Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon

................................................. 14 2.3.1. Giới thiệu về phương pháp. ................................................................................. 14 2.3.2. Nguyên liệu và phương pháp ............................................................................... 14 2.3.3. Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 15 2.4. Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết in situ (tại chỗ) và cố định Calcium Alginate ............................................................................ 18 2.4.1. Giới thiệu về phương pháp .................................................................................. 18 2.4.2. Nguyên liệu và phương pháp. .............................................................................. 19 2.4.3. Sự cố định và cảm ứng tạo Shikonin trong nuôi cấy tế bào thực vật .............. 19 2.4.4. Phương pháp phân tích ........................................................................................ 19 2.4.5. Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 20 Nhóm thực hành : Nguyễn Thị Thanh Trúc mssv 60802410 Nguyễn Thị Thủy Tiên mssv 60802210 Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 2 SHIKONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN SHIKONIN TỪ CÂY LITHOSPERMUM ERYTHRORHIZON I. Tổng quan tài liệu 1. Giới thiệu về hợp chất thứ cấp Sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật thường được hình thành với một lượng nhỏ trong cây. Chúng được biết đến như là các hợp chất thứ cấp và thường được dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm có giá trị . Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid : Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine.Một số loài thực vật có chứa nhiều alkaloid như cây thuốc phiện,canh ki na,cà độc dược,thuốc lá,khoai tây.alkaloid có thể có trong toàn cây hay chỉ tập trung ở bộ phận nào đó,như ở quả cây thuốc phiện,vỏ cây canh ki na,rễ cây và độc dược....Các hoạt tính sinh học của nó có thể tác động lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu hay bộ máy hô hấp của con người. Với liều lượng lớn alkaloid thường độc nhưng liều lượng nhỏ chúng thường làm dùng thuốc chữa bệnh. Các tinh dầu : Chứa hỗn hợp terpenoid,được sử dụng như chất mùi ,chất thơm và dung môi.Chúng không tan trong nước. Các glycoside: Bao gồm các hợp chât phenol và flavonoid,saponin,và các cyanogenic glycoside,một số dùng làm thuốc nhuộm,chất mùi thực phẩm và dược phẩm. 2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật Kỹ thuật này là tiềm năng để thu được các hợp chất có giá trị mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 3 tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy . Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001). Nuôi cấy tế bào huyền phù : Thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994). Nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) : Có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng. 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Với sự tiến bộ không ngừng của ngành công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế bào thực vật đã giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và thu nhận được nhiều hợp chất thứ cấp quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp .Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Mục tiêu của kỹ thuật nuôi cấy tế bào :cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 4 sinh học Ưu điểm :có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: F Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng; F Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng) F Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau F Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy tế bào F Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp F Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, F Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các sản phẩm tích lũy có trong tế bào có thể cao hơn khi ta tối ưu các điều kiện nuôi cấy.Nên việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đã được nghiên cứu nhiều như các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 5 Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi ấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). 4. Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp @ Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có ác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác @ Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu ản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 6 chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. @ Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày.Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. @ Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 7 @ Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcoholvà b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. II. Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon 1. Giới thiệu Shikonin Shikonin,được biết đến như một chất kháng khuẩn,chống viêm,chữa lành vết thương và khối u hoạt động,nó trở thành cây thuốc đầu tiên được sản xuất với quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.Shikonin có trong rễ của cây Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 8 Lithospermum erythrorhizon. Cây này trồng 5-7 năm, chiết rễ lấy được 1-2% chất khô, giá 1 kg là 4.500 USD. Nhu cầu tiêu thụ shikonin cao. Ở Nhật Bản phải nhập thêm của Trung Quốc, Triều Tiên. Một đoạn rễ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để làm bài thuốc nhân gian và ngày nay được sử dụng làm thuốc mỡ chữa bỏng.Nó có công thức cấu tạo như sau: Chuỗi phản ứng tổng hợp một dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao từ shikonin Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạchtới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin. Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 2.1.Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ Những vấn đề tồn tại trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ. Cơ sở khoa học của giải pháp : Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 9 Việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh trưởng của rễ hoạt động.Rễ tơ có thể được nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật và có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp với một sản lượng lớn hơn khi không chuyển plasmid Ri. Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng rất ổn định về di truyền, sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm trong đó đáng kể là khả năng tránh nhiễm khuẩn. Các công ty Nhật Bản đã sử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn. Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể sản xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng. Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn gốc thực vật đang được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ. Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư. Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng hợp để thu được một chất có cấu trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải. Công ty dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 10 Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system) nhằm chứng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6 ngăn (six-well polystyrene plates) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc 120 vòng/phút). Merkli và cs. (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất-McCown’s woody plant medium có 1% sucrose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Sevón và cs. (1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34 cây riêng rẽ đã trưởng thành. Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin, và điều đáng kể là đã tìm thấy các biến dị dòng soma trong các cây này. Tuy nhiên, sự có mặt của các gen rol (A, B và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ. Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion ( -3NO , -24SO , - 42POH , K +, Ca2+ và Mg2+) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine. Nồng độ -3NO và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao nhất khi -24SO và K+ cao. 2.2.Vi khuẩn Agrobacterium và cơ chế gây nhiễm của chúng trên thực vật. Agrobacterium là một loại vi khuẩn đất ,hiện nay đang được dùng rất nhiều trong trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp.Các plasmid của Agrobacterium có thể được sử dụng chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật hoặc dùng như một Báo cáo môn công nghệ tế bào phương tiện trung gian đ pháp sử dụng Agrobacterium đ cấp thu được. Gồm các loài Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens này có ở họ Rhizobiaceae có kh dài vào khoảng 120 bắt nguồn từ chữ Agrobacterium rhizogenes (hairy root) và g inducing tức là sinh r Cơ chế gây nhiễm trên th Trên plasmid Ti của vi khu ADN. Vùng này có kích thư tổng hợp auxin,cytokinine,opine giới hạn hai bên bằng b việc tái sinh plasmid,cho kh tiêu hóa opine. Vùng vir là vùng ADN ph động của các gene nằm trong vùng vir đư chất phenol tiết ra từ v GVHD :Lê Th ể chuyển gen khác vào trong tế bào th ã làm tăng một cách đáng kể các h tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn đất gram âm, hình que. Vi khu ả năng gây u ở thực vật. Plasmid c -150 kb, có tính chất gây u nên gọi là plasmid Ti. Ti đầu của tumer inducing. mang plasmid có khả năng gây b ọi là plasmid Ri. Ri bắt nguồn từ chữ ễ. Kích thước plasmid này tương tự plasmid Ti. ực vật của Agrobacterium tumerfaciens ẩn Agrobacterium tumefaciens có ch ớc khoảng 25kb ,có chứa gen mã hóa cho s , và các gen gây khối u (oncogene). Nó đư ở phải và trái.Ngoài ra còn có vùng ADN mã hóa c ả năng lây nhiễm (vùng vir),chuyển n ụ trách khả năng lây nhiễm.Các sản phẩ ợc tác động kích thích c ết thương là một loại protein đặc biệt như vir E ị Thủy Tiên Trang 11 ực vật.Phương ợp chất thứ ẩn ủa nó ệnh rễ tóc đầu của root ứa vùng T- ự sinh ợc ho ạp,cho việc m phẩm hoạt ủa các hợp 2, vir B, Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 12 vir D, vir D2, vir C1….Protein này có nhiệm vụ bảo vệ vùng ADN này để nó tiếp cận với hệ gen vật chủ an toàn bằng cách nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây 2 lá mầm), kích thích sinh sản ra các đoạn T- DNA bao bọc che chở các đoạn DNA này. Các Agrobacterium có đặc tính sẵn có trong tự nhiên là chuyển được gene của chúng vào cây cối thông qua một phần T-DNA của plasmid Ti hoặc Ri. Chính T-DNA của vi khuẩn được gắn vào bộ gene của thực vật sẽ làm xuất hiện khối u hoặc rễ tóc vì chúng chứa oncogene. Nhưng nếu phần T-DNA bị cắt thì plasmid Ti này vẫn giữ nguyên khả năng chuyển gene lạ vào thực vật. Do đó, plasmid Ti hiện nay trở thành một công cụ sắc bén theo đặc tính gây u vào các cây trồng. Các bước tiến hành để chuyển gen lạ vào tế bào thực vật sử dung plasmid Ti F Tách plasmid Ti từ vi khuẩn A. tumefaciens F Cắt bỏ phần T-DNA của plasmid đi F Chuẩn bị gene lạ chứa di truyền mong muốn, chẳng hạn gene độc tố của Bacillus thuringiensis để tiêu diệt sâu bọ hại cây trồng. F Chuẩn bị gene đánh dấu để theo dõi việc chuyển gene lạ vào thực vật có thành công hay không? Chẳng hạn, gene mã hóa cho một enzyme có phản ứng màu mà ở thực vật ít có như gene mã hóa enzyme - glucuronidase gọi tắt là GUS-A tạo ra màu xanh da trời đặc trưng với cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, -galactopyranoside được kí hiệu là X-gluc. Đôi khi người ta sử dụng khả năng đánh dấu của gene mã hóa luciferase - một enzyme của Đom đóm phát sáng trong tối ở các mô được chuyển gene. Cũng có khi sử dụng những gene kháng kháng sinh kanamycine - một chất ức chế sinh trưởng thực vật. F Gắn gene lạ và gene đánh dấu vào plasmid Ti thay thế vào chỗ T- DNA đã bị cắt bỏ rồi đưa vào vi khuẩn Agrobacterium. F Chuẩn bị tế bào vật chủ tiếp nhận vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmid có gene lạ như chuẩn bị các protoplast từ các thể mô, các đĩa lá. F Nuôi cấy chung vật chủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid Ti gắn gene lạ một thời gian vài ngày ở nhiệt độ ánh sáng thích hợp. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 13 F Loại bỏ vi khuẩn bằng dùng các kháng sinh đặc hiệu như carbenicilline. F Chuyển nguyên liệu thực vật vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tế bào và mô để tái sinh có thêm những chất kích thích sinh trưởng như 2,4 D, auxin khác v.v. F Cây tái sinh được nuôi trong vườn ươm và cuối cùng trồng ra đất. F Theo dõi các đặc tính của gene lạ biểu hiện ở cây trồng. Cần chú ý: - Cây được biến đổi di truyền cần phải được trồng trong vài vụ; - Cây chủ của vi khuẩn Agrobacterium có thể làm hạn chế sự biến đổi trong nhiều vụ thu hoạch. Sơ đồ khái quát Cơ chế gây nhiễm trên thực vật của Agrobacterium rhizogenes Cơ chế hoàn toàn tương tự như Agrobacterium tumefaciens chỉ khác ở chỗ trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gene sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tóc khi bị nhiễm bệnh. Plasmid Ti Cắt bỏ T-ADN Gen cần chuyển vào có gắn gen đánh dấu Agrobacterium Vật chủ Thay vào T-ADN Nuôi cấy chung Loại bỏ vi khuẩn Nuôi cấy Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 14 2.3. Thu nhận hợp chất shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon được gây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes . 2.3.1. Giới thiệu về phương pháp. Như đã giới thiệu,Shikonin là hợp chất thứ cấp đầu tiên được thu nhận với quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào rễ tơ của cây Lithospermum erythrorhizon. Để đưa shikonin vào sản xuất với quy mô công nghiệp,các nhà khoa học Nhật bản đã nghiên cứu và tạo ra dòng tế bào có khả năng tăng hàm lượng shikonin lên nhiều lần. Trong bài báo được trên Plant Molecular Biology 39: 683–693, 1999, Susanne Sommer, Annegret Köhle1, Kazufumi Yazaki, Koichiro Shimomura3, Andreas Bechthold1 and Lutz Heide đã đưa ra một phương pháp nhằm tăng lượng shikonin thu được bằng cách gây nhiễm quá trình nuôi cấy tế bào cây Lithospermum erythrorhizon với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm nhờ vi khuẩn này đưa vào tế bào của cây gen UbiC của Escherichia coli (Genetic engineering of shikonin biosynthesis hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon transformed with the bacterial ubiC gene ) 2.3.2. Nguyên liệu và phương pháp Hóa chất F Chorismate được mua dạng muối bari từ Sigma,Deisenhofen,Đức và acid shikimic được tổng hợp như miêu tả (2). 2-Aminoindan-2-phosphonic acid (AIP) nhận được từ N. Amrhein, ETH Zürich, Switzerland. Vi khuẩn,plasmids,cây,lông rễ nuôi cấy và môi trường F Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15834 có nguồn gốc ATCC. F Cấu trúc các vector nhị phân p35S-TP ubiC và TOP-TPUbiC được mô tả bởi Siebert et al và Sommer et al.pTOP được đăng ký trong cơ sở dữ liệu dưới mã số Z37515 và mô tả bởi Gatz et al.pROK1 theo thuật ngữ của Siebert et al và Sommer et al gọi là p35S. F Chồi non của Lithospermum erythrorhizon được nuôi cấy như mô tả trong Shimomura et al. ,và sử dụng cho sự chuyển đổi gen. F Lông rễ Lithospermum erythrorhizon được nuôi cấy trong môi trường MSV hoặc M-9,môi trường dùng nuôi cấy để thu nhận shikonin . F Thành phần môi trường MSV : 4.46g muối MS 30g đường 100mg inositol 0.1mg thiamine –HCl 0.5mg pyridoxine-HCl 0.5ma nicotin acid và 2mg glycine. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 15 Môi trường được điều chỉnh tới pH 6.2-6.5 trước hấp tiệt trùng.Môi trường rắn thêm vào 10g/l agar Bacto. Việc nuôi cấy được duy trì trong tối tại 25oC,tốc độ lắc của nuôi cấy huyền phù là 50 vòng/phút. Phương thức chuyển gen F Agrobacterium rhizogenes được chuyển đổi bằng phương pháp làm tan đông. F Nuôi cấy chồi non của Lithospermum erythrorhizon được chuyển đổi nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes theo Shimomura et al. (Có nghĩa nuôi cấy tế bào Lithospermum erythrorhizon chung với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để gây nhiễm ,gen từ vi khuẩn chuyển vào tế bào làm phát sinh rễ tơ theo cơ chế như trình bày phần vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ) F Sau khi rễ tơ phát triển,lấy các chóp rễ và duy trì trong môi trường rắn MSV,bổ sung 1g/l Carbenicilin để loại bỏ bi khuẩn. F Các cá thể chóp rễ được tách ra và chuyển sang môi trường tương tự,có thêm có thêm 100mg/l kanamycin (dòng 35S-TP ubiC ) hoặc 15mg/l hygmomycin (dòng TOP-TpubiC ).Chóp rễ nuôi cấy phát triển trong bóng tối ở 250C trong 4 tuần và kết quả của quá trình chuyển đổi này là dòng kháng kháng khuẩn được xác nhận bởi PCR.Môi trường nuôi cấy được duy trì dưới áp lực liên tục trong điều kiện có các kháng khuẩn. F Chóp rễ nuôi cấy trong môi trường agar được chuyển qua môi trường lỏng và cấy chuyền thường xuyên 2-3 tuần một lần trong bình chứa loại 300ml có chứa trung bình 75ml môi trường.Rễ này được nuôi cấy trong phòng tối ở 25 oC và tốc độ lắc 50 vòng /phút. F Dòng kháng kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin được lựa chọn để nhận biết sự hiện diện của gen UbiC. 2.3.3. Kết quả và thảo luận Sau hai đến 3 tuần gây nhiễm,rễ tơ bắt đầu xuất hiện ,chúng được tách và cấy vào môi trường có chứa carbenicillin cho loại bỏ các vi khuẩn. Mặc dù xử lý bằng carbenicillin gây ra sự hình thành mô sẹo nhưng rễ tơ sẽ được phục hồi từ mô sẹo sau khi chuyển đến môi trường không có carbenicillin. Lông rễ (rễ tơ )phát triển là do các T-DNA của plasmid Ri của A. rhizogenes 15834. Biểu hiện của gen UbiC trong nuôi cấy lông rễ Gen UbiC có thể được nhận biết trong nuôi cấy lông rễ kháng kháng khuẩn bằng phương pháp PCR với một đoạn gen mồi đặc biệt. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 16 Kĩ thuật Southern hybridization, với ubiC là một đoạn thăm dò, cho thấy sự tiếp hợp của gen ubiC vào DNA (hình 2) và cho phép để ước tính số lượng bản sao gene đã được tiếp hợp Rễ tơ tăng trưởng là do các T-DNA của plasmid Ri của A. rhizogenes 15834. Biểu hiện của gen UbiC trong nuôi cấy lông rễ Gen UbiC được nhận thấy trong nuôi cấy lông rễ nhờ gen kháng kháng sinh. Kĩ thuật Southern hybridization, với ubiC là một đoạn thăm dò, cho thấy sự tiếp hợp của gen ubiC vào DNA (hình 2) và cho phép để ước tính số lượng bản sao gene đã được tiếp hợp. Phiên mã và dịch mã các gen ubiC dẫn đến sự hình thành các CPL hoạt động có thể được phát hiện trong chất chiết xuất cell-free. Đóng góp của phản ứng CPL đến 4HB glucoside trong Lithospermum erythrorhizon Tạm dừng nuôi cấy các mẫu L. erythrorhizon trong môi trường sản xuất Shikonin M9. Tuy nhiên, với sự hiện diện các ion amoni (ví dụ: trong MS hoặc môi trường MSV) hoặc dưới sự chiếu xạ với ánh sáng sự hình thành shikonin bị ức chế và glucose 4HB bị tích tụ. Cùng một hiện tượng được theo dõi trong nuôi cấy rễ tơ trong nghiên cứu. Nuôi cấy rễ tơ phát triển trong môi trường M9 ,tuy nhiên, vẫn còn tích tụ một số 4HB glucoside ngoài shikonin. Để cung cấp bằng chứng rõ ràng rằng phản ứng CPL đã đưa ra góp phần vào việc sự hình thành các 4HB trong nuôi cấy L.erythrorhizon đã được chuyển gen ubiC, thử nghiệm với axít [1,7-13C2] shikimic đã được thực hiện. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 17 Hai con đường có thể sinh tổng hợp 4HB, thông qua các hợp chất phenylpropanoid hoặc thông qua các phản ứng CPL khác nhau các nhóm cacboxyl trong shikimate. Sự biểu hiện của các gen ubiC trong nuôi cấy lông rễ của L .erythrorhizon giống như mong muốn đã dẫn đến sự hình thành của 4HB trong plastid. Ngược lại, vị trí gốc của 4HB và sự hình thành shikonin trong trao đổi chất thứ cấp của L. Erythrorhizon là tế bào chất và các lưới nội chất và glucozit 4HB được tích lũy trong các không bào. Việc đưa CPL-dẫn xuất từ 4HB thành 4HB glucozit và shikonin được vận chuyển bằng cách khuếch tán qua màng plastid hoặc bằng một phương tiện vận chuyển. Bản chất của quá trình vận chuyển này vẫn còn đang được làm rõ. Biến đổi của L. erythrorhizon với ubiC đã không làm thay đổi hoạt động của quá trình trao đổi chất thứ cấp.Ví dụ tác dụng ức chế của các ion amoni hoặc của ánh sáng trên sự sinh tổng hợp shikonin cho thấy những ảnh hưởng này không tác động nhiều vào các phenylpropanoid. Phản ứng của CPL vừa được giới thiệu đóng góp khoảng một phần năm trong toàn bộ quá trình sinh tổng hợp các dẫn xuất của 4HB trong nuôi cấy biến đổi gen,được thể hiện trong thí nghiệm. Khi các con đường có nguồn gốc là 4HB bị chặn bởi một trong các chất ức chế,dòng trao đổi chất thông qua phản ứng CPL đã dẫn đến những tích lũy làm thay đổi. 75% của sự tích tụ glucozit 4HB quan sát được khi không có mặt của các chất ức chế. Điều này cho thấy sự gia tăng các dòng trao đổi chất thông qua các phản ứng CPL khi các con đường có nguồn gốc 4HB bị chặn, nhưng cũng có thể được giải thích bởi sự giảmcác quá trình dị hóa của 4HB glucozit. Việc chuyển đổi với ubiC không gia tăng shikonin hình thành trong môi trường M9 .Theo thí nghiệm trước đây cho thấy 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA reductase(HMG-CoA-reductase) và 4HB geranyltransferase có tầm quan trọng trung tâm đối với cơ chế sinh tổng hợp shikonin. Sự gia tăng trong thu nhận shikonin có thể không đạt được nhờ một enzyme duy nhất mà cần sự phối hợp đồng thời của một số hoạt động, chẳng hạn như CPL,HMG-CoA reductase và geranyltransferase 4HB. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 18 2.4. Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết in situ (tại chỗ) và cố định Calcium Alginate 2.4.1. Giới thiệu về phương pháp Nuôi cấy tế bào thực vật từ Lithospermum erythrorhizon được thực hiện để sản xuất shikonin bằng phương pháp tách chiết in situ và cố định tế bào nuôi cấy bằng hạt calcium alginate trong bình lắc.Việc cố định tế bào giúp tăng cường sản xuất và phục hồi shikonin. Thu nhận shikonin bằng n-hexadecane và cố định tế bào bằng calcium alginate đã cho năng suất sản phẩm cao hơn 2.5 lần so với cách thủ công ban đầu.Nuôi cấy tế bào được cố định bằng hạt calcium alginate ,thêm n-hexandecane vào trước ngày thứ 15 sẽ làm tăng hiệu quả sản xuất shikonin nhưng nếu thêm sau ngày thứ 15 nó lại làm hiệu suất. Nuôi cấy huyền phù thì sự đơn giản và hiệu quả hơn tách chiết từ thực vật tự nhiên.Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là tế bào thực vật chậm phát triển và sản phẩm nồng độ thấp kết quả là năng suất phản ứng cũng thấp. Hơn nữa chúng rất nhạy cảm nên làm quá trình nuôi cấy gặp khó khăn. Để giải quyết vấn đề này người ta đã sử dụng phương pháp cố định tế bào. Ưu điểm của phương pháp là nồng độ tế bào cao hơn,loại bỏ được sự rửa trôi bởi tế bào thực vật đã bị nhốt trong gel chỉ có cơ chất có phân tử lượng nhỏ vào và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra khỏi mạng lưới gel,hơn nữa ta có thể tái sử dụng các tế bào trong một hệ thống liên tục. Và quan trọng là nó giúp bao bọc tránh sự tổn thương cho các tế bào nuôi cấy.Do đó hiệu quả thu nhận sản phẩm bậc hai cũng cao hơn. Tế bào thực vật có thể được cố định trong alginate,carrageenan, polyacrylamide, agarose, bọt polyurethane, và sợi rỗng. Shikonin được nuôi cấy trong môi trường M-9.Môi trường này là tối ưu cho sản xuất shikonin bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù. Bởi các thành phần shikonin có thể ức chế sự tăng trưởng tế bào và sự sản xuất shikonin bằng cách gây nhiễu với sự cung cấp oxi,chất dinh dưỡng hoặc cả hai.Việc tìm ra n-hexadecane để cung cấp cho nuôi cấy tế bào tự do là kết quả tốt nhất. Khoảng 81% các dẫn xuất của shikonin đã bị loại ra trong dung môi,sản lượng tế bào và tổng sản phẩm shikonin đạt 90 và 100%. Dong Jin Kim and Ho Nam Chang đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của sự cố định tế bào ,sự tách chiết in situ,nồng độ hạt cố định lên việc sản xuất shikonin và tìm kiếm sự gia tăng ý nghĩa thống kê trong việc sản xuất shikonin Các dòng tế bào L. erythrorhizon KCTC PCL 52001, được sử dụng trong nghiên cứu này được dùng sản xuất sắc tố naphtoquinone (các dẫn xuất của shikonin) trong môi trường M-9, nhưng nồng độ cuối cùng của sản phẩm thấp hơn so với L. erythrorhizon (Boraginaceae). Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 19 2.4.2. Nguyên liệu và phương pháp. Môi trường nuôi cấy tế bào : F Môi trường SH có bổ sung 30g/l sucrose, 10-5 p-chlorophenoxyacetic acid (pCPA),và 10-6 kinetin. F pH được điều chỉnh tới 5.8 trước khi hấp tiệt trùng. F Tất cả các thí nghiệm đã được tiến hành trong bóng tối ở bình Erlenmeyer 250ml phủ lá nhôm ở 25°C Tốc độ lắc ở 100 vòng / phút. Được duy trì sự tăng trưởng trong trung bình khoảng 50ml môi trường. 2.4.3. Sự cố định và cảm ứng tạo Shikonin trong nuôi cấy tế bào thực vật F Nuôi cấy 60ml huyền phù cho đến pha ổn định thì thu nhận và dùng nước cất rửa sạch F Chuyển qua môi trường M-9.Môi trường này là tối ưu cho sự tổng hợp Shikonin. F Để cố định tế bào thì trong môi trường M-9 có huyền phù vừa chuyển qua.Tương ứng cứ 60ml môi trường M-9 cho vào 0.9g alginate natri.Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri và huyền phù tế bào vào bình 300ml có chứa CaCl 0.1M.Phản ứng xảy ra các hạt ngay tức thời tạo thành các hạt hình cầu có đường kính trung bình 4.5ml.Như vậy các tế bào sống đã được bao bọc bên trong lớp Calcium alginate. Giữ các hạt trong dung dịch khoảng 1h để đảm bảo lượng kết tủa là phù hợp. F Rửa sạch các hạt bằng nước cất và để sử dụng vào thí nghiệm F Thêm n-hexadecane vào bình môi trường M-9 để đem nuôi cấy tế bào phục vụ cho việc tách chiết in situ. 2.4.4. Phương pháp phân tích F Nồng độ đường sucrose trong môi trường nuôi cấy xác định bởi phương pháp DNS với đo độ hấp thụ bằng quang phổ tại 550 nm. F Shikonins tinh khiết từ tế bào và từ môi trường nuôi cấy tế bào được chiết xuất bởi CH-Cl3 trong 3 giờ với sự khuấy trộn liên tục.Để đo lượng Shikonin hòa tan trong CHCl3,cho 5ml KOH 2.5% vào ống nghiệm có chứa 1ml môi trường chứa shikonin và lắc trong vòng 10 phút F Trong môi trường có chứa n-hexadecane ,cho vào 2ml CHCl và ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút.Đem đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 622nm F Tập trung các huyền phù bằng phương pháp ly tâm.Huyền phù có chứa các tế bào được cho vào ống ly tâm. Ly tâm 3 lần và đặt yên ở nhiệt độ 700C và sau đó đo trọng lượng khô F Xác định nồng độ của các tế bào được cố định ,các hạt Calcium alginate được hòa tan trong đệm Citrat 0.2M (pH 5.0) ,22ml NaOH 2M, 10ml acid citric 2M, 60ml nước cất 68 ml và lắc trong 30 phút ở 30 ° C. Sản phẩm thu được đã được rửa sạch với nước cất, ly tâm ba lần, sấy khô, và cân nặng. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 20 F Các tỷ lệ hấp thu dưỡng khí cụ thể của L. erythrorhizon tại M-9 được đo bằng cách sử dụng một mô hình YSI 58 giải thể oxy điện cực trong một bình thủy tinh. Các bình chứa 60 mL M-9 bão hòa không khí cùng với 20 ml huyền phù các tế bào trưởng thành trong 10 ngày. Thay đổi trong nồng độ oxy trong bình được giám sát để đánh giá tỷ lệ hấp thu oxy của dịch treo tế bào 2.4.5. Kết quả và thảo luận Ảnh hưởng của việc tách chiết in situ lên việc sản xuất shikonin trong nuôi cấy huyền phù Để kiểm tra hiệu quả của quá trình,những lượng khác nhau của n-hexadecane (10,20,30 mL) đã được thêm vào bình 250ml có chứa 50ml môi trường M-9 ,trong đó có chứa các tế bào phát triển được 10 ngày trong môi trường SH. Sau đó chúng được nuôi cấy trong 14 ngày để tạo ra shikonin. Kết quả thể hiện trong hình 1 Hầu hết shikonin thu được (Hơn 95%) đã được hòa tan trong lớp n-hexadecane.Tỷ lệ thu nhận Shikonin tăng nhanh trong thời gian đầu của sáu ngày. Thời gian thu nhận shikonin mà không có n-hexadecane cho một kết quả khác. Nếu không có cảm ứng n-hexadecane thời gian cần thiết để sản xuất shikonin khoảng bảy ngày, và tổng lượng shikonin là nhỏ hơn nhiều Ở khoảng thời gian thu nhận được 20 mL shikonin khi có n –hexadecane thì cao gấp 7,4 lần so với khi không có n-hexadecane Hình 1:Ảnh hưởng của số ngày nuôi cấy lên sự thu nhận shikonin Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 21 Các chất hóa học tổng hợp hormone tăng trưởng (pCPA) được sử dụng trong SH vừa tốt cho sự tăng trưởng tế bào, nhưng nó cũng ức chế tạo thành shikonin Các pCPA được sử dụng trong thí nghiệm này là tương đối không tan trong nước, nhưng nó là dễ dàng hòa tan trong các chất kỵ nước như n-hexadecane Trước tiên, sự ức chế ngược quy định có thể hạn chế sự tổng hợp shikonin. Lớp dung môi loại bỏ shikonin từ lớp dịch nước có chứa các tế bào, và điều này có thể làm giảm tác dụng ức chế ngược. Khi nồng độ shikonin của lớp dung dịch nước giảm, gradient nồng độ shikonin tăng. Thứ hai, các dung môi có thể trích xuất các chất ức chế kị nước không đặc hiệu của trao đổi chất thứ cấp như pcPA, như nhận xét ở trên. Cuối cùng, shikonin được loại bỏ khỏi các tế bào tránh sự xuống cấp của shikonins trong nuôi cấy huyền phù mà không có sự gia tăng dung môi hữu cơ với thời gian nuôi cấy ngày càng tăng. Sản xuất tổng shikonin là độc lập với khối lượng dung môi và shikonin sản xuất chỉ được giới hạn bởi hoạt động của tế bào Ảnh hưởng của việc cố định tế bào trong hạt Calcium Alginate Calcium alginate cố định các tế bào cấy vào 50 ml M-9 thành một khối tế bào có trọng lượng khô khoảng 2,2 g / L, trong khi huyền phù nuôi cấy có khoảng 4 g tế bào khô / L. Cố định trong hạt calcium alginate cho tổng lượng shikonin tăng 1.7 và 2,5 lần . Trong nuôi cấy huyền phù chỉ 3,7% của tổng số shikonin sản xuất đã được hòa tan trong môi trường, trong khi ở các tế bào cố định calcium alginate 62% của tổng số shikonin sản xuất đã được hòa tan vào môi trường. Do đó, tế bào cố định tăng sản lượng shikonin so với phương pháp nuôi cấy tế bào tự do. Để nghiên cứu những tác động của dịch chiết tại chỗ bởi n-hexadecane và cố định alginate calcium, đo thời gian các thí nghiệm về sản lượng shikoni và lượng sucrose tiêu thụ (Hình 2) Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 22 . Hình 2:Ảnh hưởng của số ngày nuôi cấy lên sự thu nhận shikonin Tế bào đã được cố định được đưa vào 50ml môi trường M-9 chứa trong Erlen 250 ml với nồng tế bào khô là 2,4 g/l và 20ml n-hexadecane đã được hấp khử trùng Thí nghiệm được thực hiện trong 31 ngày và nồng độ tối đa đạt 71,9 shikonin mg / L. cao hơn 3,6 tới 27 lần so với nuôi cấy tế bào tự do và không có n-hexdecane Lượng sucrose tiêu hao cho thấy các tế bào cố định duy trì sự trao đổi chất của chúng nhiều hơn 31 ngày. Kể từ khi tế bào cố định được nuôi cấy tiêu thụ sucrose nhiều hơn so với các tế bào cố định mà không có dung môi .Kết quả này cho thấy rằng trong dịch chiết tại chỗ tăng cường hoạt động trao đổi chất của tế bào, dẫn đến nâng cao của sản lượng shikonin Trong cố định tế bào bằng calcium alginate thời gian cần thiết để thu nhận shikonin tối đa dài hơn so với tế bào tự do. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 23 Hầu hết các shikonin đã được phóng thích trong các lớp dung môi cả trong nuôi cấy cố định tế bào và nuôi cấy tự do. Chỉ có shikonin hòa tan trong lớp dung môi được sử dụng để tính toán shikonin sản xuất trong trường hợp sau. Ảnh hưởng của nồng độ canxi Alginate Nghiên cứu những ảnh hưởng của nồng độ calcium alginate bằng cách chuyển shikonin 190.417, và 600 50 ml M-9 trong bình 250 mL và sau đó thêm 20 ml n- hexadecane. Hình 5 cho thấy ảnh hưởng của thời gian cho việc thu nhận shikonin và tiêu thụ sucrose ứng với ba nồng độ hạt. Các chỉ số về sản xuất và tiêu thụ shikonin sucrose không thay đổi đáng kể với nồng độ hạt, và chúng không tăng tỉ lệ thuận với nồng độ hạt. Điều đó có thể là do nồng độ tế bào cao với các điều kiện khác thực nghiệm là như nhau. Các nồng độ tế bào cao hơn đòi hỏi nhiều chất dinh dưỡng và nồng độ oxy hòa tan. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan lên quá trình thu nhận shikonin Ảnh hưởng của nồng độ oxy trên hoạt động trao đổi chất Trong nuôi cấy tế bào thực vật, các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa chất dinh dưỡng và hormone tăng trưởng là: nồng độ, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy. Ảnh hưởng của tốc độ truyền oxy vào Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 24 quá trình thu nhận shikonin đã được nghiên cứu bởi nuôi cấy huyền phù L.erythrorhizon. Đo tỷ lệ hấp thụ oxy cụ thể tại các nồng độ oxy hòa tan khác nhau của huyền phù L. erythrorhizon trong môi trường M-9 sự thay đổi nồng độ oxy hòa tan được đo nhờ sử dụng một điện cực oxy hòa tan. Có khả năng trao đổi chất cũng bị hạn chế ở nồng độ oxy hòa tan thấp như trong quá trình tổng hợp shikonin. Nếu điều kiện môi trường là như nhau, nồng độ hạt cao hơn sẽ thu nhận được nhìu shikonin hơn vì mỗi hạt calcium alginate hạt cố định tế bào có cùng đặc điểm và các tế bào trong một hạt độc lập với các hạt khác.Sự hấp thụ oxy cụ thể sẽ bị hạn chế hơn trong hạt có nồng độ cao hơn vì nhu cầu oxy cao hơn. Thiếu oxy có thể xảy ra trong nuôi cấy khi nồng độ hạt cao và nó có thể dẫn đếnhoạt động trao đổi chất của tế bào giảm .Nồng độ oxy hòa tan có ý nghĩa quan trọng ảnh hưởng đến sản lượng shikonin và sự trao đổi chất của tế bào thực vật,cung cấp đủ dưỡng khí cần thiết để thu nhận shikonin hiệu quả. Các tài liệu tham khảo : Sách Công Nghệ Tế Bào Tác giả Nguyễn Đức Lượng,Nguyễn Thị Thủy Tiên,NXB ĐHQG TPHCM. Các bài báo Enhanced Shikonin Production from Lithospermum erythrorhizon by In Situ Extraction and Calcium Alginate - Immobilization Dong Jin Kim and Ho Nam Chang Department of Chemical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, FO. Box 131, Dongdaemun, Seoul, Korea Accepted for publication February 5, 1990 Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết tại chỗ và cố định Calcium Alginate Dong Jin Kim và Chang Nam Hồ * Bộ môn Kỹ thuật hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ nâng cao, FO. Box 131, Dongdaemun, Seoul, Hàn Quốc Được xuất bản 05 tháng hai năm 1999. Và Genetic engineering of shikonin biosynthesis hairy root cultures ofLithospermum erythrorhizon transformed with the bacterial ubiC gene Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 25 Susanne Sommer, Annegret Köhle1, Kazufumi Yazaki, Koichiro Shimomura3, Andreas Bechthold1 and Lutz Heide. Kỹ thuật di truyền của sự tổng hợp shikonin từ rễ tơ của cây Lithospermum erythrorhizon được chuyển gen UbiC vi khuẩn. Susanne Sommer, Annegret Köhle1, Kazufumi Yazaki, Koichiro Shimomura3, Andreas Bechthold1 and Lutz Heide Trong bài báo được trên Plant Molecular Biology 39: 683–693, 1999,