Phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi (fibroblast) người từ bánh nhau

Phần i : Giới thiệu về đề tài i. đặt vấn đề . 1 ii. Mục tiêu đề tài 5 ii.1 mục tiêu tổng quát . 5 ii.2 mục tiêu cụ thể 5 phần ii : Tổng quan tài liệu i. Sự hình thành và phát triển của nhau . 6 i.1 vị trí làm tổ của phôi 6 i.2 các thành phần cấu tạo của nhau 6 i.2.1 bánh nhau 6 i.2.2 màng ối 7 i.2.3 màng đệm 7 i.2.4 hồ máu hay khoảng gian gai nhau 7 i.2.5 vách nhau . 7 i.2.6 múi nhau 7 i.2.7 đĩa đáy . 8 i.2.8 vòng viền hay bờ giới hạn ngoại vi 8 i.2.9 dây rốn 8 i.2.10 màng nhau 8 i.3 sự tạo nhau . 9 i.3.1 sự tạo nhau từ phía con 10 i.3.1.1 sự tạo túi đệm 10 i.3.1.2 sự tạo cây gai nhau (sự tạo đĩa đệm) . 10 i.3.2 sự tạo nhau từ phía mẹ . 12 i.3.2.1 cấu trúc mô học nội mạc tử cung . 12 i.3.2.2 sự phát triển của màng rụng thành 12 i.3.2.3 sự phát triển của màng rụng bao . 13 i.3.2.4 sự phát triển của màng rụng đáy . 13 i.4 chức năng của nhau 14 i.4.1 chức năng trao đổi chất . 14 i.4.2 chức năng bài tiết hormone 15 i.4.3 chức năng miễn dịch . 15 ii. đại cương về nguyên bào sợi 16 ii.1 đặc điểm chung 16 ii.2 tế bào sợi (fibrocyte) . 18 ii.2.1 nguồn gốc . 18 ii.2.2 hình dạng . 19 ii.2.3 chức năng 21 ii.3 nguyên bào sợi (fibroblast) 21 ii.3.1 nguồn gốc 21 ii.3.2 hình dạng . 22 ii.3.3 chức năng 23 ii.3.4 khoảng đời 25 iii. Các yếu tố ảnh hưởng đến việc nuôi tế bào . 25 iii.1 giá thể 25 iii.2 pha khí 26 iii.2.1 oxygen . 26 iii.2.2 co2 . 27 iii.3 môi trường và các yếu tố bổ sung 27 iii.4 đặc tính vật lý . 29 iii.4.1 ph 29 iii.4.2 dung dịch đệm 29 iii.4.3 áp suất thẩm thấu 30 iii.4.4 nhiệt độ . 30 iii.4.5 tính nhớt . 30 iii.4.6 áp lực sức căng bề mặt và sự tạo bọt . 30 iv. Khái quát về môi trường nuôi cấy tế bào động vật . 31 iv.1 thành phần môi trường . 31 iv.1.1 dung dịch muối đệm 31 iv.1.2 amino acid . 32 iv.1.3 vitamine . 32 iv.1.4 muối . 32 iv.1.5 glucose 33 iv.1.6 huyết thanh . 33 iv.2 một vài loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động vật 35 Iv.2.1 môi trường bm . 35 iv.2.2 môi trường emem . 35 iv.2.3 môi trường dmem .35 iv.2.4 môi trường f10, f12 . 35 iv.2.5 môi trường iscove . 35 iv.2.6 môi trường 5a 36 iv.2.7 môi trường rpmi – 1640 . 36 iv.2.8 môi trường 199 . 36 iv.3 đặc điểm ba loại môi trường emem, dmem và amniomax được sử dụng để nuôi nguyên bào sợi trong đề tài này iv.3.1 minimum essential medium (mem) 36 iv.3.1.1 mô tả sản phẩm . 36 iv.3.1.2 thành phần môi trường emem . 37 iv.3.1.3 điều kiện bảo quản . 39 iv.3.1.4 cách thức sử dụng 39 iv.3.2 dulbecco’s modified eagle’s medium 39 iv.3.2.1 mô tả sản phẩm 40 iv.3.2.2 thành phần của dmem . 40 iv.3.2.3 điều kiện bảo quản 42 iv.3.2.4 đặc tính môi trường . 42 iv.3.3 sản phẩm amniomax™-c100 43 iv.3.3.1 mô tả sản phẩm 43 iv.3.3.2 công thức môi trường . 43 iv.3.3.3 điều kiện giữ 44 iv.3.3.4 cách thức sử dụng . 44 v. ứng dụng của việc nuôi cấy nguyên bào sợi . 44 v.1 ứng dụng trong lĩnh vực y học 44 v.2 ứng dụng trong dược khoa 44 v.3 ứng dụng trong nghiên cứu sinh học 44 v.4 ứng dụng trong chọn giống vật nuôi . 45 phần iii : Phương pháp iii.1 đối tượng nghiên cứu . 46 iii.1 các mục tiêu cần được khảo sát 46 iii.2 trình tự thí nghiệm . 47 iii.3 các quy trình chính được sử dụng trong thí nghiệm . 48 iii.3.1 vô trùng dụng cụ và hoá chất 48 iii.3.2 vô trùng nơi tiến hành thí nghiệm . 48 iii.3.3 các quy trình sử dụng trong thí nghiệm . 49 iii.3.3.1 thu nhận và xử lý mẫu . 49 iii.3.3.2 phân lập và tách khối mô . 49 iii.3.3.3 các quy trình nuôi tế bào . 50 iii.3.3.4 phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phồng đếm neubauer 51 iii.3.3.5 phương pháp thay môi trường . 52 iii.3.3.6 cấy chuyền tế bào . 53 iii.3.3.7 cách đếm tế bào trên quang trường 20x . 53 iii.3.4 dụng cụ – thiết bị – hóa chất 54 iii.3.4.1 dụng cụ 54 iii.3.4.2 thiết bị . 54 iii.3.4.3 hóa chất . 56 iii.3.4.4 môi trường . 56 phần iv: Kết quả – biện luận iv.1 kết quả khảo sát khả năng phát triển của nguyên bào sợi từ mô nhau.57 iv.1.1 kết qủa quan sát mẫu mô nhau thu nhận từ mổ nọi soi ở tay vòi 57 iv.1.2 kết qủa quan sát mẫu mô nhau thu nhận qua đường sanh mổ ở nhau đủ tháng . 57 iv.2 kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng của nguyên bào sợi thu nhận từ mẫu mô nhau sổ trên các loại môi trường khác nhau. . 60 iv.2.1 kết quả . 61 iv.2.1.1 ngày thứ nhất 61 iv.2.1.2 ngày thứ hai . 63 iv.2.1.3 ngày thứ ba 65 iv.2.1.4 ngày thứ tư 67 iv.2.1.5 ngày thứ năm 69 phần v: Bàn luận . 72 phần vi : Kết luận 77 tài liệu tham khảo . 79 phụ lục . 85

pdf82 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 24/01/2013 | Lượt xem: 1741 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi (fibroblast) người từ bánh nhau, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 1 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN KHOA SINH HOÏC − WXYZ − HUYØNH DUY THAÛO ÑEÀ TAØI PHAÂN LAÄP VAØ TAÏO DOØNG NGUYEÂN BAØO SÔÏI (FIBROBLAST) NGÖÔØI TÖØ BAÙNH NHAU KHOÙA LUAÄN CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC NGAØNH COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH : COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Y-DÖÔÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC TS.BS.TRAÀN COÂNG TOAÏI BS. NHAN NGOÏC HIEÀN THAØNH PHOÁ H`OÀ CHÍ MINH – NAÊM 2004 Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 2 PHAÀN I : GIÔÙI THIEÄU VEÀ ÑEÀ TAØI I. ÑAËT VAÁN ÑEÀ............................................................................................................... 1 II. MUÏC TIEÂU ÑEÀ TAØI...................................................................................................... 5 II.1 MUÏC TIEÂU TOÅNG QUAÙT....................................................................................... 5 II.2 MUÏC TIEÂU CUÏ THEÅ ................................................................................................ 5 PHAÀN II : TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU I. SÖÏ HÌNH THAØNH VAØ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NHAU....................................................... 6 I.1 VÒ TRÍ LAØM TOÅ CUÛA PHOÂI .................................................................................... 6 I.2 CAÙC THAØNH PHAÀN CAÁU TAÏO CUÛA NHAU.......................................................... 6 I.2.1 BAÙNH NHAU ...................................................................................................... 6 I.2.2 MAØNG OÁI ............................................................................................................ 7 I.2.3 MAØNG ÑEÄM........................................................................................................ 7 I.2.4 HOÀ MAÙU HAY KHOAÛNG GIAN GAI NHAU .................................................... 7 I.2.5 VAÙCH NHAU ..................................................................................................... 7 I.2.6 MUÙI NHAU.......................................................................................................... 7 I.2.7 ÑÓA ÑAÙY ............................................................................................................. 8 I.2.8 VOØNG VIEÀN HAY BÔØ GIÔÙI HAÏN NGOAÏI VI.................................................... 8 I.2.9 DAÂY ROÁN............................................................................................................ 8 I.2.10 MAØNG NHAU.................................................................................................... 8 I.3 SÖÏ TAÏO NHAU ....................................................................................................... 9 I.3.1 SÖÏ TAÏO NHAU TÖØ PHÍA CON............................................................................ 10 I.3.1.1 SÖÏ TAÏO TUÙI ÑEÄM.................................................................................... 10 I.3.1.2 SÖÏ TAÏO CAÂY GAI NHAU (SÖÏ TAÏO ÑÓA ÑEÄM) ................................... 10 I.3.2 SÖÏ TAÏO NHAU TÖØ PHÍA MEÏ ............................................................................. 12 I.3.2.1 CAÁU TRUÙC MO HOÏC NOÄI MAÏC TÖÛ CUNG ........................................... 12 I.3.2.2 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG THAØNH...................................... 12 I.3.2.3 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG BAO ........................................... 13 I.3.2.4 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG ÑAÙY ........................................... 13 I.4 CHÖÙC NAÊNG CUÛA NHAU ...................................................................................... 14 I.4.1 CHÖÙC NAÊNG TRAO ÑOÅI CHAÁT ................................................................... 14 I.4.2 CHÖÙC NAÊNG BAØI TIEÁT HORMONE ............................................................ 15 I.4.3 CHÖÙC NAÊNG MIEÃN DÒCH............................................................................. 15 II. ÑAÏI CÖÔNG VEÀ NGUYEÂN BAØO SÔÏI ...................................................................... 16 II.1 ÑAËC ÑIEÅM CHUNG ............................................................................................ 16 II.2 TEÁ BAØO SÔÏI (FIBROCYTE) ............................................................................... 18 II.2.1 NGUOÀN GOÁC ............................................................................................... 18 II.2.2 HÌNH DAÏNG ................................................................................................. 19 II.2.3 CHÖÙC NAÊNG ................................................................................................ 21 II.3 NGUYEÂN BAØO SÔÏI (FIBROBLAST) ...................................................................... 21 II.3.1 NGUOÀN GOÁC.................................................................................................. 21 II.3.2 HÌNH DAÏNG ................................................................................................... 22 II.3.3 CHÖÙC NAÊNG.................................................................................................. 23 Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 3 II.3.4 KHOAÛNG ÑÔØI ................................................................................................ 25 III. CAÙC YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG ÑEÁN VIEÄC NUOÂI TEÁ BAØO ......................................... 25 III.1 GIAÙ THEÅ .............................................................................................................. 25 III.2 PHA KHÍ .............................................................................................................. 26 III.2.1 OXYGEN ................................................................................................... 26 III.2.2 CO2............................................................................................................... 27 III.3 MOÂI TRÖÔØNG VAØ CAÙC YEÁU TOÁ BOÅ SUNG.................................................... 27 III.4 ÑAËC TÍNH VAÄT LYÙ ........................................................................................... 29 III.4.1 PH.................................................................................................................. 29 III.4.2 DUNG DÒCH ÑEÄM .................................................................................................... 29 III.4.3 AÙP SUAÁT THAÅM THAÁU ............................................................................ 30 III.4.4 NHIEÄT ÑOÄ ................................................................................................. 30 III.4.5 TÍNH NHÔÙT ............................................................................................... 30 III.4.6 AÙP LÖÏC SÖÙC CAÊNG BEÀ MAËT VAØ SÖÏ TAÏO BOÏT................ ................... 30 IV. KHAÙI QUAÙT VEÀ MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÄT..................... 31 IV.1 THAØNH PHAÀN MOÂI TRÖÔØNG........................................................................... 31 IV.1.1 DUNG DÒCH MUOÁI ÑEÄM.......................................................................... 31 IV.1.2 AMINO ACID ............................................................................................. 32 IV.1.3 VITAMINE ................................................................................................. 32 IV.1.4 MUOÁI ......................................................................................................... 32 IV.1.5 GLUCOSE.................................................................................................. 33 IV.1.6 HUYEÁT THANH......................................................................................... 33 IV.2 MOÄT VAØI LOAÏI MOÂI TRÖÔØNG ÑÖÔÏC SÖÛ DUÏNG TRONG NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO VAØ MO ÑOÄNG VAÄT 35 ................................................................................................................ IV.2.1 MOÂI TRÖÔØNG BM................................................................................................... 35 IV.2.2 MOÂI TRÖÔØNG EMEM............................................................................... 35 IV.2.3 MOÂI TRÖÔØNG DMEM.......................................................................................35 IV.2.4 MOÂI TRÖÔØNG F10, F12............................................................................. 35 IV.2.5 MOÂI TRÖÔØNG ISCOVE............................................................................. 35 IV.2.6 MOÂI TRÖÔØNG 5A...................................................................................... 36 IV.2.7 MOÂI TRÖÔØNG RPMI – 1640 ..................................................................... 36 IV.2.8 MOÂI TRÖÔØNG 199 ................................................................................................... 36 IV.3 ÑAËC ÑIEÅM BA LOAÏI MOÂI TRÖÔØNG EMEM, DMEM VAØ AMNIOMAX ÑÖÔÏC SÖÛ DUÏNG ÑEÅ NUOÂI NGUYEÂN BAØO SÔÏI TRONG ÑEÀ TAØI NAØY IV.3.1 MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (MEM) .............................................. 36 IV.3.1.1 MO TAÛ SAÛN PHAÅM............................................................................... 36 IV.3.1.2 THAØNH PHAÀN MOÂI TRÖÔØNG EMEM................................................. 37 IV.3.1.3 ÑIEÀU KIEÄN BAÛO QUAÛN ....................................................................... 39 IV.3.1.4 CAÙCH THÖÙC SÖÛ DUÏNG........................................................................ 39 Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 4 IV.3.2 DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM .............................................. 39 IV.3.2.1 MO TAÛ SAÛN PHAÅM .................................................................................. 40 IV.3.2.2 THAØNH PHAÀN CUÛA DMEM ..................................................................... 40 IV.3.2.3 ÑIEÀU KIEÄN BAÛO QUAÛN .......................................................................... 42 IV.3.2.4 ÑAËC TÍNH MOÂI TRÖÔØNG ....................................................................... 42 IV.3.3 SAÛN PHAÅM AMNIOMAX™-C100 ...................................................................... 43 IV.3.3.1 MO TAÛ SAÛN PHAÅM ...................................................................................... 43 IV.3.3.2 COÂNG THÖÙC MOÂI TRÖÔØNG ....................................................................... 43 IV.3.3.3 ÑIEÀU KIEÄN GIÖÕ .............................................................................................. 44 IV.3.3.4 CAÙCH THÖÙC SÖÛ DUÏNG ....................................................................................... 44 V. ÖÙNG DUÏNG CUÛA VIEÄC NUOÂI CAÁY NGUYEÂN BAØO SÔÏI ....................................... 44 V.1 ÖÙNG DUÏNG TRONG LÓNH VÖÏC Y HOÏC............................................................ 44 V.2 ÖÙNG DUÏNG TRONG DÖÔÏC KHOA.................................................................... 44 V.3 ÖÙNG DUÏNG TRONG NGHIEÂN CÖÙU SINH HOÏC................................................ 44 V.4 ÖÙNG DUÏNG TRONG CHOÏN GIOÁNG VAÄT NUOÂI............................................... 45 PHAÀN III : PHÖÔNG PHAÙP III.1 ÑOÁI TÖÔÏNG NGHIEÂN CÖÙU ................................................................................... 46 III.1 CAÙC MUÏC TIEÂU CAÀN ÑÖÔÏC KHAÛO SAÙT .......................................................... 46 III.2 TRÌNH TÖÏ THÍ NGHIEÄM....................................................................................... 47 III.3 CAÙC QUY TRÌNH CHÍNH ÑÖÔÏC SÖÛ DUÏNG TRONG THÍ NGHIEÄM ................. 48 III.3.1 VO TRUØNG DUÏNG CUÏ VAØ HOAÙ CHAÁT .................................................. 48 III.3.2 VO TRUØNG NÔI TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM........................................... 48 III.3.3 CAÙC QUY TRÌNH SÖÛ DUÏNG TRONG THÍ NGHIEÄM............................... 49 III.3.3.1 THU NHAÄN VAØ XÖÛ LYÙ MAÃU............................................................... 49 III.3.3.2 PHAÂN LAÄP VAØ TAÙCH KHOÁI MO ......................................................... 49 III.3.3.3 CAÙC QUY TRÌNH NUOÂI TEÁ BAØO......................................................... 50 III.3.3.4 PHÖÔNG PHAÙP XAÙC ÑÒNH MAÄT ÑOÄ TEÁ BAØO BAÈNG PHOÀNG ÑEÁM NEUBAUER 51 III.3.3.5 PHÖÔNG PHAÙP THAY MOÂI TRÖÔØNG ............................................. 52 III.3.3.6 CAÁY CHUYEÀN TEÁ BAØO ..................................................................... 53 III.3.3.7 CAÙCH ÑEÁM TEÁ BAØO TREÂN QUANG TRÖÔØNG 20X ....................... 53 III.3.4 DUÏNG CUÏ – THIEÁT BÒ – HOÙA CHAÁT............................................................ 54 III.3.4.1 DUÏNG CUÏ............................................................................................ 54 III.3.4.2 THIEÁT BÒ ............................................................................................. 54 III.3.4.3 HOÙA CHAÁT ........................................................................................... 56 III.3.4.4 MOÂI TRÖÔØNG..................................................................................... 56 Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 5 PHAÀN IV: KEÁT QUAÛ – BIEÄN LUAÄN IV.1 KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG PHAÙT TRIEÅN CUÛA NGUYEÂN BAØO SÔÏI TÖØ MO NHAU.57 IV.1.1 KEÁT QUÛA QUAN SAÙT MAÃU MO NHAU THU NHAÄN TÖØ MOÅ NOÏI SOI ÔÛ TAY VOØI ............57 IV.1.2 KEÁT QUÛA QUAN SAÙT MAÃU MO NHAU THU NHAÄN QUA ÑÖÔØNG SANH MOÅ ÔÛ NHAU ÑUÛ THAÙNG ............................................................................................................... 57 IV.2 KEÁT QUAÛ KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG TAÊNG TRÖÔÛNG CUÛA NGUYEÂN BAØO SÔÏI THU NHAÄN TÖØ MAÃU MO NHAU SOÅ TREÂN CAÙC LOAÏI MOÂI TRÖÔØNG KHAÙC NHAU. ......... 60 IV.2.1 KEÁT QUAÛ......................................................................................................... 61 IV.2.1.1 NGAØY THÖÙ NHAÁT ...................................................................................... 61 IV.2.1.2 NGAØY THÖÙ HAI........................................................................................... 63 IV.2.1.3 NGAØY THÖÙ BA .......................................................................................... 65 IV.2.1.4 NGAØY THÖÙ TÖ .......................................................................................... 67 IV.2.1.5 NGAØY THÖÙ NAÊM ...................................................................................... 69 PHAÀN V: BAØN LUAÄN......................................................................................................... 72 PHAÀN VI : KEÁT LUAÄN ........................................................................................................ 77 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ..................................................................................................... 79 PHUÏ LUÏC ...... ....................................................................................................................... 85 Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 6 PHAÀN I : GIÔÙI THIEÄU VEÀ ÑEÀ TAØI II. ÑAËT VAÁN ÑEÀ Vaøo nhöõng naêm ñaàu cuûa thaäp nieân 1960, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ baét ñaàu quan taâm vaø chuù yù ñeán doøng nguyeân baøo sôïi, laø nhöõng teá baøo non chöa tröôûng thaønh do chuùng coù nhöõng ñaëc tính ñaëc bieät nhö : Khaû naêng phaân chia in vitro daøi (50 – 70 laàn), coù khaû naêng bieät hoùa in vitro thaønh caùc daïng teá baøo xöông, teá baøo môõ, teá baøo suïn, teá baøo moâ cô trôn, nguyeân baøo cô vaø moät soá daïng sô caáp khaùc [30] ( moät soá ngöôøi cho raèng chuùng coù khaû naêng bieät hoaù thaønh teá baøo thaàn kinh ) döôùi nhöõng ñieàu kieän bieät hoùa thích hôïp. Chuùng coù khaû naêng taêng tröôûng maïnh vaø laø loaïi teá baøo chieám öu theá trong caùc moâ lieân keát cuûa cô theå, giöõ vai troø quan troïng trong vieäc thaønh laäp khung cuûa caùc moâ lieân keát. Nguyeân baøo sôïi laø loaïi teá baøo chòu traùch nhieäm chính trong vieäc cheá tieát ra caùc loaïi sôïi nhö : sôïi collagen, sôïi elastin vaø caùc loaïi proteoglycans, glycoprotein, glycosaminoglycan .v.v… trong cô theå vaø chuùng ñoùng vai troø quan troïng trong quaù trình laøm laønh veát thöông. Vôùi nhöõng ñaëc tính noåi baät cuûa mình, nguyeân baøo sôïi ñaõ ñöôïc nuoâi caáy vaø öùng duïng vaøo nhieàu muïc ñích khaùc nhau, caùc nhaø khoa hoïc vaø caùc Vieän nghieân cöùu ñaõ ñi vaøo nuoâi caáy teá baøo naøy vaø coù nhöõng keát quaû thaønh coâng raát khaû quan, cuï theå nhö : Theo Hayflick vaø Moorhead (1961), doøng nguyeân baøo sôïi WI-38 laáy töø moâ phoåi cuûa thai ngöôøi saåy khoaûng ba thaùng tuoåi, laø moät doøng teá baøo xaùc ñònh vaø doøng teá baøo ñaàu tieân ñöôïc thieát laäp duøng ñeå nghieân cöùu söï laõo hoùa ôû möùc ñoä teá baøo. Khoaûng ñôøi in vitro cuûa doøng teá baøo naøy laø 50 theá heä [31]. Doøng teá baøo IMR-90 (nöõ) vaø IMR-91 (nam), doøng nguyeân baøo sôïi phoåi laáy töø thai ngöôøi ñaõ ñöôïc thieát laäp bôûi Vieän NIA Aging Cell Respository ngaøy 7/7/1975. Khoaûng Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 7 ñôøi in vitro khoâng ñöôïc xaùc ñònh nhöng soá löôïng teá baøo toái ña ñaït ñöôïc laø khoaûng 58 – 73 laàn phaân chia vaø ñöôïc söû duïng ñeå nghieân cöùu söï laõo hoùa cuûa teá baøo. Tieáp theo sau nhöõng coâng boá noùi treân, doøng teá baøo TIG-1 ñaõ ñöôïc thieát laäp ôû Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology ngaøy 28/7/1976, ñaõ söû duïng moâ phoåi töø thai saåy naêm thaùng tuoåi. Nhöõng teá baøo ñöôïc taùch rôøi baèng hoaït tính cuûa enzyme trypsin. Khoaûng ñôøi in vitro ñaït ñöôïc laø khoaûng 67 theá heä, duøng ñeå nghieân cöùu söï laõo hoùa cuûa teá baøo. Ngoaøi vieäc laáy maãu töø phoâi, thai saåy, ngöôøi ta cuõng coù theå laáy maãu töø caù theå tröôûng thaønh. Nguyeân baøo sôïi phoåi ngöôøi (HLF) ñöôïc laáy töø phaàn trung moâ cuûa moâ phoåi ngöôøi bình thöôøng. Chuùng ñöôïc baûo quaûn laïnh ôû laàn caáy chuyeàn ñaàu tieân, coù theå ñöôïc nuoâi vaø taêng sinh ít nhaát 10 laàn nhaân ñoâi theá heä. Nghieân cöùu cho thaáy raèng HLF ñaëc bieät quan troïng trong vieäc nghieân cöùu ñeå taïo ra moät daïng thuoác môùi ñeå chöõa trò beänh hen suyeãn [36]. Nhöõng thöû nghieäm döïa treân cô sôû cuûa nguyeân baøo sôïi ñaõ ñöôïc öùng duïng ñeå cheá taïo moät loaïi thuoác khaùng sinh môùi [43]. Nghieân cöùu cuõng ñaõ phaùt hieän dòch chieát thuoác laù theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi seõ aûnh höôûng öùc cheá söï taêng tröôûng cuûa HLF. Nguyeân baøo sôïi tim ngöôøi (Human Cardiac Fibroblasts (HCF)] ñöôïc laáy töø moâ tim bình thöôøng ôû ngöôøi. Chuùng ñöôïc giöõ laïnh ôû laàn caáy chuyeàn thöù hai vaø coù theå ñöôïc nuoâi taêng sinh ít nhaát 6 laàn nhaân ñoâi theá heä. Hình 1: Nguyeân baøo sôïi phoåi ngöôøi laáy töø phaàn trung moâ ôû ngöôøi bình thöôøng Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 8 HCF ñaõ ñöôïc söû duïng duøng ñeå nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa TNF-α vaø Angiotensin (Ang) II treân chöùc naêng cuûa nguyeân baøo sôïi [37]. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng söï bieåu hieän cuûa MyoD coù theå aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh sôïi cô cuûa nguyeân baøo sôïi tim [26]. Nguyeân baøo sôïi da ngöôøi - Human Dermal Fibroblasts (HDF) - laáy töø phaàn haï bì ôû bao quy ñaàu cuûa treû bình thöôøng môùi sinh, ñöôïc baûo quaûn laïnh ôû laàn nuoâi caáy sô caáp cuoái cuøng, coù theå ñöôïc nuoâi taêng sinh ít nhaát laø 16 laàn nhaân ñoâi theá heä. Naêm 1993, hai loaïi nguyeân baøo sôïi töø daây chaèng bao xung quanh raêng ñaõ ñöôïc nuoâi caáy theo phöông phaùp nuoâi nguyeân phaùt töø caùc maûnh moâ ban ñaàu bôûi Hou vaø Yaeger [35]. Ñeán naêm 1998, Chiu_Po CHAN vaø coäng söï ñaõ laëp laïi thí nghieäm treân. Maãu moâ bao xung quanh raêng ñöôïc laáy moät caùch caån thaän töø vuøng beà maët cuûa chieác raêng thöù ba vôùi Hình 2: Nguyeân baøo sôïi tim ngöôøi (Human Cardiac Fibroblasts (HCF)] ñöôïc laáy töø moâ tim bình thöôøng ôû ngöôøi Hình 3: Nguyeân baøo sôïi cô ngöôøi [Human Dermal Fibroblasts (HDF)] laáy töø phaàn haï bì ôû bao quy ñaàu cuûa treû môùi sinh ôû ngöôøi bình thöôøng Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 9 moät thìa naïo. Moâ ñöôïc nuoâi treân ñóa 100mm baèng phöông phaùp nuoâi moâ nguyeân phaùt trong moâi tröôøng DMEM chöùa 10%FCS, 100U/ml penicilline vaø 100µg/ml streptomycine. Sau 7 – 10 ngaøy nuoâi, nguyeân baøo sôïi coù theå di chuyeån ra ngoaøi töø nhöõng maûnh moâ nuoâi ban ñaàu. Taùc giaû ñaõ söû duïng doøng nguyeân baøo sôïi naøy ñeå nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa Thrombin treân söï taêng tröôûng, toång hôïp protein, söï baùm dính, khaû naêng taïo cuïm teá baøo vaø hoaït ñoäng cuûa enzyme Alkaline phosphatase [21]. Naêm 2003, nguyeân baøo sôïi ñöôïc taùch töø phaàn trung bì cuûa maãu sinh thieát da (phaàn da laønh laáy gaàn phaàn moâ bò boûng) ôû ngöôøi tröôûng thaønh [5] nhöng chöa ñöôïc ñöa vaøo nuoâi caáy do khaû naêng nhieãm coøn quaù cao trong thôøi gian taùch daøi (baèng quy trình taùch trypsin laïnh) vaø coù theå do teá baøo bò cheát neáu laáy quaù gaàn phaàn moâ boûng. Ngoaøi ra, nguyeân baøo sôïi coøn ñöôïc nuoâi töø caùc ñoäng vaät thí nghieäm nhö : Doøng teá baøo Vero – Doøng Nguyeân baøo sôïi laáy töø thaän Khæ ôû caù theå tröôûng thaønh [34]; Doøng teá baøo 3T3 A31 - Doøng nguyeân baøo sôïi laáy töø phoâi Chuoät[15]; Doøng teá baøo NRK49F - Doøng nguyeân baøo sôïi laáy töø thaän Chuoät ôû caù theå tröôûng thaønh[22] .v.v… Taát caû caùc doøng nguyeân baøo sôïi treân ñeàu ñaõ ñöôïc nuoâi thaønh coâng vaø ñöôïc duøng ñeå nghieân cöùu trong caùc phoøng thí nghieäm veà caùc vaán ñeà nhö nghieân cöùu quaù trình laõo hoaù cuûa teá baøo, söï töông taùc cuûa teá baøo, söï toång hôïp caùc chaát, söï di chuyeån cuûa teá baøo v.v… Vôùi nhöõng thaønh coâng treân, vieäc nuoâi nguyeân baøo sôïi ñaõ ñöôïc phaùt trieån ngaøy moät khoâng ngöøng ôû caùc phoøng thí nghieäm treân theá giôùi vaø coù nhöõng öùng duïng thöïc teá to lôùn. Tuy nhieân trong ñieàu kieän Vieät Nam, ñaây laø moät lónh vöïc coøn khaù môùi meû. Vôùi mong muoán tìm hieåu veà lónh vöïc nuoâi caáy teá baøo maø cuï theå laø nguyeân baøo sôïi, chuùng toâi ñaõ tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi naøy. II. MUÏC TIEÂU ÑEÀ TAØI II.1 MUÏC TIEÂU TOÅNG QUAÙT Xaây döïng moät phöông phaùp nuoâi caáy toái öu ñoái vôùi nguyeân baøo sôïi töø moâ gai nhau. Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 10 II.2 MUÏC TIEÂU CUÏ THEÅ − Ñaùnh giaù hieäu quaû cuûa caùc phöông phaùp nuoâi caáy khaùc nhau ñoái vôùi doøng nguyeân baøo sôïi laáy töø maãu moâ gai nhau. − Xaùc ñònh phöông phaùp nuoâi toái öu ñoái vôùi nguyeân baøo sôïi töø moâ gai nhau. So saùnh khaû taênng tröôûng cuûa nguyeân baøo sôïi treân caùc loaïi moâi tröôøng nuoâi khaùc nhau : AMNIOMAX, DMEM, EMEM, AMNIOMAX + EMEM . PHAÀN II : TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU I. SÖÏ HÌNH THAØNH VAØ PHAÙT TRIEÅN CUÛA NHAU I.1 VÒ TRÍ LAØM TOÅ CUÛA PHOÂI Phoâi nang thöôøng laøm toå ôû maët tröôùc phaàn ñaùy cuûa töû cung. Neáu phoâi laøm toå ôû phaàn thaáp phía döôùi thì khi baùnh nhau phaùt trieån deã daãn ñeán nhau tieàn ñaïo, tuyø theo möùc ñoä che laáp phaàn trong coå töû cung maø ngöôøi ta goïi laø nhau baùm meùp, nhau tieàn ñaïo moät phaàn hay toaøn phaàn. Phoâi coù theå laøm toå ôû ngoaøi töû cung, trong tröôøng hôïp naøy goïi laø thai laïc choå hay thai ngoaøi töû cung. Khoaûng 90% thai ngoaøi töû cung xaûy ra ôû voøi tröùng, ít hôn laø caùc vò trí nôi buoàng tröùng caém vaøo buoàng töû cung, buoàng tröùng, phuùc maïc, coå töû cung. Nguyeân nhaân Hình 4 : ñöôøng ñi cuûa tröùng vaø söï laøm toå bình thöôøng Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 11 thöôøng laø do coù söï caûn trôû ñöôøng di chuyeån cuûa phoâi nang töø voøi tröùng vaøo buoàng töû cung (vieâm nhieãm vuøng chaäu). I.2 CAÙC THAØNH PHAÀN CAÁU TAÏO CUÛA NHAU I.2.1 BAÙNH NHAU (PLANCENTA) Baùnh nhau thöôøng coù hình ñóa, ñöôøng kính töø 18 – 20 cm, beà daøy töø 2 – 3 cm (trung taâm daøy khoaûng 3 cm vaø moûng daàn ra ngoaïi vi). Troïng löôïng trung bình 470g (baèng 1/6 troïng löôïng thai). Baùnh nhau thöôøng coù hình baàu duïc, ngoaøi ra coøn coù caùc daïng khaùc nhö baùnh nhau phuï, nhau hai thuøy, nhau maøng, nhau moùng ngöïa. Maëc duø coù nhieàu daïng song hình daïng baùnh nhau khoâng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa thai. Trong suoát thôøi gian mang thai coù söï thay ñoåi veà khoái löôïng vaø vò trí phaàn maøng ñeäm coù gai nhau. I.2.2 MAØNG OÁI (AMNIOTIC MEMBRANE) Maøng oái bình thöôøng trong veo, boùng, laùng. Maøng oái cuûa baùnh nhau deã boùc, maøng oái cuûa maøng nhau vaø daây roán khoù boùc. I.2.3 MAØNG ÑEÄM (CHORIONIC MEMBRANE) Maøng ñeäm naèm ngay döôùi maøng oái. ÔÛ baùnh nhau, maøng ñeäm phaùt trieån thaønh ñóa ñeäm; caùc gai nhau khoâng döøng laïi ôû gai nhau caáp I, gai nhau caáp II, gai nhau caáp III maø tieáp tuïc phaùt trieån thaønh caây gai nhau vôùi nhieàu loaïi gai nhau khaùc nhau veà ñaëc ñieåm caáu taïo vaø chöùc naêng I.2.4 HOÀ MAÙU HAY KHOAÛNG GIAN GAI NHAU (INTERVILLOUS SPACES) Hoà maùu (hay khoaûng gian gai nhau) coù ôû maøng ruïng ñaùy, thuoäc lôùp chöùc naêng cuûa noäi maïc töû cung, laø nhöõng hoác chöùa maùu sau khi noäi maïc töû cung bò laù nuoâi hôïp baøo phaù huûy. I.2.5 VAÙCH NHAU (PLANCENTAL SEPTA) Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 12 Vaùch nhau coù ôû baùnh nhau, laø phaàn moâ coøn laïi cuûa lôùp chöùc naêng cuûa noäi maïc töû cung khoâng bò laù nuoâi hôïp baøo phaù huûy. Beân trong caùc vaùch nhau coù nhöõng maïch maùu lôùn goïi laø caùc maïch maùu töû cung-nhau cong queo môû tröïc tieáp vaøo nhöõng hoà maùu. I.2.6 MUÙI NHAU (COTYLEDONS) Muùi nhau hay ñôn vò nhau, coù theå nhaän ra khi quan saùt maët ñaùy baùnh nhau sau soå nhau: saàn suøi, coù nhieàu raõnh chia thaønh nhöõng muùi nhau; caùc raõnh naøy öùng vôùi nhöõng nôi tröôùc ñoù coù vaùch nhau beân trong hoà maùu. Nhöõng vaùch nhau vaø raõnh laø giôùi haïn cuûa moät muùi nhau. Moãi muùi nhau laø moät ñôn vò caáu taïo, beân trong coù moät caây gai nhau. I.2.7 ÑÓA ÑAÙY (BASAL PLATE) Laø phaàn maøng ruïng ñaùy (decidua basilis) coøn laïi sau khi hoà maùu hình thaønh, thuoäc lôùp ñaùy cuûa noäi maïc töû cung, goàm coù hai lôùp : lôùp ñaëc vaø lôùp xoáp. Lôùp xoáp ôû beân döôùi, tieáp xuùc vôùi cô töû cung vaø laø choå nhau bong khi soå nhau. I.2.8 VOØNG VIEÀN HAY BÔØ GIÔÙI HAÏN NGOAÏI VI (PERIPHERAL MARGIN) Coù ôû rìa baùnh nhau, laø nôi maët ngoaøi maøng ñeäm daøy, ñuïc taïo thaønh moät ñöôøng vieàn. I.2.9 DAÂY ROÁN (UMBILICAL CORD) Daây roán goàm cuoáng phoâi, nieäu nang vaø caùc maïch maùu roán. Daây roán thöôøng caém ôû gaàn trung taâm baùnh nhau, song cuõng coù theå caém ôû baát kyø vò trí naøo khaùc. Daây roán thöôøng coù ñöôøng kính khoaûng 1-2 cm, daøi trung bình 55 cm. Bình thöôøng daây roán coù hai ñoäng maïch roán vaø moät tónh maïch roán, xung quanh caùc maïch laø moâ chaát ñoâng ñöôïc goïi laø chaát Wharton. I.2.10 MAØNG NHAU Coù caáu taïo caùc lôùp töông töï nhö ôû baùnh nhau, song möùc ñoä phaùt trieån keùm hôn (cuõng coù maøng oái, maøng ñeäm vaø maøng ruïng). Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 13 I.3 SÖÏ TAÏO NHAU Nhau hình thaønh töø phía con vaø töø phía meï: phaàn nhau töø phía con coù nguoàn goác töø laù nuoâi vaø trung bì ngoaøi phoâi, phaàn nhau töø meï coù nguoàn goác töø noäi maïc töû cung. Khôûi ñaàu, tuùi ñeäm bao boïc toaøn boä phoâi. Veà sau, vuøng tuùi ñeäm phaùt trieån seõ taïo baùnh nhau, vuøng tuùi ñeäm keùm phaùt trieån seõ taïo maøng nhau. Beân caïnh khoang töû cung, ban ñaàu coøn coù khoang oái, khoang noaõn hoaøng vaø khoang ngoaøi phoâi; veà sau chæ coøn khoang oái. Hình 6: hình daïng cuûa baùnh nhau töø phaàn meï vaø phaàn thai Hình 5 : caùc thaønh phaàn caáu taïo cuûa nhau Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 14 I.3.1 SÖÏ TAÏO NHAU TÖØ PHÍA CON (SÖÏ TAÏO TUÙI ÑEÄM VAØ CAÂY GAI NHAU) I.3.1.1 SÖÏ TAÏO TUÙI ÑEÄM Tuùi ñeäm (chorionic sac) ñöôïc hình thaønh qua 3 giai ñoaïn: + Giai ñoaïn tieàn hoác: khi phoâi nang coù laù nuoâi teá baøo vaø laù nuoâi hôïp baøo. Laù nuoâi hôïp baøo ñöôïc hình thaønh do caùc teá baøo laù nuoâi teá baøo saùt nhaäp laïi, beân trong laù nuoâi hôïp baøo khoâng coù maøng baøo töông ngaên caùch giöõa chuùng. Laù nuoâi hôïp baøo xuaát hieän ñaàu tieân ôû cöïc phoâi roài sau ñoù lan roäng daàn bao heát toaøn boä phoâi. Do laù nuoâi hôïp baøo giuùp phoâi laøm toå vaø do cöïc phoâi coù laù nuoâi hôïp baøo neân cöïc phoâi thöôøng cuõng laø cöïc laøm toå. + Giai ñoaïn hoác: caùc hoác nhoû xuaát hieän beân trong laù nuoâi hôïp baøo, sau ñoù caùc hoác nhoû naøy seõ saùp nhaäp thaønh hoác lôùn. Phaàn laù nuoâi hôïp baøo coøn laïi giöõa caùc hoác baét ñaàu coù hình thuø cuûa caùc gai nhau ban ñaàu. + Giai ñoaïn gai nhau ban ñaàu: caùc hoác beân trong laù nuoâi saùp nhaäp laïi taïo thaønh heä thoáng goïi laø hoà maùu hay khoaûng gian gai nhau. Luùc naøy laù nuoâi taïo neân maøng ñeäm hay tuùi ñeäm vôùi hình aûnh baùnh nhau ban ñaàu coù daïng tuùi bao laáy toaøn boä phoâi. I.3.1.2 SÖÏ TAÏO CAÂY GAI NHAU (SÖÏ TAÏO ÑÓA ÑEÄM) Caùc gai nhau ban ñaàu tieáp tuïc phaùt trieån taïo caây gai nhau (ñóa ñeäm) vôùi naêm loaïi gai nhau: + Gai nhau trung moâ (mesenchymal villus) caáu taïo gioáng caùc gai nhau caáp III (coù laù nuoâi, moâ loõi vaø mao maïch). Coù baûn chaát laø choài, coù tính sinh saûn vaø bieät hoùa cho ra caùc loaïi gai nhau khaùc. Gai nhau trung moâ coøn ñöôïc goïi laø choài laù nuoâi. + Gai nhau trung gian chöa tröôûng thaønh (immature intermediate villus) bieät hoùa töø caùc gai nhau trung moâ trong ba thaùng ñaàu thai kyø vaø sau ñoù bieät hoùa tieáp thaønh caùc gai nhau goác. Gai nhau trung gian chöa tröôûng thaønh coù moâ loõi daïng löôùi, coù caùc Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 15 keânh beân trong moâ loõi ñöôïc taïo neân töø caùc teá baøo löôùi vaø beân trong caùc keânh coù caùc ñaïi thöïc baøo gai nhau goïi laø caùc teá baøo Hofbauer. + Gai nhau goác (stem villus) coù nhieàu kích côõ ñöôïc goïi teân töø lôùn ñeán beù laø thaân, nhaùnh to, nhaùnh vöøa, nhaùnh beù. Ñaëc ñieåm caáu taïo cuûa caùc gai nhau goác laù coù moâ loõi xô hoaù nhieàu. Loaïi gai nhau naøy coù theå ví nhö caùc ñoaïn thaân nhaùnh cuûa moät caây troàng, chæ coù nhieäm vuï daãn truyeàn caùc chaát ôû ba thaùng cuoái thai kyø (trong ba thaùng ñaàu thai kyø caùc gai nhau goác coù trao ñoåi chaát). + Gai nhau trung gian tröôûng thaønh ( mature intermediate villus) bieät hoùa töø caùc gai nhau trung moâ trong ba thaùng cuoái thai kyø. Sau ñoù, caùc gai nhau trung gian tröôûng thaønh seõ sinh ra caùc gai nhau taän. Ñaëc ñieåm caáu taïo cuûa caùc gai nhau trung gian tröôûng thaønh laø coù kích thöôùc töông ñöông vôùi nhau gai taän, coù nhieàu mao maïch nhöng chöa coù xoang mao maïch. + Gai nhau taän (terminal villus) coù chöùa naêng trao ñoåi chaát, ñaûm baûo nhieäm vuï cuûa baùnh nhau. Gai nhau taän ñöôïc sinh ra töø caùc gai nhau trung gian tröôûng thaønh vaø laø loaïi gai nhau coù soá löôïng nhieàu nhaát ôû baùnh nhau ñuû thaùng. Ñaëc ñieåm caáu taïo cuûa gai nhau taän laø coù heä mao maïch phong phuù phaùt trieån thaønh caùc daïng xoang, ñöôïc goïi laø caùc xoang mao maïch. Beân ngoaøi caùc xoang mao maïch, lôùp laù nuoâi teá baøo coøn raát moûng; vaø nhö theá xoang mao maïch cuøng vôùi laù nuoâi hôïp baøo moûng taïo thaønh moät caáu truùc ñaëc tröng cuûa gai nhau taän goïi laø taám bieåu moâ (epithelial plate). I.3.2 SÖÏ TAÏO NHAU TÖØ PHÍA MEÏ (söï bieán noäi maïc töû cung thaønh hoà maùu, ñóa ñaùy vôùi lôùp ñaëc vaø lôùp xoáp) I.3.2.1 CAÁU TRUÙC MO HOÏC NOÄI MAÏC TÖÛ CUNG Khi phoâi laøm toå, hoaøng theå tieát ra progesteron laøm noäi maïc töû cung coù nhöõng thay ñoåi quan troïng goïi laø phaûn öùng maøng ruïng (decidual reaction). Noäi maïc töû cung luùc naøy Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 16 ñöôïc goïi laø maøng ruïng (decidua) vì khi ñeû moät phaàn maøng naøy seõ bò ruïng vaø bong ra ngoaøi. Tuyø theo vò trí, coù ba loaïi maøng ruïng: (1) maøng ruïng bao laø phaàn noäi maïc töû cung boïc ngoaøi phoâi höôùng vaøo trong loøng khoang töû cung, (2) maøng ruïng thaønh laø phaàn noâi maïc töû cung coøn laïi trong khoang töû cung khoâng phuû beà maët phoâi, ôû phía ñoái dieän vôùi maøng ruïng bao, vaø (3) maøng ruïng ñaùy laø phaàn noäi maïc töû cung naèm giöõa phoâi vaø cô töû cung. Maøng ruïng ñaùy seõ taïo neân phaàn baùnh nhau cuûa meï. I.3.2.2 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG THAØNH Maøng ruïng thaønh (decidua parietalis) coù nhöõng thay ñoåi keùo daøi ñeán thaùng thöù ba, lôùp treân maët phaùt trieån khaùc haún vôùi lôùp saâu. Lôùp treân maët seõ thaønh lôùp ñaëc coøn lôùp saâu thaønh lôùp xoáp. ÔÛ maøng ruïng thaønh khoâng coù söï taïo hoà maùu. Töø thaùng thöù tö ñeán cuoái thai kyø, maøng ruïng thaønh moûng daàn ñi do phoâi ngaøy caøng lôùn, khoang töû cung ngaøy caøng roäng vaø maøng ruïng thaønh ngaøy caøng bò keùo caêng ra. Phoâi caøng lôùn, maøng ruïng thaønh caøng tieán daàn ñeán maøng ruïng bao. Bieåu moâ cuûa hai maøng ruïng naøy daùn vaøo nhau, thoaùi hoaù roài bieán maát. Khoang töû cung giöõa hai maøng ruïng naøy saùp nhaäp vaøo nhau chuùng coøn moät veát noái. Ñeán cuoái thai kyø, doïc theo beà maët lôùp xoáp, caùc tuyeán töû cung daõn roäng vaø bò eùp laïi. Bieåu moâ tuyeán deït daàn roài bieán maát, moâ lieân keát giöõa caùc tuyeán chöùa ñaày caùc teá baøo ruïng. Ñaây laø vuøng giöõa lôùp xoáp, laø nôi maø khi ñeû ra maøng nhau bong ra vaø lôùp ñaëc bò boùc ra ngoaøi. I.3.2.3 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG BAO Maøng ruïng bao (decidua capsularis) laø phaàn noäi maïc töû cung phuû treân beà maët phoâi trong vaøo khoang töû cung, moûng hôn maøng ruïng thaønh. Maøng ruïng bao ñöôïc taùi taïo sau khi tröùng loït haún vaøo trong noäi maïc töû cung (laønh seïo). Trong khi phaùt trieån, tröùng cuøng vôùi maøng ruïng bao loài vaøo beân trong khoang töû cung. Maøng ruïng bao ñeán saùt maøng Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 17 ruïng thaønh roài daùn vaøo laáp ñi khoang töû cung bò. Sau ñoù, maøng ruïng bao thoaùi hoùa, lôùp bieåu moâ cuøng vôùi moâ lieân keát beân döôùi tieâu ñi vaø haàu nhö khoâng ñeå laïi moät veát tích gì. I.3.2.4 SÖÏ PHAÙT TRIEÅN CUÛA MAØNG RUÏNG ÑAÙY Maøng ruïng ñaùy (decidua basilis) laø phaàn moâ chính cuûa meï tham gia taïo baùnh nhau; lôùp chöùa naêng bieät hoaù thaønh hoà maùu coøn lôùp ñaùy bieät hoùa thaønh lôùp ñaëc vaø lôùp xoáp. Trong khi phaùt trieån, laù nuoâi hôïp baøo taêng sinh, taïo neân nhöõng gai nhau aên saâu vaøo beân trong maøng ruïng ñaùy. Heä thoáng caây gai nhau ñöôïc thaønh laäp, phaù huyû maøng ruïng ñaùy giuùp cho phoâi phaùt trieån. Maøng ruïng ñaùy bò phaù huûy ñeå laïi moät vuøng moâ goàm nhöõng chaát coøn laïi cuûa maøng ruïng ñaùy nhö tuyeán, moâ lieân keát, thaønh cuûa caùc maïch maùu, thaønh cuûa caùc tuyeán töû cung vaø caùc chaát tieát cuûa tuyeán töû cung bò phaân huûy thaønh chaát dinh döôõng cho phoâi. Phoâi caøng lôùn, vuøng moâ bò phaù huûy caøng roäng. Laù nuoâi hôïp baøo tieáp tuïc phaù huûy lôùp chöùc naêng noäi maïc töû cung taïo neân nhöõng hoác chöùa ñaày maùu goïi laø hoà maùu. Nhöõng hoác naøy ñöôïc ngaên bôûi caùc vaùch nhau (laø phaàn moâ cuûa lôùp chöùc naêng chöa bò laù nuoâi hôïp baøo phaù huûy heát) [1,2]. I.4 CHÖÙC NAÊNG CUÛA NHAU Nhau laø cô quan ñaûm nhieäm chöùc naêng trao ñoåi chaát giöõa cô theå meï vaø thai. Söï trao ñoåi chaát aáy bao goàm söï loït caùc chaát dinh döôõng, nöôùc, oxy, khaùng theå vaø hormone töø cô theå meï sang thai vaø söï loït theo höôùng ngöôïc laïi nhöõng chaát dò hoaù, nöôùc, khí carbonic vaø hormone. Söï trao ñoåi qua haøng raøo nhau laø moät hieän töôïng lyù hoaù hoïc phöùc taïp vì caáu truùc cuûa haøng raøo nhau khoâng phaûi laø caáu truùc cuûa moät haøng raøo baùn thaám ñôn giaûn maø noù ñöôïc tieán haønh theo nhieàu cô cheá khaùc nhau. Nhau coøn laø cô quan baøi tieát hormone. I.4.1 CHÖÙC NAÊNG TRAO ÑOÅI CHAÁT Söï trao ñoåi chaát qua haøng raøo nhau tieán haønh theo nhieàu cô cheá khaùc nhau: Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 18 ™ Khuyeách taùn ñôn giaûn. Nhieàu chaát loït qua haøng raøo nhau nhôø cô cheá khuyeách taùn ñôn giaûn. Ñoù laø caùc muoái Na, K, Ca, Mg, caùc acid amin, acid uric, urea, ammoniac, creatinin, creatin, caùc chaát khí nhö oxy, carbonic, caùc chaát gaây meâ vaø moät soá hôïp chaát hoaø tan trong môõ v.v… Söï trao ñoåi khí laø do aùp löïc khí trong maùu meï vaø trong maùu thai khaùc nhau. ™ Khuyeách taùn thuaän lôïi. Moät soá monosaccharid loït qua haøng raøo nhau nhôø cô cheá khuyeách taùn thuaän lôïi. Nhôø cô cheá aáy, glucose trong maùu meï loït qua haøng raøo nhau sang maùu thai vaø ñöôïc tích tröõ trong gan phoâi thai döôùi daïng glycogen. ™ Vaän chuyeån tích cöïc. Nhöõng chaát khaùc, thí duï caùc ion saét, caùc acid amni chuû yeáu loït qua haøng raøo nhau baèng cô cheá vaän chuyeån tích cöïc. Do ñoù caàn chuù yù söï khaùc nhau veà cô cheá trao ñoåi chaát giöõa caùc acid amin chuû yeáu vaø khoâng chuû yeáu. Nhöõng acid amin khoâng chuû yeáu loït qua haøng raøo nhau baèng cô cheá khuyeách taùn ñôn giaûn nhö ñaõ noùi ôû treân. Khaû naêng cuûa caùc loaïi protein loït qua haøng raøo nhau thì khaùc nhau. Thí duï: immunoglobulin A khoâng loït qua haøng raøo nhau, trong khi ñoù immunoglobulin G coù cuøng phaân töû löôïng vôùi noù laïi loït qua ñöôïc. Söï loït hay khoâng cuûa caùc khaùng theå qua haøng raøo nhau quyeát ñònh möùc ñoä mieãn dòch thuï ñoäng maø ñöùa treû coù theå bieåu loä sau khi ra ñôøi. Nhöõng chaát nhö insulin, thyroxin, curare, heparin khoâng loït qua nhau. I.4.2 CHÖÙC NAÊNG BAØI TIEÁT HORMONE Nhöõng hormone baøi tieát bôûi nhau goàm nhöõng hormone höôùng sinh duïc, hormone höôùng thaân, estrogen, progesterone. Nhöõng hormpne aáy ñöôïc goïi chung laø hormone maøng ñeäm. Chuùng do hôïp baøo laù nuoâi tieát ra. Hormone höôùng sinh duïc laø moät glycoprotein duy trì söï hoaït ñoäng cuûa hoaøng theå cho ñeán khi nhau baøi tieát ra estrogen vaø progesterone. Söï cheá tieát estrogen vaø progesteron bôûi nhau ñöôïc ñaûm nhieäm bôûi laù nuoâi hôïp baøo vaø taêng daàn trong thôøi gian coù thai. Söï taêng noàng ñoä estrogen tieát ra bôûi nhau vaøo maùu Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 19 meï laøm taêng söï nhaïy caûm cuûa cô töû cung ñoái vôùi taùc duïng cuûa ocytocin tieát ra bôûi thuyø sau tuyeán yeân. Ocytocin kích thích söï co boùp cuûa cô töû cung ñeå toáng thai ra ngoaøi. I.4.3 CHÖÙC NAÊNG MIEÃN DÒCH Khaû naêng mieãn dòch thuï ñoäng cuûa thai laø do immunoglobulin G töø maùu meï loït qua haøng raøo nhau sang thai. Nhôø ñoù thai coù tính mieãn dòch taïm thôøi ñoái vôùi moät soá beänh nhö thuyû ñaäu, sôûi vaø baïch haàu, nhöng khoâng coù tính mieãn dòch ñoái vôùi moät soá beänh khaùc nhö ho gaø. Maëc duø coù söï ngaên caùch giöõa maùu meï vaø maùu thai bôûi haøng raøo nhau, thöôøng thöôøng moät löôïng nhoû maùu thai coù theå loït sang maùu meï. Trong tröôøng hôïp naøy, neáu maùu thai coù Rh+ vaø maùu meï coù Rh- thì nhöõng khaùng theå khaùng huyeát caàu Rh+ seõ phaùt sinh trong maùu thai. Vì nhöõng khaùng theå naøy ñi qua nhau seõ phaù huyû maïnh hoàng caàu cuûa thai, gaây neân beänh vaøng da hoaïi huyeát cho thai. Söï truyeàn maùu sôùm cho thai vaø söï söû duïng nhöõng khaùng theå chöùa nhöõng immunoglobulin khaùng Rh laø nhöõng bieän phaùp ñieàu trò ñöôïc duøng ñeå chöõa vaø phoøng beänh naøy [4]. II. ÑAÏI CÖÔNG VEÀ NGUYEÂN BAØO SÔÏI II.1 ÑAËC ÑIEÅM CHUNG Moâ lieân keát laø moâ taïo ra vaø giöõ cho cô theå coù hình daïng nhaát ñònh, ñoàng thôøi moâ lieân keát giöõ nhieàu vai troø quan troïng vaø ña daïng ñoái vôùi cô theå : trao ñoåi chaát, baûo veä vaø toång hôïp caùc chaát coù hoaït tính sinh hoïc. Khaùc vôùi caùc moâ khaùc (moâ cô, thaàn kinh, bieåu moâ), moâ lieân keát coù khoaûng gian baøo roäng chöùa chaát caên baûn vaø caùc sôïi lieân keát. Vuøi trong chaát gian baøo ñoù laø nhieàu loaïi teá baøo khaùc nhau [3]. Nhieàu teá baøo ñaõ bieät hoùa trong cô theå tröôûng thaønh coù theå taïo thaønh nhoùm trong moät hoï maø caùc thaønh vieân coù quan heä gaàn guõi vôùi nhau ôû nhöõng vuøng moâ hoaëc bôûi nhöõng ñaëc tính coù lieân quan vôùi nhau. Moät ví duï quan troïng laø hoï teá baøo cuûa moâ lieân keát, Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 20 thaønh vieân cuûa chuùng khoâng chæ coù lieân quan vôùi nhau maø coøn coù moät khaû naêng ñaùng chuù yù laø söï chuyeån hoùa qua laïi. Hoï teá baøo naøy bao goàm : nguyeân baøo sôïi, teá baøo suïn vaø teá baøo xöông, taát caû chuùng coù moät chöùc naêng ñaëc bieät ñoái vôùi vieäc tieát ra chaát neàn ngoaïi baøo collagen vaø hoaït ñoäng cuøng nhau trong moät kieåu caáu truùc thoáng nhaát cuûa cô theå, cuõng nhö laø caùc teá baøo môõ vaø teá baøo moâ cô trôn, maø chuùng thöôøng ñöôïc tìm thaáy trong nhöõng vuøng cuøng vôùi caùc teá baøo treân. Nhöõng kieåu teá baøo naøy coù theå xaûy ra söï chuyeån hoùa qua laïi giöõa chuùng. Teá baøo cuûa moâ lieân keát ñoùng moät vai troø trung taâm trong vieäc naâng ñôõ vaø söõa chöûa cho haàu heát caùc moâ hoaëc cô quan bò huûy hoaïi, ñaëc ñieåm bieät hoùa laø moät neùt ñaëc tröng quan troïng cuûa chuùng trong söï ñaùp öùng ñoái vôùi nhieàu kieåu taùc ñoäng vaø söï huûy hoaïi [8]. Moâ lieân keát goàm 3 loaïi chính : moâ lieân keát chính thöùc, moâ suïn vaø moâ xöông. Taát caû caùc loaïi moâ lieân keát ñeàu coù nguoàn goác töø trung bì phoâi, tröø moät soá moâ lieân keát ôû vuøng ñaàu coù theå baét nguoàn töø ngoaïi bì. Moâ lieân keát laø moâ chöùa nhieàu maïch maùu ñeå nuoâi baûn thaân moâ lieân keát vaø caùc moâ khaùc. Moâ lieân keát thöa coù nguoàn goác töø trung moâ. Trong trung moâ, caùc sôïi ngaøy caøng taêng leân roài daàn daàn caùc sôïi ñoù hoïp vôùi nhau, taïo thaønh nhöõng boù sôïi lôùn hôn vaø coù nhöõng tính chaát gioáng chaát taïo keo. Nhöõng teá baøo trung moâ daàn daàn thay ñoåi ñaëc tính, keùo daøi doïc theo beà maët caùc boù sôïi roài chuyeån thaønh nhöõng teá baøo sôïi, loaïi teá baøo chính cuûa moâ lieân keát. Moâ lieân keát coù thaønh phaàn teá baøo raát ña daïng : teá baøo sôïi, ñaïi thöïc baøo, töông baøo, masto baøo, teá baøo môõ, teá baøo noäi moâ, chu baøo, teá baøo saéc toá, caùc loaïi teá baøo baïch caàu töø maùu ñeán [3]. Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 21 Moät vaøi teá baøo cuûa moâ lieân keát nhö laø nguyeân baøo sôïi vaø teá baøo môõ ñöôïc taïo thaønh vaø duy trì cuïc boä trong khi nhöõng teà baøo khaùc nhö laø teá baøo maùu taïo thaønh töø nhöõng vuøng khaùc vaø coù theå ñöôïc taïm thôøi cö truù trong moâ lieân keát. Söï töông taùc cuûa nhöõng teá baøo cuûa moâ lieân keát, taïo thaønh moät cô cheá phöùc taïp giuùp baûo veä choáng laïi söï xaâm nhieãm cuûa vi sinh vaät [13]. Chaát neàn ngoaïi baøo coù leõ aûnh höôûng leân traïng thaùi bieät hoùa teá baøo cuûa moâ lieân keát thoâng qua caùc yeáu toá sinh lyù cuõng nhö caùc yeáu toá hoùa hoïc. Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc chæ ra raèng trong nghieân cöùu treân nuoâi caáy teá baøo suïn. Döôùi ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp, teá baøo suïn seõ taêng tröôûng ñeå toång hôïp löôïng lôùn chaát neàn suïn khaùc nhau seõ bao xung quanh chính baûn thaân chuùng vaø duy trì nhöõng ñaëc tính bieät hoaù cuûa mình khi coù caùc nhaân toá kích thích thích hôïp. Tuy nhieân, döôùi nhöõng ñieàu kieän nôi maø nhöõng teá baøo ñöôïc giöõ cuøng nhau ôû maät ñoä thaáp vaø ñöôïc duy trì nhö laø moät lôùp ñôn treân chai nuoâi, moät söï bieán ñoåi xaûy ra : nhöõng teá baøo maát ñi hình daïng phaùt trieån ñaày ñuû tieâu bieåu cuûa teá baøo suïn, hình phaúng naèm treân theå neàn, vaø döøng laïi vieäc taïo ra chaát neàn cuûa suïn, trong nhöõng tröôøng hôïp ñaëc bieät, chuùng döøng laïi vieäc taïo ra collagen kieåu II - kieåu ñaëc tröng cuûa teá baøo suïn – vaø thay vaøo ñoù laø toång hôïp collagen kieåu I – kieåu ñaëc tröng cuûa nguyeân baøo sôïi. Hình 7 : Caùc loaïi teá baøo cuûa moâ lieân keát Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 22 Ñoái vôùi haàu heát caùc kieåu teá baøo, ñaëc bieät ñoái vôùi teá baøo cuûa moâ lieân keát, khaû naêng ñöôïc giöõ laïi vaø baùm dính tuøy thuoäc vaøo chaát neàn xung quanh chuùng. Moät teá baøo coù theå taïo ra moät moâi tröôøng xung quanh cho chính baûn thaân chuùng. Sau ñoù moâi tröôøng seõ taùc ñoäng trôû laïi treân teá baøo naøy ñeå taïo ra moät khaû naêng bieät hoùa. Do ñoù, chaát neàn ngoaïi baøo maø moät teá baøo tieát ra taïo thaønh moät phaàn cuûa moâi tröôøng ñoái vôùi caùc teá baøo beân caïnh cuõng nhö ñoái vôùi chính chuùng vaø höôùng ñeán vieäc taïo ra söï bieät hoùa cuûa caùc teá baøo beân caïnh trong cuøng moät caùch töông töï [8]. II.2 TEÁ BAØO SÔÏI (FIBROCYTE) II.2.1 NGUOÀN GOÁC Teá baøo sôïi coù nhieàu trong gaân, cô, maøng bao xô cuûa nhieàu cô quan, laø cô sôû caáu taïo cuûa veát seïo. Teá baøo sôïi cheá tieát nhöõng tieàn chaát cuûa nhöõng thaønh phaàn sôïi cuûa moâ lieân keát, nhöõng phaàn töû chaát taïo keo. Teá baøo sôïi ñöôïc sinh ra töø teá baøo trung moâ (ôû phoâi thai), töø nhöõng teá baøo keùm bieät hoaù ôû moâ lieân keát, hoaëc do söï sinh saûn cuûa caùc teá baøo sôïi (khaû naêng sinh saûn cuûa teá baøo sôïi raát maïnh). II.2.2 HÌNH DAÏNG Teá baøo sôïi khaù lôùn, ñöôøng kính thaân teá baøo coù theå ñaït tôùi 20 micron, coù hình sao hay hình thoi, coù nhaùnh ñeå tieáp xuùc vôùi nhöõng nhaùnh cuûa caùc teá baøo beân caïnh. Vì vaäy teá baøo sôïi ñöôïc xeáp vaøo loaïi teá baøo baát ñoäng cuûa moâ lieân keát. Baøo töông teá baøo sôïi thöôøng öa maøu acid (eosin) gioáng nhö chaát taïo keo trong chaát caên baûn naèm caïnh. Do ñoù raát khoù phaân bieät ranh giôùi teá baøo. Tuy nhieân, coù theå deã daøng nhìn roõ sau khi nhuoäm baèng phöông phaùp hematoxylin saét. Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 23 Nhaân teá baøo coù hình tröùng, saùng maøu khi teá baøo coøn non (nguyeân baøo sôïi), hoaëc hình thoi deït, saãm maøu khi teá baøo tröôûng thaønh, coù 1-2 nhaân. Chaát nhieãm saéc laø nhöõng haït nhoû, naèm raûi raùc trong nhaân. Maøng nhaân thöôøng phaúng, ñoâi khi cuõng coù theå khuùc khuyûu. Trong baøo töông coù: moät caëp tieåu theå trung taâm, moät boä Golgi naèm gaàn nhaân, nhöõng ty theå daøi, maûnh, chuû yeáu thaáy ôû thaân teá baøo, nhöng cuõng coù theå gaëp ôû caùc nhaùnh. Löôùi noäi baøo coù haït, caùc Ribosome naèm raûi raùc trong baøo töông. Khi coù söï kích thích (trong quaù trình taïo seïo veát thöông), khi teá baøo sôïi chuaån bò phaân chia, khi teá baøo tích cöïc hoaït ñoäng toång hôïp nhöõng thaønh phaàn ngoaøi teá baøo, caùc teá baøo sôïi lôùn leân veà kích thöôùc vaø baøo töông cuûa chuùng trôû neân öa base. Döôùi kính hieån vi quang hoïc, nhöõng teá baøo sôïi khoâng hoaït ñoäng coù boä Golgi ít phaùt trieån, moät ít Hình 8 : hình daïng thaân vaø nhaân cuûa teá baøo sôïi Hình 9 : thaønh phaàn teá baøo chaát cuûa teá baøo sôïi Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 24 maïng löôùi noäi baøo coù haït. Nhöng trong moâ lieân keát ñang phaùt trieån, ñang hoaït ñoäng maïnh thì boä Golgi phaùt trieån: nhieàu tuùi deït, tuùi nhoû, nhöng khoâng baøo lôùn, löôùi noäi baøo coù haït cuõng taêng leân. Bình thöôøng, teá baøo sôïi khoâng haáp thu chaát laï, nhöng khi bò kích thích maïnh, trong thôøi gian daøi (nhö trong tröôøng hôïp tieâm thuoác nhuoäm soáng daïng keo nhö xanh trypan) teá baøo coù theå haáp thu thuoác nhuoäm ñoù. Phaàn lôùn caùc nhaø nghieân cöùu moâ hoïc cho raèng teá baøo sôïi laø loaïi teá baøo ñaõ bieät hoaù, thöôøng khoâng phaûi laø nguoàn goác cuûa caùc loaïi teá baøo khaùc cuûa moâ lieân keát. Nhöng laïi coù nhöõng daãn chöùng neâu ra raèng: trong ñieàu kieän beänh lyù hoaëc trong moät soá thöïc nghieäm xaùc ñònh, teá baøo sôïi coù theå chuyeån thaønh teá baøo xöông. Coù quan ñieåm ñöôïc coâng nhaän moät caùch roäng raõi cho raèng teá baøo sôïi tích luyõ môõ hoaëc coù theå noùi moät caùch chaéc chaén raèng coù thöïc laø teá baøo sôïi ñaõ chuyeån thaønh teá baøo xöông, teá baøo môõ hay chính nhöõng teá baøo tieàn thaân cuûa chuùng (nhöõng teá baøo trung moâ chöa bieät hoaù) ñaõ thöïc hieän söï chuyeån bieán noùi treân. Söï phong phuù cuûa caùc baøo quan trong teá baøo sôïi chöùng toû teá baøo coù hoaït ñoäng chuyeån hoaù thöôøng xuyeân. II.2.3 CHÖÙC NAÊNG Hình 10 : teá baøo sôïi haáp thu vôùi thuoác nhuoäm xanh trypan Phaân laäp vaø taïo doøng nguyeân baøo sôïi ngöôøi töø maãu moâ nhau Huyønh Duy Thaûo 25

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfPhân lập và tạo dòng nguyên bào sợi (fibroblast) người từ bánh nhau.pdf