Ảnh hưởng của antistress lên khả năng đề kháng edwardsiella ictaluri của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

version 9 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2008 đến tháng 05/2009. 3.2 Địa điểm nghiên cứu - Thí nghiệm cho cá ăn với các hàm lượng Antistress khác nhau được bố trí tại trại thực nghiệm khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. - Thí nghiệm gây cảm nhiễm tại phòng gây cảm nhiễm Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần thơ. - Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản, khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu - Cá tra giống có khối lượng trung bình 12g/con. - Nguồn vi khuẩn: chủng Edwardsiella ictaluri CAF255 từ bộ sưu tập vi khuẩn trong tủ -80o, khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.3.2 Dụng cụ và thiết bị Kính hiển vi, nồi Autolaves, cân điện tử (hai số lẻ), bếp khuấy gia nhiệt, tủ cấy vô trùng, lọ nhuộm tiêu bản, lame và lamen, pipet, micro pipet, đầu col 1mL và 0,1mL, buồng đếm hồng cầu, bể composite, máy sục khí. Đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy, bao tay, đèn cồn, bình xịt cồn, khay nhựa, viết lông dầu, chai thủy tinh, bình tam giác, kim tiêm 1ml, ống nghiệm nhựa 5ml và giá ống nghiệm... 3.3.3 Hóa chất NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2.H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4, formaline (37%), Chlorin , methyl violet, nước cất, methanol, glycerol, bột Wright, bột Giemsa, acid citric, môi trường tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB), cồn 96°, cồn 70°, dung dịch nhuộm gram, giấy test oxidase, H202 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Antistress Bố trí thí nghiệm PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức thức ăn có cùng mức protein, acid amin và năng lượng. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần Nghiệm thức 1: Thức ăn có 0% Antistress Nghiệm thức 2: Thức ăn có 0,2% Antistress Nghiệm thức 3: Thức ăn có 0,4% Antistress Nghiệm thức 4: Thức ăn có 0,6% Antistress Cá được cho ăn 2 lần/ngày. Thời gian thí nghiệm trong 8 tuần Thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống bể composite (500L/bể), nước chảy tràn có sục khí. Mật độ cá thí nghiệm 50 con /bể. Các chỉ tiêu thu thập Kết thúc 8 tuần cho ăn thức ăn, thu mẫu huyết học ngẫu nhiên 3con/bể để so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức. 3.4.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Chuẩn bị thí nghiệm Bể thí nghiệm - Nước cung cấp cho thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 30 ppm và sục khí mạnh trong vòng 3-4 ngày. - Bể, lưới che, vợt dùng trong thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 10% và làm sạch bằng xà phòng và nước trước khi sử dụng. Vi khuẩn cảm nhiễm Vi khuẩn E. ictaluri CAF 255 được phục hồi trên môi trường TSA và giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 280 C. Kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hình dạng và kích thước của vi khuẩn, tính gram của vi khuẩn cũng như việc kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (phản ứng oxidase, catalase, tính di động, phản ứng decarboxylase, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (Fermentation /Oxidation: O/F). Khi vi khuẩn đã thuần thì chọn hai khuẩn lạc đồng nhất để nuôi tăng sinh trong 30ml môi trường NB ở 280C trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn sẽ được chuyển qua ống Falcon đã tiệt trùng. Li tâm ở 4.000rpm với nhiệt độ là 40C trong 5 phút. Rửa qua nước muối sinh lí 2-3 lần. Lần cuối vortex hòa tan nước muối và vi khuẩn. Đo mật độ vi khuẩn ở bước sóng 610nm (OD =1) tương đương mật độ 109cfu/mL. Pha loãng mật độ vi khuẩn về 106 cfu/mL. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 Kiểm tra lại mật số vi khuẩn trên môi trường đĩa TSA Nồng độ vi khuẩn đã sử dụng 1,2x106 cfu/mL. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần 1. Nghiệm thức 1: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0% Antistress. 2. Nghiệm thức 2: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,2% Antistress. 3. Nghiệm thức 3: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,4% Antistress. 4. Nghiệm thức 4: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,6% Antistress 5. Nghiệm thức đối chứng: tiêm nước muối sinh lí, cá đã sử dụng thức ăn có 0% Antistress. Cá được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm và 0,1 ml nước muối sinh lí ở nghiệm thức đối chứng. Cá được cho ăn theo nhu cầu. Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 10 con/bể Các chỉ tiêu thu thập Thu mẫu huyết học cá mới chết khoảng 3con/bể để so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức. Theo dõi và ghi nhận tỉ lệ chết sau cảm nhiễm ở các nghiệm thức. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận của cá mới chết sau cảm nhiễm. 3.4.3 Phương pháp lấy mẫu máu Dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (lượng máu tối thiểu là 0,3ml). Nhỏ máu xuống lam, dùng pipet cho 10µl máu vào ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick và đếm hồng cầu bằng buồng đếm. Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác (lập lại 3 lần) cho thao tác trãi mẫu để đếm bạch cầu. Trãi mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước (Hình 3.1). Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008). Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 Hình 3.1 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu (Đoàn Nhật Phương, 2007) 3.4.3 Phương pháp đếm hồng cầu Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm. Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học (40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 2 lần lặp lại. Hình 3.2 Buồng đếm hồng cầu (Đoàn Nhật Phương, 2007) Cách tính mật độ hồng cầu: HC = C x 10 x 5 x 200 (tb/mm3) Trong đó C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm. 3.4.4 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu v Nhuộm mẫu Mẫu máu đã được cố định trên lame sẽ nhuộm bằng dung dịch nhuộm Wright & Giemsa (Chinabut et al, 1991). Cách chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm được trình bày ở phụ lục 1. - Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút. - Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút. - Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút. - Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút. Lamelle Lame 10X 40X PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 - Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100. Định loại các tế bào máu theo mô tả các tế bào máu trên cá trê trắng của Chinabut et al (1991). v Đọc kết quả Đọc mẫu theo hình Z-Z Tổng bạch cầu (TBC) (Đoàn Nhật Phương, 2007) Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. TBC (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu Từng loại bạch cầu (Đoàn Nhật Phương, 2007) Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/200 3.4.5 Phân lập và tái định danh vi khuẩn Vi khuẩn được định danh qua các thao tác: nhuộm gram, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, kiểm tra tính di động, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (Fermentation /Oxidation: O/F), khả năng sinh indole, khả năng sinh H2S, phản ứng VP (voges-proskauer), phản ứng nitrate và kết quả PCR. 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các số liệu về huyết học được xử lý bằng phần mềm excel 2003 với phép xử lý thống kê t-test ở mức ý nghĩa 0,05%. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Antistress Sau 8 tuần cho ăn thức ăn, cá tra giống ngẫu nhiên thu 3 con/bể để xác định và so sánh số lượng hồng cầu và các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức cho ăn khác nhau. 4.1.1 Về hồng cầu Kết quả định lượng cho thấy số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức tăng dần theo hàm lượng Antistress được bổ sung vào thức ăn và cao hơn so với trước thí nghiêm cho ăn (Hình 4.1). Số liệu hồng cầu sau khi cho ăn Antistress 2100000 2200000 2300000 2400000 2500000 2600000 2700000 2800000 TTN I II III IV Nghiệm thức tế b ào /m l Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức sau cho ăn Antistress TTN: trước thí nghiệm; I: thức ăn bổ sung 0% Antistress; II: bổ sung 0,2% Antistress III: bổ sung 0,4% Antistress; IV: bổ sung 0,6% Antistress Số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0,4% và 0,6%Antistress (2,69x106tb/mL và 2,68.106tb/mL) so với nghiệm thức đối chứng (2,31.106tb/mL) và trước cho ăn (2,39.106tb/mL). Giữa các nghiệm thức sau khi cho ăn Antistress, các nghiệm thức có bổ sung Antistress có hồng cầu cao hơn nghiệm thức đối chứng nhưng chỉ nghiệm thức bổ sung 0,4% và 0,6%Antistress là khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Nhìn chung, các số liệu này đều cao hơn so với báo cáo của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) và Dương Thành Long (2008) trên cá tra khỏe là 2,05x106 tế bào/mL và 1,86x106 tế bào/mL. 4.1.2 Bạch cầu Tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu cũng tăng sau 8 tuần ở các nghiệm thức cho ăn khác nhau. Nhưng sự tăng của các tế bào này chỉ có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Riêng bạch cầu trung tính ở các nghiệm thức lại giảm thấp so với trước cho ăn (Bảng 4.1). Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu TTN và các NT sau cho ăn Loại tế bào (x103/mm3) TTN NT I NT II NT III NT IV TBC T L N M 107,9 ± 31a 35,7 ± 11,3a 68,1 ± 24,1a 3 ± 1,7a 1,1 ± 1a 121,3 ± 44ab 46,9 ± 16,3ab 72,5 ± 29,8ab 0,7 ± 0,8b 1 ± 1,1a 149,3± 46b 52,7 ± 19,1b 94,9 ± 29,3b 0,7 ± 0,8b 1,1 ±0,7 a 111,3± 53ab 34,9 ± 16,8ab 74,6 ± 41,5ab 1,2 ± 1,9b 0,6 ±0,7 a 148,9 ± 76ab 54,2 ± 36,2ab 92,2 ± 43,2ab 0,7 ± 0,9b 1,8 ± 1,6a TNN: Trước thí nghiệm; NT: Nghiệm thức NT I: Thức ăn bổ sung 0% Antistress NT II: Thức ăn bổ sung 0,2% Antistress NT III: Thức ăn bổ sung 0,4% Antistress NT IV: Thức ăn bổ sung 0,6% Antistress TBC : Tổng bạch cầu; T: tiểu cầu; L: lympho bào; N: neutrophil; M: mono bào Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tuy nhiên, xét về mặt số lượng thì tổng bạch cầu, tiểu cầu vẫn cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 149x103tb/ml và 42,7x103tb/ml; bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress là 1,2x103tb/ml; tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 92 x103tb/ml và 1,8 x103tb/ml. Về tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân tuy có sự chênh lệch nhưng khác biệt này không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (Bảng 4.1). Tương tự như báo cáo của Liu (1989) khi thí nghiệm trên cá nheo bổ sung vitamin C lần lượt theo nồng độ 0, 100, 500, 1000 và 4000 mg/kg thức ăn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 trong 9 tuần nhận xét không có sự khác biệt ý nghĩa về tăng trọng cũng như huyết cầu giữa các nghiệm thức cho ăn khác nhau. 4.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 4.2.1 Hồng cầu Có sự giảm đáng kể số lượng hồng cầu trong cùng nghiệm thức trước và sau khi gây cảm nhiễm (Hình 4.2). Số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức giảm chỉ bằng 45,7-61,6% so với trước cảm nhiễm. Giữa các nghiệm thức có gây cảm nhiễm, hồng cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 1,47x106tb/ml và thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 1,2 x106tb/ml. Số lượng hồng cầu ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm với vi khuẩn thấp hơn nhiều so với đối chứng (-) tiêm nước muối sinh lí. Tuy nhiên, sự khác biệt về hồng cầu ở các nghiệm thức sau cảm nhiễm đều không có ý nghĩa thống kê. Biến động số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 TTN I II III IV DC(-) Tên nghiêm thức tế b ào /m l TCN SCN Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự biến động số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức trước và sau cảm nhiễm TCN: trước cảm nhiễm SCN: sau cảm nhiễm NT I: Thức ăn bổ sung 0% Antistress NT II: Thức ăn bổ sung 0,2% Antistress NT III: Thức ăn bổ sung 0,4% Antistress NT IV: Thức ăn bổ sung 0,6% Antistress DC(-): Đối chứng tiêm nước muối sinh lí Kết quả này cũng tương tự như báo cáo Trần Hồng Ửng (2003), Phan Thị Hừng (2004) và Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) là có sự giảm đáng kể số lượng hồng cầu dưới tác dụng của vi khuẩn gây bệnh. Song, không có sự khác biệt ý PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 nghĩa về thông số huyết học và chức năng miễn dịch giữa các nghiệm thức có bổ sung thức ăn có thành phần β-glucan (Welker, 2007) 4.2.2 Các loại bạch cầu Tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu đều giảm có ý nghĩa thống kê so với cùng nghiệm thức trước cảm nhiễm. Tổng bạch cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 26,4x103tb/ml thấp hơn nhiều so với trước cảm nhiễm là 148x103tb/ml.Tổng bạch cầu thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 18,3x103tb/ml thấp hơn so với trước cảm nhiễm là 149x103tb/ml. Tế bào lympho cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 13,9x103tb/ml và thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 10x103tb/ml. Giảm nhiều so với trước lúc gây cảm nhiễm là 54,2 x103tb/ml và 53,6 x103tb/ml. Tiểu cầu cũng giảm nhiều so với trước cảm nhiễm và giảm mạnh nhất ở nghiệm thức 2 còn 4,15 x103tb/ml so với trước cảm nhiễm là 94,8x103tb/ml. Bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 0,93x103tb/ml thấp nhất ở nghiệm thức không bổ sung Antistress là 0,58x103tb/ml. Bạch cầu trung tính tăng ở đối chứng và bổ sung 0,4% Antistress so với trước khi gây cảm nhiễm. Song lại giảm ở nghiệm thức bổ sung 0,2% và 0,6% Antistress. Tuy nhiên, không có sự khác biệt ý nghĩa giữa bạch cầu trung tính trong cùng nghiệm thức trước và sau cảm nhiễm cũng như giữa các nghiệm thức với nhau. Bảng 4.2A.Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức I trước và sau cảm nhiễm Loại tế bào I (TCN) I (SCN) TBC (x103/ml) T (x103/mm3) L (x103/mm3) N (x103/mm3) M (x103/mm3) ĐTB(x103/mm3) 121,3 ± 44a 46,9 ± 16,3a 72,5 ± 29,8a 0,7 ± 0,8a 1 ± 1,1a 23 ± 11b 11 ± 5,8b 8,8 ± 6,1b 0,6 ± 0,6a 2,2 ± 1,4a 0,3 ± 0,3 Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). TCN: trước cảm nhiễm; SCN: sau cảm nhiễm; I: Thức ăn 0% Antistress PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 Bảng 4.2B.Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức II trước và sau cảm nhiễm Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). TCN: trước cảm nhiễm; SCN: sau cảm nhiễm II: Thức ăn 0,2% Antistress Bảng 4.2C.Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức III trước và sau cảm nhiễm Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). TCN: trước cảm nhiễm; SCN: sau cảm nhiễm III: Thức ăn 0,4% Antistress Loại tế bào II (TCN) II (SCN) TBC (x103/ml) T (x103/mm3) L (x103/mm3) N (x103/mm3) M (x103/mm3) ĐTB(x103/mm3) 149,3± 46a 52,7 ± 19,1a 94,9 ± 29,3a 0,7 ± 0,8a 1,1 ±0,7 a 18,3± 6,8b 10 ± 3,4b 4,2 ± 2,2b 0,9 ± 0,8a 2,3 ± 1,8a 0,8 ±0,9 Loại tế bào III (TCN) III (SCN) TBC (x103/ml) T (x103/mm3) L (x103/mm3) N (x103/mm3) M (x103/mm3) ĐTB(x103/mm3) 111,3± 53a 34,9 ± 16,8a 74,6 ± 41,5a 1,2 ± 1,9a 0,6 ±0,7 a 24,1± 14,8b 12,4 ± 6,8b 5,4 ± 6,6b 0,7 ± 0,6a 3,6 ±3,7 b 2 ±2,8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 Bảng 4.2D.Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức IV trước và sau cảm nhiễm Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). TCN: trước cảm nhiễm; SCN: sau cảm nhiễm IV: Thức ăn 0,6% Antistress Đại thực bào, bạch cầu đơn nhân tăng so với trước cảm nhiễm nhưng sự tăng này chỉ có ý nghĩa ở nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress. Điều này chứng tỏ khi cá bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh thì trước hết hệ miễn dịch không đặc hiệu sẽ hoạt động do thành phần chính của hệ miễn dịch không đặc hiệu là bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính. (Verlhae et al (1998) trích dẫn bởi Nguyễn Kim Kha, 2006). Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 4kg Antistress lần lượt là 3,57x103tb/ml và 2,06 x103tb/ml cao hơn trước gây cảm nhiễm là 0,63x103tb/ml và 0x103tb/ml. Tương tự như trước gây cảm nhiễm, không có sự khác biệt ý nghĩa về giá trị của các tế bào bạch cầu giữa các nghiệm thức cho ăn thức ăn khác nhau sau cảm nhiễm (Bảng 4.3). Loại tế bào IV (TCN) IV (SCN) TBC (x103/ml) T (x103/mm3) L (x103/mm3) N (x103/mm3) M (x103/mm3) ĐTB(x103/mm3) 148,9 ± 76a 54,2 ± 36,2a 92,2 ± 43,2a 0,7 ± 0,9a 1,8 ± 1,6a 26,4± 11,2b 13,9 ± 6,6b 8,3 ± 7b 0,7 ± 1,1a 3 ±2,3 a 0,5 ±0,6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Bảng 4.3 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm Giá trị thể hiện trên Bảng là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn Các giá trị trong cùng 1 hàng có các chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). I: Thức ăn 0% Antistress II: Thức ăn 0,2% Antistress III: Thức ăn 0,4% Antistress IV: Thức ăn 0,6% Antistress Cá bệnh không những có sự suy giảm về số lượng ở hồng cầu và tiểu cầu, tế bào lympho cũng như tổng bạch cầu mà còn có sự xuất hiện nhiều hồng cầu bị thoái hóa (Hình 4.3d) và đại thực bào (Hình 4.3e), đại thực bào chứa vi khuẩn (Hình 4.2a) mà ở cá khỏe trước cảm nhiễm không quan sát được. Tuy nhiên, không tìm thấy sự xuất hiện của hồng cầu tiền trưởng thành trong các mẫu quan sát như báo cáo của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) có sự xuất hiện nhiều hồng cầu này trong hệ tuần hoàn cá bệnh. Do những tổn thương ở thận, tỳ tạng làm vòng tuần hoàn máu bị rút ngắn. Loại tế bào (x103 tb/mm3) I(ĐC+) II(+2) III(+4) IV(+6) TBC T L N M ĐTB 23 ± 11a 11 ± 5,8a 8,8 ± 6,1a 0,6 ± 0,6a 2,2 ± 1,4a 0,3 ± 0,3a 18,3± 6,8a 10 ± 3,4a 4,2 ± 2,2a 0,9 ± 0,8a 2,3 ± 1,8a 0,8 ±0,9 a 24,1± 14,8a 12,4 ± 6,8a 5,4 ± 6,6a 0,7 ± 0,6a 3,6 ±3,7 a 2 ±2,8 a 26,4± 11,2a 13,9 ± 6,6a 8,3 ± 7a 0,7 ± 1,1a 3 ±2,3 a 0,5 ±0,6 a PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 Hình 4.3 Các loại tế bào máu cá bệnh Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002) vùng gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng đó là những vùng bị hoại tử. Khi cá bị nhiễm vi khuẩn đến giai đoạn hoại tử thận mất những chức năng quan trọng như bài tiết các chất thải của quá trình trao đổi chất, gây ra sự tích tụ các sản phẩm thải của quá trình biến dưỡng gây độc cho cơ thể. Đồng thời do mô tạo máu bị phá hoại làm cho lượng máu trong cơ thể bị giảm do không có máu thay thế. Sự hoại tử ở tỳ tạng cũng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất a: Đại thực bào chứa vi khuẩn b: Tiểu cầu c: Hồng cầu không nhân d: Hồng cầu phân hủy nhân e: Đại thực bào f: Tế bào lympho g: Tế bào mono h: Hồng cầu hai nhân i: Bạch cầu trung tính PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 các tế bào lympho và bạch cầu để bảo vệ cơ thể chống lại vi khuẩn và những tác nhân gây bệnh khác 4.2.3 Kết quả tỉ lệ chết sau cảm nhiễm Cá tra gây cảm nhiễm được tiêm 0,1ml vi khuẩn Edwardsiella ictaluri chủng CAF 255 với nồng độ 1,2x106 tb/ml. Sau khi tiêm vi khuẩn cá bỏ ăn, có hiện tượng bơi lờ đờ trong ngày thứ 3. Cá bắt đầu chết vào tối ngày thứ 4 ở nghiệm thức bổ sung 0kg và 2kg Antistress/tấn thức ăn. Cá ở các nghiệm thức có cảm nhiễm vi khuẩn đều chết tập trung vào ngày thứ 5 và giảm dần sang ngày thứ 6. Từ ngày thứ 7 cá không chết thêm cho đến kết thúc thí nghiệm. Tỉ lệ chết cao nhất (100%) nhận được ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress, thấp nhất là nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress (83%) và hai nghiệm thức bổ sung 0% và 0,4% Antistress cũng có tỉ lệ chết cao là 93% (Hình 4.4) Tỉ lệ chết sau cảm nhiễm 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ngày % T ỉ l ệ ch ết ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 Hình 4.4 Biểu đồ tỉ lệ chết giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm E. ictaluri Trong khi đó, cá ở nghiệm thức tiêm nước muối sinh lí luôn khỏe mạnh và linh hoạt, tỉ lệ chết là 0%. Chứng tỏ điều kiện thí nghiệm là đạt yêu cầu không ảnh hưởng đến tỉ lệ chết. Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Ngô Minh Dung (2007) khi tiến hành gây cảm nhiễm cá tra giống với chủng vi khuẩn Tỷ- PTK207 với nồng độ 107 và 106CFU/ml cá chết xuất hiện từ ngày thứ 3 và không thấy cá chết từ ngày thứ 6. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Trong nghiên cứu cuả Welker (2007), cá nheo cũng có tỉ lệ sống tăng 5-17% và có khả năng giảm stress ở thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung 0,1% β- glucan trong 4 tuần so với đối chứng sau khi cảm nhiễm với E.ictaluri. Tuy nhiên sự tăng tỉ lệ sống ở nghiệm thức có thành phần thức ăn là men phụ có bổ sung β-glucan là không có ý nghĩa thống kê và không ảnh hưởng đến hoạt động tăng trưởng, thông số huyết học và chức năng miễn dịch. Cũng như Liu (1989) khi thí nghiệm trên cá nheo bổ sung vitamin C ở các nồng độ khác nhau trong 9 tuần cho kết quả cá có chế độ ăn 1000mg vitamin C/kg thức ăn có khả năng tăng khả năng kháng E. ictaluri so với không cho ăn. Cá khi cảm nhiễm với E. ictaluri có LD50=105cfu/ml ở thí nghiệm không bổ sung vitamin C và LD50=107cfu/ml ở chế độ bổ sung 1000mg/kg thức ăn. Tuy nhiên, ở mức vitamin C cao hơn 2000 và 4000mg/kg thì khả năng này cũng không tăng thêm nữa. 4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn Cá chết từ ngày thứ 4 có hiện tượng xuất huyết ở các gốc vi, quanh miệng và hậu môn; gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng. Giống với ghi nhận của Inglis et al (1993) cá bị nhiễm E. ictaluri có hiện tượng viêm loét trên da, xương nắp mang, bụng. Những vết loét màu đỏ xuất hiện nhiều trên da sung huyết xảy ra trên các vi, xuất hiện những đồm trắng ở vùng da có màu tối, mang sưng, lồi cầu mắt. Nội quan có chứa dịch, phù đục, thận và tỳ tạng sưng to, gan có nhiều đốm hoại tử. Với chủng E. ictaluri 224 khi gây cảm nhiễm trên cá tra giống với nồng độ 106 cfu/ml, Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng ghi nhận cá bắt đầu xuất hiện những đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng từ ngày thứ hai sau cảm nhiễm. Kết quả cấy vi sinh thu được 81 chủng vi khuẩn trên cả 4 nghiệm thức cảm nhiễm đều cho kết quả khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ, màu trắng đục, phát triển chậm trên môi trường TSA sau 24-48 giờ hình dạng tương tự chủng CAF255 ban đầu được phục hồi để gây cảm nhiễm (Hình 4.5). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Hình 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn Hình 4.6 Kết quả nhuộm Gram Thu mẫu vi sinh mẫu gan thận của nghiệm thức tiêm nước muối không cho kết quả có vi khuẩn phát triển trên đường cấy. Tiến hành kiểm tra các phản ứng cơ bản trên các nghiệm thức gây cảm nhiễm. Kết quả thu được các chủng vi khuẩn kiểm tra đều có Gram (-), hình que (Hình 4.6), catalase dương tính, oxydase âm tính, di động yếu ở nhiệt độ phòng (30-350C), có khả năng lên men và oxy hóa đường glucose, H2S, VP, indole âm tính, nitrate dương tính (Hình 4.7). Hình 4.7 Kết quả test sinh hóa (OF, H2S, nitrate, indole) 1: Có khả Oxy hóa 2: Có khả năng lên men 3: Không có khả năng sinh H2S 4: Phản ứng nitrate (+) 5: Không có khả năng tạo sản phẩm indole PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Kết quả chạy PCR cũng thu được kết quả có vi khuẩn E. ictaluri hiện ở vạch 407 pb. Các kết quả này giống với ghi nhận của Waltman et al (1986) trên 119 dòng vi khuẩn E.ictaluri được nghiên cứu (theo Inglis, 1993 ), Từ Thanh Dung và ctv (2004), Nguyễn Trúc Phương (2008) cũng cho kết quả tương tự trên chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri CAF255. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận 1. Sau khi cho ăn antistress, số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0.4% và 0,6% Antistress so với nghiệm thức đối chứng và trước cho ăn. 2. Tổng bạch cầu, tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Trong khi đó, nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress lại có số lượng bạch cầu trung tính cao nhất; tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Tuy nhiên, tất cả sự chênh lệch về bạch cầu không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung Antistress. 3. Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào tăng trong cùng nghiệm thức trước và sau khi gây cảm nhiễm. Trong khi đó, hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu lại giảm. 4. Giữa các nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm, số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Bạch cầu đơn nhân; đại thực bào cao nhất nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress. Bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. 5. Sau cảm nhiễm, thu được tỉ lệ cá chết thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress/tấn thức ăn là 83%. 5.2 Đề xuất Tiếp tục bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm kiểm tra khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra khi sử dụng Antistress với phương pháp ngâm trong dung dịch vi khuẩn. Để đánh giá các thông số huyết học của cá tra giữa các nghiệm thức tại cùng thời điểm thu mẫu 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ… PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Benli, C.K and Yildiz. H.Y, 2004. Blood parameters in Nile tiapia (Oreochromis niloticus L.) Spontaneously infected with Edwardsiella tarda. Aquaculture Research, 35, 1888-1380 2. Chinabut S, P. Kitsawat and C. Limsuwan, 1991. Histology of the walking catfish, Clarias batrachus. International development research centre, Canada. 96 pages. 3. Dương Thành Long, 2008. Tìm hiêu một số chỉ tiêu huyết học ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá rô phi (Oreochromis niloticus). Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 4. Đoàn Nhật Phương, 2007. Non-specific immuni responses towards ascorbic acid supplementation in hybrid catfist (clarias gariepius x c. Macrocephalus) feed. 5. Inglis, V., J. R. Roberts and R. N. Bromage. Bacterial diseases of fish. 1993. Institute of aquaculture. 312 pp. 6. Kumari, J and P. K. Sahoo, 2006. Dietary b-1,3 glucan potentiates innate immunity and disease resistance of Asian catfish, Clarias batrachus. Journal of Fish diseases, 29 (2): 95-101. 7. Liu, P. R., Plumb, A. J., Guerin, M and Lovell, R.T. Iffect of megalevels of dietary vitamin C on the immune response of channel catfish Ictalurus punctatus in ponds. Diseases of aquatic organisms: vol. 7: 191-194, 1989. 8. Lương Thanh Trúc, 2000. Bổ sung vitamin C để phòng bệnh ngoại kí sinh trùng lên cá tra ở giai đoạn ương. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy Sản. Đại Học Cần Thơ. 9. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan Edwardsiella ictaluri trên các cơ quan khác nhau của cá tra. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 10. Ngô Minh Dung, 2007. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 11. Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008. Điều tra hiện trạng nuôi, bệnh và tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong nuôi thâm canh cá tra ao. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 12. Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008. Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra nuôi trong ao bị bệnh mủ gan. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 13. Nguyễn Kim Kha, 2006. Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin C lên khả năng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra giống với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 14. Nguyễn Quốc Thịnh, 2002. Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 40 trang. 15. Phạm Thanh Hương, 2006. Xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra (Pangasius hyphopthalmus) bệnh vàng da ở tỉnh Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 16. Phan Thị Hừng, 2004. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra( Pangasius hypophthalmus) bị bệnh vàng da. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 17. Saurabh, S and Sahoo. P.K, 2008. Lysozyme: an important defence molecule of fish innate immune system. Aquaculture Research, 39(3): 223- 229. 18. Trần Hồng Ửng, 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (Pangasius hyphophthalmus) bệnh trắng gan. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ 19. Trần Thị Ngọc Hân, 2006. Khảo sát mô học cá tra (Pangasius hyphothalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. Luận văn tốt nghiệp Đại Học. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 71 trang. 20. Trần Thị Thanh Hiền, 2004. Giáo trình dinh dưỡng và thức ăn Thuỷ Sản. Khoa Thủy sản. Trường Đại Học Cần Thơ. 150 trang 21. Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngoc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy.2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hyphophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ. 137-142 22. Welker, T.L, C. Lim, M. Yildirim- Aksoy, R. Selby and P. H. Klesius, 2007. Channel catfish, Ictalurus punctatus, Fed Diets containing Commercial Whole – cell Yeast or Yeast subcomponents. Journal of the World Aquaculture Society, 38 (1): 24-35 23. Williams, M.L and M.L. Lawrence. 2005. Identification and characerization of a two component hemolysin from E. Ictaluri. Journal of aquatic animal Health. 108: 281-289. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 PHỤ LỤC A CÔNG THỨC PHA CHẾ MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐƯỢC SỬ DỤNG 1. Dung dịch Natt & Herrick -NaCl: 3,88g -Na2SO4: 2,5g -Na2HPO4.12H2O: 2,91g -KH2PO4: 0,25g -Formaline(37%): 7,5ml -Methyl violet 2B: 0,1g -Nước cất: 1000ml -Sau khi để yên trong bóng tối qua đêm thì tiến hành lược qua mắc lưới 125µm. 2. Dung dịch Wright Hòa tan 1g Wright trong 600ml methanol, khuấy liên tục trong đêm. Sau đó lọc qua mắc lưới 125µm. 3. Dung dịch Giemsa Hòa tan 3,8g Giemsa trong 25ml Glycerol và ủ ở 600 trong 2 giờ. Sau đó cho thêm vào 75ml methanol. Dung dịch nhuộm sẽ được pha loãng từ dung dịch gốc 10 lần bằng nước cất. 4. Dung dịch pH 6.2-6.8 Hòa tan 27,6g monobacsic sodium phosphate trong 1000 ml nước cất. Hòa tan 53,6g dibasic sodium phosphate trong 1000ml nước cất. Tiến hành pha loãng 68ml dung dịch 6g monobacsic sodium phosphate với 32ml dung dịch dibasic sodium phosphate. 5. Dung dịch pH 6,2 Hòa tan 19,212g acid citric trong 1000ml nước cất. Hòa tan 53,628g Na2PO4.7H2O trong 100ml nước cất. Trộn 6,78ml dung dịch đầu với 13,22ml của dung dịch 2. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 PHỤ LỤC B Bảng B1: Ảnh hưởng của các loại thức ăn lên tỉ lệ sống và sinh trưởng của cá Nghiệm thức Wi (g) Wf (g) TLS (%) WG (g) DWG (g/ngày) ĐC 12,01±0,00a 55,99±11,67a 99,33±1,15a 43,99±11,67a 0,79±0,21a NT1 12,02±0,01a 65,99±4,76ab 96,00±5,29a 53,97±4,75ab 0,96±0,08ab NT2 12,02±0,01a 72,73±4,83b 98,00±2,00a 60,72±4,83b 1,08±009b NT3 12,03±0,01a 68,87±3,74ab 100,00±0,00a 56,84±3,76ab 1,01±0,07ab NT4 12,04±0,01a 70,71±9,18ab 95,00±7,07a 58,68±9,17ab 1,05±0,16ab Ghi chú: Giá trị thể hiện là số trung bình ± độ lệch chuẩn. Các số liệu cùng nằm trong một cột có mang chữ cái giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa p > 0,05 Bảng B2: Kết quả test một số phản ứng sinh hóa Chủng ban đầu Nghiệm thức Gram Hình dạng Oxidase Catalase Di động O/F H2S VP Indol Nit rat CAF 255 II(1.7) - Que - + + - +/+ - - - + II(3.6) - Que - + + - +/+ - - - + III(2.1) - Que - + + - +/+ - - - + III(2.6) - Que - + + - +/+ - - - + IV(4.2) - Que - + +- +/+ - - - + V(2.4) - Que - + + - +/+ - - - + (+ - ): di động yếu PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 PHỤ LUC C PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI KHUẨN VÀ KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CƠ BẢN 1. Phân lập vi khuẩn Giải phẩu cá, ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng lên môi trường thạch TSA. Áp dụng các biện pháp vô trùng để tránh trường hợp bị tạp nhiễm. Ủ các đĩa vi khuẩn ở nhiệt độ 28- 30oC. Sau 24-48 giờ quan sát và ghi nhận hình thái của khuẩn lạc. Tiếp tục tách ròng, theo dõi để đạt đĩa cấy thuần. Sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản. 2. Nhuộm Gram Cho một giọt nước muối sinh lý lên lame, dùng que cấy triệt trùng lấy một ít khuẩn lạc trãi đều lên lame. Để lame khô tự nhiên. Hơ lướt lame lên ngọn đèn cồn, để cố định vi khuẩn, để nguội. Nhuộm Crystal violet (dd1) khoảng 1 phút, rữa lame bằng nước. Nhuộm iodine (dd2) trong 1 phút, rửa lame bằng nước. Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây. Rửa lame lại bằng nước sạch. Nhuộm safranin (dd4) khoảng 2 phút, rửa lại bằng nước sạch và để khô. Quan sát lame trên kính hiển vi quang học (40X và 100X). Vi khuẩn Gram (+): màu xanh/tím, vi khuẩn Gram (-): màu hồng. 3 Tính di động: Cho Vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngữa lamelle lên bàn. Dung pipet tiệt trùng nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lamelle. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít khuẩn lạc hòa tan vào giọt nước muối trên lamelle. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle. Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. 4 Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào một khuẩn lạc trên đĩa agar hoặc dung que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên que thử oxidase. Quan sát que thử trong 30 giây và quan sát sự thay đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) và không chuyển màu âm tính (-). 5 Phản ứng Catalase Nhỏ một giột dung dịch H2O2 3% lên lame. Dung que cấy triệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3%. Phản ứng Catalase dương tính (+) có hiện tượng sủi bọt, catalase âm tính (-) không sủi bọt. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 6 Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F) Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F đã tiệt trùng. Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F, sau đó phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào một ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (F), ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (O). Để 2 ống nghiệm vào trong tủ ấm 28-30oC. Đọc kết quả sau 1-7 ngày. Lên men (F) khi ống có phủ dầu paraffin chuyển màu vàng. Oxy hóa (O) khi ống không có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng. Không phản ứng khi 2 ống nghiệm đều màu xanh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 PHỤ LỤC D BẢNG DẤU HIỆU BỆNH LÍ VÀ KẾT QUẢ VI SINH Stt NT N Dấu hiệu bên ngoài Dấu hiệu bên trong KQ 1 II1 4 Gan sưng + 2 Các vi xuất huyết Gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng + 3 Các vi xuất huyết Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng + 4 Xuất huyết vi, nắp mang, miệng Đốm trắng thận trước, gan (ít) + 5 5 Gan nhạt màu, có đốm trắng, thận nhũng + 6 Gan sưng nhạt màu, thận trước hoại tử, thận sau và tỳ tạng có đốm trắng. + 7 Xuất huyết nhẹ ở các vi Đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng + 8 Xuất huyết nhẹ ở các vi Gan, thận, tỳ tạng bị nhũng # 9 Xuất huyết nhẹ ở các vi Đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng + 10 II2 4 Thận nhũng, tỳ tạng có đốm + 11 Gan, thận, tỳ tạng đốm trắng, bóng hơi trương to + 12 Vây xuất huyết nặng Bong bóng, gan, thận có đốm, thận nhũng + 13 5 Xuất huyết nặng ở các vi, nắp mang, quanh miệng Đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng + 14 Xuất huyết nặng ở các Đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 vi, nắp mang, quanh miệng 15 Xuất huyết nặng ở các vi, nắp mang, quanh miệng Đốm trắng ở gan, thận, tỳ tạng + 16 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng có đốm + 17 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng có đốm # 18 II3 4 Xuất huyết hậu môn Gan sưng, thận nhũng + 19 Xuất huyết các vi Gan sưng, thận có đốm + 20 Xuất huyết các vi Gan, thận sưng; gan, thận, tỳ tạng có đốm + 21 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng có đốm + 22 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng có đốm + 23 5 Gan sưng và có đốm, thận nhũng + 24 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng có đốm + 25 III1 4 Gan nhạt màu, thận có nhiều đốm trắng + 26 5 Xuất huyết các vi Gan đốm trắng, thận nhũng + 27 Xuất huyết các vi, quanh miệng Gan, tỳ tạng có nhiều đốm, thận nhũng + 28 III2 Gan sưng, thận nhũng + 29 Xuất huyết các vi Thận nhũng, gan nhạt màu + 30 Xuất huyết hậu môn Gan nhợt nhạt và nhũng + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 nặng 31 Xuất huyết các vi Thận nhũng, gan sưng nhạt màu + 32 Xuất huyết miệng Gan trắng, thận nhũng + 33 Xuất huyết vi hậu môn Gan sưng, thận đốm trắng + 34 Gan sưng, thận đốm trắng + 35 III3 Xuất huyết các vi và quanh miệng Gan sưng, thận, tỳ tạng đốm trắng + 36 Gan, thận có đốm trằng + 37 Xuất huyết quanh miệng, mang nhạt màu Gan sưng, gan, thận có nhiều đốm trắng + 38 Xuất huyết toàn thân Gan, thận, tỳ tạng đều có đốm + 39 Gan có đốm trắng, thận nhũng + 40 Xuất huyết vi bụng và hậu môn Gan, thận sưng và có nhiều đốm + 41 Xuất huyết vi bụng và hậu môn Thận trước có đốm trắng + 42 5 Xuất huyết nhẹ các vi Gan nhiều đốm trắng, thận nhũng + 43 Xuất huyết hậu môn Gan sưng, thận, tỳ tạng có đốm trắng + 44 IV1 4 Xuất huyết hậu môn Gan nhạt màu, gan thận có nhiều đốm trắng + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 45 Bình thường Gan nhạt màu + 46 Bình thường Gan nhạt màu + 47 Bình thường Gan nhạt màu + 48 Xuất huyết quanh miệng, vi Thận sưng, gan, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 49 Mõm xuất huyết gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 50 Xuất huyết quanh miệng Gan, thận sưng có nhiều đốm trắng + 51 Xuất huyết vi, mắt Thận sưng, gan thận có đốm trắng + 52 5 Gan sưng, thận, tỳ tạng có đốm trắng + 53 IV2 4 Mang nhạt màu Gan, thận, tỳ tạng bị nhũng + 54 Xuất huyết vi, quanh miệng Gan, thận đốm trắng + 55 Gan sưng, thận, tỳ tạng có đốm + 56 Xuất huyết vi, quanh miệng Gan, thận có đốm trắng + 57 Xuất huyết vi Gan, thận sưng có đốm trắng + 58 IV3 4 Xuất huyết vi, quanh miệng Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng + 59 Xuất huyết vi, quanh miệng Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng + 60 Xuất huyết vi bụng, hậu môn Gan sưng, thận có đốm trắng và hoại tử + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 61 5 Xuất huyết vi bụng, hậu môn Gan sưng, thận có đốm trắng và hoại tử + 62 V1 4 Xuất huyết các vi Thận có nhiều đốm trắng, gan sưng + 63 Xuất huyết các vi, mang trắng Gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng + 64 Xuất huyết các vi nhẹ Gan trắng, thận nhũng + 65 Xuất huyết vi, quanh miệng Thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 66 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 67 Xuất huyết các vi, quanh miệng, nắp mang Gan nhạt màu, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 68 Xuất huyết vi, quanh miệng Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 69 Xuất huyết hậu môn Gan, thận nhiếu đốm trắng + 70 5 Xuất huyết các vi Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 71 V2 4 Xuất huyết quanh miệng, đuôi Thận, tỳ tạng đốm trắng, gan xuất huyết + 72 Bình thường Gan, thận nhạt màu + 73 Gan, tỳ tạng có đốm, thận nhũng + 74 Gan, thận, tỳ tạng nhiều đốm, thận sưng + 75 Xuất huyết vi,quanh mắt Thận sưng, gan, thận đốm trắng + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 Ghi chú: NT: nghiệm thức N: ngày chết +: Có kết quả vi sinh #: Không phân tích vi sinh 76 5 Gan nhạt màu có đốm trắng, thận hoại tử + 77 V3 4 Xuất huyết các vi Gan nhạt màu, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 78 Xuất huyết các vi, bụng Gan nhạt màu, thận, tỳ tạng nhiều đốm trắng + 79 Gan, thận, tỳ tạng đều bị nhũng + 80 Gan sưng, thận hoại tử có đốm trắng + 81 5 Xuất huyết vi, quanh miêng Gan sưng, nhạt màu có đốm, thận nhũng + 82 Các vi xuất huyêt Gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng + 83 Các vi xuất huyêt Gan, thận, tỳ tạng có đốm trắng + PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 PHỤ LỤC E THÔNG SỐ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRƯỚC CHO ĂN Số liệu huyết cầu của cá trước cho ăn Con Mật độ hồng cầu(tb/ml) Tổng bạch cầu(tb/ml) Lympho(tb/ml) Tiểu cầu(tb/ml) Mono(tb/ml) Trung tính(tb/ml) ĐTB(tb/ml) 1 2920000 128016.7 48646.35 72329.44 3200.418 3840.501 0 2 2285000 116892.1 47341.29 69550.79 0 0 0 3 2460000 109637.9 36728.69 71812.81 548.1894 548.1894 0 4 1875000 126779.4 53247.33 69094.75 2535.587 1901.69 0 5 2185000 127985.2 31356.37 92789.26 1279.852 2559.704 0 6 2695000 141842.1 41134.21 97161.84 0 3546.053 0 7 2380000 164547.4 50186.96 106133.1 1645.474 6581.896 0 8 2290000 100396.7 29115.03 68269.73 1003.967 2007.933 0 9 2655000 46831.75 35826.29 7258.921 1639.111 2107.429 0 10 2320000 89972.3 32390.03 53083.66 1349.584 3149.03 0 11 2530000 123846.2 41488.46 77403.85 0 4953.846 0 12 1960000 87353.76 21838.44 61584.4 0 3930.919 0 13 2505000 106188.3 28670.85 73269.94 0 4247.533 0 14 2340000 94119.28 20235.64 67765.88 1882.386 4235.368 0 15 2495000 54386.92 17131.88 34535.69 1359.673 1359.673 0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 PHỤ LỤC E THÔNG SỐ HUYẾT HỌC CỦA CÁ SAU CHO ĂN Số liệu huyết cầu của cá sau cho ăn Antistress NT Mật độ hồng cầu(tb/ml) Tổng bạch cầu(tb/ml) Lympho(tb/ml) Tiểu cầu(tb/ml) Mono(tb/ml) Trung tính(tb/ml) ĐTB(tb/ml) I 2745000 154647.9 54126.76 98201.41 1546.479 773.2394 0 2600000 104577 34510.4 67975.03 2091.54 0 0 2750000 217625.9 76169.06 137104.3 3264.388 1088.129 0 1695000 86709.88 31649.11 52893.03 433.5494 1734.198 0 1945000 124148.9 62695.21 60212.23 620.7447 0 620.7447 2025000 114084.5 33654.93 78718.31 0 1711.268 0 2320000 96666.67 40600 56066.67 0 0 0 2270000 66993.82 31152.13 35506.73 334.9691 0 0 2395000 126052.6 57984.21 66177.63 630.2632 1260.526 0 II 2905000 178864.1 69757.01 108212.8 894.3206 0 0 2725000 151495.4 47721.06 101501.9 1514.954 757.4771 0 2605000 106658.6 41596.84 62395.26 2133.171 533.2929 0 2400000 149575.1 35150.14 111433.4 747.8754 2243.626 0 2130000 102704.4 34919.5 65730.82 2054.088 0 0 2665000 103351.8 38240.17 63044.6 516.759 1550.277 0 2435000 148097.6 58498.55 88858.56 740.488 0 0 2890000 249029.7 95876.43 153153.3 0 0 0 2385000 154034.8 52371.82 99352.43 1540.348 770.1739 0 III 2475000 132092.7 59441.71 71990.52 660.4635 0 0 2865000 52515.27 24682.18 27307.94 525.1527 0 0 2830000 122016.7 56127.68 65889.01 0 0 0 2895000 158797.5 45257.28 111952.2 793.9873 793.9873 0 2810000 123194.2 28334.66 91779.65 1231.942 1847.912 0 2120000 40326.09 10888.04 29438.04 0 0 0 2920000 77946.61 21825.05 56121.56 0 0 0 3105000 87254.97 23995.12 57588.28 436.2748 5235.298 0 2190000 207810.2 43640.15 158974.8 2078.102 3117.153 0 IV 2400000 96532.59 33303.74 62746.19 482.663 0 0 2890000 208641.9 61549.36 142919.7 2086.419 2086.419 0 2725000 109604.7 42197.82 62474.69 4932.212 0 0 2345000 72525.77 16680.93 54031.7 1087.887 725.2577 0 2365000 156322 43770.15 109425.4 3126.439 0 0 2550000 117364 28754.18 86849.37 0 1760.46 0 2970000 305735.3 136052.2 166625.7 1528.676 1528.676 0 2765000 79650.21 42612.86 37037.35 0 0 0 3105000 193512.7 83210.48 107399.6 2902.691 0 0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 PHỤ LỤC E THÔNG SỐ HUYẾT HỌC CỦA CÁ SAU CẢM NHIỄM Số liệu huyết cầu của cá sau cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri NT Mật độ hồng cầu(tb/ml) Tổng bạch cầu(tb/ml) Lympho (tb/ml) Tiểu cầu(tb/ml) Mono (tb/ml) Trung tính(tb/ml) ĐTB (tb/ml) I 1600000 30434.78 14304.35 12478.26 3500 0 152.1739 1625000 17520.22 8584.906 5256.065 2277.628 525.6065 876.0108 1045000 15554.8 7932.95 6533.018 622.1922 466.6441 0 2625000 44491.53 24025.42 15127.12 4004.237 1334.746 0 1265000 20569.11 12752.85 3085.366 4422.358 0 308.5366 760000 14456.52 8384.783 2023.913 1662.5 1662.5 722.8261 1630000 27627.12 11188.98 15333.05 828.8136 138.1356 138.1356 625000 7591.093 3340.081 2429.15 1138.664 265.6883 417.5101 1605000 28310.72 8776.323 16844.88 1415.536 849.3216 424.6608 II 1425000 27105.98 14501.7 6640.965 3117.188 677.6495 2168.478 1000000 11463.25 7279.164 2636.548 630.4788 745.1113 171.9488 1880000 24118.84 9768.13 6512.086 4582.579 2532.478 723.5652 715000 10642.76 8194.926 1436.773 478.9242 478.9242 53.2138 630000 15491.8 6584.016 2556.148 3950.41 774.5902 1471.721 1555000 21013.51 13973.99 5148.311 1260.811 420.2703 210.1351 III 1450000 11693.55 5145.161 1695.565 3800.403 526.2097 526.2097 1705000 23040.54 11520.27 6451.351 3571.284 230.4054 1267.23 400000 29799.43 22498.57 4767.908 1787.966 446.9914 297.9943 1805000 44385.25 18197.95 22192.62 3106.967 221.9262 665.7787 1275000 48529.41 20867.65 4852.941 12617.65 1941.176 8250 1655000 25771.83 12885.92 3221.479 4381.212 644.2959 4638.93 1275000 16357.19 9977.887 3516.796 1553.933 1308.575 0 1110000 5204.287 3174.615 1066.879 312.2572 494.4072 156.1286 400000 12371.13 7608.247 494.8454 1051.546 432.9897 2783.505 IV 1595000 15026.92 4958.883 8715.612 1277.288 75.13459 0 1325000 30729.88 17055.08 8143.417 4609.482 614.5975 307.2988 1040000 39584.78 27907.27 5937.716 4156.401 593.7716 989.6194 1175000 23979.59 10071.43 13188.78 359.6939 239.7959 119.898 1355000 13686.87 8348.99 1163.384 2463.636 1437.121 273.7374 1615000 22931.03 9860.345 9860.345 2407.759 343.9655 458.6207 1555000 42602.74 16828.08 24709.59 426.0274 213.0137 426.0274 1735000 10472.84 8116.449 628.3702 1204.376 104.7284 418.9135 1695000 40494.88 14375.68 12350.94 7896.502 3847.014 2024.744 975000 21932.52 14804.45 2522.239 4386.503 219.3252 0 2060000 29249.49 20328.4 3656.187 3948.682 292.4949 1023.732 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 PHỤ LỤC E THÔNG SỐ HUYẾT HỌC CỦA CÁ CÒN SỐNG SAU CẢM NHIỄM Số liệu huyết cầu của cá còn sống sau cảm nhiễm NT Mật độ hồng cầu(tb/ml) Tổng bạch cầu(tb/ml) Lympho(tb/ml) Tiểu cầu(tb/ml) Mono(tb/ml) Trung tính(tb/ml) ĐTB(tb/ml) I 1630000 126465.5 65129.74 58174.14 1264.655 632.3276 1264.655 2610000 212638.8 83992.32 118014.5 3189.582 7442.358 0 2805000 189661.9 54053.65 125176.9 2844.929 7586.477 0 2140000 164379 73148.67 81367.62 3287.581 6575.162 0 3535000 268802 95424.71 170689.3 1344.01 1344.01 0 1105000 163171.4 57109.98 87296.69 3263.428 15501.28 0 3290000 168304.1 68163.17 96774.88 841.5207 2524.562 0 3110000 105024.1 11552.65 91896.11 525.1206 1050.241 0 1880000 349249 237489.3 103028.5 1746.245 6984.98 0 1905000 225872.5 83572.82 132135.4 3388.087 6776.174 0 3270000 268961 68585.06 193651.9 4034.416 2689.61 0 II.2 3145000 227051.5 65844.92 152124.5 3405.772 5676.287 0 2590000 206976.2 56918.47 103488.1 8279.05 38290.6 0 III.1 920000 57337.11 25228.33 25515.01 4873.654 4586.969 0 1945000 245315.3 87086.94 65008.56 9812.613 83407.21 0 1940000 126761.4 16478.98 57676.42 5704.261 46901.7 0 IV.1 2645000 188928.6 50066.07 122803.6 0 16058.93 0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 PHỤ LỤC F Bảng F1: Bảng theo dõi tỉ lệ chết của cá sau cảm nhiễm NT NT1 NT1 NT1 NT2 NT2 NT2 NT3 NT3 NT3 NT4 NT4 NT4 NT5 NT5 NT5 Ngày Bể T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 14/01/09 Ngày 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15/01/09 Ngày 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 16/01/09 Ngày 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17/01/09 Ngày 4 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 18/01/09 Ngày 5 0 0 0 5 3 6 2 10 8 8 9 8 8 8 6 19/01/09 Ngày 6 0 0 0 10 8 10 5 10 10 9 10 9 10 10 10 20/01/09 Ngày 7 0 0 0 10 8 10 5 10 10 9 10 9 10 10 10 21/01/09 Ngày 8 0 0 0 10 8 10 5 10 10 9 10 9 10 10 10 22/01/09 Ngày 9 0 0 0 10 8 10 5 10 10 9 10 9 10 10 10 23/01/09 Ngày 10 0 0 0 10 8 10 5 10 10 9 10 9 10 10 10 24/01/09 Số liệu cá chết được cộng tích lũy theo từng ngày Mật độ vi khuẩn: 1,2 x 106 NT1: Thức ăn 0% Antistress (tiêm 0.85% NaCl) NT2: Thức ăn 0% Antistress (tiêm vi khuẩn) NT3: Thức ăn 0,2% Antistress (tiêm vi khuẩn) NT4: Thức ăn 0,4% Antistress (tiêm vi khuẩn) NT5: Thức ăn 0,6% Antistress (tiêm vi khuẩn) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version