Ảnh hưởng của giống chè và chất lượng nguyên liệu đến hoạt tính kháng bacillus subtilis, bacillus cereus và proteus sp

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo này là trung thực và chưa hề được sử dụng. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện chuyên đề này đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2010 Sinh viên Phạm Thị Hồng Diệu LỜI CẢM ƠN Chuyên đề tốt nghiệp này được thực hiện tại Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội dưới sự hướng dẫn của Ths. Giang Trung Khoa –Trưởng Bộ môn Công Nghệ Chế Biến – Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Để hoàn thành chuyên đề, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ môn Công Nghệ Chế Biến – Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội cho phép tôi thực hiện chuyên đề này. Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy hướng dẫn Giang Trung Khoa đã dành nhiều thời gian, công sức tận tình hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành chuyên đề. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công Nghệ Thực Phẩm các anh chị trong Viện bảo tàng giống vi sinh vật trường Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn các bạn, các em, anh chị trong nhóm sinh viên thực tập tốt nghiệp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành chuyên đề. Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân trong gia đình luôn dành sự cảm thông chia sẻ và điều kiện giúp đỡ tôi có đủ nghị lực để hoàn thành chuyên đề này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2010 Sinh viên MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................ LỜI CẢM ƠN...................................................................................... MỤC LỤC........................................................................................... DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................. DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................. DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ................................................................ Phần I: MỞ ĐẦU.............................................................................. . ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................. 1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU........................................................... 1.2.1. Mục đích.............................................................................. 1.2.2. Yêu cầu................................................................................ Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................... 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ...................................... 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố........................................................... 2.1.2. Đặc điểm thực vật và giống chè chính....................................... 2.1.2.1. Chè Trung Quốc (Camellia sinensis var. sinensis)............ 2.1.2.2. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. assamica)................... 2.1.2.3. Đặc điểm một số giống chè trồng ở Việt Nam................. 2.1.2.3.1. Giống Trung Du.............................................................. 2.1.2.3.2. Giống Shan..................................................................... 2.1.2.3.3. Giống PH1...................................................................... 2.1.2.3.4. Giống 1A......................................................................... 2.1.2.3.5. Giống TRI777................................................................. 2.1.3. Thành phần hóa học cơ bản trong lá chè nguyên liệu .......... 2.1.3.1. Nước.................................................................................. 2.1.3.2. Polyphenol - tanin chè ......................................................... 2.1.3.3. Protein và chất chứa nitơ ..................................................... 2.1.3.4. Ankaloid .............................................................................. 2.1.3.5. Hợp chất pectin .................................................................... 2.1.3.6. Nhóm chất thơm .................................................................. 2.1.3.7. Các chất tro .......................................................................... 2.1.3.8. Các sắc tố ............................................................................. 2.1.3.9. Vitamin ................................................................................ 2.1.3.10. Enzyme .............................................................................. 2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ................................................................... 2.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới ........................ 2.2.1.1. Tình hình sản xuất................................................................ 2.2.1.2. Tình hình tiêu thụ................................................................. 2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam......................... 2.2.2.1. Tình hình sản xuất ............................................................... 2.2.1.2. Tình hình tiêu thụ................................................................. 2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam......................... 2.2.2.1. Tình hình sản xuất ............................................................... 2.2.2.2. Về tình hình tiêu thụ ............................................................ 2.3. GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOL CHÈ.................................. 2.3.1. Bản chất của Polyphenol chè................................................... 2.3.2. Đặc tính của Polyphenol.......................................................... 2.3.2.1. Hoạt kháng oxy hóa.............................................................. 2.3.2.2. Hoạt tính chống khuẩn ........................................................ 2.3.3. Tiềm năng ứng dụng của Polyphenol chè............................... 2.4. GIỚI THIỆU VỀ 3 CHỦNG VI KHUẨN................................. 2.4.1. Bacillus subtilis.......................................................................... 2.4.2. Bacillus cereus........................................................................... 2.4.3. Proteus........................................................................................ Phần III: VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP ................ 3.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU............................. 3.1.1. Địa điểm..................................................................................... 3.1.2. Nguyên vật liệu ........................................................................ 3.1.3. Hóa chất sử dụng........................................................................ 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng....................................................... 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU....................................................... 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 3.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu........................................... 3.3.2. Phương pháp xác định polyphenol tổng số trong chè ............... 3.3.2.1. Chiết xuất polyphenol.......................................................... 3.3.2.2. Pha loãng.............................................................................. 3.3.2.3. Xây dựng đường chuẩn acid gallic ...................................... 3.3.2.4. Xác định hàm lượng polyphenol.......................................... 3.3.2.5. Tính kết quả.......................................................................... 3.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol....................... 3.3.3.1. Nguyên lý............................................................................. 3.3.3.2.Tiến hành............................................................................... 3.3.3.3. Đọc kết quả........................................................................... 3.3.3.4. Bố trí thí nghiệm................................................................... 3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU......................................................................... Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................... 4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ TRONG 3 GIỐNG CHÈ THEO PHƯƠNG PHÁP ISO 14502-1:2005............................................................................... 4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA GIỐNG VÀ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN................ 4.2. ĐỀ NGHỊ..................................................................................... Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................. 4.1. KẾT LUẬN ................................................................................ 4.3. QUAN HỆ GIỮA HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TRONG NGUYÊN LIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CHÈ............................................................................ TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................. PHỤ LỤC............................................................................................  trang   DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Viết tắt C CK PP EC ECG EGC EGCG GC GCG VK ATVSTP HACCP NN-PTNT  Đọc là Catechin Chất khô Polyphenol Epicatechin Epicatechingallate Epigallocatechin Epigallocatechin gallate Galocatechin Galocatechingalate Vi khuẩn Vệ sinh an toàn thực phẩm Hệ thống phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn Nông nghiệp – Phát triển nông thôn   DANH MỤC CÁC BẢNG STT  Tên bảng  Trang   2.1 3.1 4.1 4.2 4.3 4.4. 4.5  Thành phần hóa học trong lá chè tươi Thị trường xuất khẩu chè 6 tháng đầu năm 2009 Tương quan giữa giá trị mật độ quang và nồng độ acid gallic Hàm lượng polyphenol tổng số trong chè nguyên liệu (%CK) Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng kháng của chủng Bacillus subtilis Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng kháng của chủng Bacillus cereus Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng kháng của chủng Proteus sp.    DANH MỤC CÁC HÌNH STT  Tựa đề của minh hoạ  Trang   4.1 4.2 4.3 4.4  Đồ thị chuẩn acid gallic Hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu chè Tương quan giữa hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu đến hoạt Hình ảnh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của các giống chè nghiên cứu    Phần I MỞ ĐẦU . ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam, mặc dù chiếm ưu thế là nước đứng thứ 7 trên thế giới về diện tích trồng chè, nhưng thu nhập mang lại từ sản phẩm này vẫn chưa cao, cây chè vẫn chỉ được coi là cây xoá đói, giảm nghèo ở nước ta do giá không ổn định và thường thấp hơn giá cùng loại của nhiều nước từ 20-25%. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nước chiết chè có khả năng chống oxy hoá, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng nấm... và vi rút rất hiệu quả [1,11]. Điều này là do trong chè có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học như ankaloid, tanin, catechin, methylxanthine và đặc biệt là các polyphenol,...[4,21]. Do đó chè và các sản phẩm từ chè đã được ứng dụng nhiều trong y học, dược mỹ phẩm và trong công nghiệp thực phẩm. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của polyphenol chè hay nước chiết chè thường được tập chung chủ yếu trên đặc tính chống oxy hoá. Nhìn chung việc làm rõ đặc tính kháng khuẩn của polyphenol chè còn nhiều bất cập, ít thông tin, đặc biệt đối với các vi khuẩn vừa gây bệnh cho người, vừa gây thối hỏng thực phẩm. Tuy vậy, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol chè hay nước chè pha phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như: loại chè (chè đen, chè xanh...), giống chè (nguyên liệu trong chế biến), chủng vi sinh vật thử nghiệm, nhiệt độ và dung môi trích ly... Trong nghiên cứu này, với mục đích xác định ảnh hưởng của giống chè đến khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh và gây hư hỏng thực phẩm, bước đầu xác lập cơ sở khoa học cho việc định hướng sử dụng polyphenol chè, chúng tôi tiến hành đề tài “Ảnh hưởng của giống chè và chất lượng nguyên liệu đến hoạt tính kháng Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Proteus sp” 1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Mục đích Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 03 giống chè phổ biến ở nước ta, làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng polyphenol chè/nước chiết chè trong bảo quản chế biến nông sản thực phẩm. Yêu cầu - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong 03 giống chè thí nghiệm. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn đối với 03 chủng: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus sp. Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người Trung Quốc vào năm 2700 trước công nguyên. Đầu tiên được sử dụng như một dược liệu, sau trở thành một thứ đồ uống mang đậm tính dân tộc của Trung Quốc. Dựa vào di tích khảo cổ học và điều kiện sinh thái của cây chè, căn cứ ở các vùng chè hoang dại và tập quán sử dụng chè, nhiều tài liệu của Trung Quốc, Liên Xô cũ đã đi đến kết luận: cây chè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núi phía Bắc Việt Nam. Ngày nay, cây chè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới, trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải dài từ 30 vĩ độ nam đến 45 vĩ độ bắc, tập trung chủ yếu ở các nước châu Á chiếm 80 – 90% tổng diện tích chè thế giới.[5] Trong đó, nổi tiếng là Ấn Độ, Trung Quốc, Kenya, Sri Lanka, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam.[27] Ở Việt Nam, chè được trồng trong khoảng 30 tỉnh, tập trung ở 14 tỉnh, trong đó vùng Trung du và miền núi phía Bắc chiếm khoảng trên 60%, Tây Nguyên khoảng 14%, còn lại là các vùng khác.[5] 2.1.2. Đặc điểm thực vật và giống chè chính Tên khoa học của cây chè là: Camellia sinensis (L) O. Kuntze Bộ chè: Theales Họ chè: Theacea Chi chè: Camellia Loài: Camellia sinensis Trên thế giới để dễ phân loại, người ta chia ra làm 2 loại: Chè Trung Quốc và chè Ấn Độ[5] 2.1.2.1. Chè Trung Quốc (Camellia sinensis var. sinensis) Đặc điểm: Lá nhỏ, rất cứng. Thuộc loại thân độc thân hoặc đa thân. Có khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu khắc nghiệt như nhiệt độ thấp. Có hàm lượng tanin không cao. Thích hợp cho sản xuất chè xanh 2.1.2.2. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. assamica) Đặc điểm: Lá to, mềm, bóng. Thuộc loại độc thân. Có khả năng thích nghi với điều kiện nhiệt đới. Có hàm lượng tanin cao. Thích hợp cho sản xuất chè đen 2.1.2.3. Đặc điểm một số giống chè trồng ở Việt Nam[5,25,27] Chè là loại cây dễ lai chéo, nên có khả năng tạo ra nhiều giống mới. Dưới đây là đặc điểm của một số giống chè được trồng chủ yếu ở nước ta. 2.1.2.3.1. Giống Trung Du Đây thực chất là giống chè Trung Quốc, được du nhập vào nước ta từ rất lâu đời, ở vùng Trung du Bắc Bộ. Giống có khả năng thích nghi với vùng đất khô cằn, khả năng kháng chịu sâu bệnh tốt và thích hợp ở mức trung bình cho cả sản xuất chè đen và chè xanh. Hiện nay, giống này chiếm khoảng 60% tổng diện tích chè của cả nước. 2.1.2.3.2. Giống Shan Chiếm khoảng trên 20% diện tích, được phát triển chủ yếu ở vùng núi cao như: Hà Giang, Sơn La,…Cây thuộc loại độc thân, lá to, thích nghi với điều kiện tương đối lạnh. Giống có hàm lượng tanin khá cao, năng suất cao, chất lượng sản phẩm tốt. Thích hợp cho cả sản xuất chè đen lẫn chè xanh. 2.1.2.3.3. Giống PH1 Đây là giống được chọn tạo từ chè Assam-manipur tại trại chè Phú Hộ, hiện chiếm khoảng 10% diện tích. Giống này có đặc điểm búp to, cuộng mập, thuỷ phần cao, năng suất cao nhưng chất lượng sản phẩm thấp do hàm lượng EGCG cao và để lại dư vị đắng cho sản phẩm. 2.1.2.3.4. Giống 1A Giống chè 1A được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc cá thể từ tập đoàn Manipur ( Ấn Độ). Búp có lá mềm, màu xanh vàng. Trọng lượng búp thường cao hơn chè Trung Du, cho năng suất từ trung bình đến khá. Chè 1A có hương thơm dịu, chất lượng sản phẩm tốt, có thể chế biến thành chè xanh, chè đen và chè đặc sản với chất lượng cao. 2.1.2.3.5. Giống TRI777 Giống chè TRI 777 được nhập nội và thuần hóa từ giống chè trong tập đoàn của SriLanka có nguồn gốc chè Shan Việt Nam (Sơn La). Lá thô, màu xanh đậm, thuôn dài. Búp mập hơn giống Trung Du. Cho năng suất trung bình, chất lượng tốt. Chè TRI 777 có hương thơm đặc trưng, chế biến thành chè đen và các loại chè đặc sản có chất lượng cao. 2.1.3. Thành phần hóa học cơ bản trong lá chè nguyên liệu [5,7,27,28] Thành phần hoá học của chè rất đa dạng và phong phú. Trong đó, có một số lượng lớn các chất có giá trị sinh học cao. Các hợp chất này vừa quyết định đến chất lượng chè thành phẩm, vừa quyết định đến tính chất dược lý của chè. Bảng 2.1: Thành phần hóa học trong lá chè tươi[28] 2.1.3.1. Nước[27,28] Nước là thành phần lớn nhất ở búp chè, có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của cây chè cũng như trong quá trình chế biến. Hàm lượng nước trong các đọt chè tươi thường chiếm khoảng 75-82%, và phụ thuộc vào: Độ non già của nguyên liệu, niên vụ, chế độ canh tác và phụ thuộc vào chất kích thích sinh trưởng. 2.1.3.2. Polyphenol - tanin chè [27,28] Tanin chè là một hỗn hợp phức tạp các hợp chất có đặc tính polypenol, bao gồm các polyphenol catechin đơn giản và các sản phẩm oxy hóa của chúng. Tanin chè là thành phần hoá học quyết định đến các tính chất màu sắc, hương vị của các loại chè sản phẩm do chính chúng tạo ra hoặc do những biến đổi hoá học của chúng đem lại. Hàm lượng tuyệt đối của tanin chè càng cao thì chất lượng của chè càng tốt. Tanin bị phân huỷ ở nhiệt độ cao (180-2000C). Hợp chất polypenol thường chiếm khoảng 20-30% chất khô. Theo kết quả nghiên cứu các giống chè, thành phần của tanin trong chè tươi nguyên liệu gồm có: - Nhóm chất catechin (tiền chất của tanin) đơn phân tử chiếm khoảng trên 80% tổng lượng tanin chè, có vị chát - đắng. - Nhóm tanin đặc biệt: là polyphenol đa phân tử, chúng tạo màu và vị chát dịu cho chè. - Nhóm chất phi tanin: Nhóm này gồm 7 catechin khác nhau đó là Epicatechin (EC), Epigalocatechin (EGC), Galocatechin (GC), Epicatechingalat (ECG), Epigalocatechingalat (EGCG), Galocatechingalat (GCG) và Catechin.Trong đó EGCG có vị đắng đặc trưng còn EC, EGC và GC có vị chát dịu. Nhóm chất phi tanin có vị đắng ở dạng glucozit và có màu thuộc họ flavonol. Hợp chất polyphenol là sản phẩm của quá trình quang hợp do đó nó bị ảnh hưởng của các yếu tố: mức độ sinh trưởng của lá, chế độ bón phân, cường độ chiếu sáng. 2.1.3.3. Protein và chất chứa nitơ [5,27,28] Trong đọt chè tươi có chứa một lượng lớn các hợp chất chứa nitơ, chiếm khoảng 18% chất khô, nhờ quá trình phân giải protein dưới tác dụng của enzyme proteaza tạo nên mùi thơm và một phần vị cho chè. Các axit amin trong lá chè đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo hương thơm mới cho chè sản phẩm khi lên men chè hoặc khi chế biến nhiệt. Hàm lượng protein trong lá chè luôn luôn thay đổi và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mùa vụ, chế độ chăm sóc, độ non già của nguyên liệu... 2.1.3.4. Ankaloid [5,7,27,28] Nhóm hợp chất ankaloid trong chè có nhiều nhưng về hàm lượng thì nhiều nhất là cafein. Hàm lượng cafein trong đọt chè non một tôm 2,3 lá non chiếm khoảng 2-4% chất khô, cao hơn hai lần trong hạt cà phê. Cafein bị thăng hoa ở nhiệt độ 1800C nên ít bị tổn thất nhiều khi sấy. Hàm lượng cafein trong chè cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống chè, điều kiện canh tác, kỹ thuật chăm bón và nhất là độ trưởng thành của đọt chè, lá chè càng non càng chứa nhiều cafein 2.1.3.5. Hợp chất pectin [27,28] Pectin là hợp chất thuộc nhóm glucid. Hàm lượng pectin trong chè chiếm khoảng 2% chất khô, thay đổi phụ thuộc vào độ trưởng thành của lá chè, lá càng non thì hàm lượng pectin hoà tan trong nước càng tăng. Pectin có tính keo, khi bị hydrat hoá thì tính keo tăng lên, có vai trò định hình cho chè thành phẩm, tạo vị ngọt dịu, tạo độ sánh, độ nhớt cho nước chè pha. Nhưng pectin cũng là chất hút ẩm mạnh nên gây khó khăn trong việc bảo quản chè lâu dài. 2.1.3.6. Nhóm chất thơm [27,28] Hương thơm của chè trước hết phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng các cấu tử tinh dầu có trong nguyên liệu và được tạo mới trong quá trình chế biến chè. Sự tích luỹ các chất thơm phụ thuộc vào giống chè, điều kiện khí hậu và đất đai. Hàm lượng chất thơm trong lá chè khoảng 0,02-0,2% chất khô. 2.1.3.7. Các chất tro [1,5,28] Chất tro trong nguyên liệu chè non chiếm khoảng 4-5% chất khô và khoảng 5-6% trong chè sản phẩm. Trong chè, chất tro chia làm 2 nhóm chính: hòa tan trong nước và không hòa tan trong nước. Chất tro là chỉ tiêu đánh giá chất lượng vệ sinh công nghệ trong chế biến chè. 2.1.3.8. Các sắc tố [28] Trong lá chè, các chất màu hòa tan trong chất béo như chlorofin (có màu xanh), caroten (có màu vàng), xantofin (có màu da cam), antoxianidin (có màu đỏ hồng) chiếm khoảng 0,3% chất khô. 2.1.3.9. Vitamin [1,28] Trong chè có chứa nhiều loại vitamin, bao gồm các loại vitamin A, B1, B2, C, PP… giá trị của chè ở một mức độ nhất định phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các vitamin đó. Trong lá chè tươi có chứa một lượng lớn vitamin C, hàm lượng lớn gấp 2-3 lần trong nước cam, chanh. 2.1.3.10. Enzyme [1,5,7,28] Trong lá chè non có chứa hầu hết các loại enzyme, hai nhóm enzyme quan trọng nhất đối với công nghệ chế biến chè là nhóm enzyme thuỷ phân và nhóm enzyme oxy hoá-khử. - Trong nhóm enzyme thuỷ phân, proteaza và glucosidaza đóng vai trò quan trọng trong sự tạo thành hương vị đặc trưng cho chè sản phẩm sau này. - Nhóm enzym oxy hoá khử trong chè gồm: polyphenoloxydaza, catalaza, peroxydaza. Nhóm này đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men chè đen. 2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 2.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới [30] 2.2.1.1. Tình hình sản xuất Đến năm 2002, diện tích trồng chè trên toàn thế giới đã tăng gấp 3 lần so với năm 1934, với hơn 2.550.000 ha chè. Cũng vào thời điểm này, theo thống kê của FAO, có hơn 58 nước trồng và chế biến chè. Trong đó, Ấn Độ, Sri Lanka, Kenya và Trung Quốc luôn đứng đầu về năng suất và chất lượng[6]. Trước nhu cầu tiêu thụ chè chất lượng cao ngày càng tăng, các nước sản xuất và tiêu thụ chè buộc phải đầu tư chiều sâu cho vùng trồng chè như cải thiện giống, thực hiện nghiêm các kỹ thuật canh tác, thu hái, công nghệ chế biến…[29] Hàng năm, 45% sản lượng chè thế giới dành cho xuất khẩu. Công nghiệp chè đã chiếm một vai trò quan trọng đối với nền kinh tế của nhiều nước. Theo nghiên cứu, xuất khẩu chè đã mang lại 33% thu nhập từ các sản phẩm nông nghiệp của Kenya, 55% ở Srilanca, 2% ở Indonexia và 5% tại Tanzania.[6] 2.2.1.2. Tình hình tiêu thụ[30] Giá chè thế giới năm 2009 đã tăng gấp đôi so với năm 2008 lập kỷ lục cao của nhiều năm nay do hạn hán ở Ấn Độ, Sri Lanka và Kenya, trong khi nhu cầu chè thế giới tăng mạnh. Từ mức giá trung bình 2,38 USD/kg năm 2008, giá chè hảo hạng BP1s của Kenya đã tăng lên 2,74 USD/kg vào đầu năm 2009, tiếp tục tăng lên 3,18 USD/kg vào tháng 9/2009 và kết thúc năm 2009 ở mức 5,45 USD/kg. Nhu cầu chè cao ngay cả trong giai đoạn kinh tế suy thoái, nhất là với các loại chè chế biến. Giá chè tăng đã không ảnh hưởng nhiều tới tiêu thụ ở các nước phát triển bởi sức cạnh tranh của mặt hàng này rất cao trên thị trường đồ uống nói chung. Dự báo tình trạng thiếu cung chè sẽ càng thêm trầm trọng trong năm 2010 do sản lượng ở Châu Phi, Sri Lanka và Ấn Độ tăng không theo kịp mức tăng của nhu cầu về chè. Theo Ông Aditya Khaitan, Giám đốc công ty McLeod Russel India Ltd. - công ty sản xuất chè lớn nhất thế giới, dự báo thị trường chè thế giới có thể thiếu cung cao hơn so với dự báo hồi tháng 10/2009, giá có thể lập kỷ lục cao mới trong năm nay do tình trạng thiếu hụt kéo dài quá lâu. 2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam[29,30] 2.2.2.1. Tình hình sản xuất [29] Việt Nam có lịch sử trồng chè từ lâu đời, nhưng cây chè chỉ mới được trồng và phát triển với quy mô lớn từ khoảng 100 năm nay, tập trung ở vùng Trung du miền núi phía Bắc và Tây nguyên như: Thái Nguyên, Sơn La, Bắc Thái, Hà Tuyên, Lâm Đồng, Gia Lai,.. [5]. Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5 nghìn ha, tăng 1.900 ha so với năm 2007. Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiến đạt 6,5 tấn búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha của năm 2007. Mặc dù tốc độ tăng diện tích chè cao đến chóng mặt trong vòng 10 năm qua (1996 - 2005), lên tới gần 150%, nhưng sản lượng chè nguyên liệu vẫn thiếu hụt do không chạy theo nổi số lượng nhà máy, cơ sở chế biến được thành lập mới và do năng suất chè không cao. Trên 70% diện tích chè hiện sử dụng là các giống chè chất lượng trung bình. 2.2.2.2. Về tình hình tiêu thụ [30] Năm 2009, kim ngạch xuất khẩu chè của Việt Nam tăng khoảng 40 triệu USD so với năm trước. Đây là một trong số ít những ngành giữ được phong độ xuất khẩu trong bối cảnh kinh tế toàn cầu sa sút. Việt Nam hiện có 270 doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh chè. Trong đó, 75% lượng chè khô làm ra hàng năm được xuất khẩu sang 110 nước và vùng lãnh thổ và hiện đứng thứ 5 thế giới sau Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Kenya về sản lượng cũng như kim ngạch xuất khẩu. Triển vọng thiếu cung chè trong những tháng tới sẽ là cơ hội tốt cho ngành chè Việt Nam. Tuy nhiên, điểm yếu của chè nước ta là chất lượng không đồng đều, nên giá chưa cao, chỉ bằng nửa giá thế giới. Trong khi giá chè trung bình toàn cầu năm 2009 là 2,2 USD/kg thì chè Việt Nam chỉ khoảng 1,1 USD/kg. Do vậy, trong khi khối lượng xuất khẩu tăng mạnh thì trị giá xuất khẩu chỉ tăng khoảng 13,6%, đạt 167 triệu USD. Trong 6 tháng đầu năm 2009, thị trường xuất khẩu chè nhiều nhất của Việt Nam là Pakistan, thứ hai là Nga, xuất sang Trung Quốc tăng nhẹ.  Bảng 2.2: Thị trường xuất khẩu chè 6 tháng đầu năm 2009 [30] Thị trường XK  Lượng (tấn)  Trị giá (USD)   Ấn Độ  2.745  2.855.667   Arập xê út  121  252.078   Ba Lan  562  627.046   Tiểu VQ Arập TN  249  380.791   Đài Loan  8.141  9.797.712   Đức  873  1.106.699   Hoa Kỳ  2.097  1.915.326   Indonêsia  2.044  1.580.973   Nga  8.750  10.392.735   Pakistan  13.025  18.135.797   Philippin  132  410.161   Trung Quốc  3.258  3.485.625   Trong kế hoạch phát triển kinh tế, vấn đề đặt ra cho ngành chè nước ta hiện nay là nâng cao chất lượng sản phẩm và xây dựng thương hiệu chè Việt Nam. Tại Hội nghị phát triển chè các tỉnh miền núi phía Bắc, Bộ NN-PTNT đã yêu cầu các địa phương cần sắp xếp lại các cơ sở chế biến chè một cách phù hợp, đình chỉ hoạt động đối với các đơn vị không đảm bảo. Bộ khuyến khích các cơ sở áp dụng tiêu chuẩn về chất lượng, ATVSTP đối với chè như ISO-9001:2000 và HACCP. Bên cạnh đó, từng địa phương phải đảm bảo điều tiết, phân vùng nguyên liệu các cơ sở chế biến để khắc phục cả hai xu hướng: tranh chấp trong thu mua hoặc ép cấp, ép giá đối với người sản xuất. 2.3. GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOL CHÈ 2.3.1. Bản chất của Polyphenol chè Trong cây chè, polypenol là thành phần hóa học chủ yếu chiếm khoảng 20-30% khối lượng chất khô. Trong đó, catechin chiếm tỷ lệ cao hơn cả (chiếm khoảng 15- 20% chất khô và trên 70% tổng lượng polypenol trong lá chè) [1,4]. Hiện nay trong chè người ta tìm được các loại polypenol – catechin sau: EC, EGC, GC, ECG, EGCG, GCG, C. Trong đó EGCG chiếm đến 75% tổng lượng catechin. Các polypenol-catechin này có vai trò quyết định đối với chất lượng cảm quan và tính chất dược lý của chè. [4] Catechin có công thức cấu tạo chung như sau:
trong đó, khi R1 =R2 = H ta có epicatechin (EC); khi R1 =OH, R2 = H ta có epigallocatechin (EGC). Khi R2 là gốc gallat:
Và, nếu R1 = H ta có epicatechingallat (ECG), còn khi R1 =OH ta có epigallocatechin gallat (EGCG). Chính các polypenol trên là thành phần chính trong phức tanin của chè. 2.3.2. Đặc tính của Polyphenol 2.3.2.1. Hoạt kháng oxy hóa Đặc điểm chính của chất kháng oxy hóa là nó có khả năng khử các gốc tự do. Những gốc tự do này có thể oxy hóa nucleic aicd, protein, lipid hoặc DNA và gây bệnh thoái hóa. Hợp chất kháng oxy hóa như là phenolic acid, polypenol và flavonoid sẽ thu nhận các gốc tự do (peroxide, hydroperoxide hoặc lipid peroxyl...) và do đó dập tắt các quá trình tự oxy hoá này.[18,19] Khi khảo sát khả năng quét gốc tự do tổng hợp như DPPH, ABTS…, các polypenol – catechin chè thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, Vitamin E, trolox từ 3 đến 6 lần. Trong các catechin chè, EGCG và ECG có hoạt tính này trội hơn cả và được xếp theo trật tự giảm dần như sau: ECG ≈ EGCG > EGC > GC > EC ≈ C [22]. Sự khác biệt này là dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức cấu tạo, cho phép tiếp nhận electron dễ dàng hơn [19]. Trong nước chiết chè, các catechin đóng góp khoảng 70 – 80% khả năng kháng oxy hóa. [22]. Khi tiến hành thử nghiệm in vitro và in vivo về khả năng kháng oxy hóa trong môi trường lipid như chống oxy hóa lipid màng tế bào (LDL), chống oxy hóa các acid béo, hay quét các gốc tự do superoxyl, hydroxyl… các hợp chất catechin đều thể hiện khả năng phản ứng rất mạnh. 2.3.2.2. Hoạt tính chống khuẩn Liên quan đến hoạt tính chống khuẩn của polypenol chè, phần lớn các nghiên cứu tập trung trên tác dụng của catechin đối với các vi khuẩn gây bệnh cho con người có trong thực phẩm. Mendel (2007) đã chỉ ra rằng, ở nồng độ 10-9 mol/l, catechin chè có khả năng ngăn cản Bacillus cereus. Chất chiết chè xanh và chè đen đều có thể ngăn cản sự phát triển của Campylobacter jejuni và Campylobacter coli ( Diker cộng sự, 1991); ngoài ra polypenol chè có thể ngăn cản sự sinh bào tử và phát triển của Cl. Perƒringens đối với bảo quản lạnh thịt gà tây (Juneja et al., 2007); hay polypenol chè có khả năng chống lại in vitro đối với Staph. Aureus và L. monocytogenes nhưng không có tác dụng với E. Coli O157:H7 (Jim và cộng sự, 2004),…Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của polypenol chè đối với các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Fukai và cộng sự (1991) đã nghiên cứu ảnh hưởng của polypenol chè trên 8 chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách , súp lơ, cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh, thối ướt, đốm lá trên tỏi, súp lơ, xà lách…, kết quả cho thấy: catechin chè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của các polypenol chè đều dưới 100ppm. Trong 4 cấu tử catechin thử nghiệm (EGC, EGCG, EC, ECG) thì EGCG và EGC hiệu quả hơn cả. Về ảnh hưởng của chất chiết chè đối với bảo quản nông sản, Ana và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của polypenol đến các chỉ tiêu cảm quan, nâu hoá, hô hấp, pH, vitamin C, caroten… của xà lách chế biến tối thiểu. Các tác giả cũng chỉ ra rằng, sử dụng polypenol ở nồng độ 0.25g/100ml nước để bảo quản xà lách chế biến tối thỉểu cho hiệu quả cao hơn khi so sánh với xử lý bằng Clo ở nồng độ 120ppm. Đây là những thông tin khoa học quan trọng để sử dụng polypenol chè trong bảo quản nông sản, thực phẩm. 2.3.3. Tiềm năng ứng dụng của Polyphenol chè[24,31] Nhìn chung, tác dụng kháng oxy hóa của polypenol trong chè có vai trò rất lớn và đặc biệt quan trọng trong các lĩnh vực y học – sức khỏe và thực phẩm. Trong y học, hợp chất kháng oxy hóa đóng vai trò quan trọng như là nhân tố bảo vệ sức khỏe. Một số nghiên cứu lâm sàng cho thấy, các chất kháng oxy hóa có trong ngũ cốc, trái cây, rau quả, rượu vang đỏ và đặc biệt là chè có thành phần là vitamin C, vitamin E, caroten, phenolic acid, phytate, phytoestrongen, hợp chất polyphenol là yếu tố chính làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh nan y như: bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột và ngoài ra còn có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá, tăng tuổi thọ. EGCG chè xanh giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm răng lợi, ngăn ngừa chứng huyết khối, nó giúp ích trong việc phòng và điều trị các chứng tắc mạch và thiếu máu cục bộ cũng như giảm thiểu nguy cơ đột qụy do nhồi máu cơ tim, giúp xương vững chắc, giảm cân, giúp ngăn ngừa và điều trị chứng loét dạ dày. Một tác dụng tích cực khác từ chè là giúp giảm nguy cơ ung thư. Hoạt chất EGCG có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, do đó nó giúp giảm nguy cơ ung thư cũng như sự lan tỏa của các tế bào khối u. Trong thực phẩm, đặc tính kháng oxi hoá của catechin chè có thể được sử dụng như những chất kháng oxi hoá tự nhiên, hoặc được sử dụng để tạo ra các thực phẩm chức năng (Yang và cộng sự, 1995; Jiang và cộng sự, 1995). Khi nghiên cứu ảnh hưởng của polypenol chè đến sự oxi hoá lipid đối với “thịt đỏ”, thịt gia cầm, cá, Shuze và cộng sự (2001) nhận thấy: polypenol chè ở nồng độ 300mg/kg thịt có thể ngăn cản được quá trình tiền oxy hoá lipid. Cũng ở bảo quản cá, Chih-Cheng và Chung-Saint (2005) đã nhận thấy rằng, chất chiết chè xanh và chè Pouchung ở nồng độ 5% (5g chè/100ml nước) có thể ngăn cản sự oxy hoá lipid và protein đồng thời lưu giữ được chất lượng cá ngừ filet bảo quản bằng phương pháp lạnh đông. Trong mỹ phẩm, do tác dụng ngăn cản quá trình oxy hóa nên polypenol chè đặc biệt được chú ý đến trong các ngành mỹ phẩm. Với da, chè còn có tác dụng đặc biệt do thành phần của vitamin B2. Vitamin B2 có tác dụng giữ tính đàn hồi cho da, không bị khô ráp và mềm mại. Vitamin P và K tạo nên vẻ đẹp bên ngoài cho da, giúp tuần hoàn máu làm cho da luôn hồng hào, tươi tắn. Hơn nữa trong chè còn có một lượng chất sắt nhất định, giúp củng cố lượng hồng cầu trong máu [24]. Đặc biệt, polypenol chè có khả năng chống lại được các tia cực tím khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và là tác nhân chống oxy hóa mạnh bảo vệ cho da chống lão hóa...[31]. Do vậy, ngành công nghiệp mỹ phẩm đã tạo ra các loại kem chống nắng được bổ sung chất chiết xuất từ chè xanh... Với xu hướng sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên, chè xanh sẽ ngày càng được chú ý, ưa chuộng và trong tương lai sẽ ngày càng có nhiều các sản phẩm từ chè phục vụ trong mọi lĩnh vực của đời sống con người. 2.4. GIỚI THIỆU VỀ 3 CHỦNG VI KHUẨN 2.4.1. Bacillus subtilis[6] B. subtilis là vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí sống ký sinh, có khả năng sinh bào tử, được tìm thấy phổ biến trong đất, trong nước biển, nước ngọt. Đặc biệt, người ta cũng phân lập được vi khuẩn này trong cơ thể người (khi bị viêm tim, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng mắt...) và trong các nông sản thực phẩm. Nhiệt độ tối ưu từ 25 – 350C. Tính chống chịu của bào tử B. subtilis là vấn đề nghiêm trọng trong các ngành công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và ngành sản xuất vật liệu tiệt trùng. Khả năng này là do bề mặt của bào tử Bacillus rất kỵ nước. Điều này cho phép chúng bám chặt vào bề mặt thiết bị, ngay cả với vật liệu Inox và làm giảm mạnh hiệu quả của quá trình vệ sinh, tẩy rửa. Trong một số trường hợp, B. subtillis cũng gây ra vấn đề ngộ độc thực phẩm (thịt lạnh, pizza, bánh...) với các triệu chứng: nôn mửa, ỉa chảy, thường xuất hiện sau ăn thực phẩm bị nhiễm từ 2 đến 5 giờ. Ngoài ra nó cũng là một trong những nguyên nhân gây bệnh viêm vú ở bò, có thể tái nhiễm ngay cả khi được xử lý kháng sinh. (Euzéby J.B. (2007). Dictionnaire de bactériologie vétérinaire. 2.4.2. Bacillus cereus[6] B. cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kích thước bào tử không vượt quá kích thước tế bào nên khi sinh bào tử tế bào không bị biến dạng. Điều kiện phát triển: - Nhiệt độ tối thích: 30 – 370C - pH: (4,3 - 9,3), bị ức chế khi có 0,1% acetic acid (pH 5,1) - Phát triển tốt khi có oxy. Thực phẩm bị nhiễm B. cereus gây bệnh cho người là thịt, hải sản, sản phẩm ngũ cốc, sản phẩm rau, nhiều loại thảo mộc, gia vị sấy khô, nước sốt, xôi, cơm đĩa. Ở Mĩ, cơm chiên được xem là một trong những nguyên nhân hàng đầu của nhiễm vi khuẩn B. cereus.  Chính vì thế mà có người còn gọi hội chứng cơm chiên. Bào tử B. cereus thường có mặt ở trên ngũ cốc và có thể sống sót khi đun nấu không kỹ. Trực khuẩn còn sống sót phát triển sẽ sinh độc tố. B.cereus phân bố rộng, trong đất, bụi, không khí, nước... Nó có thể sinh bào tử và sống sót trong tất cả các giai đoạn của quá trình chế biến. Thực phẩm chứa > 104 CPU B.cereus/g có thể coi là không an toàn cho sử dụng. Vi khuẩn này có khả năng gây viêm ruột.  Người bị phơi nhiễm vi khuẩn có thể bị viêm ruột trong vòng 1 đến 6 giờ, và dẫn đến tiêu chảy, ói mửa, đau bụng trong vòng 6 đến 24 giờ.    2.4.3. Proteus[6] Đặc điểm : Proteus là vi khuẩn sống ký sinh ở ruột và các hốc tự nhiên của người. Chúng là loại vi khuẩn “gây bệnh cơ hội”. Proteus là trực khuẩn gram âm, di động mạnh. Vi khuẩn có nhiều hình thể thay đổi trên các môi trường khác nhau, từ dạng trực khuẩn đến dạng hình sợi dài. Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thạch dinh dưỡng, khuẩn lạc có một trung tâm lan dần ra, từng đợt, từng đợt , mỗi đợt là một gợn sóng và có mùi thối đặc biệt. Trên môi trường có natri deoxycholate, Proteus mọc thành khuẩn lạc tròn, riêng biệt không gợn sóng, có một điểm đen ở trung tâm, xung quanh màu trắng nhạt. Nguồn lây nhiễm: Proteus có rộng rãi trong tự nhiên, có trong ruột người và chỉ gây ngộ độc khi có điều kiện, ngộ độc thức ăn do Proteus chiếm tỷ lệ tương đối cao, nhiều nhất là khi xâm nhập vào thịt sống. Biểu hiện bệnh: Proteus là một loại vi khuẩn "gây bệnh cơ hội". Chúng có thể gây ra : viêm tai giữa có mủ, viêm màng não thứ phát sau viêm tai giữa ở trẻ còn bú, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết ... Đặc điểm của các tổn thương và mủ do Proteus gây ra có mùi thối như trong hoại thư do vi khuẩn kị khí gây nên. Phần III VẬT LIỆU - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP 3.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.1.1. Địa điểm Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Thời gian thực hiện: 16/01/10 – 10/05/10. 3.1.2. Nguyên vật liệu - Chè nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu gồm 3 giống chè : Trung Du, Shan và PH1 với 3 độ non già là : 1 tôm 2 lá, nguyên liệu loại B và nguyên liệu già (2 lá cuối của cành chè). Nguyên liệu được thu hoạch vào đầu vụ (giữa tháng 3/2010) tại trại chè Phú Hộ – Phú Thọ. - 3 chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus sp. được mua tại viện bảo tàng giống vi sinh vật – Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội. 3.1.3. Hóa chất sử dụng - Nước cất, acetone, ethyl acetate, methanol 70%, cồn 700, (Na2CO3) 7,5%, NaOH 25%, acid gallic monohydrate. Chloroform, gelatin (Trung Quốc). Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Đức). - Môi trường Mueller Hinton (Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire, England) 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng - Cân phân tích với độ chính xác 0.001g. Máy lắc ngang (GYROMAXTM, Model 727, USA). Máy quang phổ (UV-VIS 1800 – Shimadzu). Máy sấy chân không. Bếp điện, bếp cách thủy, nồi hấp, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh. - Bình tam giác các loại, bình định mức, cốc đong, ống nghiệm, micropipet các loại , đĩa petri loại 100mm, que cấy vòng, đèn cồn, cốc thủy tinh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của giống và chất lượng nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol 3.2.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng loại nguyên liệu giống Trung du, Shan và PH1 đối với Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus sp. 3.2.3. Đánh giá tương quan giữa hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu với hoạt tính kháng khuẩn 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu Mẫu chè tươi được hái trên đồi chè theo 4 hướng Đông, Tây, Nam, Bắc và một điểm ở giữa. Hái ở các điểm rồi trộn đều và lấy mẫu trung bình theo phương pháp đường chéo. Mẫu sau khi thu hái được vô hoạt enzyme bằng cách hấp ngay ở 950C trong 3 phút, sau đó được sấy khô đến độ ẩm 5% trong máy sấy đông khô (-450C). Mẫu sau sấy được nghiền nhỏ ở kích thước 0,5 -1mm và được bảo quản trong túi PE đựng trong lọ thủy tinh ở 40C. 3.3.2. Phương pháp xác định polyphenol tổng số trong chè Xác định polyphenol tổng số trong chè theo phương pháp ISO 14502-1 :2005 3.3.2.1. Chiết xuất polyphenol - Cân chính xác 0,2 ± 0,001 g chè khô (độ ẩm khoảng 5%, kích thước 0,5-1mm, phải trộn đều lấy đại diện) cho vào ống nghiệm hoặc ống chiết (10 ml). - Cho bình tam giác có chứa dung môi methanol 70% vào bể ổn nhiệt ở 700C trong 30 phút - Đặt ống nghiệm chứa mẫu vào bể ổn nhiệt ở 700C, để khoảng 1 phút rồi cho 05 ml methanol 70% ở 700C vào ống chiết. Sau đó, lấy ra và khuấy trộn trên Vortex. - Tiếp tục nâng nhiệt ống chiết trong bề ổn nhiệt (700C) và khuấy trộn lại trên Vortex ở các thời điểm 5 và 10 phút trích ly - Sau khi chiết (10 phút), dịch chiết được hạ xuống nhiệt độ phòng bằng phương pháp tự nhiên và được ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 10 phút - Gạn cẩn thận phần dịch trong phía trên của ống chiết vào một ống nghiệm khắc độ 10 ml (hoặc bình định mức 10 ml). Phần bã tiếp tục được chiết lại một lần nữa với thủ tục như trên. Sau đó dịch chiết sau ly tâm của lần chiết 2 được dồn với lần chiết 1 (trong bình địch mức 10 ml) và dùng methanol 70% ở nhiệt độ thường lên thể tích tới vạch. 3.3.2.2. Pha loãng Lấy 1 ml dịch chiết ở trên + 99 ml nước cất 2 lần, lắc đều (chuẩn bị trong bình định mức 100 ml). Dịch pha loãng này được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tổng số. 3.3.2.3. Xây dựng đường chuẩn acid gallic Đường chuẩn acid gallic được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 10 đến 50 μg/ml (dung dịch chỉ sử dụng trong ngày). 3.3.2.4. Xác định hàm lượng polyphenol - Dùng Pipette chuyển 1 ml nước cất vào ống nghiệm 10 ml (nhắc lại 2 lần) - mẫu trắng. - Dùng pipette chuyển 1 ml dịch chiết mẫu pha loãng vào các ống nghiệm 10 ml (nhắc lại 2 lần) - Mẫu phân tích - Dùng pipette cho 5 ml dung dịch Folin-ciocalteu 10% vào mỗi ống nghiệm và lắc đều. - Sau khi cho folin-ciocalteu 5 phút, tiếp tục cho 4 ml NaCO3 7,5% vào mỗi ống nghiệm, nút miệng ống, lắc đều - Để các ống phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 60 phút sau đó đo mật độ quang ở 765 nm (cuvet 10 mm, cửa đối chứng là nước cất). 3.3.2.5. Tính kết quả Hàm lượng polypenol tổng số (WT, % CK) được tính theo công thức: (Dsample - Dintercept) x Vsample x d x 100 WT = Sstd x msample x 10.000 x WDM,sample Trong đó: Dsample: mật độ quang thu được của dung dịch mẫu Dintercept: mật độ quang khi x bằng 0 Sstd: giá trị hệ số góc (a) msample: khối lượng mẫu phân tích (g) Vsample: thể tích dịch chiết (ml) (10 ml) d: hệ số pha loãng (100) WDM,sample: hàm lượng chất khô của mẫu phân tích (%) 3.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol được xác định theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 3.3.3.1. Nguyên lý Dịch chiết chè xanh của các giống khác nhau được nhỏ vào các lỗ thạch trong môi trường nuôi cấy, dưới tác dụng của hoạt chất kháng khuẩn sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn có sẵn trong môi trường. Đo đường kính vòng vô khuẩn. Từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng khuẩn của các giống chè. 3.3.3.2.Tiến hành Phương pháp hoạt hóa, chuẩn bị dịch vi khuẩn Vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh. Từ ống tồn trữ, cấy 1 vòng que cấy vào bình tam giác chứa 50ml môi trường Mueller Hinton (không có agar) đã khử trùng, nuôi cấy lắc ở 370C, 220vòng/phút trong 48h. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn (theo phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu), pha loãng bằng nước cất vô trùng để số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 106CFU/ml (Dung dịch đã pha loãng này dùng để tiến hành cấy lên môi trường). Chuẩn bị môi trường Cân 38g môi trường chuẩn Mueller-Hinton pha với 1000ml nước cất , đun sôi cho tan hết thạch, chia ra các bình tam giác 250ml, hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Để thạch nguội xuống khoảng 40-450C, đổ 25ml môi trường vào mỗi đĩa pettri. Để thạch đông, nhỏ 10μl dịch vi khuẩn 106CFU/ml cho mỗi đĩa, chang đều. Khi bề mặt khô thì tiến hành đục lỗ thạch bằng nút khoan, đường kính lỗ khoảng 6mm. Chuẩn bị dịch chiết chè Các giống chè được trích ly theo phương pháp ISO 14502-1:2005. Sử dụng ngay dịch chiết sau khi lên định mức 10ml với methanol 70%, không pha loãng. Tiến hành (Tiến hành trong tủ cấy vô trùng, thực hiện đầy đủ các thao tác vô trùng. Các đĩa thạch có thể được để se mặt thạch trong tủ ấm 37oC/ 30 phút) Dùng micropipet 100μl với đầu típ vô trùng, chuyển 70μl dịch chiết chè vào các lỗ thạch trong đĩa petri. Nhỏ 70μl methanol 700 vào lỗ thạch đối chứng. Sau đó chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (~10oC) từ 4-8h để dịch khuyếch tán ra thạch. Chuyển sang nuôi trong tủ ấm ở 370C/12h. 3.3.3.3. Đọc kết quả Sau 12h đọc kết quả. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết chè được tính bằng: D-d Trong đó: D: đường kính vòng vô khuẩn (mm). d: đường kính lỗ thạch (mm). 3.3.3.4. Bố trí thí nghiệm Mỗi đĩa pettri chang một chủng vi khuẩn. Trên đĩa pettri, tiến hành đục 4 lỗ, đường kính lỗ 6mm, mỗi lỗ cách nhau ít nhất 20mm. 03 lỗ được truyền dịch chiết của 3 loại nguyên liệu khác nhau (1 tôm 2 lá, loại B và lá già của cùng một giống), lỗ thứ 4 làm đối chứng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm IRRISTAT 4.0 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL TỔNG SỐ TRONG 3 GIỐNG CHÈ THEO PHƯƠNG PHÁP ISO 14502-1:2005 Để xác định hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu các giống chè nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn của acid gallic, kết quả cho thấy quan hệ giữa nồng độ và giá trị mật độ quang của acid gallic là rất chặt, có độ tin cậy cao (R2= 0,9989) (hình và bảng 4.1). Kết quả xác định giá trị này trong nguyên liệu các giống chè nghiên cứu được thể hiện qua hình và bảng 4.2
Hình 4.2: Hàm lượng polyphenol tổng số trong nguyên liệu chè Chúng tôi nhận thấy rằng, trong tất cả các loại nguyên liệu của 3 giống chè nghiên cứu thì hàm lượng polyphenol trong chè PH1 là cao hơn cả, sau đó đến giống chè Shan, và thấp nhất là giống Trung du. Tuy nhiên, sự chênh lệch giữa giống PH1 và giống Shan là không lớn. Cụ thể, trong nguyên liệu búp 1 tôm 2 lá, hàm lượng polyphenol của giống Trung du chỉ đạt 20,79%CK trong khi nó lên tới 26,05%CK và 26,59%CK tương ứng trong giống chè Shan và PH1. Đối với nguyên liệu loại B, hàm lượng này trong giống Trung du, Shan và PH1 là 18,85%CK, 20,64%CK và 22,75%CK tương ứng. Mặt khác, chúng tôi cũng nhận thấy, sự chênh lệch về hàm lượng polyphenol giữa nguyên liệu non (búp 1 tôm 2 lá) và nguyên liệu thường được sử dụng trong chế biến (nguyên liệu loại B) giữa các giống có sự khác biệt khá lớn. Thực vậy, trong khi sự chênh lệch này chỉ khoảng 2%CK với giống Trung du thì nó lên tới khoảng 4-5%CK đối với giống PH1 và giống Shan. Đây có thể sẽ là cơ sở khoa học quan trọng trong việc định giá chất lượng nguyên liệu, tính toán hiệu quả sản xuất đối với cả công nghiệp chế biến cũng như trong việc khai thác các hợp chất polyphenol từ chè tươi nguyên liệu. Về hàm lượng polyphenol trong các lá chè già chúng tôi nhận thấy, hàm lượng này cũng khá cao trong cả 3 giống nghiên cứu, dao động trong khoảng từ 11,52%CK (giống trung du) đến 14,63%CK (giống PH1), và chiếm khoảng 45 đến 50% so với hàm lượng của nó trong nguyên liệu 1 tôm 2 lá. Điều này mở ra một triển vọng giá trị hoá, nâng cao giá trị kinh tế của cây chè từ việc tận thu các lá chè già, bị bỏ đi trong sản xuất để tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học cao – các polyphenol chè. 4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA GIỐNG VÀ CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU ĐẾN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN Để thấy được một trong các đặc tính sinh học quan trọng của polyphenol chè - hoạt tính kháng khuẩn, ảnh hưởng của chất lượng nguyên liệu trong các giống chè nghiên cứu đến khả năng ức chế 3 chủng vi khuẩn B. subtilis, B. cereus và Proteus. sp đã được khảo sát. Kết quả được trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3: Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng kháng của chủng Bacillus subtilis Giống  Hoạt tính kháng khuẩn  LSD0,05    1 tôm 2 lá  B  2 lá già    Trung Du  4.8Aa  3.8Ab  1.8Ac  0.58   Shan  6.3Ba  5.2Bb  2.3Ac  0.74   PH1  7.3Ca  5.8Cb  2.5Ac  0.94   LSD0,05  0.99  0.58  0.94    A, B, C: Sai khác theo giống a, b,c : Sai khác theo độ non già Bảng 4.4: Ảnh hưởng giống và chất lượng nguyên liệu đến khả năng kháng của chủng Bacillus cereus Giống  Hoạt tính kháng khuẩn  LSD0,05    1 tôm 2 lá  B  2 lá già    Trung Du  12.0Aa  10.5Ab  9.3Ac  0.66   Shan  13.2Ba  11.7Bb  10.0Bc  0.94   PH1  13.7Ba  12.2Bb  10.2Bc  0.82