sinh trong lá sau giai đoạn cảm ứng giúp loại bỏ tác động cản tăng trưởng của chất này, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự kéo dài của các sơ khởi rễ. Tóm lại, ở Nhàu, sự hình thành rễ trực tiếp từ lá hay trụ hạ diệp đều trải qua 2 giai đoạn: tạo sơ khởi rễ và kéo dài sơ khởi này. Lá và trụ hạ diệp Nhàu có những đáp ứng khác nhau với NAA trong sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh dẫn đến sự khác biệt về số rễ và chiều dài rễ giữa hai loại mô cấy. 54 3.2.2. SỰ PHÁT SINH RỄ GIÁN TIẾP THÔNG QUA MÔ SẸO CÓ NGUỒN GỐC TỪ LÁ NHÀU 3.2.2.1. Sự thay đổi hình thái trong sự hình thành mô sẹo từ lá Nhàu Dưới tác động của một auxin mạnh là 2,4-D ở nồng độ 1 mg/l, các tế bào biểu bì ở cả mặt trên và mặt dưới dọc theo gân lá đều có dấu hiệu phản phân hóa và bắt đầu phân chia mạnh mẽ theo hướng tiếp tuyến để hình thành mô sẹo. Biểu bì mặt trên của lá do được úp xuống và tiếp xúc trực tiếp với môi trường, được cảm ứng bởi chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh trước tiên nên mô sẹo được hình thành sớm và tăng sinh nhanh. Ở tuần thứ 2, khi mô sẹo tiếp tục tăng sinh, các tế bào tế bào lớp ngoài cùng của khối mô sẹo tách rời nhau trong quá trình phân chia và dễ dàng phóng thích vào môi trường. Do các tế bào có khuynh hướng tách rời nhau nên mô sẹo có dạng một khối nhầy. Lúc này các tế bào mô sẹo có dạng hình bầu dục hoặc sợi, màu vàng sáng và sậm màu dần từ tuần 4 trở đi. 3.2.2.2. Sự thay đổi hình thái trong sự phát sinh rễ thông qua mô sẹo Sau khi chuyển sang môi trường không có 2,4-D, trong tuần thứ nhất, các tế bào mô sẹo bắt đầu phân chia chỉ trong 1 mặt phẳng và hình thành nên 1 chuỗi gồm nhiều tế bào gắn kết với nhau. Mỗi tế bào đều có nhân to, thấy rõ hạch nhân và một dải tế bào chất mỏng sát vách, bao quanh 1 không bào trung tâm lớn. Điều này phù hợp với các mô tả về những biến đổi hình thái của tế bào trong nuôi cấy dịch treo tế bào Morinda citrifolia (O’Driscoll và cộng sự, 1991). Sau đó, các tế bào ở một đầu của chuỗi bắt đầu phân chia theo nhiều hướng để tạo thành một khối sinh mô gồm các tế bào có kích thước nhỏ hơn, đẳng kính, tế bào chất đậm đặc. Các tế bào lớp ngoài cùng của khối mô này bắt màu xanh của thuốc nhuộm nên có thể chúng đã được tẩm suberin và tạo thành lớp vỏ bọc ngoài khối sinh mô. Từ đó chúng hình thành những nốt phát triển độc lập. Sau đó, bên trong các nốt có sự phân hóa mạch đồng thời với sự hình thành những sơ khởi rễ. Cuối cùng, các rễ có sự phân hóa mạch hoàn chỉnh kéo dài ra bên ngoài. 55 Ở các môi trường không bổ sung BA, sau 1 tuần, các nốt đều tạo rễ. Trong khi ở môi trường có bổ sung BA riêng lẻ hoặc phối hợp với NAA 0,1 mg/l các nốt duy trì lâu ở trạng thái hình cầu hơn là tạo rễ. Có lẽ sự có mặt của BA trong môi trường nuôi cấy đã thúc đẩy sự phân chia của tế bào, duy trì trạng thái trẻ hóa của mô, vì thế làm chậm sự phân hóa của nhóm tế bào này. Do đó lớp ngoài của các nốt không tẩm suberin mà tiếp tục phân chia để hình thành mô sẹo. 3.2.2.3. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ từ mô sẹo Trong sự phân hóa cơ quan, auxin có sự hiệu ứng thay đổi theo thời gian, vì hàm lượng auxin thay đổi theo sự phát triển của mô cấy (Bùi trang Việt, 2000). Do đó trong sự tạo mô sẹo từ lá Nhàu, có lẽ sự thay đổi hàm lượng 2,4-D trong môi trường đã ảnh hưởng đến khả năng phát sinh rễ của mô sẹo này. Trong giai đoạn hình thành mô sẹo, dưới tác động của 2,4-D hoạt tính zeatin và giberelin thay đổi không đáng kể, vì thế có lẽ khả năng phân chia của mô sẹo chủ yếu chịu ảnh hưởng của auxin nội sinh. Trong tế bào, auxin kích thích hoạt động của bơm proton của màng nguyên sinh chất, giúp H+ được bơm ra vách tế bào làm pH của vách giảm xuống. Sự hạ thấp pH ở vách cần thiết cho sự gỡ liên kết giữa các vi sợi cellulose và hoạt hóa hoạt động của một số enzym thủy giải protein của vách vách trở nên lỏng lẻo. Vì vậy ở tuần thứ 2, dưới tác động của 2,4-D, các tế bào mô sẹo ở lớp ngoài cùng có xu hướng tách rời nhau. Bên cạnh đó, hoạt tính IAA nội sinh cao trong mô sẹo đã kích thích các tế bào tiếp tục phân chia mạnh mẽ. Khi thời gian nuôi cấy đủ dài để giảm dần tác động của 2,4-D, mô sẹo sẽ chậm phân chia và dễ dàng phân hóa hơn. Do đó mô sẹo 4 và 8 tuần tuổi có thể tạo rễ khi được chuyển sang môi trường không có 2,4-D. Cường độ hô hấp thể hiện nhu cầu năng lượng trong quá trình phân chia tế bào, các tế bào đang phân chia có cường độ hô hấp cao hơn các tế bào đang phân hóa (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Vì vậy có thể sự giảm hô hấp của mô sẹo theo thời gian thể hiện sự giảm dần hoạt tính của 2,4-D trong môi trường nuôi cấy. Điều này dẫn đến sự hạ thấp hoạt tính IAA trong mô sẹo do đó các tế bào có xu hướng phân hóa hơn phân chia. Điều này 56 chứng tỏ các tế bào mô sẹo ở tuần thứ 8 đã sẵn sàng phân hóa để tạo rễ khi có sự thay đổi môi trường nuôi cấy. Khi chuyển mô sẹo này sang các môi trường không có 2,4-D, sự hình thành các nốt trong mô sẹo và sự tạo rễ từ các nốt này phụ thuộc vào hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh. Trên môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng thực vật, các nốt này được hình thành rất sớm trong những ngày đầu và nhanh chóng hình thành rễ. Do đó ở tuần thứ 2, không còn thấy các nốt hình cầu. Trên môi trường có bổ sung NAA và BA, có sự tăng mạnh hoạt tính IAA và zeatin nội sinh. Điều này dẫn đến sự khử phân hóa ở các nốt và năng lượng chủ yếu tập trung cho việc phân chia tạo mô sẹo hơn là hình thành sơ khởi rễ. Vì vậy trên môi trường có bổ sung NAA và BA, các nốt tồn tại nhiều ở dạng hình cầu, chỉ có một số ít nốt tạo rễ. Trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật và có bổ sung NAA và BA, sự tăng đồng thời hoạt tính của GA3 và IAA qua các tuần nuôi cấy phù hợp với giả thuyết của Pilet (1964): giberelin làm tăng hàm lượng auxin bằng cách làm thoát auxin từ các dạng dính hoặc làm ngừng hoạt động của auxin oxydase (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Như vậy, có lẽ có sự phối hợp hoạt động của giberelin và auxin trong việc kích thích sự hình thành rễ bất định từ mô sẹo lá Nhàu. 57 3.2.3. SỰ PHÁT SINH CHỒI Ở CÂY NHÀU 3.2.3.1. Sự thay đổi hình thái trong sự phát sinh chồi Để có hoạt tính, chất điều hòa tăng trưởng thực vật phải được nhận bởi những thể nhận chuyên biệt của tế bào đích, các thể nhận này có thể khác nhau tùy thuộc vào mô đích (Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự phát sinh chồi ở trụ hạ diệp, các tế bào ở vùng vỏ là các tế bào đích nhận sự tác động của zeatin. Trước tiên, vùng vỏ xuất hiện nhiều cụm tế bào phân chia mạnh. Sau đó, các nhóm tế bào nhu mô vỏ dưới biểu bì tiếp tục phân chia để tạo các sơ khởi chồi trong khi các nhóm tế bào khác trong vùng vỏ phân hóa tạo mạch dẫn rời rạc. Các nhóm mạch dẫn này sau đó nối lại với nhau để tạo sự liên kết mạch dẫn giữa các chồi phía ngoài và trụ trung tâm. 3.2.3.2. Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi trực tiếp Đối với cây thân gỗ, chồi bất định có khuynh hướng hình thành từ những mô trẻ ở các bộ phận của cây con mới nảy mầm như trụ hạ diệp hơn là lá trưởng thành (Edwin, 1996). Tương tự ở cây Nhàu, không phải mọi mô cấy đều có khả năng cảm ứng được với môi trường nuôi cấy để khử phân hóa, phát sinh cơ quan. Chồi chỉ có thể được hình thành tại những vùng mà các tế bào đang ở trạng thái tế bào sinh mô. Do đó, trụ hạ diệp hình thành chồi sớm trong khi lá phù ra và không tạo chồi khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung zeatin 1 mg/l. Trên cùng vật liệu là trụ hạ diệp của cây Nhàu, zeatin và BA có tác động kích thích ra chồi khác nhau. Zeatin ở nồng độ 1 mg/l có thể làm mẫu cấy đạt tỷ lệ tạo chồi gần 100% trong khi BA chỉ có thể đạt tỷ lệ tạo chồi cao nhất khoảng 80% ở nồng độ 2 mg/l. Có thể vì zeatin là chất điều hòa tăng trưởng thực vật có nguồn gốc nội sinh nên dễ dàng được mô cấy hấp thu. Dù có tác động hỗ trợ nhau trong quá trình phân chia của tế bào, tăng trưởng của thực vật nhưng cũng có sự đối kháng giữa cytokinin (giúp sự tạo chồi) 58 và auxin (giúp sự tạo rễ). Chính vì vậy khi phối hợp auxin và cytokinin đã làm chồi chậm xuất hiện và tỷ lệ tạo chồi rất thấp. Các bước phát triển trong cơ thể thực vật là kết quả của hàng loạt phản ứng biến dưỡng. Các hoạt động biến dưỡng này chịu sự chi phối của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được sinh ra trong quá trình đó (Taiz và Zeiger, 1991). Trong sự tạo chồi ở trụ hạ diệp cây Nhàu, hoạt tính zeatin và ABA tăng mạnh trong 2 tuần đầu, và giảm xuống ở tuần 4. Cytokinin được biết là có tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Hơn nữa, cytokinin còn thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch (Taiz và Zeiger, 2002).Vì vậy, có lẽ chính sự gia tăng hoạt tính zeatin trong 2 tuần đầu đã kích thích mạnh sự phân bào tạo các trung tâm phân chia ở vùng nhu mô vỏ dưới biểu bì, và thúc đẩy sự phân chia, phân hóa mạch dẫn ở vùng nhu mô vỏ bên trong. Khi phối hợp BA và ABA trong môi trường nuôi cấy khúc cắt chồi của cây Cam vàng Citrus sinensis (L.) sẽ làm tăng sự hấp thu đường của mô cấy. Đặc biệt, ABA còn thúc đẩy sự tích lũy đường bên trong chồi ở nồng độ cao giúp chồi phát triển mạnh (Giladi và cộng sự, 1977). Vì vậy, có lẽ ở cây Nhàu, hoạt tính zeatin và ABA nội sinh tăng mạnh trong 2 tuần đầu phần nào giúp mô cấy tăng hấp thu đường, từ đó cung cấp nguồn carbon và năng lượng cho hoạt động phân chia của các tế bào nhu mô vỏ trong những tuần đầu. Bên cạnh đó, sự phân chia tế bào diễn ra mạnh mẽ cũng rất cần năng lượng ATP được sinh ra trong quá trình hô hấp (Taiz và Zeiger, 2002). Vì vậy, cường độ hô hấp ở trụ hạ diệp cũng tăng cao ở tuần thứ 2 ứng với sự gia tăng của hoạt tính zeatin. Ở tuần thứ 4, khi các chồi đã được hình thành, hoạt động phân chia không mạnh mẽ như trong giai đoạn biệt hóa tạo chồi, do đó cường độ hô hấp giảm dần. Sự hạ thấp hoạt tính auxin ở tuần 1 và duy trì không đổi dẫn đến gia tăng tỷ lệ cytokinin/auxin trong 2 tuần đầu. Tỷ lệ này sẽ quyết định chiều hướng phát sinh hình thái, do đó mô cấy nghiêng về sự phát sinh chồi. 59 Các hạt đang phát triển có lượng giberelin tăng 300 lần. Như ở đậu, GA3 và GA5 luôn hiện diện trong cây mầm. Có lẽ chính vì vậy mà hàm lượng giberelin nội sinh trong trụ hạ diệp cây Nhàu rất cao. Tuy nhiên ở một số cây thân gỗ, giberelin ức chế sự hình thành sơ khởi chồi (Daksha và cộng sự, 1992). Do đó, sự hạ thấp hoạt tính giberelin trong trụ hạ diệp ngay ở tuần đầu tiên là cần thiết cho quá trình hình thành chồi.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf11.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf12.pdf
  • pdf13.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
Luận văn liên quan