Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

mở bằng các khe nút dọc theo hai bên đường của giá noãn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, tùy vào giống, loài mà hạt có thể từ vài trăm đến vài ngàn hạt. Hạt cần trải qua 130 – 150 ngày để hạt trưởng thành, hạt nở sau 90 ngày. Hạt nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa. Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào. Trong thực nghiệm, người ta có thể đánh thức các “ phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose. Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam) Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp ( Keiki chỉ một cây con mọc từ một mắt trên cuống hoa. Một số loài hoa nhỏ như P. lueddemanniana thường tạo Keiki trên cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả đầu tiên vào năm 1894 (Williams và Williams, 1894). Keiki còn có thể được hình thành ở nhiều loài Phalaenopsis và một số loài thuộc các chi lai. Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ. Việc trồng và chăm sóc lan hồ điệp gặp rất nhiều khó khăn, để có được những cây khỏe mạnh, cho hoa đẹp cần phải tốn nhiều công sức và thời gian chăm sóc, vì vậy việc tìm hiểu điều kiện sống phù hợp của giống lan này là điều kiện cần thiết để có được Hồ điệp là một loài lan ở vùng nhiệt đới mà sự tăng trưởng của chúng chịu ảnh hưởng của hai mùa mưa nắng rõ rệt. Tuy nhiên lan hồ điệp chỉ xuất hiện ở những vùng rừng ẩm hoặc ven suối. Không có sự biến động đáng kể về nhiệt độ và ẩm độ giữa mùa mưa và mùa khô nơi hồ điệp sinh sống, vì thế cây hồ điệp không có mùa nghỉ mặc dù do sự bất lợi về thời tiết trong mùa khô, cây hồ điệp tăng trưởng chậm hơn chút ít so với mùa mưa (trong điều kiện tự nhiên). Nhiệt độ thích hợp cho lan hồ điệp sinh trưởng và phát triển là 18oC vào ban đêm và 22oC - 25oC vào ban ngày. Tuy nhiên hồ điệp là loài lan chịu nóng hơn đa số các loài khác, do đó nó cũng có thể tăng trưởng khá tốt ở bất cứ nơi nào nhiệt độ không quá 35oC vào ban ngày và 25oC vào ban đêm. Đây là loài lan có biên độ khá rộng về ánh sáng, ánh sáng hữu hiệu cho loài lan này là 30%. Vì thế với giàn che có độ che sáng 70% là thích hợp. Đây là loài lan duy nhất chịu được ánh sáng yếu, nhưng thực tế nhu cầu ánh sáng của chúng cao hơn nhiều, vì thế không nên đặt lan hồ điệp vào nơi quá râm mát. Ánh sáng rất cần thiết cho sự tăng Hồ điệp với bộ lá màu xanh đậm chưa phải là cây lí tưởng cho việc ra hoa, hơn nữa cây trồng trong điều kiện này có khẳ năng kháng bệnh kém. Cây lan được đặt nơi có ánh sáng khuếch tán vừa phải với bộ lá có màu xanh, có ánh sáng nhẹ màu vàng là tốt Ở Việt Nam, nếu cây lan hồ điệp được trồng với 12 giờ chiếu sáng trong ngày, trong đó khoảng 1 - 2 giờ cây nhận được ánh sáng trực tiếp, cây sẽ phát triển tốt Hồ điệp là loại đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho chúng lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm. Trong mùa mưa mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng, một lần lúc 3 giờ chiều. Tưới như vậy sẽ đảm bảo cho cây khô ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây thối lá. Tốt nhất nên tưới từ trên xuống và tưới nghiêng để nước không đọng trên hoa. Vào mùa nắng nên tưới chúng 3 lần/ngày. Nếu thời tiết trở nên quá lạnh thì phải đợi cho nước ấm hơn mới tưới cây để cây không bị rét vì nước quá Lan hồ điệp cần độ ẩm cao vào ban ngày, lá cần không khí ẩm khoảng 80%. Không để nước nhiều trong chậu, cần để độ ẩm không khí cao. Ở vùng khô hạn, chúng ta cần tăng độ ẩm bằng cách đặt cây phía trên một khay nước (không để đáy chậu đụng vào nước). Không nên để cây trong điều kiện khô hạn quá lâu. Cây cần được thông thoáng cao để tránh vi khuẩn và vi nấm gây viêm nhiễm. Một số vi khuẩn rễ sẽ làm úng rễ. Để giải quyết những vấn đề này, cần cắt bỏ phần lá bị nhiễm, dùng thuốc mancozeb, sau đó để cây trong điều kiện khô ráo trước khi xịt thuốc khử trùng benzyl konium chloride để diệt bào tử quanh cây và chậu. Sau đó tăng độ thông thoáng cho cây lên để loại bỏ hoàn toàn nguyên nhân này. Trong khi xử lí cây nên giữ bề mặt được khô ráo trong giây lát. Nếu không thể để cây được thông thoáng tự nhiên có thể giảm nhiệt độ vào ngày nóng và sấy khô nhẹ cho cây vào đêm lạnh. Nên sử dụng các loại chậu thông thoáng, có vòm ở đáy giữ nước. Các loại chậu nhựa giúp mau khô thoáng, chậu bằng đất giúp giữ ẩm khi gió lớn. Còn các chậu có kích thước phù hợp để bộ rễ phát triển tốt vì các chậu quá to sẽ làm giảm độ ẩm. Đối với các cây trong chậu cao 13, 18, 25 cm thì sử dụng một lớp giá thể (vỏ cây, dớn) dày khoảng 13 cm trộn với 20% than hoạt tính loại tốt. Trồng cây vào chậu, sau đó thêm lên bề mặt chậu hỗn hợp giá thể tương tự để giữ ẩm cho rễ. Sử dụng hỗn hợp giá thể phù hợp, không quá khô cũng không quá ẩm ướt. Cây nên được trồng trong vườn ươm hoặc những nơi có điều kiện tương tự nhưng phải được thông khí từ hai phía. Chúng ta còn có thể trồng cây bên ngoài nhà kính, trong các hành lang, sân nhà có rào, hướng nam, khi đó cây cần có ẩm độ phù hợp và hứng được ánh sáng vừa đủ, nên để cây cạnh cửa sổ hướng nam, nhiều bóng râm là Thông thường cần bón phân cho cây 2 lần mỗi tuần. Cây cần được bón phân thường xuyên vì chúng không thể giữ được phân bón lâu. Nên sử dụng các loại bình xịt để tưới ướt là giúp lá hấp thụ chất dinh dưỡng tốt nhất và dùng thêm chất giữ ẩm pha vào phân. Phân bón tùy giai đoạn như sau:  Khi cây ra hoa nên bón 6,9N - 10,8P - 27,1K vào mùa thu. Nồng độ đạm thấp giúp lá tăng trưởng, P giúp rễ tăng trưởng tốt và K giúp cây cứng cáp, tạo phát  Vào tháng 5 đến tháng 10, sử dụng dung dịch: 17,5N - 4,6P - 22,5K để cây phát  Từ tháng 10 đến tháng 12 cần tưới 20,3N - 3,3P - 17K giúp cho tế bào phân chia nhanh. Tuy nhiên, một số trường hợp cây sẽ bị mềm và yếu nếu sử dụng quá lâu. Chú ý cắt bỏ rễ hư hỏng của cây và rửa với dung dịch mancozeb chuẩn trong 10 phút. Sử dụng dao sạch khuẩn để phòng bệnh cho cây. Vào thời điểm có hoa cần chú ý tạo dáng cho cành hoa sớm để có được vòm hoa đẹp. Khi cụm hoa bắt đầu rộ, chúng ta không nên di chuyển cây, thời gian này cần tăng cường ánh sáng và dinh dưỡng cho cây. 2.7.5.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt Trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện. Cánh môi của hoa lan có hình dạng và cấu tạo đặc biệt thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang phấn đi. Thông thường, để đạt tỷ lệ thụ phấn thành công cao, con người Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã khám phá ra được nguyên nhân làm cho hạt lan có thể nảy mầm liên quan đến sự có mặt của nấm rễ. Nếu không có nấm cộng sinh thì lan không thể nảy mầm. Với vai trò là nguồn cung cấp đường cho hạt lan, hệ thống rễ sợi của nấm xâm nhập vào trong phôi và cung cấp nguồn cacbon cho phôi Năm 1922, Knudsun đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn. Khi qủa đã chín 2/3 có thể khử trùng quả bàng dung dịch thuốc tẩy và cồn. Sau đó dùng một con dao tách vỏ và lấy hạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Sau khi hạt nảy mầm được 30 - 60 ngày chuyển cây con sang môi trường mới. Rễ thường hình thành khi cây con có từ 2 - 3 lá. Cấy chuyển cây con sau mỗi 30 - 60 ngày đồng thời giảm mật độ cây trong bình. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn tùy giống. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật ở các cây họ lan là biến dị xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp mang lại sự đa dạng cho các loài lan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì các cây con tạo thành từ hạt 2.7.5.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng. Trong điều kiện ẩm độ tốt hoặc trồng trong các nhà kính mang tiểu khí hậu nhân tạo thì có thể Vào thời kỳ cuối mùa sinh trưởng của cây, cây được cắt rời thành từng đoạn lan và vẫn giữ nguyên trong chậu. Sau một thời gian, lấy cây đem cắt bỏ các rễ hư rồi rửa bằng dung dịch khử trùng để tiêu diệt hết mầm mống gây bệnh. Sau đó đặt các đoạn lan vừa tách chiết vào giữa chậu mới. Để cây ở nơi có điều kiện ẩm độ và ánh sáng thích hợp với từng loại cụ thể để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Những loài lan đơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió. Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to. Phần bên gốc cây cắt sát sẽ nảy ra 2 - 3 cây con ở nách lá gần chỗ cắt. Có thể dùng dây kẽm siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc ra 2 - 3 cây con. Khi hoa tàn thì cắt bỏ chừa 3 - 4 mắt phía trên phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên cây con. Phalaenopsis trồng lâu năm có thể ra cây Việc nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chiết truyền thống tạo được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao. Hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị, vì vậy việc nuôi cấy hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti, 1992). Vì vậy, để sản xuất cây con đồng loạt cần phải áp dụng phương pháp nhân giống vô tính. Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính Phalaenopsis là nguồn mẫu rất hạn chế do chúng là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và Sagawa, 1974). Hơn nữa, Phalaenopsis thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, Một số phương pháp nhân giống vô tính Phalaenopsis thành công được trình bày 2.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh Chồi đỉnh của cây Phalaenopsis khi bị tổn thương hoặc già cỗi có khả năng được tạo ra được một hoặc nhiều chồi từ các chồi ngủ ở gốc. Từ quan sát này, các nhà làm vườn đã mạnh dạn cắt phần phía dưới các rễ khí của cây và nuôi cấy riêng lẻ chúng để nhân thành các cây mới theo ý muốn. Phương pháp này được xem là phổ biến nhất. Chồi có thể phát triển từ phần gốc khi được nuôi cấy ở 27oC (Trần Thanh Vân, 1974). Từ phương pháp này, một chồi ban đầu có thể tạo ra 3 - 4 chồi khác trong 10 tháng (Trần Thanh Vân, 1974). Các chồi sinh dưỡng phát triển thành chồi ngủ trên trục cây Phalaenopsis, từ nách lá mỗi chồi sẽ tạo ra 2 chồi mới (Koch, 1974, Holters, 1983). Phương pháp sử dụng chồi đỉnh được ứng dụng thành công cho nhiều loài lan. Tuy nhiên, đối với các loài lan đơn thân như Phalaenopsis, khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh sẽ làm tổn thương cây mẹ, do đó, hiện nay phương pháp nhân giống sử dụng phát hoa được sử dụng phổ biến hơn. 2.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis Gavino Rotor là người đầu tiên trong việc nhân giống vô tính in vitro lan hồ điệp khi còn là nghiên cứu sinh Lawrence McDaniels Đại Học Cornell (Rotor, 1949). Ông đã sử dụng phát hoa đã bỏ lá bắc mang 4 - 6 chồi, cắt phát hoa thành các đoạn mang một chồi nằm giữa cách hai đầu cắt 7 - 8 cm. Sau đó khử trùng bề mặt và cắt vô trùng thành các đoạn mang chồi cách hai đầu 1- 2 cm. Cấy các đoạn phát hoa vào môi trường Knudson C làm rắn với agar, các đoạn phát hoa được cắm thẳng cho chồi hướng lên. Phương pháp của Rotor ít được chú ý đến do tỷ lệ nhiễm cao và hệ số nhân thấp. Nhưng 10 năm sau đó những nhà nghiên cứu khác đã tạo ra nhiều quy trình mới dựa trên phương pháp này (Sagawa và Niimoto, 1960; Sagawa, 1961; Kotomori và Hình 2.5: Quy trình tái sinh cây con từ phát hoa lan hồ điệp Phương pháp nhân giống từ phát hoa là phương pháp đặc trưng ở Phalaenopsis. Ưu điểm chính của phương pháp này là tạo ra cây con sạch bệnh và đồng nhất về di truyền, điều mà gieo hạt truyền thống không thể đạt được. Ngoài ra, việc nhân giống in vitro từ phát hoa có ưu điểm lớn là không làm tổn thương cây mẹ, so với việc nhân giống từ ngọn chồi hoặc lá trưởng thành từ cây mẹ. Tuy nhiên, phương pháp này có khuyết điểm là hệ số nhân thấp. Do vậy phương pháp nhân giống vô tính từ phát hoa thường được sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu mô in vitro cho các phương pháp hiệu quả hơn sau này. Một số phương pháp mới như phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo mô sẹo và phát sinh phôi vô tính đem lại hệ số nhân cao đều dựa vào nguồn mẫu in vitro tạo thành nhờ nuôi cấy phát hoa (Tanaka và cộng sự, 1977; Park và cộng sự, 2000, 2.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis M.Tanaka và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vô tính cây Phalaenopsis từ mô lá tại trường đại học Osaka, Nhật Bản (Tanaka và cộng sự, 1975; Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Nguyên liệu cho các thí nghiệm ban đầu của nhóm là mô lá lấy từ cây trưởng thành và từ cây con in vitro tạo thành từ gieo hạt. Tuy nhiên các lá trưởng thành này không có khả năng tạo PLB, trong khi đó lá các cây con mới nảy mầm lai tạo được PLB. Như vậy, khả năng tạo PLB giảm xuống khi tuổi cây giống tăng lên (Tanaka và cộng sự, 1975). Theo phương pháp này, PLB có thể tạo ra từ nuôi cấy mẫu lá in vitro trên môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB (từ 1 đến 7 PLB) tại mặt cắt của mẫu lá. Các PLB này có thể được biệt hóa tiếp tục trên môi trường lỏng Vacin – Went bổ sung 20% nước dừa và tiếp tục được tái sinh trên môi trường gieo hạt Phalaenopsis. Sau khi chuyển sang vườn ươm cây tiếp tục phát triển bình thường và nở hoa. Quy trình này tạo được số lượng lớn cây giống đồng nhất về mặt 2.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con Cho đến nay, chưa có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tối ưu hóa giai đoạn tăng trưởng PLB thành cây con, chủ yếu chỉ theo dõi ảnh hưởng của các chất bổ sung lên tốc độ tăng trưởng chứng tỏ là quá trình sản xuất trong thực tế đã khá hoàn thiện về Nghiên cứu về việc sử dụng các chất chống nâu hóa trong giai đoạn này, cho thấy chồi con phát triển tối đa trong môi trường bổ sung 2 g/l than hoạt tính. Khảo sát của Rahman A. và cộng sự chứng tỏ chồi non tăng trưởng mạnh trên môi trường bổ sung 50 ml/lít cao bắp, tốt hơn dịch khoai tây và đu đủ. Một vấn đề thực tế là quá trình tăng trưởng PLB của cây con thường xảy ra không ổn định, điều này thường gặp ở rất nhiều cơ sở sản xuất giống lan hồ điệp trong nước. PLB có xu hướng tạo thành cụm chồi nhiều hơn là chồi, làm giảm tốc độ tăng trưởng riêng của chồi, buộc người sản xuất phải có thêm một đợt cấy chuyền không mong muốn. Vần đề này có thể được giải quyết bằng cách bổ sung IAA thay cho NAA 2.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp Hồ điệp không chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, hồ điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành công nghiệp trồng hoa ở Hà Lan. Chúng còn là những món quà xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản. Ngoài ra các loài hoa đẹp, xa xỉ cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng quà Lan hồ điệp, là một loài lan có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, cũng là một loài cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Hơn nữa, trong vài thập kỉ gần đây nền công nghệ trồng lan phát triển giúp người trồng đã giảm giá thành đáng kể đối với loại lan này nên giá cả phù hợp với những người mê hoa hay người mới tập trồng. Hồ điệp rất được ưa chuộng và được trồng ở nhiều nơi. Trước đây, hồ điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hoá cao cấp trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, công nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các ngày lễ. Thêm vào đó, công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu hoa, kích thước hoa…Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi lan và tạo nên những cơn sốt hoa lan trên thị trường thế giới. Hồ điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con lại được xuất khẩu cho các nước khác với cả Mỹ để trồng ra hoa. Hàng ngàn các giống được lai và tạo dòng rất có giá trị trên thị trường. Các nhà nhân giống đã gieo hạt được rất nhiều giống hồ điệp có chất lượng hoa và cây giống rất có giá trị như các tính trạng qui định màu sắc hoa, và cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, và gần đây là các giống có hương thơm. Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn đến một hệ quả là các giống có giá trị hiện nay có thể không còn giá trị chỉ trong vài năm nữa. Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Thời gian thực hiện từ tháng 2 - 2009 đến tháng 7 - 2009 tại phòng di truyền giống cây trồng - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, số 121 Nguyễn Bỉnh Thí nghiệm được tiến hành trên giống lan hồ điệp lai Phalaenopsis sp tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.  Bình chứa môi trường nuôi cấy, pipet, ống đong.  Bàn để môi trường và mẫu cấy.  Các dụng cụ thao tác: dao, kéo, pen, đèn cồn, bình tia, bông gòn thấm nước. Ghi chú: tất cả phải được hấp vô trùng.  Các kệ để bình hay ống nghiệm nuôi cấy.  Máy điều hòa nhiệt độ: nhiệt độ phòng cấy từ 24oC đến 25oC.  Phòng sáng được trang bị 2 máy lạnh Panasonic chỉnh nhiệt độ 25oC, chiếu sáng bằng đèn Compact 3U theo quang kì 16 giờ sáng/8 giờ tối, cường độ ánh sáng là 2000 lux. Ẩm độ không khí trong phòng biến động từ 50 - 70%. Môi trường nuôi cấy: môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường MS BAP (6-benzyladenine), NAA ( - naphthaleneacetic acid), TDZ (Thidiazuron) Các chất khác: đường glucose, agar, nước dừa. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl để đạt pH = 5,8. 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vô trùng mẫu cấy lan hồ điệp nhằm tạo nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp Vật liệu thí nghiệm: các mắt ngủ được cắt từ phát hoa của lan hồ điệp. Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy Môi trường vào mẫu: MS + agar (8 g/lít) + đường (30 g/lít) + than hoạt tính (2 g/lít)+ nước dừa (10 ml/lít) + BAP (2 mg/lít), pH = 5,8. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố , 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức cấy 20 mẫu. Nồng độ Javel (%) Quan sát và ghi nhận tỷ lệ mẫu sống: 10 ngày sau xử lý, 20 ngày sau xử lý, 30  Tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn. Tổng số mẫu nhiễm % Tỷ lệ nhiễm = ------------------------------- x 100 Tổng số mẫu cấy  Tỷ lệ mẫu chết, mẫu sống. Số mẫu chết % Tỷ lệ mẫu chết = --------------------------- x 100 Tổng số mẫu đưa vào % Tỷ lệ mẫu sống = 100% - tỷ lệ mẫu chết. 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp Mục tiêu thí nghiệm: tìm nồng độ BA, TDZ và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro. Vật liệu thí nghiệm: lá của lan hồ điệp lai được nuôi cấy in vitro. Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b) Sáng 3 6 9 15 3 6 9 15 5+3 3+5 2+7 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tố gồm 22 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 30 mẫu. Trong đó, yếu tố A : điều kiện nuôi cấy; yếu tố B: nồng độ chất điều hòa sinh trưởng. Môi trường nền (MTN): môi trường MS + đường (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít), NAA (1 mg/lít), agar (8 g/lít), than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8. Quan sát và ghi nhận tỷ lệ tạo protocorm 80 ngày sau cấy. Tổng số mẫu tạo protocorm  Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) = ----------------------------------- x 100 Tổng số mẫu cấy  Thời gian tạo protocorm: tính từ khi protocorm đầu tiên hình thành được nhìn thấy. Tổng số khối protocorm  Tỷ lệ khối protocorm được tạo ra (%) = ----------------------------------- x 100 Tổng số mẫu cấy  Đường kính khối protocorm.  Chiều cao khối protocorm. 3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA và BAP thích hợp cho cây lan hồ Vật liệu thí nghiệm: mẫu nuôi cấy là cây lan Phalaenopsis in vitro, có 3 lá. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại cấy 3 chai, mỗi chai cấy 5 mẫu. Môi trường nền: MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 Chỉ tiêu theo dõi:  Thời gian tạo rễ (NSC): tính từ ngày bắt đầu cấy đến ngày mẫu cấy ra rễ đầu tiên  Chiều dài rễ (mm): đo từ đầu rễ đến chóp rễ. Tổng số cây có rễ  Tỷ lệ cây có rễ (%) = --------------------------- x100 Tổng số cây cấy Tổng số rễ  Số rễ trung bình (rễ/cây) = ----------------------- Tổng số cây Tổng số lá  Số lá trung bình (lá/cây) = ----------------------- Tổng số cây  Chiều cao chồi: đo từ gốc đến chữ v trên cùng. Các chỉ tiêu được tiến hành theo dõi ở 20 ngày sau cấy, 10 ngày theo dõi 1 lần. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm thống kê MSTATC. 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy Khử mẫu là một bước kỹ thuật đầu tiên của mọi quy trình nuôi cấy mô thực vật, đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ điều kiện tự nhiên vào điều kiện nuôi cấy vô trùng. Đối tượng nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: phát hoa, đỉnh sinh trưởng, thân, lá. Tùy theo khả năng tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà bộ phận này chứa ít hay nhiều nấm khuẩn. Trong khi môi trường để nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin. Thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do đó tốc độ phân bào của nấm, vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, chỉ cần bị nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô cấy sẽ phủ một hoặc nhiều loại nấm hay vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô cấy không thể tiếp tục phát triển và chết dần. Vì vậy, đối với loại cây trồng khác nhau, việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có tính chất quyết định tới sự thành công của quá trình nuôi cấy mô tế bào. Một số chất khử trùng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô như : HgCl2, javel, Ca(0Cl)2 đều mang lại hiệu quả cao. Trong thí nghiệm này, nước javel được dùng làm chất khử trùng phát hoa của lan hồ điệp vì giá thành rẻ, an toàn và mang lại hiệu quả cao. Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ javel khác nhau trong thời gian 30 phút, kết quả khử trùng mẫu được thể hiện ở bảng 4.1: Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu Hóa chất Nồng độ khử trùng (%) Javel Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 nhận thấy: Với các nồng độ javel khác nhau cho tỷ lệ nhiễm khác nhau, nồng độ javel càng thấp thì mức độ tạp nhiễm nấm và vi khuẩn càng cao. Mẫu bị nhiễm có thể là do thao tác thí nghiệm như: rửa mẫu không sạch, thao tác cấy, hoặc do bản thân mẫu cấy dễ bị nhiễm. Ở giai đoạn 10 NSC, 20 NSC, 30 NSC: khử trùng bằng javel 20% trong thời gian 30 phút cho kết quả nhiễm cao nhất (40% ở 10 NSC, 55% ở 20 NSC, 70% ở 30 NSC). Khử trùng bằng javel 60% và javel 80% trong 30 phút không có mẫu nhiễm ở 10 NSC nhưng sau đó thì mẫu bắt đầu bị nhiễm và tỷ lệ nhiễm tăng dần ở 20 NSC (javel 60% nhiễm 15% , javel 80% nhiễm 5%) và 30 NSC (javel 60% nhiễm 20% và javel 80% nhiễm 10%). Xử lý javel 80% trong 30 phút cho tỷ lệ nhiễm thấp nhất (10% ở 30 NSC). Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ chết và tỷ lệ sống của mẫu Nồng độ javel (%) 20 40 60 80 Tỷ lệ chết (30NSC) 70 70 35 30 Đối với nồng độ javel thấp hơn 60%, mẫu sau khi cấy bị nấm và vi khuẩn phát triển mạnh, mặt thạch bị che phủ bởi các bào tử nấm (dịch vi khuẩn). Xử lý javel 20% và javel 40% trong thời gian 30 phút cho tỷ lệ mẫu chết (70%) và tỷ lệ mẫu sống bằng nhau (30%). Khử trùng mẫu bằng javel 80% cho tỷ lệ chết thấp nhất (30%) và tỷ lệ sống cao nhất (70%). Mẫu sống nảy chồi, phát triển tốt. Nhìn chung, mỗi nồng độ javel khác nhau thì thu được tỷ lệ mẫu sống, mẫu chết và tỷ lệ nhiễm khác nhau. Với 4 nồng độ khử trùng trên thì khử trùng bằng javel 80% trong thời gian 30 phút cho hiệu quả tốt nhất. So với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Huệ năm 2007 về khử trùng phát hoa lan hồ điệp, có thể sử dụng HgCl2 0,1% với hình thức khử trùng kép và thời gian khử trùng hai lần là 6 phút cho tỷ lệ mẫu phát hoa lan hồ điệp sống là 60%. Kết quả này thấp hơn kết quả thí nghiệm khi xử lý bằng javel nồng độ 60% và 80% trong 30 phút (tỉ lệ sống lần lượt là 65% và 70%). Các kết quả nghiên cứu với việc sử dụng HgCl2 làm chất khử trùng với nồng độ thấp đều cho hiệu quả khá cao vì HgCl2 ít hoặc không gây tổn thương tế bào mẫu cấy. Tuy nhiên, HgCl2 là một hoá chất gây độc cho người và động vật vì vậy chất này rất hạt chế hoặc cấm sử dụng. Do đó, thời gian và chất khử trùng phù hợp cho việc khử trùng bề mặt mẫu cấy phát hoa của lan hồ điệp là javel 80% trong 30 phút. Hình 4.1: Mẫu nảy chồi và hình thành hoa thứ cấp (20 NSC) 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp in vitro Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ mẫu lá hình thành protocorm A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CV (%) Ftính Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (**: α = 0.01), các giá trị xử lý được chuyển đổi theo công thức (x + 0,5)1/2 Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.2 cho thấy: Trong điều kiện nuôi cấy khác nhau thì lượng mẫu tạo protocorm khác nhau. Khi nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng thì số nghiệm thức có mẫu tạo protocorm (8 NT) ít hơn trong tối (9 NT) và số lượng mẫu tạo protocorm trong tối trung bình 4,2 mẫu/NT nhiều hơn số mẫu tạo protocorm trong điều kiện có ánh sáng trung bình 2,3 mẫu/NT. Nghiệm thức 9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho số mẫu tạo protocorm nhiều nhất. Trong đó, ở điều kiện tối thì lượng mẫu tạo protocorm (93,3%) nhiều hơn lượng mẫu tạo protocorm khi nuôi trong điều kiện có ánh sáng (66,7%). Nghiệm thức 2 (6 mg BAP/lít, 1,67 mẫu tạo protocorm) và nghiệm thức 5 (3 mg TDZ/lít, 0,67 mẫu tạo protocorm) có mẫu tạo ra được protocorm khi nuôi trong tối nhưng không tạo được protocorm khi nuôi ngoài sáng. Sử dụng nồng độ BAP 15 mg/lít (nuôi trong tối, NT4) và TDZ 6 mg/lít (nuôi ngoài sáng, NT6) thu được tỉ lệ mẫu tạo protocorm bằng nhau (43,3%). Các nghiệm thức không có phản ứng với môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy (không tạo ra protocorm) gồm: NT1 (BAP 3 mg/lít, nuôi trong tối và sáng), NT8 (TDZ 15 mg/lít, nuôi trong tối và sáng), NT2 (6 mg BAP/lít, nuôi trong sáng), NT5 (TDZ 3 mg/lít, nuôi trong sáng). Như vậy, khi nuôi mẫu trong điều kiện tối (che sáng 100%) sẽ cho kết quả tốt hơn khi nuôi ngoài sáng. Bảng4.4:Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ đến phản ứng của mẫu NT BAP 3 mg/l BAP 6 mg/l BAP 9 mg/l BAP 15 mg/l TDZ 3 mg/l TDZ 6 mg/l TDZ 9 mg/l TDZ 15 mg/l BAP 3 mg/l + TDZ 5mg l BAP 5mg/l + TDZ 3mg/l 30,0 3,00 BAP 7 mg/l + TDZ 2 mg/l 10 CV (%) 10,38 Ftính 115,24** Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (**: α = 0.01), các giá trị xử lý được chuyển đổi theo công thức (x + 0,5)1/2. Sử dụng nồng độ BAP và TDZ khác nhau thì tỷ lệ mẫu tạo protocorm khác nhau. Nghiệm thức 9 bổ sung BAP và TDZ (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) có số mẫu tạo protocorm cao nhất (80%). Một số nghiệm thức chỉ sử dụng 1 loại chất điều hòa sinh trưởng cho tỷ lệ tạo protorcom thấp hơn hẳn. Chẳng hạn, ở nghiệm thức 5 (3 mg TDZ/lít) cho kết quả thấp nhất (3,3%). Thậm chí ở hai nghiệm thức 1 (3 mg BAP/lít) và nghiệm thức 8 (15 mg TDZ/lít) không tạo được protocorm khi nuôi trong điều kiện sáng và tối. Sự sai khác này rất có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Từ những kết quả trên, có thể nhận thấy rằng kết hợp giữa 3 mg BAP/lít và 5 mg TDZ/lít trong môi trường nuôi cấy nhằm tăng khả năng tạo protocorm của lan hồ điệp. Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu lá lan hồ điệp in vitro A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Từ kết quả bảng 4.5 cho thấy: Khi nuôi trong điều kiện tối thì tỷ lệ mẫu sống cao hơn khi nuôi ngoài sáng. Với điều kiện trong tối: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) tỷ lệ mẫu sống là 100% trong đó số mẫu không tạo protocorm chỉ 6,7%. NT5 (3 mg TDZ/lít) cho tỷ lệ mẫu không tạo protocorm cao nhất (83,3%) và NT7 (9 mg TDZ/lít) cho tỷ lệ mẫu không tạo protocorm thấp nhất (16,6%), NT8 (15 mg TDZ/l) cho tỷ lệ mẫu chết cao nhất (66,7%). % Mẫu không tạo protocorm Trong tối 70,0 63,3 33,3 23,3 83,3 16,7 16,6 33,3 6,7 40,0 33,3 Khi nuôi ngoài sáng: NT1 (3 mg BAP/lít) có tỷ lệ mẫu không tạo protocorm cao nhất (60%), NT3 (9 mg BAP/lít) và NT7 (9 mg TDZ/lít) cho tỷ lệ mẫu không tạo protocorm thấp nhất (20%). NT2 (6 mg BAP/lít) và NT5 (3 mg TDZ/lít) có tỷ lệ mẫu chết cao nhất (56,7%). NT9 (5 mg TDZ/lít và 3 mg BAP/lít) có tỷ lệ mẫu chết thấp nhất (6,7%). Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CV (%) 8,93** Ftính Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (**: α = 0.01), các giá trị xử lý được chuyển đổi theo công thức (x + 0,5)1/2. Số khối protocorm tạo thành/LLL Tối sáng 0,0 gh 2,3 bc 7,3 de 5,0 hi 1,3 ab 8,3 ab 8,7 0,0 10,0 de 4,7 bcd 6,7 Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trong tối cho số lượng protocorm tạo ra cao hơn trong sáng. Số lượng khối protocorm tạo ra ở điều kiện tối dao động từ 1,3 khối protocorm/lần lặp lại (NT5) đến 10 khối protocorm/lần lặp lại (NT9). Trong khi đó, ở điều kiện nuôi cấy có ánh sáng thì số lượng này lại chỉ có từ 1 khối protocorm/lần lặp lại (NT11) đến 7,7 khối protocorm/lần lặp lại (NT9). Nghiệm thức 9 (5 mg TDZ/l + 3 mg BAP/l) tạo ra được nhiều khối protocorm nhất. Khi nuôi trong tối thì lượng khối protocorm tạo ra (10 khối protocorm/lll) nhiều hơn lượng khối protocorm tạo ra khi nuôi trong điều kiện có ánh sáng (7,7 khối protocorm/lll), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 6 (6 mg TDZ/lít) và nghiệm thức 7 (9 mg TDZ/lít) khi nuôi trong tối. NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) ở điều kiện sáng đạt 7,7 khối protocorm/lll, sự khác biệt này lại rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 6 (6 mg TDZ/lít) và nghiệm thức 7 (9 mg TDZ/lít) khi nuôi ngoài sáng. Nghiệm thức 2 (6 mg BAP/lít, 2,3 khối protocorm/lll) và nghiệm thức 5 (3 mg TDZ/lít; 1,3 khối protocorm/lll) tạo ra được khối protocorm khi nuôi trong tối nhưng không tạo ra được khối protocorm khi nuôi trong sáng. NT1 (3 mg BAP/lít) và NT8 (15 mg TDZ/lít) không tạo ra được khối protocorm khi nuôi ở trong cả hai điều kiện nuôi cấy khác nhau. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm và quan sát thấy khối protocorm tạo ra trong điều kiện tối thì có màu xanh nhạt hơn màu của khối protocorm được nuôi trong điều kiện sáng và protocorm được tạo ra sớm hơn. Bảng 4.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới kích thước của protocorm A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CV (%) 9,23 9,44 Ftính 7,74** 3,43** Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (**: α = 0.01), các giá trị xử lý được chuyển đổi theo công thức (x + 0,5)1/2. Đường kính protocorm: Khi nuôi trong tối thì protcorm tạo ra có đường kính lớn hơn protocorm nuôi ngoài sáng. NT9 (5 mg TDZ/lít kết hợp 3 mg BAP/lít) có đường kính lớn nhất (5,7 mm trong tối, 4,7 mm ngoài sáng). Khi nuôi trong tối: NT9 tạo được protocorm có đường kính lớn nhất (5,7 mm) nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với NT7 (9 mg TDZ/lít). Ngoài NT1 (3 mg BAP/lít) và NT8 (15 mg TDZ/lít) không tạo được protocorm thì NT11 (2 mg TDZ/lít kết hợp 7 mg BAP/lít) có đường kính protocorm nhỏ nhất (1,3 mm). Khi nuôi ngoài sáng: NT1 (3 mg BAP/lít), NT2 (6 mg BAP/lít), NT8 (15 mg TDZ/lít) không tạo được protocorm. Trong số các NT tạo được protocorm thì protocorm ở NT11 (2 mg TDZ/lít kết hợp 7 mg BAP/lít) có đường kính thấp nhất (1,2 mm). Chiều cao của protocorm: Đường kính protocorm (mm) Trong tối Từ kết quả thí nghiệm ta thấy: chiều cao của protocorm trong tối cao hơn protocorm trong sáng. Khi nuôi trong điều kiện tối: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho kết quả cao nhất (2,67 mm), khác biệt này rất có ý nghĩa thống kê so với so với NT11 (2 mg TDZ/lít + 7 mg BAP/lít), NT1 (3 mg BAP/lít), NT2 (6 mg BAP/lít), NT3 (9 mg BAP/lít), NT8 (15 mg TDZ/lít) nhưng không có sự khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao protocorm dao động từ 1,42 mm (NT2) đến 2,67 mm (NT9). Ngoài NT1, NT8 không tạo được protocorm thì NT2 (6 mg BAP/lít) cho kết quả thấp nhất (1,42 mm) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với NT3 (9 mg BAP/lít), NT4 (15 mg BAP/lít), NT5 (3 mg TDZ/lít), NT10 (3 mg TDZ/lít + 5 mg BAP/lít), NT11(2 mg TDZ/lít + 7 mg BAP/lít). Khi nuôi ngoài sáng: NT9 (5 mg TDZ/lít + 3 mg BAP/lít) cho kết quả cao nhất (2,17 mm), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với NT3 (9 mg BAP/lít), NT4 (15 mg BAP/lít), NT6 (6 mg TDZ/lít), NT7 (9 mg TDZ/lít) nhưng lại có sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao protocorm của các nghiệm thức dao động từ 1 mm (NT10, NT11) đến 2,17 mm (NT9). Ngoài NT1 (3 mg BAP/lit), NT2 (6 mg BAP/lít), NT8 (15 mg TDZ/lít) không tạo được protocorm thì NT10 (3 mg TDZ/lít + 5 mg BAP/lít), NT11 (2 mg TDZ/lít + 7 mg BAP/lít) cho kết quả thấp nhất (1 mm). Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường thích hợp để tạo protocorm là: MS + đường (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than hoạt tính (2 g/lít ) và nuôi trong điều kiện tối, pH = 5,8. Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu suất tạo protocorm thấp trong điều kiện ánh sáng mạnh, tương tự như công bố của Tanaka và Sakanishi (1980), Park và cộng sự (2002). Kết quả này có thể giải thích do ánh sáng tác động lên sự hình thành hay biến tình các phân tử tín hiệu, dẫn tới ức chế quá trình phân chia tế bào. Điển hình là nghiên cứu của Imaizumi và cộng sự cho thấy tín hiệu tác động lên thụ quan ánh sáng xanh (Chryptochrom) có thể làm giảm hoạt tính của auxin ở rêu (Physcomytrella patens). Chính vì vậy trong điều kiện tối, hoạt tính của auxin không bị giảm đi. Phẫu thức cắt ngang lá phát sinh protocorm được hình thành từ mô hạ bì phân chia và dày lên. Sau đó xảy ra quá trình phân bào mạnh tạo sơ khởi protocorm và quá trình tăng trưởng tế bào diễn ra mạnh giúp protocorm tăng kích thước. Theo Vuyl Stake (1989) tác dụng kích thích tạo chồi đạt được chủ yếu vào việc nuôi cấy các mẫu trên môi trường bổ sung nồng độ cytokinin cao. Cytokinin có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng nếu sử dụng nồng độ quá cao sẽ làm giảm sự phát sinh và sinh trưởng của chồi, hình dạng của chồi bị thay đổi và biến dị soma tăng. Ngoài ra, ta còn có thể sử dụng một số môi trường khác để tạo protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp như: MS + nước dừa (10 ml/lít) + saccharose (3%) + agar (6,5 g/lít) + than hoạt tính (1 g/lít) + dịch chuối xanh (100 g/lít) + NAA (0,2 mg/lít) + BAP (1 mg/lít), pH = 5,8 (Nguyễn Thị Huệ, 2007). Đối với một số loại cây khác như cây dứa Long Phụng thì môi trường thích hợp cho tạo protocorm là: MS + agar (7,5 g/lít) + BAP (4 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) (Phạm Ánh Hồng, 2006). Hình 4.2: Protocorm được tạo ra trong điều kiện tối (80 NSC) Hình 4.3: Protocorm tạo ra trong điều kiện sáng (80 NSC) 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro Việc tạo cây hoàn chỉnh thân, lá, rễ là giai đoạn cuối của quá trình nuôi cấy in vitro. Các nhà nuôi cấy mô cho rằng, nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kích thích sự hình thành rễ. Do đó, trong kĩ thuật nhân giống vô tính in vitro thì việc sử dụng auxin để kích thích sự tạo rễ là vô cùng quan trọng. Kết quả thí nghiệm sử dụng nồng độ NAA (auxin) nhằm kích thích quá trình phát triển của cây lan hồ điệp được trình bày ở bảng 4.8. Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan hồ điệp in vitro Ngày sau cấy 20 NSC 30 NSC 40 NSC CV (%) Ftính Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau trên cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (**: α = 0.01). Từ kết quả thí nghiệm thu được ở bảng 4.8 nhận thấy: sau 7 ngày nuôi cấy thì rễ đầu tiên bắt đầu xuất hiện ở các nghiệm thức : NT2 (0,5 mg NAA/lít), NT3 (1 mg NAA/lít), NT4 (1,5 mg NAA/lít). Giai đoạn 20 NSC và 30 NSC: Chiều dài rễ trung bình/cây: chiều dài rễ tăng dần. NT3 có bổ sung 1 mg NAA/lít cho rễ dài nhất (1,5 cm ở 20 NSC, 2,1 cm ở 30 NSC). NT1 (Đ/C) không bổ sung NAA cho kết quả thấp nhất (1 cm ở 20 NSC; 1,5 cm ở 30 NSC). Số rễ trung bình/cây: NT3 bổ sung 1 mg NAA/lít cho kết quả cao nhất (2 rễ ở 20 NSC; 2,2 rễ ở 30 NSC). NT1 không bổ sung NAA và NT4 bổ sung 1,5 mg NAA/lít cho kết quả thấp nhất (1,1 rễ ở 20 NSC). Ở giai đoạn 30 NSC: NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT3 (1 mg NAA/lít) có tỷ lệ cây ra rễ nhiều nhất (86,7%). Giai đoạn 40 NSC: Chiều dài rễ trung bình/cây: NT3 (1 mg NAA/lít) cho kết quả cao nhất (3,1 cm/rễ) và khác biệt rất có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại rất có ý nghĩa. NT1 (0 mg NAA/lít) cho kết quả thấp nhất (2,1 cm/rễ) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê so với NT4 (1,5 mg NAA/lít). Số rễ trung bình/cây: khi tăng nồng độ NAA (0 mg NAA/lít; 0,5 mg NAA/lít;1 mg NAA/lít) thì số rễ trung bình/cây tăng dần và NT3 (1 mg BAP/lít) cho kết quả tốt nhất (2,4 rễ/cây), sự khác biệt này rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. NT4 (1,5 mg NAA/lít; 1,45 rễ/cây) cho kết quả cao hơn so với đối chứng (1,32 rễ/cây) và sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Phần trăm cây có rễ: cây lan hồ điệp in vitro tạo rễ ở 40 NSC đạt 100% khi cấy vào môi trường bổ sung 0,5 mg NAA/lít và 1 mg NAA/lít. NT1 (0 mg NAA/lít) cho kết quả thấp nhất (73,33%). Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến số lá của lan hồ điệp in vitro NT 1 2 3 4 CV (%) ns Ftính 1,62 Ghi chú: ns: sự khác biệt giữa các nghiệm thức trên cùng một cột không có ý nghĩa thống kê. Kết quả thu thập trình bày ở bảng 4.9 cho thấy: Giai đoạn 20 NSC: với số lá ban đầu là 3 lá, số lá trên cây có chiều hướng tăng dần khi nồng độ NAA tăng từ 0 mg NAA/lít đến 1 mg NAA/lít. Khi tiếp tục tăng nồng độ lên 1,5 mg NAA/lít thì số lá giảm. NT3 (1 mg NAA/lít) cho số lá nhiều nhất (3,6 lá/cây). NT1 (ĐC) cho kết quả thấp nhất (3,2 lá/cây). Giai đoạn 30 NSC: giai đoạn này số lá tăng thêm từ 0,4 lá/cây đến 0,8 lá/cây ở các nghiệm thức. Số lá trung bình/cây ở nghiệm thức 2 cao nhất (4,2 lá/cây), nghiệm thức 4 có số lá trung bình trên cây ít nhất (3,6 lá/cây). NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT3 (1 mg NAA/lít) cho kết qủa cao nhất (4,4 lá/cây). NT4 (1,5 mg NAA/lít) cho kết quả thấp nhất (4,13 lá/cây) nhưng sự khác biệt giữa hai nghiệm thức này không có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Ở tất cả các nghiệm thức, lá phát triển bình thường và có màu xanh đậm. Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến kích thước lá và chiều cao của cây lan hồ điệp in vitro Ngày sau cấy 20 NSC 30 NSC 40 NSC CV (%) Ftính Ghi chú: Ký tự theo sau giá trị trung bình khác nhau có sự khác biệt trong thống kê (*: α = 0,05; **: α = 0,01). Xét về chỉ tiêu chiều dài lá: Bảng 4.10 cho thấy, giai đoạn 20 NSC: chiều dài lá tăng dần từ 1,6 cm đến 2 cm khi tăng nồng độ NAA từ 0 mg đến 1 mg. Ở nồng độ 1,5 mg NAA/lít thì chiều dài lá bắt đầu giảm. NT3 (1 mg NAA/lít) có chiều dài lá dài nhất (2 cm/lá). Nghiệm thức đối chứng (0 mg NAA/lt1i) cho kết quả thấp nhất (1,6 cm/lá). Ở giai đoạn 30 NSC: tốc độ tăng trưởng chiều dài lá từ 0,24 cm đến 0,44 cm (so vời chiều dài lá ở 20 NSC). Chiều dài lá tăng dần từ 1,84 cm (ĐC) đến 2,44 cm (NT3). Ở giai đoạn 40 NSC: kết quả trắc nghiệm phân hạng cho thấy nghiệm thức 3 (1,5 mg NAA/lít) có chiều dài lá trung bình/cây lớn nhất (3,1 cm/lá) nhưng sự khá biệt này không có ý nghĩa thống kê so với NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT4 (1,5 mg NAA/lít). Nghiệm thức đối chứng (NT1) cho kết quả thấp nhất (2,1 cm/lá) và khác biết rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Xét về chỉ tiêu chiều rộng lá: Ở giai đoạn 20 NSC: chiều rộng lá tăng dần từ 0,74 cm/lá đến 1 cm/lá (bảng 4.10). NT3 (1 mg NAA/lít) cho kết quả cao nhất (1 cm/lá). NT1 cho kết quả thấp nhất (0,74 cm/lá). Ở giai đoạn 30 NSC: chiều rộng lá dao động từ 0,92 cm/lá đến 1,22 cm/lá. Chiều rộng lá ở nghiệm thức 3 có tốc độ tăng trưởng cao hơn hẳn các nghiệm thức còn lại (0,22 cm/lá so với 20 NSC). Ở giai đoạn 40 NSC: nghiệm thức 3 (1 mg NAA/lít) cho kết quả cao nhất (1,5 cm/lá), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 2 (0,5 mg NAA/lít) nhưng lại có sự khác biết có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 1 (ĐC) và nghiệm thức 4 (1,5 mg NAA/lít). Xét về chỉ tiêu chiều cao cây: Ở giai đoạn 20 NSC và 30 NSC: tốc độ tăng trưởng chiều cao cây ở các nghiệm thức từ 0,2 cm/cây đến 1,17 cm/cây. Khi bổ sung 1 mg NAA/lít vào môi trường nuôi cấy lan hồ điệp thì chiều cao cây phát triển hơn hẳn so với các nghiệm thức còn lại (2,55 cm/cây ở 30 NSC). Nghiệm thức 1 (ĐC) cho kết quả thấp nhất (1,36 cm/cây ở 30 NSC). Ở giai đoạn 40 NSC: kết quả phân hạng cho thấy NT3 (1,5 mg NAA/lít) có chiều cao cây cao nhất (2,83 cm/cây), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với NT2 (0,5 mg NAA/lít) và NT4 (1,5 mg NAA/lít) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức 1 (ĐC) cho kết qủa thấp nhất (1,6 cm/cây) nhưng không có sự khác biệt với nghiệm thức 2 (2,2 cm/cây). Từ những kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy môi trường thích hợp để cho cây lan hồ điệp in vitro sinh trưởng và phát triển tốt là MS + đường (30 g/lít) + agar (8 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + NAA (1 mg/lít). 5.1 Kết luận Qua các thí nghiệm nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra kết luận: - Nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu phát hoa lan hồ điệp là javel 80% trong 30 phút. Phương pháp này cho tỷ lệ nhiễm thấp (20%) và tỷ lệ sống cao (70%). - Môi trường thích hợp cho sự phát sinh protocorm từ mẫu lá lan Hồ Điệp là: môi trường MS + đường (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít), pH = 5,8. - Môi trường thích hợp để cho cây lan hồ điệp in vitro sinh trưởng và phát triển tốt là MS + đường (30 g/lít)+ agar (8 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + NAA (1 mg/lít). 5.2 Đề nghị - Áp dụng kết quả đạt được vào nhân nhanh giống lan hồ điệp tại Viện đồng thời kiểm nghiệm hiệu quả của các môi trường nhằm phổ biến đến các đơn vị khác. - Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm nhân giống hồ điệp trên một số môi trường khác nhau đồng thời thêm các dịch chiết như: chuối xanh, nước dừa để có được hệ số nhân tối ưu nhất. - Tiến hành khảo sát thêm một số chất kích thích sinh trưởng khác cho sự phát sinh protocorm và tái sinh cây lan hồ điệp như kinetin, IBA, 2,4-D. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, 1997. Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Giáo trình cao học Nông Nghiệp, nhà xuất bản Nông nghiệp năm 1997, trang 62 - 79. Trần Hợp, 1990. Phong Lan Việt Nam, tập 2. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội năm 1990, trang 54. Lê Thị Ánh Hồng và cộng sự, 2000. Tạo sự hình thành trực tiếp các cơ quan thể và tái sinh một số giống cây, hoa sạch bệnh bằng phương pháp nghiên cứu cắt lát mỏng tế bào và ảnh hưởng của TDZ đến khả năng tái sinh cây, Kết quả nghiên cứu khoa học 1999-2000, trang 163 - 164. Phan Thúc Huân, 1997. Hoa lan nuôi trồng và kinh doanh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp năm 1997, trang 6-18, 173. Dương Công Kiên. 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Tập 1, 2, 3. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Xuân Linh, 2002. Giáo trình kỹ thuật trồng hoa cây cảnh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp năm 2002, trang 95 - 97. Trấn Văn Minh,1999. Nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trung tâm khoa học tự nhiên và quốc gia. Viện sinh học nhiệt đới, trang 4 - 8. Nguyễn Công Nghiệp, 1998. Trồng hoa lan. Nhà xuất bản thành phố Hồ Chí Minh năm 1998, trang 229 - 239. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2003. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp). Báo cáo khoa học, Hội nghị CNSH toàn quốc năm 2003, trang 850 - 855. Nguyễn Thiện Tịch, Đoàn Thị Hoa, Trần Sĩ Dũng, Huỳnh Thị Ngọc Nhân, 2003. Kỹ thuật nuôi trồng hoa lan. Nhà xuất bản thành phố Hồ Chí Minh năm 2003, trang 46-135. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Đỗ Năng Vịnh, 2002. Công nghệ sinh học cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp năm 2002, trang 96 - 97. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Tập 2. Nhà xuất bản nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Ngô Đằng Phong, Huỳnh Thị Thùy Trang, Nguyễn Duy Năng. 2003. Hướng dẫn sử dụng phần mềm MSTATC trong phương pháp nghiên cứu nông nghiệp. Phần cơ bản. Tài liệu dành cho sinh viên khoa Nông Học – trường đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Ammirato, 1983. In: Evans et al-1983, P: 82 - 123. Barna K.S and Wakhlu A.K, 1995. Effect of thidiazuron on micropropagation of rose. In vitro cell. Dev. Biol 31, P: 44 - 46. Bui Van Le, N.T Do My, C. Gendy, J. Vidal and K. Tran Thanh Van, 1997. Somatic embryogenesis and plant regeneration on thin cell layer of a C4 species Digitaria sanguinalis (L.) Scop. Plant Cell Tiss. Org Cult. 49, P: 201 - 208. Bui Van Le, N.T. Do My, C. Gendy, J. Vidal and K. Tran Thanh Van, 1998. Transformation of a C4 monocot, the Digitaria sanguinalis (Large crabgrass) using somatic embryogenesis induced on Thin Cell Layer. Abstracts. IX Inter Congr Plant Tiss and Cell Cult. Jerusalem, Israel, P: 191. Ernst R, 1994. Effect of thidiazuron on in vitro propagation of Phalaenopsis Doritaenopsis (Orchidaceace). Plant Cell Tiss Org Cult 39, P: 273 - 275. Intuwong O. and Y. Sagawa, 1974. Clonal propagation of Phalaenopsis by shoot-tip culture. Am. Orchid soc. Bul, 43, P: 893 - 895. Michio Tanaka and Yoshihiro Sakanishi, 1972. Clonal propagation of Phalaenopsis through tissue culture. College of Agriculture, University of Osaka-Prefecture Morru- umemachi, Sakai, Osaka 591- Japan. Misson và cs, 1983. Meded. Fac. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent 48. P: 1151 - 1157. R.J.Griesbach, 2002. Development of Phalaenopsis Orchids for the Mass-Market. P: 458. R.L.M.Pierik, 1999. In vitro culture of higher plants. Kluwer academic publishers, 1998. P:69 - 71. Tran Thanh Van, 1973. Direct flower neoformation from superficial tissue of small explant of Nicotiana tabacum. Planta 115. P: 87 - 92. Tran Thanh Van and Trinh, 1990. Organogenic differentation in Bhojwani SS (Ed). Plant tissue culture: Application and limitations. Development in crop sciences 19. P: 34 - 53. Từ Internet Clone your phalaenopsis by keiki paste. Orchids Asia. The horticultural information pages on orchids of the Asian region. OrchidMania Grassrotts Support for AIDS Prevention – Relief and orchid Conservation. Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh. Phụ lục 1. Một số hình ảnh thí nghiệm Hình 4.5: Mẫu nhiễm nấm Phụ lục 2. Kết quả xử lý thống kê và trắc nghiệm phân hạng số liệu thí nghiệm 2.1 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây lan Hồ Điệp in vitro Kết quả xử lý thống kê và phân hạng lượng mẫu tạo protocorm Data file: ? &k0S? &k2GANHTAN? &k0S Title: Function: FACTOR Experiment Model Number 1: Two Factor Completely Randomized Design Data case no. 1 to 66. Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lll) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: a) with values from 1 to 2 Factor B (Var 3: b) with values from 1 to 1 Variable 5: pro Grand Mean = 1.751 1 2 3 5 Total ------------------------------------------------------- * 1 * 1.999 65.964 * 2 * 1.503 49.602 ------------------------------------------------------- * * 1 0.707 4.243 * * 2 1.085 6.508 * * 3 2.201 13.207 * * 4 1.937 11.621 * * 5 0.880 5.278 * * 6 2.465 14.791 * * 7 2.665 15.991 * * 8 0.707 4.243 * * 9 2.901 17.404 * * 10 1.981 11.884 * * 11 1.733 10.397 ------------------------------------------------------- * 1 1 0.707 2.121 * 1 2 1.462 4.387 * 1 3 2.544 7.633 * 1 4 2.196 6.588 * 1 5 1.052 3.157 * 1 6 2.735 8.204 * 1 7 2.849 8.547 * 1 8 0.707 2.121 * 1 9 3.135 9.405 * 1 10 2.187 6.561 * 1 11 2.413 7.240 * 2 1 0.707 2.121 * 2 2 0.707 2.121 * 2 3 1.858 5.573 * 2 4 1.678 5.033 * 2 5 0.707 2.121 * 2 6 2.196 6.588 * 2 7 2.481 7.444 * 2 8 0.707 2.121 * 2 9 2.666 7.999 * 2 10 1.774 5.323 * 2 11 1.052 3.157 ------------------------------------------------------- A N A L Y S I S K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob --------------------------------------------------------------------------- -- 2 Factor A 1 4.056 4.056 122.8710 0.0000 4 Factor B 10 38.043 3.804 115.2422 0.0000 6 AB 10 2.090 0.209 6.3307 0.0000 -7 Error 44 1.453 0.033 --------------------------------------------------------------------------- -- Total 65 45.642 --------------------------------------------------------------------------- -- Coefficient of Variation: 10.38% s_ for means group 2: y s_ for means group 4: y s_ for means group 6: y Kết quả phân hạng tương tác AB: Data File : ? &k0S? &k2GANHTAN? &k0S Title : Case Range : 84 - 105 Variable 5 : pro Function : ? &k0S? &k2GRANGE? &k0S Error Mean Square = 0.03000 Error Degrees of Freedom = 44 No. of observations to calculate a mean = 3 Least Significant Difference Test LSD value = 0.3807 at alpha = 0.010 ? &k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1 2 3 4 5 6 7 8