ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã

ADN lặp lạ i liên tiếp không ghi mã 2010 ĐHQGHN- ĐHKHTN- KHOA SINH HỌC 2010 ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã Giảng viên hướng dẫn: TS. Đinh Đoàn Long Nhóm thực hiện: Lê Thanh Hương Trần Thị Thanh Huyền Nguyễn Thành Phương Đào Văn Quý CNTN Sinh học - K11 Hà Nội, 5-2010 ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 2 Mục lục 1. Giới thiệu chung về ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã .......... 3 a. ADN satellite b. ADN minisatellite c. ADN microsatellite 2. Các cơ chế hình thành ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã ...... 6 3. ADN lặp lại liên tiếp được sử dụng như là chỉ thị phân tử trong nhiều ứng dụng sinh học ......................................................... 8 ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 3 1. Giới thiệu về ADN satellite. Ở Eukaryote nói chung, và ở loài người nói riêng, trong genomes thì chỉ có chừng 5% là các trình tự mã hóa cho protein hoặc ARN (được gọi là gen). Số còn lại là các trình tự không mã hóa, trong số này trình tự ADN lặp lại liên tiếp chiếm một vị trí quan trọng, chúng được gọi là Tandem Repeat Sequence. Các Tandem Repeat Sequence này có tính đa hình về số lượng rất lớn, chúng khác nhau bởi số lượng base trong một đơn vị, khác nhau bởi số lượng đơn vị lặp. Chính sự đa hình này giúp cho phân biệt giữa các cá thể với nhau trong loài, cũng như giữa các loài với nhau. Hình 1: ADN lặp lại liên tiếp [1] Một cách tương đối, dựa vào số lượng base trong một đơn vị lặp, các nhà khoa học chia Tandem Repeat Sequence thành 3 nhóm. a. Nhóm thứ nhất là ADN vệ tinh - ADN satellite, đơn vị lặp lại của chúng có từ một tới vài trăm base. Độ dài của cả vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb. ADN satellite được tìm thấy ở xung quanh vùng tâm động của NST. Sự phân bố của chúng tại đây có vai trò nhất định trong quá trình phân chia tế bào, được biết chúng liên quan tới sự liên kết với các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển các các NST về cực tế bào. Về mặt ứng dụng, rất hiếm khi các ADN satellite được con người sử dụng làm chỉ thị phân tử trong nhận dạng cá thể, mà thường dùng làm chỉ thị phân tử trong việc lập bản đồ gen vùng gần tâm động. b. Nhóm thứ hai là ADN tiểu vệ tinh- ADN minisatellite, hay còn được biết đến là ADN lặp lại ngẫu nhiên đa hình (Variable Number Tandem Repeat). Số base trong một đơn vị của VNTR dao động từ 10-100 base, chúng chiếm ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 4 đoạn ADN từ 1-5 kb, thậm chí có thể lên tới 20 kb. VNTR có thể phân bố một cách tập trung hoặc nằm rải rác trên NST, trên các NST. Dựa vào sự phân bố đó, người ta chia ADN minisatellite làm 2 loại: • ADN tiểu vệ tinh đa vị trí (multi-locus minisatellite): Hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen. Các tiểu vệ tinh đa vị trí được phát hiện vào năm 1985. • ADN tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite): chỉ có tại một vị trí trên bộ gen. Nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí có giá trị dấu ấn ADN. VNTRs được sử dụng như là chỉ thị phân tử trong rất nhiều các ứng dụng sinh học như nhận dạng cá thể, lập bản đồ gen do chúng có tính đa hình rất cao, hay có nhiều dạng số lượng các đơn vị lặp khác nhau giữa các cá thể. Hình 2: Tính đa hình về số lượng các VNTRs. c. Nhóm thứ ba, khi số lượng base rất ít, khoảng từ 1-6 base được lặp lại nhiều lần thành từng đoạn khoảng 200 base thì chúng được gọi là ADN vi vệ tinh - ADN microsatellite. Chúng cũng được biết tới với một số thuật ngữ khác như Single Sequence Repeat (SSRs) hay Short Tandem Repeat (STRs). Cũng giống như ADN minisatellite, ADN microsatellite phân bố tập trung hoặc rải rác trên NST, trong genome. Số lượng loại ADN này rất lớn trong genome, và chúng có tính đa hình về số lượng rất cao giữa các cá thể, chính vì thế chúng được ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 5 dùng làm các chỉ thị phân tử rất thông dụng. Một lý do khác nữa đó là chúng được nhân lên một cách dễ dàng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). Việc sử dụng STRs là rất hiệu quả trong nhận dạng cá thể, như xác định quan hệ huyết thống, truy tìm tội phạm, truy tìm tông tích… Hình 3: Một ví dụ về STRs. Một số ví dụ về các STRs, như dưới đây: Mononucleotide SSR (A) 11: AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT) 6: GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG) 4: CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC) 4: ACTCACTCACTCACTC Loại dinucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA. Chúng có thể phân ra 3 loại: Hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp. Ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại. Ngắt quãng bị chèn bởi một hoặc nhiều base. Về chức năng của ADN satellite và của ADN microsatellite, cả hai loại ADN này phân bố một cách rải rác, chúng có thể nằm trong gen. Do đó, chúng ít nhiều ảnh hưởng tới sự hoạt động của gen. Rất nhiều ADN microsatellite đã ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 6 được tìm ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Ở một số trường hợp sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của ADN microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của Promotor. Vị trí của ADN microsatellite gần hay xa Promotor cũng làm hoạt động của Promotor thay đổi. 2. Cơ chế hình thành các ADN lặp lại liên tiếp. Hình 4: Cơ chế hình thành ADN lặp lại liên tiếp thông qua trao đổi chéo không cân giữa các NST [1]. Các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết cho rằng, các ADN lặp được hình thành do sự bắt chéo không cân giữa vùng ADN mang đoạn lặp trong kì đầu giảm phân I. Kết quả là các tế bào sinh ra mang số lượng các đoạn lặp khác nhau. ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 7 Một cơ chế khác cũng được xem xét đó là do sự trượt lỗi của ADN polymerase trong quá trình sao chép, cơ chế này thích hợp hơn cho sự hình thành các ADN microsatellite. Hình 5: Cơ chế hình thành ADN microsatellite lặp lại liên tiếp do sự trượt lỗi của ADN polymerase. Trong đó quá trình trượt lỗi lúc sao chép, xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt của phân tử ADN mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được. Sự trượt lỗi này tạo ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 8 ra một chỗ phình nhất thời mà có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện. Dẫn tới đoạn lặp bị ngắn đi hoặc dài thêm ra. 3. Ứng dụng của ADN lặp lại liên tiếp. Như đã nói ở trên, các ADN lặp lại liên tiếp này được dùng như là các chị thị phân tử trong nhiều ứng dụng cho phép nhận dạng các cá thể, hay lập bản đồ gen. Trong đó, chủ yếu sử dụng các VNTRs và STRs làm marker. Một kỹ thuật cho phép xác định quan hệ huyết thống, truy tìm tội phạm… được phát triển bởi Jeffereys vào năm 1985 đó là ADN fingerprinting hay còn gọi là” dấu vân ADN “. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai acid nucleic Southern Blotting. Kỹ thuật xác định dấu vân ADN dựa trên nguyên tắc của lai Southern Blotting được gọi là RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Tuy nhiên, để tiến hành kỹ thuật RFLP cần phải có một lượng lớn mẫu ADN. Ngày nay, để cải thiện điều này, người ta xác định dấu vân ADN dựa trên kỹ thuật PCR nhân lên các đoạn ADN lặp. Để nhân lên được các đoạn ADN lặp thì cần sử dụng mồi đặc hiệu, chúng nằm ở vùng sườn. Hình 6: ADN minisatellite được sử dụng làm chỉ thị phân tử trong nhận dạng cá thể [2] ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 9 Hình 7: ADN microsatellite được sử dụng làm chỉ thị phân tử trong nhận dạng cá thể [2] Sau đây, xin được trình bày các bước tiến hành trong xác định” dấu vân ADN “sử dụng kỹ thuật PCR để truy tìm tội phạm. •Tách chiết ADN từ máu hoặc tóc tìm thấy ở hiện trường. •Tách chiết ADN từ mẫu của nghi can. 1 • Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuyếch đại các đoạn lặp. 2 • Điện di trên gel polyacryamide. Chụp ảnh và phân tích kết quả. 3 ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 10 Phân tích kết quả: Hình 8: Hình ảnh thu được sau khi phân tách các ADN lặp lại trên gel Acryamide [5] So sánh các băng của các đối tượng trong hình ảnh trên ta dễ dàng xác định được thủ phạm gây án không ai khác là người B. Để đề phòng có sự giống nhau về các đoạn lặp được sử dụng giữa hai cá thể ngẫu nhiên, dẫn tới kết án nhầm, người ta cần phân tích càng nhiều locus gen sẽ cho kết quả sẽ càng chính xác hơn. ADN lặp lại liên tiếp không ghi mã 2010 11 Tài liệu tham khảo. 1. David Clark - Molecular Biology : Understanding the Genetic Revolution. 2. Butler - Forensic DNA Typing Biology Technology and genetics of STR Markers 2nd. 3. Alberts- Johnson and et al - Molecular Biology Of The Cells 5th. 4. Võ Thị Thương Lan- Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử. 5. Phạm Hùng Vân- Dấu ấn DNA và các xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tìm tội phạm. 6. Wikipedia & NCBI.