Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α

MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt .vii Danh sách các hình viii Danh sách các bảng, biểu đồ và sơ đồ .x PHẦN 1. MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt Vấn Đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài .2 1.3 Nội dung thực hiện 2 1.3.1 Phần 1 2 1.3.2 Phần 2 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU 3 2.1 Hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn .3 2.1.1 Hiện tượng biến nạp 3 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 3 2.1.2.1 Vai trò .3 2.1.2.2 Ứng dụng 3 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tượng biến nạp 4 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly .5 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. .5 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly .5 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp 7 2.3.3.1 Phương pháp vật lý .7 2.3.3.2 Phương pháp hoá học .7 2.3.4 Phương pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp .8 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid .9 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR 10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .10 2.3.7 Điện di DNA .14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA 14 2.4.1 Plasmid 15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút .16 2.5 Các enzym được sử dụng cho biến nạp DNA 16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn .16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) .19 2.5.2.2 Terminal transferase .19 2.5.2.3 Các DNase 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. 20 2.5.4 Các enzym nối DNA .20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase .20 2.5.3.2 T4 DNA lygase .21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội .21 2.6.1 Với plasmid .21 2.6.2 Với DNA phage 21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận 21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp 23 3.2 Vật lyệu và phương pháp dùng trong thí nghiệm 23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α .23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) 23 3.2.1.3 Đoạn DNA 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm .24 3.2.3 Các thiết bị máy móc 24 3.2.4 Các loại môi trương nuôi cấy vi khuẩn .24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm 25 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR 10 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR .10 2.3.7 Điện di DNA .14 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA 14 2.4.1 Plasmid 15 2.4.2 Nhiễm sắc thể virút .16 2.5 Các enzym được sử dụng cho biến nạp DNA 16 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn .16 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 19 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) .19 2.5.2.2 Terminal transferase .19 2.5.2.3 Các DNase 20 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. 20 2.5.4 Các enzym nối DNA .20 2.5.3.1 E.coly DNA lygase .20 2.5.3.2 T4 DNA lygase .21 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội .21 2.6.1 Với plasmid .21 2.6.2 Với DNA phage 21 2.7 Các nghiên cứu lyên quan đến khóa luận 21 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp 23 3.2 Vật lyệu và phương pháp dùng trong thí nghiệm 23 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm 23 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α .23 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) 23 3.2.1.3 Đoạn DNA 24 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm .24 3.2.3 Các thiết bị máy móc 24 3.2.4 Các loại môi trương nuôi cấy vi khuẩn .24 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm 25 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA .50 4.5.2 Tinh sạch plasmid .52 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp 52 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp 54 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp 55 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR 56 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị .59 TÀI LYỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC 63 Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α”

doc1 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 25/01/2013 | Lượt xem: 2450 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
PAGE  PAGE ii TÓM TẮT PHẠM DUY, HUỲNH VĂN THÁI, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α”, 8-2005. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn. Đế tài được thực hiện từ 01/03/2005 đến 15/08/2005 với các nội dung: Xây dựng phương pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phương pháp sử dụng hoá chất. Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α.. Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra. Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript. Thực hiện kiểm tra kết quả chèn bằng enzym cắt giới hạn và phản ứng PCR trên plasmid tái tổ hợp với cặp primers T3 T7 dựa trên vùng trình tự T3 T7 PNA polymerase và cặp primers ITS4 ITS5 dựa trên vùng trình tự ITS của nấm Beauveria bassiana. Kết quả thu được như sau: Thiết lập được quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. Biến nạp plasmid mang đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α. Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi. Kết quả kiểm tra phản ứng nối bằng phương pháp PCR trên plasmid cho thấy đã chèn được đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong vi khuẩn Psedomonas fluorescens và đoạn DNA (580bp) trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana vào plasmid.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • doctomtat.doc
  • docloicamon.doc
  • pdfbaihoanchinh.pdf
  • docbia.doc
  • docDANHSACHTUVIETTAT.doc
Luận văn liên quan