Ảnh hưởng của dipterex lên các chỉ tiêu sinh hóa của cá tra giống (pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong điều kiện thí nghiệm

úng loai hóa chất này. Nội dung đề tài: Xác định ảnh hưởng của Dipterex đến hoạt tính của một số chỉ tiêu sinh hóa: - Cholinesterase (ChE) - Lipid peroxidation (LPO) - Catalase (CAT) - Glutathion S-transferase (GST) 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học cá Tra 2.1.1 Phân loại Cá Tra là một loài trong số 11 loài thuộc họ cá Tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả Rainboth xếp cá Tra nằm trong giống cá Tra dầu (Pangasianodon). Phân loại cá Tra Bộ cá nheo: Siluriformes Họ cá Tra: Pangasiidae Giống cá Tra dầu: Pangasianodon Loài cá Tra: Pangasianodon hypophthalmus 2.1.2 Một vài đặc điểm sinh học cá Tra Cá Tra thuộc nhóm cá trắng (cá sông) sống trên dòng chính và các nhánh sông rạch lớn. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều mùn bả hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao (Dương Nhựt Long, 2003). Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá,…. Trong điều kiện nuôi cá có thể ăn thức ăn viên, các thức ăn có nguồn gốc động vật sẽ giúp cá lớn nhanh (Dương Nhựt Long, 2003). Cá Tra lớn nhanh trong ao nuôi, sau khoảng 6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1–1,2 kg/con. 2.2. Một số chỉ tiêu sinh hóa và các tác nhân gây nên sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh hóa Cholinesterase (ChE) là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv., 1961). ChE rất cần thiết cho các chức năng bình thường của thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên. ChE phân bố nhiều ở mô thần kinh và cũng có ở các mô khác. ChE khi bị ức chế dẫn đến sự tích tụ của acetylcholine tại các synap (các khoảng trống giữa hai tế bào thần kinh), làm mất chức năng dẫn truyền của các xung thần kinh (Hart, 1993). Trong nghiên cứu độc học, ChE được sử dụng nhiều và có vai trò như chất đánh dấu sinh học. Lipid peroxidation (LPO) là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh. Trong quá trình hô hấp hiếu khí tế bào đã sản sinh ra các gốc oxy hoá (Reactive oxygen species – 4 ROS): superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (-OH). ROS được tạo ra trong quá trình hô hấp hiếu khí này cần được phân huỷ và trung hoà để tránh gây tổn thương cho sinh vật và thành phần nhạy cảm nhất của tế bào đối với ROS là chuỗi acid béo chưa bão hoà trên màng tế bào. Hệ quả của quá trình này là LPO được tạo thành (điều kiện bình thường LPO vẫn được sinh ra). Đây là chất độc đối với tế bào. Tuy nhiên để chống lại ROS cơ thể sinh vật thích ứng bằng cách sử dụng các nhân tố chống oxy hoá bao gồm các chất không phải là enzyme (vitamine E, vitamin C, glutathione…) và enzyme Catalase (CAT) , Glutathione reductase, SOD) ( Zhang và ctv., 2004) Catalase (CAT) là một trong những enzyme chống oxy hoá phân bố tại các perixosome có vai trò quan trọng trong việc loại bỏ H2O2, chất được sinh ra trong quá trình - oxy hoá chuỗi acid béo dài CAT được nghiên cứu để đánh giá sự tác động của chất độc cũng như khả năng của cơ thể chống lại ROS do chất độc gây ra Glutathione – S transferase (GST) là enzyme có chức năng xúc tác phản ứng giữa các hợp chất có ái lực điện tử (thuốc trừ sâu, kim loại nặng) với GSH; các hợp chất lạ từ đó chuyển hoá thành N-acetyl cystine S dạng kết hợp sau đó sẽ được thải qua nước tiểu và phân (Yawad, 1989). Ngoài ra Storey (1996) cũng cho rằng GST có vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng giữa GSH với các thành phần tổn thương của tế bào bị tấn công bởi ROS. Theo Zhang và ctv., (2004) enzyme này có liên quan đến việc giải độc đối với những chất ngoại sinh, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các mô từ sự tác động của ROS. Theo Guimaraes et al., 2006 ở nồng độ 0,25 ppm, sau 72 giờ gây nhiễm, Trichlorfon đã gây nên hiện tượng phù và sung huyết ở cá rô phi (Oreochromis niloticus) đồng thời làm tăng hoạt tính của ChE ở cơ của cá. Theo Nguyễn Ngọc Hiền (2007), nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ và Enrofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả cho thấy, sau 171 giờ cho an kháng sinh Enroflloxacine đã làm biến động hoạt tính cả 4 loại men: ChE, CAT, GST, LPO khi khảo sát ở các cơ quan: mang, gan, não, cơ trong diều kiện thí nghiệm. Kháng sinh Enrofloxacine tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE. 24h sau khi ngừng cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có xu hướng chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine làm tăng hoạt tính của các men: CAT, GST, LPO ở các cơ quan cơ, gan, mang của cá. Mật độ ương nuôi càng cao trong thời gian dài thì hoạt tính của các men GST, CAT, LPO ở các cơ quan gan, mang, cơ của cá càng tăng cao, ngược lại thì hoạt tính của ChE càng giảm. Hoạt tính của ChE, CAT, và LPO được tìm thấy cao nhất ở não và GST cao nhất ở gan. Theo Trần Văn Phú (2008) sau 171 giờ cho ăn kháng sinh Enrofloxacine đã làm biến động họat tính của cả 4 lọai men: ChE, CAT, GST và LPO khi khảo sát ở não, mang, gan và cơ của cá tra giai đọan con giống. 5 Kháng sinh Enrofloxacine có tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở tất cả các nghiệm thức. Sau khi ngừng cho ăn kháng sinh Enrofloxacine 24 giờ, thì họat tính ChE có xu hướng giảm chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171 giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine làm tăng họat tính GST, CAT và LPO ở các cơ quan cơ, mang và gan của cá. Hồ Thị Thanh Tuyến (2008), ảnh hưởng của mật độ và kháng sinh Enrofloxacin đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao. Kết quả thí nghiệm cho thấy mật độ nuôi đã làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra, thời gian nuôi với mật độ cao càng dài thì hoạt tính của ChE ở tất cả các cơ quan càng giảm và hoạt tính của CAT (trừ ở não) , GST, LPO càng tăng cao. Và kháng sinh Enrofloxacin cũng tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở cả hai mật độ nuôi. Một ngày sau khi cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của ChE có xu hướng giảm và phục hồi trở lại sau 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin cũng làm tăng hoạt tính CAT và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 3 ngày ở gan, não và sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày ở mang trong ao nuôi có mật độ thấp. Ở ao nuôi mật độ cao, hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày. Kháng sinh Enrofloxacin làm tăng hoạt tính GST, LPO và hoạt tính này bắt đầu hồi phục trở lại sau khi cá ăn kháng sinh 7 ngày ở các ao có mật nuôi khác nhau. Theo Nguyễn Đăng Khoa (2006), nghiên cứu ảnh hưởng của Endosulfan lên một số chỉ tiêu sinh hóa trong Tôm sú (Penaeus monodon). Ông cho rằng: Ở Tôm sú giống nhỏ, Endosulfan tác động gây ức chế làm giảm hoạt tính của ChE ở nghiệm thức 0,1µg/L (43%) và 1µg/L (51%) và ChE phục hồi tốt sau 7 ngày tiếp xúc với Endosulfan. Và endosulfan không làm biến đổi hàm lượng LPO trên tôm giống nhưng gây ra những biến đổi GST và CAT theo hướng khác so với bình thường. Còn ở Tôm sú lớn, ông cũng cho rằng Endosulfan cũng làm giảm hoạt tính của ChE trên mang nhưng không làm gia tăng LPO ở cả hai cơ quan mang và gan tụy ở các nồng độ thí nghiệm. Endosulfan cũng gây ra những biến đổi GST và CAT ở mang và gan tụy theo hướng khác so với bình thường. Nguyễn Văn Công và ctv (2006), khi nghiên cứu ảnh hưởng của Diazon lên hoạt tính của enzym cholinesterase và tăng trọng của cá Lóc (Chana striata). thấy rằng Diazon làm giảm đáng kể hoạt tính ChE ở nồng độ 0,016mg/l, tốc độ tăng trưởng bị ức chế ở nồng độ cao nhất (0,35mg/l). Điều này cho thấy hoạt tính ChE có thể làm chất chỉ thị để phát hiện ra sinh vật bị ảnh hưởng của chất độc Diazon. Theo Nguyễn văn Công và ctv (2006), nghiên cứ ảnh hưởng của nhiệt độ và oxy hòa tan lên độc tính của Basudin 50EC ở cá Lóc (Chana striata). Kết quả cho thấy trong điều kiện bình thường thì hoạt tính của ChE tập trung nhiều nhất là ở não, kế đến là thịt, thấp nhất là ở gan. Hoạt tính này không chịu ảnh hưởng bởi khảng DO và nhiệt độ trong thí nghiệm. Và Ông cho rằng nhiệt độlà yếu tố ảnh hưởng đến độc tính của Basudin 50EC, khi nhiệt độ tăng thì 6 làm tăng mức độ ức chế AchE trong não và trong thịt nhưng trong gan không thể hiện rõ. Theo Nguyễn Thị Em (2008), nghiên cứu sự ảnh hưởng của các độ mặn khác nhau lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và sinh trưởng của Tôm Càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở độ mặn 15 và 25% thì hoạt tính của enzym ChE ở cơ và mang của Tôm Càng Xanh đều giảm sau 6 giờ và phục hồi sau 24 giờ, ở gan tụy hoạt tính của ChE giảm so với đối chứng và không có khả năng phục hồi sau 7 ngày. Hoạt tính của CAT ở mang và gan tụy ở cả 2 độ mặn 15 và 25% đều tăng cao so với đối chứng (trong đó CAT ở mang tăng cao hơn gan tụy). Ở nghiệm thức 15% hoạt tính của LPO ở mang có khuynh hướng giảm và tăng ở gan tụy tuy nhiên ở độ mặn 25% thì hoạt tính của LPO ở cả mang và gan tụy đều có xu hướng tăng so với đối chứng. Còn đối với hoạt tính của GST sau 6 – 24 giờ ở mang giảm và tăng cao sau 3-7 ngày. 2.3. Sơ lược về Dippterex 2.3.1. Đại cương về Dipterex - Công thức hóa học của Dipterex là C4H8O4Cl3P. - Công thức cấu tạo: Dimethyl (2,2,2-trichloro-hydroxyethyl)phosphonate - Khối lượng phân tử: 257,45 - Tên khoa học: dimethyl–(2,2,2-tricholoro-1-hydroxyethyl) phosphonate. - Tên thường dùng: Trichlorfon - Tên thương phẩm: Dylox (Mỹ), triclophon, Tuzon, Neguvon, hay chlophos (Liên Xô) Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Dipterex(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 2.3.2. Một vài tính chất của Dipterex Là chất rắn, kết tinh màu trắng, mùi dễ chịu, nóng chảy ở 83–84 oC. Hòa tan được trong alcol, benzen và đa số hydrocacbon chlor hóa khác. Dipterex bền ở nhiệt độ phòng, mang tính axit, ở pH=5,5 thì Dipterex chuyển hóa chậm thành dimetyl diclovinyl photphat (DDVP). 7 Bảng 2.1:Thời gian phân hủy 50% của Dipterex theo pH và nhiệt độ (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) Khoảng pH 1–5 Nhiệt độ 70oC Nhiệt độ (oC) Thời gian phân hủy (ngày) pH Thời gian phân hủy (giờ) 10 2.400 1 32 20 526 2 34 30 140 3 33 40 41 4 26,6 50 10,7 5 15,3 60 3,2 6 3,0 70 1,13 8 0,6 Hình 2.2. Công thức cấu tạo của DDVP (Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 2.3.3 Ứng dụng Dipterex Trong ngành vệ sinh y tế thì Dipterex dùng diệt ruồi và côn trùng nên hạn chế nhiều bệnh tật nguy hiểm. Trong thú y thì Dipterex dùng vệ sinh chuồng trại, diệt kí sinh trùng bên ngoài và bên trong. Trong thủy sản thì Dipterex dùng trị một số bệnh phổ biến do giun sán, rận cá, giáp xác, nấm kí sinh…(Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987) 8 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu: Cá Tra giống thí nghiệm được mua từ các các trại giống ở Cần Thơ, có khối lượng trung bình từ (17,9 ± 4,1g), màu sắc của cá tươi sáng, đồng cỡ, không bị dị tật và không có dấu hiệu bệnh lý. Hóa chất thí nghiệm: Dipterex sử dụng có tên thương mại là ĐỊCH BÁCH TRÙNG 90SP chứa 90% hoạt chất Trichlorfon (Hình 3.3), dạng chất rắn và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. Thuốc được khuyến cáo sử dụng trị sâu bệnh cho các loại cây trồng như bọ trĩ, bọ xít, sâu khoang trên lúa, vải thiều, đậu tương với nồng độ từ 1,0 đến 1,2 kg/ha. Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn công nghiệp Cargill có hàm lượng đạm 30 %, mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, khẩu phần ăn từ 5-7 % khối lượng thân. Bể xi măng 1000 lít (3 bể), bể composit hình chữ nhật 500 lít, máy so màu quang phổ, watter bath, máy li tâm, kính hiển vi, pipet, tủ trữ đông mẫu (- 80oC) Nguồn nước dùng thí nghiệm là nguồn nước máy. Các hoá chất, dụng cụ và phương tiện sử dụng trong phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thuỷ Sản – Khoa Thuỷ Sản - Trường Đại học Cần Thơ. Hình 3.3. Dipterx dùng trong thí nghiệm 3.2. Phương pháp nghiên cứu: 3.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Cá được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ thống bể 9 composite có thể tích là 500 lít với mật độ là 70 con/bể. Hệ thống bể được sục khí liên tục. Cá được bố trí với các nghiệm thức sau : Nghiệm thức 1 : Bể không có Dipterex ( đối chứng). Nghiệm thức 2 : Bể có Dipterex 0,01ppm Nghiệm thức 3 : Bể có Dipterex 0,1ppm Nghiệm thức 4 : Bể có Dipterex 0,5ppm 3.2.2. Phương pháp pha hóa chất : Từ hóa chất ĐỊCH BÁCH TRÙNG 90SP thương mại chứa 90% hoạt chất Trichlorfon pha thành dung dịch mẹ có nồng độ 10.000ppm. Từ dung dịch gốc pha thành các nồng độ 0,01pp, 0,1ppm, 0,5ppm theo công thức : C1V1= C2V2 Trong đó : C1 : là nồng độ của dung dịch gốc V1 : Thể tích dung dịch gốc dùng để pha. C2 : Nồng độ dung dịch cần pha (0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm) V2 : Thể tích cần pha. 3.2.3. Thời gian thu mẫu : Mẫu được thu vào 5 thời điểm Lần thu mẫu 1: Trước khi cho hóa chất vào bể 0 giờ Lần thu mẫu 2: Khi cho hóa chất vào bể sau 6 giờ Lần thu mẫu 3: Khi cho hóa chất vào bể sau 96 giờ Lần thu mẫu 4: Khi cho hóa chất vào bể sau 14 ngày Lần thu mẫu 5: Khi cho hóa chất vào bể sau 56 ngày 3.2.4. Phương pháp thu mẫu Cá được thu ngẫu nhiên 5 con/bể, riêng lần thu thứ nhất chỉ thu 1con/bể. Cá sau khi thu được cân trọng lượng và đo chiều dài. Mẫu dùng để phân tích các chỉ tiêu sinh hóa bao gồm : não, mang, gan, cơ được thu vào ống ependoff , quá trình thu mẫu được thực hiện trong điều kiện lạnh và mẫu được cố định bằng cách nhúng vào Nitơ lỏng. Sau khi thu xong thì toàn bộ mẫu được trữ lạnh ở -800C cho đến khi mẫu được phân tích. 10 3.2.5. Phương pháp phân tích mẫu: 3.2.5.1. Phương pháp nghiền mẫu: Tất cả các mẫu não, mang, gan, cơ đều được nghiền trong dung dịch buffer KH2 PO4/K2HPO4 50mM. Quy trình nghiền mẫu: Sau khi nghiền đem mẫu chia làm 2 phần:  1 phần được cho vào trong ống ependoff để phân tích LPO sau đo đem trữ ở -800C cho đến khi phân tích  1 phần đem ly tâm 10000 vòng/10 phút (40C) lấy phần nước trong nổi ở trên cho vào ống ependoff để phân tích các chỉ tiêu ChE, CAT, GST đem trữ ở -800C cho đến khi phân tích. 3.2.5.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hóa: a) Lipid peroxidation (LPO): Nguyên lý: Phân tích LOOHs như là một phương pháp xác định phản ứng LPO. Thiobarbituric Acid Reactive Substance (TBARS) được áp dụng phổ biến nhất. TBARS phản ứng với MDA, sản phẩm được xác định thông qua máy so màu quang phổ ở bước sóng 535 nm (Fatima và ctv, 2000). Chuẩn bị đường chuẩn với nồng độ MDA tăng dần. Trị số đọc được trên máy so màu quang phổ cho phép tính LPO (µmol MDA/g mẫu).  Chuẩn bị hóa chất: Trichloroacetic acid 5% (TCA 5%): 5g TCA/100ml H2O, giữ lạnh và sử dụng trong ngày. Thiobabituric acid 0,67% (TBA 0,67%): 67mg TBA/1ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), trộn đều, sau đó thêm 9ml H2O, bảo quản tốt, tránh ánh sáng (che tối bằng giấy bạc). Mẫu não, gan, mang, cơ, giải đông và được trữ trong nước đá Cân mẫu từ 0,1-0,3g cho vào ống nghiền bằng nhựa Cho 3ml KH2 PO4/K2HPO4 50mM (pH = 7,5) Cân mẫu (mẫu và buffer) 11  Quy trình bao gồm: Sử dụng 500µL mẫu nghiền với 0,5ml trichloroacetic (TCA) 5% và 0,5ml thiobarbituric acid (TBA) 0,67% . Ủ hỗn hợp 15 phút . Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, lấy phần nổi. Cho phần nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 15 phút. Lấy ống thuỷ tinh ra, làm mát ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở 535 nm. Đường chuẩn với giá trị MDA cho phép xác định được LPO thể hiện qua µmol MDA tương đương/g mẫu b) Glutathione S-transferase (GST) Nguyên lý : phản ứng mang tính kiềm của sự kết hợp của GSH với 1 – chloro- 2,-dinitrobenzene (CDNB) thông qua hoạt động của GST.  Chuẩn bị hóa chất: - 1-chloro-2,4-diitrobenzen (CDNB)50mM: 50,5mg/5ml ethanol, giữ trong tủ mát. - GSH 50mM: 76,83mg/5ml dung dịch Hepes, pH= 7,5. Nồng độ MDA Thể tích pha loãng Dung dịch chuẩn 500 1 100 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước 2 50 2ml dung dịch 1 + 2ml nước 3 10 1ml dung dịch 2 + 4ml nước 4 5 2ml dung dịch 3 + 2ml nước 5 2,5 2ml dung dịch 4 + 2ml nước 6 1,25 2ml dung dịch 5 + 2ml nước 7 0,625 2ml dung dịch 6 + 2ml nước 8 0 Nước Nồng độ MDA (µM) 0 0,625 1,25 2,5 5 10 50 100 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Bảng 3.2. Tiến trình lập đường chuẩn MDA Thêm vào 1ml TBA 0,67% Ủ trong nước sôi khoảng 10 phút Đọc ở bước sóng 535 nm 12 - Dung dịch đệm phosphat pH=7,5 Hóa chất Test (µl) Blank (µl) Đệm Hepes pH 7,5 700 700 CDNB (trong ethanol) 1,5mM 30 30 GSH 30 30 H2O 220 240 Mẫu 20 / Đo ở bước sóng 340 nm trong 3 phút Công thức tính : Hoạt tính của GST = ( A340/phút – Ablank) x độ pha loãng x coff.ExMol CDNBcoeff = 9,6mM-1 cm-1 là hệ số CDBN chuyển thành CDBN-GST + HCl dưới tác dụng của GST. Đơn vị của GST là nmol/mg protein/phút c) Catalase (CAT) Nguyên lý: Phương pháp thông thường xác định CAT dựa trên sự thay đổi của dung dịch đo ở bước sóng 240nm. Phương pháp yêu cầu trong đo quang phổ phải sử dụng curvet thạch anh để tránh sự nhiễu. Titanium oxisulfate (TiOSO4) phản ứng với H2O2 mà không bị khử bởi catalase sau 6 phút.  Chuẩn bị hóa chất: - Dung dịch BC: gồm 1g Albumine bovine (BSA, Sigma); 100ml Imidazol buffer 0,02 M pH 7,0. - Sau đó, cho 50µl H2O2 30% vào 250ml BC để tạo thành dung dịch SC - Chuẩn bị dung dịch TiOSO4 : 1,7g TiOSO4 pha loãng trong 500ml H2SO4 2N. Đun sôi trong 10 phút và để nguội dung dịch đến ngày hôm sau. Pha loãng 1,5 lần với H2SO4 2N - Tiếp đến, thêm 0,75 ml TiOSO4 vào 1,25 ml SC và đọc ở bước sóng 420nm. Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0,75 và 0,95 và là độ hấp thụ cao nhất (H2O2 không bị khử bởi catalase) nếu không thay đổi thể tích H2O2. Bảng 3.3. Quy trình phân tích Enzym GST 13 Độ hấp thụ mẫu trắng 1 (không H2O2) được hiệu chỉnh về 0. Độ hấp thụ mẫu trắng 2 được làm nền từ mẫu. Nó tương đương phản ứng của mẫu với TiOSO4. Công thức tính: CAT (U/mg protein) = log SC – log (hấp thụ) * V(ml) phản ứng/ V(ml) SC/ V(ml) mẫu/T(phút) phản ứng * độ pha loãng/mg protein d) Cholinesterase (ChE) Nguyên lý: Hoạt tính ChE được xác định ở 25oC sử dụng phương pháp so màu quang phổ (bổ sung bởi Ellman và ctv (1961)) mà acetylthiocholine bị thuỷ phân bởi acetylcholinesterase tạo ra thiocholine. Sự kết hợp tiếp theo với DTNB (5,5 dithiobis 2 nitrobenzoic acid) hình thành màu vàng anion 5-thio-2- nitrobenzoic acid được hấp thu mạnh ở bước sóng 412 nm.  Chuẩn bị hoá chất: - Dithiobisnitrobenzoate (DTNB) 167µM: 66,1mg/100ml Sodium phosphate 50mM, pH=7,5. - Cơ chất Acetylthiocholine iodide (AchI) 30mM: 8,67mg/1ml Sodium photphate, pH= 7,5. Phân tích (µ l) Trắng 1 (µ l) Trắng 2 (µ l) SC 1250 / / BC / 1250 1250 TritonX-100 0,02% hay Tween 0,04% 25 25 25 Đệm phosphate / 25 / Mẫu 25 / 25 Ủ 6 phút ở 0oC TiOSO4 750 750 750 Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút. Bảng 3.4. Quy trình phân tích Enzym Catalase 14 Công thức tính: R = Abs * pha loãng/ [(thể tích mẫu (ml) * 0,0136)/protein (mg/ml)] R: Số mole cơ chất thuỷ phân/phút/mg protein 0,0136 là hệ số Acetylcholine iodide chuyển thành thiocholine và acetat. e) Protein Nguyên tắc: Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv, (1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Trong môi trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi Folin được đưa vào, Folin sẽ kết dính với protein. Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh.  Chuẩn bị hoá chất: - BSA 10mg/ml H2O - Hỗn hợp A: 150ml Na2CO3 2% + 1,5ml CuSO41% + 1,5ml NaK Tartrate2% - Folin: 10ml folin + 10ml H2O Trắng (µl) Mẫu (µl) DTNB (150 µM ) 900 900 Đệm (phosphate hay tris) 50 / Sample / 50 Đọc ở bước sóng 412 nm trong 10 phút Chất nền (nồng độ 4,5mM) 50 50 Bảng 3.5. Quy trình phân tích enzym ChE 15 Hoá chất Đường chuẩn Mẫu 0mg 0,05 mg 0,1mg 0,2mg 0,5mg protein protein protein protein protein BSA Mẫu H2O NaOH 1N 0µl 5µl 10µl 20µl 50µl / / / / / 500 µl 495µl 490 µl 480 µl 450 µl 500 µl 500µl 500µl 500µl 500µl / 10µl 490µl 500µl Ủ trong 30 – 120 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl 500µl Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660nm Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein có trong mẫu (mg protein/ml) Bảng 3.6. Quy trình phân tích Protein 16 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của men Cholinesterase (ChE) trong não, mang, gan, cơ của cá Tra giống Cholinesterase (ChE) là một chất hóa học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn truyền thông qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961). Khi cho cá tiếp xúc với thuốc ở các nồng độ thuốc: đối chứng; 0,01 ppm, 0,1 ppm và 0,5 ppm thì sự biến đổi về hoạt tính của ChE trong cơ, mang, gan, não của cá được trình bày ở Hình 4.3, 4.5, 4.6 và 4.7. Kết quả cho thấy hoạt tính của enzyme ChE ở cơ, mang, gan và não của cá có chiều hướng bắt đầu giảm so với nghiệm thức đối chứng kể từ khi cá tiếp xúc với Dipterex. Ở mang, ở nghiệm thức không có Dipterex (0ppm) hoạt tính của ChE tăng ở thời điểm thu mẫu 6 giờ khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở thời điểm thu mẫu 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày hoạt tính của ChE giảm tuy nhiên sự giảm này không có ý nghĩa thống kê so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở nghiệm thức có Dipterex 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm hoạt tính của ChE giảm khác biệt ở ý nghĩa thống kê qua các thời điểm thu mẫu sau khi tiếp xúc với Dipterex lần lượt ở 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày so với lần thu mẫu 0 giờ và nồng độ thuốc càng cao thì hoạt tính của ChE càng bị ức chế (ở nồng độ 0,01ppm thì hoạt tính của ChE bị ức sau khi tiếp xúc với Dipterex là 67%, 0,1ppm thì 71%, còn ở nồng độ 0,5ppm là 81%). 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0 160.0 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm µ m ol /m in /m g P ro te in 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a b c b b a b a a a aa a a a a a a a a Hình.4.4 .Biến đổi hoạt tính của ChE trong mang của cá Tra qua các thời điểm thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Gan là cơ quan có chức năng quan trọng trong quá trình giải độc sau khi hóa chất xâm nhập vào cơ thể, nhiều loại men có chức năng oxy hóa hay giải độc của đa số sinh vật đều do gan sản sinh ra. Hoạt tính của ChE ở gan có xu hướng giảm khi tiếp xúc với thuốc Dipterex. Ở nghiệm thức không có Dipterex hoạt tính của ChE tăng ở thời điểm thu mẫu 6 giờ và 56 ngày và 17 giảm ở thời điểm thu mẫu 96 giờ, 14 ngày khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở các nghiệm thức có Dipterex họat tính của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê qua các lần thu mẫu. Ở nghiệm thức 0,01ppm hoạt tính của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê ở thời điểm thu mẫu 14 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở nghiệm thức 0,1ppm hoạt tính của ChE giảm khác biệt có ý nghĩa sau khi tiếp xúc với Dipterex ở các tất cả các thời điểm thu mẫu 6 giờ, 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày (p<0.05). Còn ở nghiệm thức 0,5ppm hoạt tính của ChE giảm ở tất cả các thời điểm thu mẫu và sự sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05) ở thời điểm thu mẫu 14 ngày, 56 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. Ở thời điểm thu mẫu 0 giờ ở nghiệm thức 0,1ppm hoạt tính của ChE tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức: không có Diprerex, 0,01ppm, 0,5ppm. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm µm ol /m in /m g p ro te in 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày ab b b b b ab a aba ab a ab a a a a a a b ab Hình 4.5. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Ở não, ở nghiệm thức không có Dipterex và nghiệm thức có Dipterex 0,01ppm hoạt tính của ChE giảm không có ý nghĩa ở tất cả các thời điểm thu mẫu 6 giờ, 96 giờ,14 ngày, 56 ngày so với lần thu mẫu đối chứng. Tuy nhiên ở nghiệm thức 0,01ppm hoạt tính của ChE giảm 48% so với nghiệm thức không có Dipterex. Trong khi đó ở thời điểm thu 6 giờ ở nghiệm thức 0,1ppm và 0,5ppm hoạt tính của ChE lại tăng so với lần thu mẫu đối chứng nhưng chỉ khác biệt ở có ý nghĩa ở nghiệm thức 0,5ppm. So với thời điểm thu mẫu 0 giờ. 18 Ở cơ, ở thời điểm thu mẫu 6 giờ ở nghiệm thức không có Dipterex và ở nghiệm thức 0,1ppm hoạt tính của ChE tăng khác biệt so với thời điểm thu mẫu đối chứng, còn ở nghiệm thức 0,01ppm và 0,5ppm hoạt tính của ChE tăng không khác biệt có ý nghĩa ở thời điểm 6 giờ. Nhìn chung hoạt tính của ChE bị ức chế khi tiếp xúc với Dipterex. Theo như kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Công và ctv., (2006) … kết luận rằng, dưới tác nhân của hóa chất và thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ thì hoạt tính của ChE bị ức chế ở nhiều mức độ khác nhau, tùy theo nồng độ và thời gian tiếp xúc với hóa chất. Cũng theo Hiran và ctv., (2003) thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của endosufan lên hoạt tính của ChE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius), kết quả cho ta thấy endosufan đã làm giảm hoạt tính của ChE trong não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius). Như vậy khi cá tiếp xúc với Dipterex men ChE ở cá bị ức chế một cách đáng kể ở mang và gan, điều này có thể dẫn đến các hiện tượng ức chế các hoạt động sinh học khác trong cơ thể cá như khả năng bơi lội của cá chậm lại. 0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm µ m ol /m in /m g pr ot ei n 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a a a a a a a a a a a a a b a a a a a Hình 4.6: Biến đổi hoạt tính của ChE trong não của cá Tra qua các lần thu mẫu(các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) 19 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm µ m ol /m in /m g p ro te in 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngàya b a a a a a a a a a b a a a a a a a a Hình 4.7. Biến đổi của hoạt tính của ChE trong cơ ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) 4.2. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của Lipid peroxidation (LPO) trong não, mang, gan, cá Tra giống: Lipid peroxidation (LPO) là chất có liên quan đến các tác nhân oxi hóa trong cơ thể thường góp phần vào tiến trình phát sinh bệnh. Kết quả về sự biến đổi hoạt tính của LPO trong não, mang, gan ở cá tra khi cho cá tiếp xúc với thuốc trừ sâu Dipterex được thể hiện ở Hình 4.8, 4.9 và 4.10. Ở nghiệm thức không có Dipterex và nghiệm thức 0,01ppm, hoạt tính của LPO ở não cá tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê thời điểm thu mẫu 6 giờ và 96 giờ. Ở nghiệm thức 0,1ppm, 0,5ppm hoạt tính của LPO cũng tăng nhưng không khác biệt so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. 0 200 400 600 800 1000 1200 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm nm ol M D A /g m ẫu 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a c b a a a c b a a ab b ab a a ab b b ab a Hình 4.8. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong não ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05) a 20 Ở mang, ở thời điểm thu mẫu 6 giờ ở nghiệm thức không có Dipterex và 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm hoạt tính của LPO đều tăng khác biệt so với thời điểm thu 0 giờ. Còn ở các thời điểm thu mẫu 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày hoạt tính LPO tăng nhưng không khác biệt so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm n m ol M D A /g m ẫu 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngàya b a a a a b a a a a b a a a a b a ab a Hình 4.9. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong mang ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Ở gan, ở thời điểm thu mẫu 6 giờ và 96 giờ ở cả nghiệm thức không có Dipterex và 0,01ppm, 0,1ppm và 0,5ppm hoạt tính của LPO đều tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lần thu mẫu 0 giờ. Ở thời điểm thu mẫu 14 ngày hoạt tính của LPO ở nghiệm thức 0,01ppm và 0,5ppm tăng khác biệt có ý nghĩa thông kê trong khi đó ở nghiệm thức không có Dipterex và 0.1ppm thì hoạt tính của LPO cũng tăng nhưng không khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm n m ol M D A /g m ẫu 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a b b a a b d c c a a b b ab a a b c b a Hình 4.10. Biến đổi của hoạt tính của LPO trong gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) 21 Kết quả này trùng với kết quả nghiên cứu của Pandey và ctv., (2000) endosulfan đã làm gia tăng LPO có ý nghĩa so với đối chứng ở các cơ quan như gan, thận và mang khi cho cá lóc (Chana punctatus) tiếp xúc với endosulfan ở nồng độ thấp là 5 ppb. Tương tự với kết quả nghiên cứu này là sau khi cho cá tra ăn kháng sinh enrofoxacine thì hoạt tính LPO ở tất cả các lần thu mẫu của cả 2 mật độ nuôi đều tăng lên, gia tăng này có ý nghĩa thống kê ở lần thu mẫu sau khi cho ăn kháng sinh 1 ngày trở đi và sau cho cá ăn kháng sinh 3 ngày làm hoạt tính LPO ở tất cả các nghiệm thức bắt đầu tăng chậm lại hoặc từ từ giảm dần nghĩa là enrofoxacine đã làm tăng hoạt tính LPO ở cá (Nguyễn Ngọc Hiền, 2007). Theo như tác giả Hồ Thị Thanh Tuyến (2008) khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ và kháng sinh Enrofloxacine lên hoạt tính của LPO ở cá Tra thì kết quả cho thấy cả mật độ và kháng sinh đã làm tăng hoạt tính của LPO. Qua đó cho ta thấy khi cho cá tiếp xúc với Dipterex hoạt tính của LPO tăng lên để giải độc cho cá. 4.3. Ảnh hưởng của Dipterex đến hoạt tính của men Glutathione – S – transferase (GST) trong mang, gan của cá Tra giống Glutathione – S – transferase (GST) là men xúc tác phase II quan trọng trong quá trình làm giảm Glutathione (GSH) tiếp hợp lên tế bào làm phá hủy sự tấn công của ROS dẫn đến sự làm giảm độc tính của chúng (Storey, 1996). Qua hình 4.11 và 4.12. Biến đổi hoạt tính của GST trong mang, gan của cá Tra qua các thời điểm thu mẫu. Kết quả cho ta thấy ở mang, ở nghiệm thức không có Dipterex hoạt tính của GST tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lần thu mẫu 0 giờ (p>0.05) ở thời điểm thu 6 giờ, ở các thời điểm thu 96 giờ, 14 ngày, 56 ngày thì hoạt tính của GST giảm không có ý nghĩa thống kê so với lần thu mẫu 0 giờ. Đối với các nghiệm thức có Dipterex 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm thì hoạt tính của GST đều có xu hướng giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê ở các thời điểm thu mẫu so với lần thu mẫu 0 giờ. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm nm ol C D N B /p hú t/m g pr ot ei n 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a b a a a b ab a a a d c ab b a c b ab ab ab Hình 4.11. Biến đổi của hoạt tính của CAT trong mang ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) 22 Ở gan, ở thời điểm thu mẫu 6 giờ ở nghiệm thức không có Dipterex và 0,01ppm, 0,1ppm hoạt tính của GST đều tăng nhưng chỉ có nghiệm thức không có Dipterex và 0,01ppm tăng có ý nghĩa thống kê, còn ở nghiệm thức 0,5ppm thì lại giảm nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với thời điểm thu mẫu 0 giờ. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm nm ol C D N B /p hú t/ m g pr ot ei n 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a b a a a a b a a a a ab b a a a a a a a Hình 4.12. Biến đổi của hoạt tính của GST trong gan ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Theo kết quả nghiên cứu của Pandey et al., (2000) nghiên cứu trên cá Channa punctatus (23-50g/con), cho tiếp xúc với endosulfan ở nồng độ thấp 5µg/l cũng cho thấy, GST ở gan, mang và thận đều tăng lên có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên , cũng trên endosulfan ở nông độ thấp 10,6 – 32,0ng/l thì hoạt tính GST giảm đối với Tôm Macrobrachium malcolmsonii giai đoạn giống. Theo Cazenave và ctv. (2006) nhận thấy hoạt tính của CAT trên gan, mang và não cá Corydoras paleatus khi tiếp xúc với Microsystin–RR ở các nồng độ 0,5; 2,5 và 10 ppb sau 24 giờ thì ở nồng độ Microsystin-RR lớn hơn hoặc bằng 2 ppb làm LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường và hoạt tính GST ở gan, não giảm ở nồng độ 0,5 g/L. Như vậy khi cá tiếp xúc với cá độc chất có trong môi trường hay cá ăn thức ăn có độc tố thì có thể cá sẽ phản ứng lại bằng cách gia tăng hoạt tính GST nhằm giúp tế bào giải độc cho cơ thể. 4.4. Ảnh hưởng của Dipterex lên hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, mang của cá Tra giống (U/mg Protein) Catalase (CAT) là một men trong cơ thể có tác dụng biến đổi hydroperoxyl một trong các sản phẩm được thải ra trong quá trình trao đổi chất thành nước và khí oxy. Hydrogen peroxide được sinh ra trong quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể và là tiền thân của các phân tử gốc tự do làm tổn hại đến tế bào bằng cách tạo ra các phản ứng oxy hóa. Nhìn chung khi cho cá Tra tiếp xúc với thuốc trừ sâu Dipterex thì hoạt tính của CAT có xu hướng giảm qua ở các thời điểm thu mẫu. Ở mang, hoạt tính CAT giảm sau khi tiếp xúc với Dipterex. Ở điều kiện không có Dipterex hoạt tính 23 CAT tăng ở lần thu mẫu 6 giờ (167%) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lần thu mẫu 0 giờ. Ở nghiệm thức có Dipterex hoạt tính của CAT giảm sau khi tiếp xúc với Dipterex. Ở nghiệm thức 0,1ppm hoạt tính của CAT giảm khác biệt có ý nghĩa ở thời điểm thu mẫu 6 giờ so với thời điểm thu mẫu 0 giờ, ở nghiệm thức 0,01ppm hoạt tính CAT giảm có ý nghĩa ở thời điểm thu mẫu 56 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ, còn đối với ngiệm thức 0,5ppm hoạt tính CAT giảm sai khác có ý nghĩa thống kê ở thời điểm thu mẫu 96 giờ và 56 ngày so với thời điểm thu mẫu 0 giờ 0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600 0.0700 0.0800 0.0900 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm U /m g pr ot ei n 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a b a a a c bc abab a c b a ab a c bc a ab a Hình 4.13. Biến đổi của hoạt tính của CAT trong mang ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Ở não, ở điều kiện không có Dipterex hoạt tính của CAT ở các thời điểm thu mẫu hầu như không có sự khác biệt với nhau. Ở nghiệm thức 0,01pm, hoạt tính CAT giảm so với thời điểm thu mẫu 0 giờ nhưng không có ý nghĩa thống kê, ở nghiệm thức 0,1ppm và 0,5ppm hoạt tính của CAT có xu hướng tăng ở thời điểm thu mẫu 6 giờ so với thời điểm thu mẫu 0 giờ tuy nhiên chỉ sai khác có ý nghĩa ở nghiệm thức 0,5ppm. Theo như kết quả nghiên cứu trên cho thấy hoạt tính của CAT có xu hướng giảm khi tiếp xúc với Dipterex. Theo như nghiên cứu của Kaur et al., (2005) trên cá Lóc (Channa punctata) sau 3 giờ gây sốc nhiệt cho thấy hoạt tính của CAT tăng lên ở gan nhưng giảm ở mang và thận. Mặc khác, theo nghiên cứu của Cazennave et al., (2006) cũng cho thấy hoạt tính của CAT tăng ở gan cá Corydoras paleatus khi tiếp xúc với Microcystin-RR ở những nồng độ khác nhau. Tác giả nhận định rằng, các nhân tố chống oxi hóa đáp ứng khác nhau ở các cơ quan khác nhau. 24 0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 0ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.5ppm U /m g pr ot ei n 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày a a a a a a a a a a a a a a a a b a a a Hình 4.14. Biến đổi của hoạt tính của CAT trong não ở cá Tra qua các lần thu mẫu (các chữ cái (a,b,c,d) thể hiện sự khác biệt thống kê trong cùng một nghiệm thức, các cột có cùng một chữ cái thì khác biệt không có ý nghĩa (p<0.05)) Nhìn chung, khi cho cá Tra tiếp xúc với Dipterex đã làm thay đổi hoạt tính ChE, LPO, GST, CAT, làm giảm hoạt tính của ChE, GST, CAT, làm tăng hoạt tính của LPO và chủ yếu bị ảnh hưởng nhiều nhất sau khi cho Dipterex vào ở thời điểm thu mẫu 6 giờ. 25 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận Hoạt tính của ChE giảm ở mang và gan sau khi tiếp xúc với Dipterex ở nồng độ 0,01ppm, 0,1ppm, 0,5ppm . Hoạt tính của LPO cao nhất là ở não (trung bình từ 1008,2 ±126.9 đến 123,3 ± 10,8 nmole MDA/g mẫu), kế đến là mang (trung bình từ 984.3 ± 117,4 đến 64,1 ± 9.,18 nmole MDA/g mẫu) và thấp nhất là ở gan (trung bình từ 392,1 ± 22,7 đến 35,3 ± 14,68 nmole MDA/g mẫu). Hoạt tính của GST ở mang và gan giảm sau khi tiếp xúc với thuốc. Hoạt tính của CAT ở mang và não có chiều hướng giảm sau khi cho cá tiếp xúc với Dipterex. Hoạt tính của CAT ở não (trung bình từ 0,2047 ± 0,0292 đến 0,0047 ± 0,0009U/mg Protein) cao hơn ở mang (trung bình từ 0.0676 ± 0,0166 đến 0.0090 ± 0,0002 U/mg Protein). Qua 56 ngày hoạt tính của các enzym chưa được phục hồi sau khi bị tác động của Dipterex. 5.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu sự biến đổi sinh hóa trên cá tra dưới tác động thuốc trừ sâu và nhiều yếu tố môi trường khác trong điều kiện thí nghiệm và quy mô ao nuôi Nên nghiên cứu ở nồng độ cao và thời gian dài hơn để thấy rõ sự ảnh hưởng của Dipterex lên các chỉ tiêu enzym và khả năng hồi phục của các enzym. Khi phân tích hoạt tính của ChE ở cá nên phân tích ở não. Khi phân tích hoạt tính của LPO ở cá nên phân tích ở gan. 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2005.Quyết định của Bộ Trưởng Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn về việc ban hành danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam. doc. Truy cập ngày 13/01/009. Bùi Quang Tề.2006. Bệnh Học Thủy Sản. Cazenave, J., Maria de los angeles Bistoni và ctv, 2006. Differential detoxification and antioxidant response in diverse argan of corydoras paleatus experimentally exposed to microcytin-RR. Aquatic Toxicological. Dương Nhựt Long, 2004. Giáo trình Kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt. Ellman, G. L., K. D. Courtney, V. Andres and R. M. Featherstone, 1961. A new and rapid colorimetric determination of AchE activity. Biochem. Pharmacol. 7,88-95. Fatima, M.,Ahmad. I.,Sayeed . I.,Athar, M.,Raisuddin, S.200. Polluttan- induced over-activation of phagocytes is concomitantly associated with peroxidative damage in fish tisues. Aquat. Toxicol. 49: 243-250. Hart, A. D. M., 1993. Relationship between behavior and inhibition of Acetylcholineterase in bird expose to organophotphate pesticide. Environmental Toxiology and Chemistry. 12: 321 - 326. Hiran, M. Dutta, D. A. Arends, 2003. Effects of endosulfan on brain acetylcholinesterase activity in juevenile bluegill sunfish. Environmental Research 91, 157-162 Kaur, M, F. Atif, M. Ali, H. Rehman and S. Raisuddin. 2005. Heat stress – induced alteration of antioxidants in the freshwater fish Channa punctata Block. 67: 1653 – 1665. Horberg TE, Hoy T, Nafstad I. 1989. Organophosphat poisoning of Atlantic salmon in connection with treatmen again salmon lice. Act Veterinaria Scandinavica, 30: 385-390. Hồ Thị Thanh Tuyến, (2008), Ảnh hưởng của mật độ và kháng sinh đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao. Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Nuôi trồng thủy sản – Đại học Cần Thơ. 27 Nguyễn Ngọc Hiền, (2007). Ảnh hưởng của mật độ và enrofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh hoá của cá Tra (Pangasius hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Luận văn Đaih học Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn đại học. Nguyễn Thị Phương Nga, 2004. Phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản tại Sóc Trăng, bạc Liêu và Cà Mau. Luận văn cao học. Theo Nguyễn Đăng Khoa (2006), nghiên cứu ảnh hưởng của Endosulfan lên một số chỉ tiêu sinh hóa trong Tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp Đại học Nguyễn Văn Công, Nguyễn Xuân Lộc, Lư Thị Hồng Ly và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Ảnh hưởng của Basudin 50EC lên hoạt tính enzyme cholinterase và tăng trọng của cá lóc (Channa striata). Tạp chí khoa học chuyên ngành Thủy sản 2006, 13-23. Theo Nguyễn Thị Em (2008), nghiên cứu sự ảnh hưởng của các độ mặn khác nhau lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và sinh trưởng của Tôm Càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Nuôi trồng thủy sản – Đại học Cần Thơ. Pandey, S, I. Ahmad, S. Parvez, B. Bin-Hafeez, R. Haque and S. Raisuddin. 2000. Department of medical elemcatology and toxicology, tamia hamdard (Hamdar University), New dehi 110062. Idia. Storey, KB.1996. Oxidative stress: Animal adaption in nature. Braz. J. Med. Biol. Res.29: 1715-1733. Trần Lâm Ban – Đỗ Phổ, 1987. Các hợp chất hữu cơ của photpho. NXB khoa học . Trương Quốc Phú, 2006. Giáo trình quản lí chất lượng nước. trường đại học Cần Thơ. Trần Văn Phú, 2008. Ảnh hưởng của Enrofloxacine lên một một số chỉ tiêu sinh hóa của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp. Yawad, V.B.1989. Effect of endosulfan on glutathione S-transferase and glutathion content of the premolt field crab Paratelphusa hydrodromus. Bull. Environ.Contam. Toxicol. 43: 597. 28 Zhang, J, H. Shen, X. Wang, J. Wu, and Y. Xue. 2004. Effect of chronic exposure of 2,4-Ddichlorophenicol on antioxidant system in liver of freshwater fish Carassius auratus. Chemosphere.55: 167-174. 29 Phụ Lục Hoạt tính của LPO trong não của cá Tra Hoạt tính của LPO trong mang của cá Tra Hoạt tính của LPO trong gan cá Tra Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 119.4 464.2 183.7 150.3 63.9 0 274.8 363.0 136.6 70.9 0 133.2 342.3 352.5 119.6 52.3 0.01 80.4 421.6 259.0 216.7 47.9 0.01 113.0 407.2 271.6 191.9 6.1 0.01 347.6 202.6 187.9 51.8 0.1 65.3 237.0 227.9 147.6 154.6 0.1 287.0 173.0 218.3 87.0 0.1 115.1 384.2 331.1 203.9 55.5 0.5 117.2 247.6 346.3 219.2 93.5 0.5 236.3 327.5 210.8 65.8 0.5 101.3 359.5 404.0 208.3 92.9 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 206.5 821.4 429.7 119.7 170.6 0 194.0 1250.5 399.4 159.9 144.7 0 952.7 600.4 177.4 189.2 0.01 212.6 734.9 312.6 160.8 151.8 0.01 175.6 735.0 363.5 194.3 98.3 0.01 630.9 466.5 165.5 135.8 0.1 157.2 550.2 85.1 123.9 137.9 0.1 329.4 419.7 580.9 143.9 102.3 0.1 414.9 492.1 142.8 129.7 0.5 644.1 244.1 485.2 114.4 132.8 0.5 210.8 409.7 543.3 240.4 152.4 0.5 820.2 343.5 149.3 137.9 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 73.1 250.0 127.2 287.8 118.5 0 1562.9 132.2 129.8 122.8 0 55.0 721.1 65.1 215.1 95.0 0.01 103.8 564.5 61.8 307.8 216.3 0.01 91.7 846.9 92.4 245.0 93.7 0.01 1220.5 98.2 351.2 47.7 0.1 45.9 790.3 112.3 266.6 102.1 0.1 966.8 65.7 196.6 37.0 0.1 113.6 1196.0 62.5 132.9 59.4 0.5 89.5 728.5 144.1 258.0 39.3 0.5 397.3 134.3 320.3 145.0 0.5 83.5 1039.0 327.7 887.6 99.2 30 Hoạt tính của AChE trong não của cá Tra Hoạt tính của AChE trong mang cá Tra Hoat tính của AChE trong gan cá Tra Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 439.72 182.26 81.35 126.23 70.53 0 110.63 82.06 66.46 58.36 0 31.36 231.06 155.48 93.38 204.21 0.01 27.22 117.25 105.53 17.90 72.45 0.01 632.90 71.93 43.29 44.01 57.51 0.01 65.20 26.38 49.78 55.57 0.1 147.50 112.49 37.63 91.99 80.31 0.1 417.13 64.16 34.06 46.86 0.1 192.61 125.99 85.27 32.13 44.15 0.5 7.22 350.09 86.52 24.29 52.39 0.5 700.77 5.32 24.71 74.67 0.5 25.54 193.67 7.72 145.73 69.28 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 22.47 39.44 14.08 8.01 18.69 0 104.59 16.05 10.65 11.64 0 19.50 70.57 13.21 21.36 10.10 0.01 145.90 32.45 17.63 10.92 14.00 0.01 24.18 26.61 20.14 14.74 9.36 0.01 25.97 8.92 9.66 13.34 0.1 95.30 21.52 9.90 9.05 14.19 0.1 23.37 9.66 6.97 18.55 0.1 107.78 43.88 9.66 12.01 15.31 0.5 50.89 11.88 9.68 14.73 13.49 0.5 7.97 3.48 11.83 15.67 0.5 53.87 10.31 8.64 3.30 7.81 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 6.19 11.09 2.68 5.12 6.40 0 10.94 6.15 4.45 8.94 0 7.91 11.78 5.25 4.15 16.35 0.01 8.79 6.59 3.86 1.35 12.57 0.01 13.48 11.47 5.69 4.38 2.07 0.01 9.56 6.09 5.53 6.52 0.1 30.07 8.10 2.63 6.19 5.08 0.1 9.40 2.80 5.95 2.53 0.1 46.39 12.14 5.00 2.68 0.5 21.12 8.49 12.30 5.76 6.12 0.5 6.25 3.37 2.93 2.24 0.5 6.81 6.03 3.99 4.10 1.42 31 Hoạt tính của AChE trong cơ cá Tra Hoạt tính của GST trong mang cá Tra Hoạt tính của GST trong gan cá Tra Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 35.50 139.29 23.66 43.31 18.54 0 163.57 60.29 71.25 3.60 0 136.68 300.32 38.57 90.54 8.78 0.01 393.67 123.23 21.86 113.76 64.26 0.01 43.63 2291.20 85.06 137.93 18.80 0.01 209.51 84.59 38.20 52.17 0.1 51.28 317.45 73.63 108.71 9.14 0.1 159.03 99.69 30.80 32.06 0.1 225.27 362.54 69.99 55.87 64.96 0.5 189.37 483.36 143.80 96.80 0.94 0.5 92.76 27.57 43.60 6.09 0.5 64.98 76.37 23.33 84.06 49.29 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 698 794 170 263 75 0 3122 365 253 48 0 597 2170 163 435 67 0.01 2463 980 289 269 230 0.01 669 873 318 287 114 0.01 852 110 358 99 0.1 1528 645 258 339 117 0.1 723 217 273 54 0.1 1361 1086 170 488 27 0.5 762 702 280 547 153 0.5 910 164 306 109 0.5 1847 585 293 428 33 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 97 314 142 220 24 0 397 140 155 289 0 180 397 47 135 237 0.01 254 189 123 124 165 0.01 149 426 174 154 163 0.01 456 113 70 237 0.1 288 325 74 82 139 0.1 317 77 151 155 0.1 321 680 209 196 164 0.5 133 376 706 115 192 0.5 467 131 43 262 0.5 801 56 193 166 137 32 Hoạt tính của CAT trong não cá Tra Hoạt tính của CAT trong mang cá Tra Hàm lượng Protein trong não cá Tra Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 0.0628 0.0362 0.0180 0.0440 0.0298 0 0.0270 0.0345 0.0321 0.0216 0 0.0087 0.0614 0.0589 0.0295 0.0707 0.01 0.0090 0.0268 0.0398 0.0079 0.0194 0.01 0.2692 0.0166 0.0157 0.0149 0.0205 0.01 0.0074 0.0196 0.0218 0.0157 0.1 0.0427 0.0176 0.0168 0.0371 0.0470 0.1 0.1343 0.0170 0.0259 0.0103 0.1 0.0558 0.0293 0.0351 0.0169 0.0139 0.5 0.0039 0.2339 0.0516 0.0091 0.0167 0.5 0.0103 0.0091 0.0128 0.5 0.0056 0.1756 0.0131 0.0418 0.0155 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 0.0282 0.0347 0.0113 0.0170 0.0092 0 0.0884 0.0129 0.0192 0.0085 0 0.0224 0.0797 0.0188 0.0279 0.0092 0.01 0.0686 0.0294 0.0222 0.0194 0.0122 0.01 0.0259 0.0419 0.0260 0.0198 0.0103 0.01 0.0366 0.0105 0.0228 0.0130 0.1 0.0628 0.0317 0.0207 0.0194 0.0097 0.1 0.0270 0.0198 0.0176 0.0152 0.1 0.0683 0.0442 0.0229 0.0320 0.0137 0.5 0.0363 0.0454 0.0214 0.0238 0.0182 0.5 0.0394 0.0086 0.0221 0.0148 0.5 0.0645 0.0303 0.0209 0.0256 0.0109 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 0.41 0.90 1.93 1.12 2.11 0 1.48 2.04 2.48 2.07 0 5.25 0.67 1.17 1.80 0.80 0.01 3.51 1.54 1.83 8.13 2.70 0.01 0.14 2.25 4.38 4.11 3.45 0.01 3.02 5.74 4.49 2.78 0.1 1.34 1.31 3.95 1.93 2.11 0.1 0.20 2.31 3.02 3.45 0.1 0.47 1.31 1.88 5.90 3.53 0.5 5.90 0.20 1.17 7.26 2.78 0.5 0.10 5.25 7.32 2.38 0.5 6.45 0.20 6.67 1.28 2.46 33 Hàm lượng Protein trong mang cá Tra Hàm lượng Protein trong gan cá Tra Hàm lượng Protein trong cơ cá Tra Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 3.08 2.01 7.10 6.61 5.27 0 0.37 4.49 5.52 6.70 0 3.62 0.50 6.01 3.51 7.57 0.01 0.57 1.54 5.09 5.52 6.62 0.01 2.86 2.25 4.60 5.09 8.64 0.01 3.02 8.41 4.11 7.05 0.1 1.17 1.85 5.20 5.20 5.91 0.1 2.01 5.63 6.12 5.47 0.1 1.01 1.27 4.11 3.67 7.49 0.5 1.44 1.98 4.71 3.29 6.10 0.5 1.85 8.46 4.60 5.63 0.5 0.90 2.28 3.40 3.57 6.03 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 14.50 7.43 14.82 10.64 9.19 0 6.59 12.43 12.21 9.71 0 9.11 6.12 12.05 10.64 12.32 0.01 7.70 11.83 19.45 16.35 12.64 0.01 9.93 6.92 12.92 13.08 13.51 0.01 5.85 14.50 13.03 10.38 0.1 7.48 8.17 30.76 10.69 12.16 0.1 7.66 25.76 12.59 11.61 0.1 6.34 4.00 12.05 9.60 12.60 0.5 14.06 7.97 3.35 10.47 14.42 0.5 6.12 13.52 10.53 9.83 0.5 3.24 7.80 14.39 11.83 12.44 Thời gian thu mẫu Nghiệm thức 0 giờ 6 giờ 96 giờ 14 ngày 56 ngày 0 1.99 0.43 4.16 3.02 5.08 0 0.97 1.39 1.44 2.86 0 1.17 0.53 2.48 1.61 3.02 0.01 0.30 1.04 3.57 1.77 3.14 0.01 1.99 0.06 1.61 1.17 2.66 0.01 0.70 1.83 4.27 3.02 0.1 1.12 0.63 1.12 1.99 3.06 0.1 0.97 1.61 7.59 2.66 0.1 0.90 0.47 2.21 3.19 2.58 0.5 0.85 0.26 1.23 1.72 3.14 0.5 0.90 4.00 3.95 2.90 0.5 0.79 0.23 2.21 2.15 3.61