Thử nghiệm sử dụng phức hợp vi sinh vật trong chế biến phomai từ đậu hũ và bã đậu nành (okara)

MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục các sơ đồ Danh mục các hình Danh mục các bảng Danh mục các đồ thị Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 PHẦN I. TỔNG QUANTÀI LIỆU .5 1.1. Giới thiệu về đậu nành . 6 1.1.1. Hệ thống phân loại 6 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng của đậu nành . 6 1.1.3. Công dụng của đậu nành . 7 1.1.4. Một số sản phẩm từ đậu nành trên thế giới .9 1.1.4.1. Những sản phẩm từ đậu nành ở phương Tây .9 1.1.4.2. Những sản phẩm đậu nành ở phương Ðông .1 0 1.1.5. Okara . 12 1.1.5.1. Giới thiệu . .12 1.1.5.2. Định nghĩa về chất xơ 16 1.1.6. Phomai sữa và phomai đậu nành . 20 1.1.6.1. Phomai sữa . 20 1.1.6.2. So sánh phomai sữa và phomai đậu nành . .21 1.2. Các giống vi sinh vật sử dụng .23 1.2.1. Bacillus subtilis 23 1.2.1.1. Hệ thống phân loại 23 1.2.1.2. Phân bố .23 1.2.1.3. Hình thái . 23 1.2.1.4. Cấu trúc . 24 1.2.1.5. Sự hình thành bào tử 26 1.2.1.6. Hệ enzyme của B. subtilis .27 1.2.1.7. Công dụng .28 1.2.2. Vi khuẩn lactic 29 1.2.2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic .29 1.2.2.2. Lactobacillus . 32 1.2.2.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic .33 1.2.3. Nấm Linh chi . .35 1.2.3.1. Hệ thống phân loại .35 1.2.3.2. Đặc tính sinh học . .35 1.2.3.3. Dược tính của nấm Linh chi . 37 1.2.2.4. Công dụng của nấm Linh chi . .39 1.2.2.5. Enzyme cellulase . 39 PHẦN II. .41VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 42 2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật . .42 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus.sp .42 2.2.1.1. Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật .42 2.2.1.2. Các đặc tính sinh lý của Lactobacillus sp 44 2.2.1.3. Các đặc tính sinh hóa của Lactobacillus.sp .45 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn B.subtilis .47 2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram .47 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử .47 2.2.2.3. Các đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.subtilis .48 2.2.2.4. Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B.subtilis .51 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi52 2.2.3.1. Phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát nấm sợi Linh chi .52 2.2.3.2. Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi 52 2.2.4. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtilis .53 2.3. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật 54 2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis .54 2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease của B.subtilis .56 2.3.3. Xác định họat tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) của nấm sợi Linh chi .58 2.4. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm .61 2.4.1. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm từ đậu hũ . .61 2.4.2. Quy trình kỹ thuật chế biến sản phẩm từ okara . .62 2.5. Phân tích chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm 63 2.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm .63 2.5.2. Phương pháp xác định hàm Ntổng số .64 2.5.3. Phương pháp xác định hàm lượng Namoniac .67 2.5.4. Phương pháp xác định hàm lượng Nformol . 68 2.5.5. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng 70 2.5.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 72 2.5.7. Phương pháp xác định hàm lượng lipid . 73 2.5.8. Phương pháp xác định chỉ số peroxide 74 2.5.9. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose . .75 PHẦN III. .77KẾT QUẢVÀBIỆN LUẬN 3.1. Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các vi sinh vật sử dụng trong đề tài .78 3.1.1. Lactobacillus sp 78 3.1.1.1. Một số đặc điểm sinh lý của Lactobacillus sp 78 3.1.1.2. Một số đặc điểm sinh hóa của Lactobacillus sp .79 3.1.2. Bacillus subtilis .80 3.1.2.1. Một số đặc điểm sinh lý của vi khuẩn B.subtilis .81 3.1.2.2. Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B.subtilis 83 3.1.3. Nấm Linh chi . .84 3.1.3.1. Kết quả định tính các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi Linh chi 84 3.1.3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtilis .86 3.2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật dùng trong đề tài .86 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme amylase của vi khuẩn B.subtilis theo thời gian .86 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme protease của vi khuẩn B.subtilis theo thời gian .87 3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian .88 3.3. Kết quả chế biến sản phẩm .90 3.3.1. Sản phẩm từ đậu hũ . .90 3.3.1.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis sử dụng .90 3.3.1.2. Khả năng bảo quản của Lactobacillus sp .91 3.3.1.3. Kết quả khảo sát các loại phụ gia và nồng độ 93 3.3.1.4. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai từ sinh khối nấm sợi Linh chi . 94 3.3.1.5. Kết quả chế biến sản phẩm từ đậu hũ . 95 3.3.2. Sản phẩm từ okara . .9 6 3.3.2.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước (okara:nước) . 96 3.3.2.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast sử dụng .96 3.3.2.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis sử dụng .97 3.3.2.4. Khả năng bảo quản của Lactobacillus sp .98 3.3.2.5. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai từ sinh khối nấm sợi Linh chi . 99 3.3.2.6. Kết quả chế biến sản phẩm từ okara . .99 3.4. Kết quả phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm .100 3.4.1. Độ ẩm 101 3.4.2. Hàm lượng NTS .102 3.9.3. Hàm lượng Nformol .103 3.9.4. Hàm lượng Namoniac .104 3.9.5. Hàm lượng đường tổng .105 3.9.6. Hàm lượng đường khử . 106 3.9.7. Hàm lượng lipid . 10 7 3.9.8. Chỉ số peroxyde 108 3.9.9. Hàm lượng cellulose . 10 9 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 110 4.1 Kết luận 111 4.2. Đề nghị .112 TÀI LIỆU THAM KHẢO

pdf33 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 1859 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Thử nghiệm sử dụng phức hợp vi sinh vật trong chế biến phomai từ đậu hũ và bã đậu nành (okara), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
HVTH: Võ Thanh Trang PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN HVTH: Võ Thanh Trang 3.1. Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các vi sinh vật sử dụng trong đề tài 3.1.1. Lactobacillus sp. Hình 3.1. Khuẩn lạc Lactobacillus sp. Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn Lactobacillus sp. trên môi trường cà chua có bổ sung CaCO3 Đặc điểm hình thái Lactobacillus sp. : khuẩn lạc nhỏ tròn, màu trắng đục. Là vi khuẩn Gram dương. Tế bào hình que, đứng riêng rẽ, kích thước ~ 0,5 x 1µm. 3.1.1.1. Một số đặc điểm sinh lý của Lactobacillus sp. ™ Khả năng làm đông tụ sữa (+): có hiện tượng đông tụ sữa sau khi cấy Lactobacillus sp. vào môi trường sữa đậu nành sau 24 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ phòng. (ĐC): sữa đậu nành đã được hấp tiệt trùng, không cấy giống vi khuẩn. Hình 3.3. Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp. + ĐC HVTH: Võ Thanh Trang ™ Kết quả định tính acid lactic Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 1 ml thuốc thử Ufermen. Ống 2: 3 ml dịch lên men, 1 ml thuốc thử Ufermen. Ống 3: 3 ml acid lactic 98 %, 1 ml thuốc thử Ufermen. Hình 3.4. Kết quả định tính acid lactic Tiến hành định lượng acid lactic sau 24 giờ nuôi tĩnh ở nhiệt độ phòng cho kết quả hàm lượng acid lactic đạt 2,93%, tương đương 33oT 3.1.1.2. Một số đặc điểm sinh hóa của Lactobacillus sp. ™ Catalase âm tính: không có hiện tượng sủi bọt khi nhỏ dung dịch H2O2 vào dịch nuôi cấy Hình 3.5. Thử nghiệm catalase ™ Oxydase âm tính 1: (-) H2O 2: (+) Pseudomonas aeruginosa 3: (-) E.coli 4: Lactobacillus sp. Hình 3.6. Thử nghiệm oxidase 1 2 3 + - 1 2 3 4 HVTH: Võ Thanh Trang ™ Nitratase âm tính 1: ĐC (-) H2O 2: ĐC (+) Pseudomonas aeruginosa 3: ĐC (-) Lactobacillus acidophilus 4: Lactobacillus sp. Hình 3.7. Thử nghiệm nitratase ™ Khả năng lên men glucose (1): ĐC (-): môi trường phenol red broth (2): ĐC (+): E.coli (3): Lactobacillus sp. Hình 3.8. Thử nghiệm khả năng lên men glucose 3.1.2. Bacillus subtilis Hình 3.9. Khuẩn lạc B.subtilis Hình 3.10. Tế bào vi khuẩn B.subtilis 1 2 3 4 1 2 3 Bào tử Tế bào sinh dưỡng Bào tử nang HVTH: Võ Thanh Trang Đặc điểm hình thái vi khuẩn B.subtilis: khuẩn lạc to; màu trắng đục, bám vào mặt thạch; bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn, nhớt. Là vi khuẩn Gram dương. Tế bào hình que, đứng riêng rẽ hay kết chuỗi, có mang bào tử hình trứng; nằm ở giữa hay lệch về một đầu của bào tử nang, kích thước 0,5 × (1 -1,5)µm. 3.1.2.1.Một số đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Bacillus subtilis ™ Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis Bảng 3.1. Sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo điều kiện nuôi và thời gian CFU/ml Trạng thái nuôi pH 0 giờ 8 giờ 16 giờ 24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ 2 4,8x1010 3x1010 2,8x1010 2,6x1010 2,5x1010 2,4x1010 2,2x1010 Lắc 7 4,8x1010 3,5x1011 1,0x1013 3,8x1013 3,3x1013 2,9x1013 2,4x1013 0.0E+00 1.0E+10 2.0E+10 3.0E+10 4.0E+10 5.0E+10 6.0E+10 0 giờ 8 giờ 16 giờ 24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ Thời gian (giờ) Số lư ợn g tế b ào (C FU /m l) Đồ thị 3.1. Đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời gian ở pH 2 HVTH: Võ Thanh Trang 1.0E+10 1.0E+11 1.0E+12 1.0E+13 1.0E+14 1.0E+15 0 giờ 8 giờ 16 giờ 24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ Thời gian (giờ) Số lư ợn g tế b ào (C FU /m l) Đồ thị 3.2: đường biểu diễn sự biến đổi số lượng tế bào B.subtilis theo thời gian ở pH 7 Nhận xét: ở đồ thị 3.1, pH 2 không phải là điều kiện phù hợp cho sự tăng trưởng và phát triển của B.subtilis nên lượng tế bào B.subtilis không những không tăng mà còn giảm dần theo thời gian. Lượng tế bào giảm đi có thể có một phần là tế bào sinh dưỡng còn sót lại trong giống cấy, một phần là lượng bào tử yếu, không chịu được pH thấp. Số lớn còn lại có thể tồn tại trong hơn 48 giờ tiếp theo. Ở đồ thị 3.2, pH 7 là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của B.subtilis nên số lượng tế bào tăng nhanh sau 16 giờ nuôi lắc, từ 16 – 24 giờ, mật độ tương đối ổn định và đạt cực đại ở 24 giờ, sau đó thì giảm dần. Phần lớn tế bào sinh dưỡng trở thành bào tử nang trong khoảng 20-30 giờ, sau đó phóng thích bào tử tự do. HVTH: Võ Thanh Trang 3.1.2.2. Một số đặc điểm sinh hóa ™ Catalase dương tính Có hiện tượng sủi bọt khi nhỏ dung dịch H2O2 vào dịch nuôi cấy B.subtilis Hình 3.11. Thử nghiệm catalase (+) ™ Nitratase dương tính 1: (-) H2O 2: (+) Pseudomonas aeruginosa 3: Bacillus subtilis 4: (-) Lactobacillus acidophilus Hình 3.12. Thử nghiệm nitratase ™ Khả năng thủy phân tinh bột Khi cho thuốc thử Lugol lên bề mặt môi trường tinh bột, tinh bột kết hợp với iod sẽ làm cho môi trường hóa đen. Kết quả hình 3.13 cho thấy B.subtilis có khả năng phân giải tinh bột nên tạo thành vòng tan, nơi cơ chất tinh bột bị enzyme amylase của B.subtilis phân giải hết Hình 3.13. Phản ứng thủy phân tinh bột 1 2 3 4 HVTH: Võ Thanh Trang ™ Khả năng thủy phân casein Khi cho thuốc thử Folin lên bề mặt môi trường có bổ sung casein, nếu casein bị thủy phân thành các acid amin (tyrosine), các acid amin này sẽ tác dụng với thuốc thử Folin tạo thành màu xanh đen Kết quả hình 3.14 cho thấy, B.subtilis có khả năng phân giải protein. Hình 3.14. Phản ứng thủy phân casein 3.1.3. Nấm Linh chi Quan sát tiêu bản phòng ẩm tơ nấm dưới kính hiển vi, ta thấy tơ nấm Linh chi có hình sợi mảnh, dài, phân nhánh. Hình 3.15. Hình thái nấm sợi Linh chi 3.1.3.1. Kết quả định tính các chất có hoạt tính sinh học của nấm sợi Linh chi ™ Định tính saponin (+): môi trường Czapek –Dox lỏng có sinh khối nấm Linh chi. Mặt ngăn cách có màu nâu đỏ: có saponin (-) : Nước cất Hình 3.16. Định tính saponin - phản ứng Liebermann-Burchard (-) (+) HVTH: Võ Thanh Trang ™ Định tính alkaloid (1): Nước cất (2) và (3): môi trường Czapek –Dox lỏng có sinh khối nấm Linh chi (2): Định tính với thuốc thử Mayer. Xuất hiện kết tủa trắng vàng. (3): Định tính với thuốc thử Wagner. Xuất hiện kết tủa nâu đỏ => có alkaloid Hình 3.17. Định tính alkaloid ™ Định tính steroid (1): Nước cất (2): môi trường Czapek –Dox lỏng có sinh khối nấm Linh chi, môi trường chuyển màu đỏ sẫm => có steroid Hình 3.18. Định tính steroid - phản ứng Salkowki ™ Khả năng phân giải cellulose của nấm Linh chi Khi cho thuốc thử Lugol lên bề mặt môi trường có bổ sung CMC (carboxymethyl cellulose), cơ chất này sẽ kết hợp với iod làm cho môi trường hóa đen. Kết quả hình 3.19 cho thấy nấm Linh chi có khả năng phân giải CMC nên tạo thành vòng tan, nơi cơ chất CMC bị enzyme cellulase của nấm Linh chi phân giải hết Hình 3.19. Vòng phân giải CMC 1 2 3 1 2 HVTH: Võ Thanh Trang 3.1.3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtils Xung quanh miếng sinh khối nấm Linh chi có một vòng trong vô khuẩn, chứng tỏ hệ sợi nấm Linh chi có khả năng kìm hãm sự tăng trưởng của vi khuẩn B.subtilis song không mạnh lắm. Tuy nhiên trên thực tế, B.subtilis luôn lấn át tơ nấm Linh chi trong việc chiếm bế mặt cơ chất bởi tốc độ tăng trưởng sinh khối rất mạnh. Vì lý do đó trong quá trình thực hiện đề tài, vi khuẩn lactic đã được sử dụng để ức chế B.subtilis, tạo điều kiện cho tơ nấm Linh chi mọc và lan tỏa, tạo vỏ bọc sinh học. 3.2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật dùng trong đề tài 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme amylase của vi khuẩn B.subtilis theo thời gian Bảng 3.2. Sự biến thiên hoạt tính chung enzyme amylase của vi khuẩn B.subtilis Thời gian (giờ) OD Hoạt tính (UI/ml MT) Đối chứng 1,699 0 0 1,687 0,00047 4 1,5954 0,0041 8 1,5617 0,0054 12 1,205 0,019 16 1,161 0,021 20 0,731 0,032 24 0,877 0,038 28 0,772 0,036 Hình 3.20. Vòng kháng vi khuẩn B.subtilis của nấm Linh chi HVTH: Võ Thanh Trang 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h (U I/m l M T) Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis theo thời gian Nhận xét: Từ 0-8 giờ, hoạt tính thay đổi không đáng kể, tăng rõ hơn ở 12-20 giờ, đạt cực đại ở 24 giờ với hoạt tính 0,038UI/ml môi trường. Sau đó hoạt tính bắt đầu giảm ở 28 giờ nhưng sự khác biệt này chưa đáng kể. 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme protease của vi khuẩn B.subtilis theo thời gian Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn B.subtilis Thời gian (giờ) OD Hoạt tính (ĐVHT/ml MT) Đối chứng 0,18 0 0 0,277 6,9 4 0,281 7,18 8 0,351 11,95 12 0,353 12,08 16 0,529 24,05 20 0,547 25,3 24 0,652 32,42 28 0,582 27,66 HVTH: Võ Thanh Trang 0 5 10 15 20 25 30 35 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h (Đ V H T/ m l M T) Đồ thị 3.4. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của B.subtilis theo thời gian Nhận xét: Hoạt tính enzyme protease tăng theo thời gian. Trong 12 giờ đầu, hoạt tính enzyme tăng không đáng kể. Đến 16 giờ, hoạt tính enzyme bắt đầu tăng mạnh và đạt cực đại ở 24 giờ với giá trị 32,42 ĐVHT/ml. Hoạt tính bắt đầu giảm sau 28 giờ. Từ 16- 24 giờ, hoạt tính thay đổi không đáng kể. Hoạt tính giảm ở giờ thứ 28. 3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của nấm Linh chi theo thời gian Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian Thời gian 0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày Hoạt tính enzyme cellulase (UI/ml) 0,024 0,277 3,3 8,3 10,9 HVTH: Võ Thanh Trang 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 Thời gian (ngày) H oạ t t ín h en zy m e (U I/m l) Đồ thị 3.5. Đường biến thiên hoạt tính enzyme cellulase của nấm sợi Linh chi theo thời gian Nhận xét: Hoạt tính enzyme tăng theo thời gian. Trong 2 ngày đầu hoạt tính này chưa thay đổi đáng kể. Từ ngày thứ 2 trở đi, hoạt tính liên tục tăng nhanh, tăng khả năng phân giải chất xơ cho cơ chất. Hoạt tính đạt cực đại ở ngày thứ 8. HVTH: Võ Thanh Trang 3.3. Kết quả chế biến sản phẩm 3.3.1. Sản phẩm từ đậu hũ 3.3.1.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis sử dụng trên cơ chất đậu hũ Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis sử dụng Tỉ lệ giống (%) Thời gian thủy phân 0,5 1 2 Đặc điểm khảo sát Chưa nhuyễn Chưa nhuyễn Khá nhuyễn Tình trạng cơ chất 16 giờ 0,76 1,133 1,187 Đạm formol (%) 3,7.1012 Lượng tế bào (CFU/g) Chưa nhuyễn Khá nhão, không đắng, béo, còn mùi đậu nành Nhão, không đắng, béo, thơm nồng Tình trạng cơ chất 20 giờ 0,824 1,19 1,273 Đạm formol (%) 3,5. 1012 4,7.1012 Lượng tế bào (CFU/g) Hơi nhão Nhuyễn, nhão, không đắng, béo, thơm nồng Nhuyễn, nhão, hơi đắng, béo, thơm nồng. Tình trạng cơ chất 24 giờ 0,962 1,28 1,291 Đạm formol (%) 4,5.1012 Lượng tế bào (CFU/g) Hơi bị sình, tạo khí Nhuyễn, nhão, đắng, mùi nồng Rất nhuyễn, nhão, béo, đắng, nồng Tình trạng cơ chất 28 giờ 1,1 1,295 1,342 Đạm formol (%) Bị sình, nồng Hơi bị sình Rất đắng Tình trạng cơ chất 32 giờ 1,16 1,365 1,394 Đạm formol (%) HVTH: Võ Thanh Trang Kết luận: + Với tỉ lệ B.S 0,5%, quá trình thủy phân lâu và dễ bị hư do nhiễm tạp nên không dùng được. + Với tỉ lệ B.S 1%, lượng tế bào thay đổi đáng kể trong khoảng 16-28 giờ. Hàm lượng đạm formol cũng tăng rõ rệt trong giai đoạn này nhưng tới 28 giờ, cơ chất bắt đầu bị đắng, mùi nồng, nên ngừng thủy phân ở 24 giờ. + Với tỉ lệ B.S 2%, mật độ tế bào tăng đáng kể trong khoảng 16-24giờ. Hàm lượng đạm formol tăng đáng kể trong giai đoạn này. Song tới 24 giờ, cơ chất bắt đầu bị đắng, mùi nồng. Nên ngừng thủy phân ở 20 giờ hoặc sớm hơn. Với tỉ lệ giống B.S 2%, quá trình thủy phân nhanh hơn khoảng 4 giờ so với tỷ lệ 1%. Tùy theo điều kiện thực tế mà cả 2 tỉ lệ này có thể được sử dụng, tất nhiên 2% tốt hơn vì càng để lâu (32 giờ) với 1% BS dễ bị sình (bị nhiễm tạp). + Tỉ lệ B.S 1% và thời gian thủy phân 24 giờ được sử dụng để chế biến sản phẩm. 3.3.1.2. Khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. đối với cơ chất đậu hũ thủy phân bằng sinh khối B.subtilis Thời gian bảo quản không bị tạp nhiễm ở 20oC ở nhiệt độ phòng Tỷ lệ giống B.subtilis (%) Tỷ lệ đường sucrose (%) Tỷ lệ giống Lactobacillus (%) Ngày Tháng Năm Ngày Tháng Năm 0 2 1 1 10 7 0 2 20 15 0 2 1 1 1 1 >1 HVTH: Võ Thanh Trang 2 >3 0 1 2 2 >1 0 1 3 2 >3 Kết luận: cơ chất đậu hũ được thủy phân bằng 1% giống B.subtilis có thể không bị tạp nhiễm trong vòng 24-30 giờ ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ dễ bị sình (tạo khí). Nếu bổ sung 1-2% Lactobacillus sp. thì thời gian bảo quản sẽ kéo dài hơn nhiều (từ 7-15 ngày). Nếu có đường sucrose (1-3%) thì khả năng bảo quản của Lactobacillus sẽ tăng rất nhiều (từ hơn 3 tháng tới hơn 3 năm). Với B.subtilis, nếu có thêm đường (1%) thì thời gian bảo quản sẽ không kéo dài hơn (1 ngày). Ở 20oC, thời gian bảo quản thường lâu hơn đáng kể khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ giống Lactobacillus để bảo quản sản phẩm là 2%, và không sử dụng đường sucrose. HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.1.3. Kết quả khảo sát các loại phụ gia và nồng độ Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các loại phụ gia và nồng độ thích hợp Loại phụ gia Nồng độ 0,4% 1% 1,5% 2% XPA Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình 0,5% 1% 1,5% 2% CMC Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình Chảy nhão, khó định hình 0,5% 1% 1,5% 2% Agar Chảy nhão, khó định hình Khối cơ chất cứng, dẻo, định hình tốt Khối cơ chất hơi cứng Khối cơ chất quá cứng, không mềm dẻo. Kết luận: nồng độ agar 1% được chọn để định hình sản phẩm HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.1.4. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai từ sinh khối nấm sợi Linh Chi. Bảng 3.8. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai (100g) từ sinh khối nấm sợi Linh chi Nhiệt độ Ngày tuổi Nhiệt độ phòng 20oC 0 giờ Cấy tơ nấm Cấy tơ nấm 1 ngày Tơ nấm bắt đầu bung rõ, xốp Tơ nấm hơi bung 4 ngày Tơ nấm bắt đầu lan nhanh Tơ nấm bắt đầu bung rõ, xốp 6 ngày Tơ nấm phủ kín các mặt trên của sản phẩm Tơ nấm bắt đầu lan nhanh 8 ngày Tơ nấm phủ kín sản phẩm hình khối Tơ nấm phủ kín phần trên của sản phẩm 11 ngày Tơ nấm phủ kín sản phẩm hình khối Nhận xét: ở nhiệt độ phòng, sinh khối tơ nấm sinh trưởng nhanh hơn đáng kể ở 20oC. Để tơ nấm phủ kín toàn bộ sản phẩm (hình khối khoảng 100g) cần khoảng 8 ngày ở nhiệt độ phòng và khoảng 11 ngày ở 20oC HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.1.5. Kết quả chế biến sản phẩm từ đậu hũ Hình 3.21. Sản phẩm 1 - phomai nấu Hình 3.22. Sản phẩm 2 - phomai Linh chi Bảng 3.9. Cảm quan sản phẩm từ đậu hũ Sản phẩm Chỉ tiêu Sản phẩm 1 Sản phẩm 2 Màu Màu vàng ngà Màu trắng Mùi Mùi thơm nồng Mùi thơm nồng, hơi hăng của nấm Vị Vị béo, không đắng, hơi chua Vị béo, đắng nhẫn của Linh chi, chua. Trạng thái Mềm, mịn, nhuyễn, không bị lợn cợn trong miệng Bề ngoài cứng do tơ Linh chi bao bọc, bên trong mềm, mịn, nhuyễn HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.2. Sản phẩm từ okara 3.3.2.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước (okara:nước) Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tỉ lệ trương nước của okara Tỉ lệ Đặc điểm 1:1 1:2 1:3 1:4 Tình trạng cơ chất Quá khô Khô, có thể định khuôn. Tuy nhiên, không dễ trong việc xử lý với enzyme celluclast sau này. Nhão, mềm, có thể định khuôn. Dễ dàng cho việc xử lý với enzyme celluclast sau này. Quá nhão Kết luận: sử dụng tỉ lệ okara:nước = 1:3 3.3.2.2. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast sử dụng Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme celluclast Tỉ lệ enzyme celluclast sử dụng Nguyên liệu 1% 2% 3% Thời gian cho enzyme hoạt động Hàm lượng cellulose (%) 1 giờ 7,2 7,02 6,78 6,65 2 giờ 7,2 6,94 6,54 6,45 3 giờ 7,2 5,73 5,15 5,02 4 giờ 7,2 5,09 4,65 4,7 5 giờ 7,2 3,87 3,7 3,61 6 giờ 7,2 3,77 3,66 3,54 Nhận xét: dưới tác dụng của enzyme celluclast, hàm lượng cellulose giảm dần theo thời gian. Kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt về hàm lượng cellulose rõ ràng HVTH: Võ Thanh Trang giữa việc sử dụng và không sử dụng enzyme. Tỷ lệ enzyme cũng góp phần vào sự khác biệt này. Tỷ lệ enzyme càng cao, thời gian enzyme hoạt động càng nhiều, hàm lượng cellulose càng giảm. Bảng 3.14 và kết quả thống kê cho thấy, hàm lượng cellulose thay đổi không đáng kể trong 1 giờ đầu tiên, sau đó liên tục giảm dần. Có sự khác biệt đáng kể giữa hàm lượng cellulose được thủy phân ở mốc 4-5 giờ. Tỉ lệ 1% enzyme thủy phân cellulose ít hơn hẳn so với tỉ lệ 2% và 3%. Tuy nhiên, tỉ lệ 2% và 3% lại không cho kết quả thủy phân khác nhau mấy. Do đó để tiết kiệm enzyme và thời gian, tỉ lệ 2% enzyme celluclast được chọn để chế biến sản phẩm và thời gian cho enzyme hoạt động là 5 giờ, lượng cellulose đã được thủy phân là 48,6%, lượng cellulose còn lại là 51,4% (3,7% so với 7,2%). 3.3.2.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis để chế biến sản phẩm Bảng 3.12. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống B.subtilis để chế biến sản phẩm từ okara Tỉ lệ giống Thời gian (%) thủy phân 1 2 3 Đặc điểm khảo sát Chưa nhuyễn, nhão, không đắng, béo, mùi thơm nồng Nhuyễn, nhão, không đắng, béo, mùi thơm nồng Bột okara chuyển sang màu sẫm tối, nhuyễn, nhão, có vị đắng, mùi thơm nồng. Tình trạng cơ chất 24 giờ 0,18 0,24 0,31 Đạm formol (%) Kết luận: với độ tin cậy là 95%, sau 24 giờ thủy phân, hàm lượng đạm formol thay đổi không đáng kể giữa tỉ lệ giống B.S 1%-2% và 2%-3%. Do đó, kết hợp với cảm quan sản phẩm, có thể sử dụng tỉ lệ giống là 2% để chế biến sản phẩm HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus sp. để bảo quản sản phẩm từ okara Bảng 3.13. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus sp. để bảo quản sản phẩm từ okara Thời gian bảo quản không bị tạp nhiễm ở 20oC ở nhiệt độ phòng Tỷ lệ giống B.subtilis (%) Tỷ lệ đường sucrose (%) Tỷ lệ giống Lactobacillus (%) Ngày Tháng Năm Ngày Tháng Năm 0 4 2 1 20 17 0 2 28 25 0 7 4 1 2 1-1,5 2 1 2 3 >3 Kết luận: tương tự sản phẩm từ đậu hũ, cơ chất okara được thủy phân bằng 2% giống B.subtilis có thể không bị tạp nhiễm trong vòng 2 ngày ở nhiệt độ phòng, sau 4 ngày dễ bị sình, có mùi hôi khó chịu. Nếu bổ sung 1-2% Lactobacillus sp. thì thời gian bảo quản sẽ kéo dài hơn nhiều (từ 17-28 ngày). Nếu có đường sucrose (1%) thì khả năng bảo quản của Lactobacillus sẽ tăng rất nhiều (có thể trên 3 tháng). Ở 20oC, thời gian bảo quản thường lâu hơn đáng kể khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ giống Lactobacillus được dùng để bảo quản sản phẩm là 1%, và không sử dụng đường sucrose. HVTH: Võ Thanh Trang 3.3.2.5. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai từ sinh khối nấm sợi Linh Chi. Bảng 3.14. Kết quả khảo sát thời gian tạo vỏ bọc cho sản phẩm phomai (100g) từ sinh khối nấm sợi Linh chi Nhiệt độ Ngày tuổi Nhiệt độ phòng 20oC 0 giờ Cấy tơ nấm Cấy tơ nấm 1 ngày Tơ nấm bắt đầu bung rõ, xốp Tơ nấm hơi bung 2 ngày Tơ nấm lan nhanh Tơ nấm bắt đầu bung, xốp 4 ngày Tơ nấm phủ kín các mặt trên của sản phẩm Tơ nấm lan nhanh, che phủ 80% diện tích mặt trên sản phẩm 7 ngày Tơ nấm phủ kín sản phẩm hình khối Tơ nấm phủ kín phần trên của sản phẩm 9 ngày Tơ nấm phủ kín sản phẩm hình khối. 3.3.2.5. Kết quả chế biến sản phẩm từ okara Hình 3.23. Sản phẩm 3 - phomai nấu Hình 3.24. Sản phẩm 4 – phomai Linh chi HVTH: Võ Thanh Trang Bảng 3.15. Cảm quan sản phẩm từ okara Sản phẩm Chỉ tiêu Sản phẩm 3 Sản phẩm 4 Màu sắc Vàng ngà Vỏ bọc nấm màu trắng, bên trong vàng sậm Mùi Thơm Thơm, hơi hăng Vị Bùi, ít béo, chua nhẹ Bùi, ít béo, đắng nhẫn của nấm Linh chi, chua Cấu trúc Mềm, nhuyễn Mềm, nhuyễn 3.4. Kết quả phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng của sản phẩm Ký hiệu sản phẩm: SP1: Sản phẩm phomai nấu từ đậu hũ SP2: Sản phẩm phomai Linh chi từ đậu hũ SP3: Sản phẩm phomai nấu từ okara SP4: Sản phẩm phomai Linh chi từ okara Ký hiệu mẫu phân tích: M0: Nguyên liệu M1: Sau khi xử lý với B.subtilis 24 giờ M2: Sản phẩm sau 7 ngày M3: Sản phẩm sau 14 ngày M4: Sản phẩm sau 21 ngày M5: Sản phẩm sau 30 ngày HVTH: Võ Thanh Trang 3.4.1. Độ ẩm (%) Bảng 3.16. Độ ẩm Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 80 81,3 75,32 73,11 69,4 67,53 SP2 80 81,3 72,91 67,82 65,9 61,17 SP3 6,8 76,7 76,65 72,33 71,2 70,13 SP4 6,8 76,7 74,52 71,28 70,14 69,58 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đ ộ ẩm (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.6. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian Nhận xét: ở sản phẩm 3 và 4, độ ẩm tăng vọt từ 6,8% lên 76,7% là do lượng nước bổ sung vào trước khi xử lý với enzyme (tỉ lệ okara:nước = 1:3), cùng với một thể tích dung dịch giống B.subtilis. Sau đó hàm ẩm ở cả 4 sản phẩm đều giảm dần theo thời gian do các hoạt động sống của vi sinh vật đều cần nước nên làm hao hụt lượng nước trong sản phẩm. Đồng thời, quá trình thuỷ phân và lên men lactic tách loại nước và một phần nước của sản phẩm bốc hơi cũng làm cho hàm ẩm của sản phẩm giảm dần. HVTH: Võ Thanh Trang 3.4.2. Hàm lượng NTS (%) Bảng 3.17. Hàm lượng NTS Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 5,3 4,6 4,1 3,83 3,18 2,19 SP2 5,3 4,6 3,84 3,57 3,1 2,24 SP3 2,8 2,1 1,57 1,34 1,26 1,03 SP4 2,8 2,1 1,63 1,4 1,32 1,14 0 1 2 3 4 5 6 M0 M1 M2 M3 M4 M5 N T S (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.7. Sự biến đổi hàm lượng NTS của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: Hàm lượng NTS của các sản phẩm giảm dần theo thời gian. Nguyên nhân là do các vi sinh vật sử dụng nitơ (N) cho hoạt động sống của chúng. Hàm lượng NTS không khác biệt đáng kể giữa hai sản phẩm có và không cấy sinh khối nấm Linh chi do nấm Linh chi ít sử dụng nguồn N cho quá trình phát triển. Chỉ tiêu NTS cũng cho thấy hàm lượng protein (x 5,7) của sản phẩm 3 và 4 tương đối thấp và thấp hơn hẳn sản phẩm 1 và 2 (khoảng từ 5 % đến 15% đối với sản phẩm 3 và 4; khoảng từ 10 % đến 30% đối với sản phẩm 1 và 2). HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.3. Hàm lượng N formol (%) Bảng 3.18. Hàm lượng Nformol Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 0,49 1,28 1,39 1,43 1,56 1,82 SP2 0,49 1,28 1,34 1,41 1,44 1,5 SP3 0,14 0,21 0,36 0,57 0,78 0,9 SP4 0,14 0,21 0,32 0,55 0,62 0,7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 M0 M1 M2 M3 M4 M5 N fo rm ol (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.8. Sự biến đổi hàm lượng Nformol của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: hàm lượng Nformol trong mẫu tăng dần theo thời gian chủ yếu do các hoạt động thủy phân protein của B.subtilis. Hàm lượng N biến đổi đáng kể sau khi nguyên liệu được thủy phân với B.subtilis, không có sự khác biệt rõ rệt về hàm lượng đạm ở các mẫu 3, 4, 5 ở cả 4 sản phẩm. Hàm lượng protein được thủy phân ở cả 4 sản phẩm là khá cao (Nformol/NTS ≈ 0,1-0,8) HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.4. Hàm lượng Namoniac (%) Bảng 3.19. Hàm lượng Namoniac Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 0,047 0,051 0,156 0,268 0,428 0,433 SP2 0,047 0,051 0,097 0,17 0,4 0,42 SP3 0,056 0,059 0,119 0,126 0,143 0,186 SP4 0,056 0,059 0,084 0,032 0,14 0,26 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 M0 M1 M2 M3 M4 M5 N am on ia c ( % ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.9. Sự biến đổi hàm lượng Namoniac của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: hàm lượng Namoniac tăng dần do các vi sinh vật chuyển hóa protein thành các acid amin và giải phóng một phần NH3. Tuy nhiên, tỉ lệ Namoniac/Nformol rất thấp (<0,5), vẫn còn trong mức cho phép, không ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng sản phẩm. HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.5. Hàm lượng đường tổng (%) Bảng 3.20. Hàm lượng đường tổng Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 1,033 0,972 0,893 0,862 0,681 0,439 SP2 1,033 0,972 0,905 0,884 0,705 0,683 SP3 2,34 2,32 2,047 1,892 1,454 1,273 SP4 2,34 2,32 2,193 2,021 1,56 1,139 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 M0 M1 M2 M3 M4 M5 H àm lư ợn g đư ờn g tổ ng (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.10. Sự biến đổi hàm lượng đường tổng của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: hàm lượng đường tổng ở các sản phẩm giảm dần theo thời gian (giảm gần ½ sau 30 ngày) do các vi sinh vật sử dụng lượng đường này cho các hoạt động sống của chúng, đặc biệt là ở sản phẩm 2 và sản phẩm 4 còn có nấm Linh chi cũng góp phần sử dụng nguồn đường này. HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.6. Hàm lượng đường khử (%) Bảng 3.21. Hàm lượng đường khử Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 0,201 0,211 0,236 0,254 0,348 0,362 SP2 0,201 0,211 0,353 0,375 0,492 0,501 SP3 0,4 0,577 0,803 0,895 0,926 0,941 SP4 0,4 0,577 0,894 0,977 1,03 1,117 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 M0 M1 M2 M3 M4 M5 H àm lư ợn g đư ờn g kh ử (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.11. Sự biến đổi hàm lượng đường khử của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: hàm lượng đường khử của các sản phẩm đều tăng theo thời gian. Điều này có thể được giải thích là do hoạt động của hệ enzyme thủy phân của vi sinh vật. Enzyme amylase của B.S phân giải tinh bột trong đậu hũ (tuy hàm lượng tinh bột trong đậu hũ rất ít) tạo đường glucose, enzyme cellulase của nấm Linh chi phân giải cellulose của okara thành đường glucose cho hoạt động sống của chúng. Đồng thời, tác dụng của enzyme thương phẩm celluclast cũng khiến cho hàm lượng đường ở sản phẩm 3 và 4 cao hơn, tăng nhiều hơn so với sản phẩm 1 và 2. Vi khuẩn Lactobacillus sp. cũng sử dụng nguồn đường này để lên men tạo acid lactic. HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.7. Hàm lượng lipid Bảng 3.22. Hàm lượng lipid Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 14,3 13,917 13,641 13,465 12,103 11,863 SP2 14,3 13,917 13,69 13,591 13,134 13,014 SP3 11,5 11,403 11,23 11,159 11,021 11,019 SP4 11,5 11,403 11,264 11,197 11,066 11,038 0 2 4 6 8 10 12 14 16 M0 M1 M2 M3 M4 M5 H àm lư ợn g lip id (% ) SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.12. Sự biến đổi hàm lượng lipid của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: hàm lượng chất béo của các sản phẩm 1 và 2 (từ đậu hũ) đều ở mức cao hơn hàm lượng béo của sản phẩm 3 và 4, do okara đã được tách béo trong quá trình chế biến các sản phẩm khác trước đó. Hàm lượng béo của cả bốn sản phẩm đều giảm theo thời gian. HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.8. Chỉ số peroxide Bảng 3.23. Chỉ số peroxide Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 SP1 0,355 0,361 0,363 0,368 0,371 0,376 SP2 0,355 0,361 0,221 0,193 0,117 0,079 SP3 0,34 0,342 0,351 0,359 0,362 0,365 SP4 0,34 0,342 0,189 0,102 0,087 0,075 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 M0 M1 M2 M3 M4 M5 C hỉ số p er ox yd e SP1 SP2 SP3 SP4 Đồ thị 3.13. Sự biến đổi chỉ số peroxide của sản phẩm theo thời gian Nhận xét: lượng chất béo bị oxy hóa rất thấp (từ 0,075 – 0,38 đơn vị), hoàn toàn nằm trong mức cho phép (< 5,0 đơn vị). Chỉ số peroxide tăng nhẹ ở các sản phẩm SP1, SP3 do chất béo bị oxy hóa. Trong khi ở SP2 và SP4, chỉ số peroxide chỉ tăng nhẹ ở M2, sau đó thì giảm dần, do nấm sợi Linh chi có khả năng chống oxy hóa rất tốt. HVTH: Võ Thanh Trang 3.9.9. Hàm lượng cellulose Bảng 3.24. Hàm lượng cellulose Sản phẩm SP4 Nguyên liệu (M0) Sau khi xử lý với celluclast (M1) Sau khi tơ nấm Linh chi phủ kín bề mặt sản phẩm (sau 7 ngày) (M2) Cellulose (%) 7,2 3,7 2,9 % giảm 48,6 59,7 Nhận xét: dưới tác dụng của enzyme celluclast thương phẩm và enzyme cellulase của nấm Linh chi, hàm lượng cellulose giảm nhiều theo thời gian. Lượng cellulose đã được thủy phân sau khi tác dụng với enzyme celluclast và enzyme cellulase của nấm Linh chi lần lượt là 48,6% và 59,7%, (3,7% so với 7,2% và 2,9% so với 7,2%). Trong đó enzyme celluclast thủy phân được 48,6% cellulose, tơ nấm Linh chi thủy phân thêm được 11,1%. Tổng lượng cellulose được thủy phân là 59,7% của nguyên liệu gốc.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf12.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf11.pdf
  • pdf13.pdf
  • pdf14.pdf
  • pdf15.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
Luận văn liên quan