Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính lan hồ điệp (phalaenopsis sp.)

, các phôi rời rạc nhau. K: Phôi bị khô, màu xanh do môi trường dinh dưỡng đã sử dụng hết. X: Phôi có dạng màu xanh đậm, xốp, một số đã xuất hiện lông hút, gần như dạng PLB. V: Phôi dạng vàng, xốp. Từ bảng số liệu trên ta thấy các nguồn mẫu phôi khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau tới khả năng tăng sinh của mẫu. Sinh khối thu được cao nhất là nguồn mẫu phôi có dạng vàng xốp. Đạt thấp nhất là các mẫu phôi màu trắng, bị ngập trong môi trường dinh dưỡng do hiện tượng không đông của agar (gây ra bởi nhiệt độ cao khi hấp vô trùng môi trường), chúng thường ở dạng rời rạc nhau, không liên kết thành từng khối, nguyên nhân là do những mẫu bị ngập trong môi trường dinh dưỡng sẽ thiếu oxygen, dẫn đến quá trình hô hấp bị ức chế, kết quả là khả năng tăng sinh kém, chính vì vậy sau khi được cấy chuyền trên môi trường thạch phôi vẫn tăng sinh chậm. 35 Những phôi có màu xanh đậm, xốp đã chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp thu được sinh khối cao, tuy nhiên vẫn kém hơn các mẫu phôi màu vàng xốp. Mặt khác, khi quan sát trên kính hiển vi quang học một số mẫu đã xuất hiện lông hút, chính vì vậy mẫu cấy thu được đã có sự hình thành PLB ( Hình 2.b). Những dạng phôi bị khô, màu xanh là do môi trường dinh dưỡng đã sử dụng hết hoặc là do mẫu nằm ở phía trên không được tiếp xúc trực tiếp với môi trường dinh dưỡng. Do đó khi được cấy chuyền sang môi trường dinh dưỡng mới, chúng phát triển trở lại bình thường. Tuy nhiên, hệ số nhân vẫn kém hơn so với các dạng phôi màu vàng xốp và xanh xốp. Từ đó, chúng tôi kết luận rằng: Nguồn mẫu phôi ban đầu có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng tăng sinh khối của phôi. Điều này cũng được thể hiện rõ khi chúng tôi tiến hành quan sát sự phát triển hình thái của mẫu cấy, mặc dù trên cùng một loại môi trường nhưng nếu nguồn mẫu ban đầu khác nhau thì mẫu thu được sẽ có hình thái khác nhau . Nguồn mẫu phôi cho hệ số nhân cao nhất là các mẫu phôi vàng xốp . Những phôi xanh khi cấy chuyền sẽ biêṭ hóa trở về daṇg màu vàng ở giai đoạn đầu , về sau chúng cũng chuyển sang dạng xanh và cuối cùng là phát triển thành PLB . Thời gian giữ được mẫu ở dạng phôi lâu nhất là những phôi daṇg màu vàng xốp vì những phôi ban đầu có màu xanh thường hình thành trực tiếp PLB sau một thời gian ngắn nuôi c ấy. 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian giữ và cấy truyền phôi Sau 4 tuần nuôi cấy , số lượng phôi đã được nhân lên rõ rệt . Hệ số nhân thu được tỷ lệ thuâṇ với thời gian nuôi cấy . Sinh khối đạt cao nhất là từ 6 – 8 tuần nuôi cấy. Sau 8 tuần nuôi cấy mặc dù các phôi vẫn tiếp tục nhân lên nhưng đã có hiện tượng hóa nâu và chết đi của một số mẫu phôi. Vì vậy sau 6 – 8 tuần nuôi cấy nên tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Nguồn mẫu phôi được sử dụng cho thí nghiệm này là các phôi có dạng màu vàng xốp. Kết quả thu được sau 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuôi cấy được ghi nhận ở bảng 3.2.1 và hình 3.a 36 Bảng 3.2.1 Tốc độ nhân nhanh của mẫu cấy sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau Ban đầu 4 tuần 6 tuần 8 tuần TLT (g) 0,08 ± 0,01 0,78 ± 0,06 1,60 ± 0,05 1,82 ± 0,03 Số lượng 125 ± 5 202 ± 7 340 ± 4 378 ± 15 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 Ban đầu 4 tuần 6 tuần 8 tuần Thời gian nuôi cấy T rọ n g l ƣ ợ n g t ƣ ơ i 0 50 100 150 200 250 300 350 400 S ố l ƣ ợ n g p h ô i m (g) Số lượng Biểu đồ 3.1 Tốc độ tăng sinh của phôi sau các khoảng thời gian khác nhau Sinh khối thu được gấp 9,75 lần mẫu ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy, gấp 20 lần sau 6 tuần nuôi cấy và gấp 22,5 lần sau 8 tuần nuôi cấy. Từ đó có thể thấy được hệ số nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy vô tính là rất cao. Mặc dù tốc độ nhân của phôi vẫn tiếp tục tăng theo thời gian nuôi cấy, tuy nhiên tốc độ nhân đã có sự giảm dần từ tuần thứ 6 - 7 trở đi. Từ tuần thứ 6 - 8 hệ số nhân chỉ tăng thêm 2,5 lần (từ 20 lần → 22,5 lần), trong khi đó từ tuần thứ 4 - 6 cho hệ số nhân tăng thêm 10,25 lần (từ 9,75 lần → 20 lần). Điều này cho thấy tốc độ nhân nhanh vượt trội hơn hẳn trong giai đoạn từ 4 - 6 tuần nuôi cấy so với trong giai đoạn từ 6 - 8 tuần nuôi cấy. Đồng thời sau khoảng 7,5 - 8 tuần nuôi cấy một số phôi đã hóa nâu (Hình 3.a1). Điều này là do trong quá trình nuôi cấy, mẫu tiết ra các hợp chất có bản chất phenol, qua thời gian giữ phôi càng lâu thì hàm lượng của các hợp chất này càng tăng lên, chính vì vậy làm cho các mẫu hóa nâu và chết đi. Điều này được quan sát rất rõ khi nuôi cấy phôi Hồ điệp trên môi trường 37 gelrite, sau 3 tuần nuôi cấy chúng tôi đã quan sát thấy ở một số bình nuôi cấy có hiện tượng tiết phenol ra môi trường làm môi trường bị hóa vàng ở vị trí xung quanh mẫu. Dó đó, sau 6 - 8 tuần nên tiến hành cấy chuyền phôi sang môi trường mới. Sau đó, các mẫu cấy ở giai đoạn được 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần sẽ tiếp tục được cấy chuyền sang môi trường mới và theo dõi sự tăng sinh của chúng nhằm xác định rõ hơn nữa ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới khả năng tăng sinh của phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai thời gian giữ phôi kéo dài hơn, do đó sau 12 tuần nuôi cấy chúng tôi mới tiến hành cân trọng lượng tươi của các mẫu cấy để so sánh tốc độ nhân nhanh của các mẫu cấy chuyền có nguồn gốc là 4 tuần, 6 tuần và 8 tuần nuôi cấy. Kết quả thu được ở bảng 3.2.2 và hình 3.b. Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới khả năng tăng sinh của phôi sau 12 tuần nuôi cấy NT Nguồn mẫu ban đầu TLT (g) Số lượng phôi Số lượng PLB 1 4 tuần 2,02 ± 0,08 510 ± 5 70 ± 3 2 6 tuần 3,53 ± 0,16 730 ± 10 130 ± 5 3 8 tuần 1,16 ± 0,05 306 ± 7 18 ± 3 38 b Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian cấy chuyền tới khả năng tăng sinh của phôi (a): phôi thu được tương ứng ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần. (a1): phôi sau 8 tuần nuôi cấy; (a2): phôi sau 6 tuần nuôi cấy; (a3): phôi sau 4 tuần nuôi cấy. (b1), (b2), (b3): phôi ở các giai đoạn 8 tuần, 6 tuần, 4 tuần được cấy chuyền sau 12 tuần. (c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c7): phôi thu được ở các nghiệm thức P0, P1, P2, P3, P4, P5, NG2 sau 21 tuần nuôi cấy. (d1), (d2), (d3), (d4): ảnh hưởng của proline tới lên khả năng tăng sinh của phôi sau 4 tuần tương ứng ở các nồng độ 0 mg/l; 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 0,75 mg/l. Trong đó (d1) là môi trường đối chứng có bổ sung 20% nước dừa lấy từ các trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm. 39 Nguồn mẫu cấy ban đầu là 6 tuần đem nuôi cấy sẽ thu được trọng lượng tươi, số lượng phôi, số lượng PLB trung bình cao nhất (trọng lượng tươi trung bình thu được gấp 44,13 lần so với mẫu cấy ban đầu). Đạt thấp nhất là các mẫu cấy 8 tuần (trọng lượng tươi trung bình thu được chỉ gấp 14,5 lần so với mẫu cấy ban đầu), ở dạng này cũng xuất hiện nhiều phôi hóa nâu nhất (Hình 3.b1). Như vậy thời gian cấy chuyền phôi tốt nhất là khoảng 6 tuần. Tiếp tục theo dõi sự phát triển của các nghiệm thức này, chúng tôi nhận thấy ở nghiệm thức 3 các phôi bị hóa nâu và chết đi rất nhiều, còn lại thì chuyển sang dạng PLB và thể chồi sau đó phát triển trực tiếp thành cây con. Ở nghiệm thức 2 cho hệ số nhân cao nhất sau 21 tuần nuôi cấy mỗi mẫu cấy có trọng lượng tươi trung bình là 5,30g gấp 66,25 lần so với mẫu cấy ban đầu. Ở nghiệm thức thứ 2 này hầu hết các phôi cũng chuyển sang dạng chuyển tiếp màu xanh và dạng PLB, ngoài một số phôi đã phát triển trực tiếp thành cây con (Hình 7.a2 và Hình 7.a3). Nghiệm thức 1 cho hệ số nhân thấp hơn nghiệm thức 2 nhưng mẫu cấy duy trì được ở trạng thái phôi cao nhất, một số vẫn ở dạng màu vàng xốp, một số chuyển sang dạng chuyển tiếp màu xanh, một số ít cũng chuyển thành dạng PLB, tuy nhiên các PLB thu được ở nghiệm thức 1 này có đường kính nhỏ hơn so với PLB thu được ở nghiệm thức 2 và thường có hình cầu. Điều này được giải thích là do tuổi của mẫu phôi ban đầu khi cấy chuyền có sự khác nhau, những phôi càng được giữ lâu trước khi đem đi cấy chuyền thì độ tuổi càng già, do đó khả năng chuyển thành dạng PLB cao hơn. Từ tất cả các nghiệm thức trên chúng tôi kết luận rằng đối với các phô i có màu vàng, xốp thì thời gian cấy chuyền tốt nhất là sau 6 tuần nuôi cấy. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nguồn nƣớc dừa già tới khả năng tăng sinh của phôi Các thí nghiệm 1 và 2 đều sử dụng nước dừa lấy từ các trái dừa non có cơm dày khoảng 0,3 – 0,4cm. Nước dừa từ lâu đã được biết đến như là một chất không thể thiếu trong nuôi cấy mô lan. Trong nước dừa có chứa các 40 acid amin, một số loại đường và đặc biệt có chứa cytokinin tự nhiên. Hàm lượng cytokinin, acid amin, đường trong nước dừa non thường cao hơn so với nước dừa già (lấy từ những trái đã già) do trong những trái dừa già các chất này đã được dùng để nuôi cơm của trái dừa. Chính vì vậy trong nuôi cấy mô lan người ta thường sử dụng các loại nước dừa non để nuôi cấy. Tuy nhiên, mục tiêu của nhân giống lan Hồ điệp ngoài tạo ra cây con có chất lượng cao, đồng nhất, hệ số nhân cao thì giá thành cây giống cũng là điều đáng quan tâm. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng nguồn nước dừa già được lấy từ những trái có cơm dày khoảng 0,5 - 1cm. Vì trong nước dừa già hàm lượng cytokinin, acid amin, đường giảm đi do đó chúng tôi tăng nồng độ nước dừa lên 30%. Kết quả thu được ở bảng 3.3 và hình 4. Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nước dừa già tới khả năng tăng sinh của phôi Phôi PLB Chồi TLT (g) SL TLT (g) SL TLT (g) SL Ban đầu 0,08 ± 0,01 125 ± 5 0 0 0 0 8 tuần 0,60 ± 0,05 225 ± 5 1,40 ± 0,12 220 ± 8 0,20 ± 0,03 7 ± 3 12 tuần 1,09 ± 0,03 1,68 ± 12 2,40 ± 0,05 50 ± 5 2,45 ± 0,03 47 ± 5 Ở giai đoạn đầu mẫu cấy thu được cho hệ số nhân thấp, các mẫu tăng sinh chậm. Tuy nhiên, sau 6 tuần nuôi cấy đã có sự khác biệt rõ rệt cả về hệ số nhân và hình thái. Hầu hết các phôi không bị hóa nâu sau 8 tuần nuôi cấy như trong thí nghiệm 2 mà tốc độ tăng sinh tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Các mẫu cấy chỉ bị chết đi khi môi trường dinh dưỡng sử dụng hết. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, các phôi hầu như đều chuyển thành dạng PLB, rất ít còn ở trạng thái phôi như ban đầu. 41 Hình 4: Ảnh hưởng của nước dừa già tới sự phát triển của phôi, PLB và cây con. (a), (b), (c): sự phát triển của phôi sau các khoảng thời gian 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,8. (c1), (c2): sự phát triển của phôi, PLB trên môi trường Hw (môi trường Vacin-Went + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,3) sau 12 tuần nuôi cấy. (c3): sự phát triển của cây con trên môi trường RC3 (môi trường Vacin-Went + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l AC + 30% nước dừa già, pH = 5,3) 42 Sau 8 tuần nuôi cấy trọng lượng tươi của phôi thu được gấp 7,5 lần so với mẫu cấy ban đầu, đồng thời phát sinh các PLB (trọng lượng tươi 1,4 g/mẫu) và các cụm chồi non (7 chồi/mẫu) (Hình 4.b). Sau 12 tuần nuôi cấy sinh khối thu được đã tăng lên rất rõ rệt. Các mẫu cấy phát triển gần như kín bề mặt môi trường. Trong giai đoạn này, hầu hết các phôi đã phát triển hoàn toàn thành dạng PLB có đường kính lớn và xuất hiện nhiều dạng chồi nhỏ (Hình 4.c). Sau 12 tuần, một số bình mẫu được tách và cấy chuyền trên môi trường Hw (môi trường Vacin-Went có bổ sung 30 g/l đường sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH = 5,3) đối với phôi và PLB; cấy trên môi trường RC 3 (môi trường Vacin- Went có bổ sung 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 0,5 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA; 30% nước dừa già; pH = 5,3) đối với các cụm chồi. Sau đó theo dõi thì thấy rằng: các phôi khi được cấy chuyền qua môi trường Hw sẽ nhân lên với hệ số rất cao (gấp 80 lần sau 16 tuần nuôi cấy) đồng thời vẫn giữ được ở trạng thái phôi màu vàng sau 16 tuần, phôi có đường kính lớn và xốp (Hình 4.c1), một số ít phát triển thành dạng PLB tròn (Hình 1.d2). Các PLB phát triển rất đồng đều nhau với đường kính PLB lớn hơn hẳn so với các dạng PLB thu được ở thí nghiệm 1 và 2. Các PLB phát triển thành cụm chồi với hệ số nhân cao (Hình 4.c2). Các cụm chồi sau khi được cấy trên môi trường RC3 cho sự hình thành rễ cũng phát triển rất đồng đều nhau. Sau 16 tuần nuôi cấy trung bình mỗi cây con đã phát triển với số lượng lá là 3 và số lượng rễ là 4. Chiều dài rễ và lá cân đối nhau. Tuy nhiên, các lá có dạng thon, dài hơn so với các cây con nuôi cấy trên môi trường ra rễ ở thí nghiệm 1 và 2 (Hình 4.c3). Từ đó chúng tôi kết luận rằng nếu sử dụng môi trường có bổ sung 30% nước dừa già thì các phôi sẽ trực tiếp phát triển thành dạng PLB sau đó phát triển thành chồi non và các cây con. Ở môi trường này cho hệ số nhân PLB cao đồng thời các PLB phát triển đồng đều có đường kính lớn. Mặt khác, nước dừa non thường có giá thành cao gấp 7 – 8 lần so với giá thành của nước dừa già, vì vậy mặc dù tăng nồng độ nước dừa già lên 30% nhưng 43 giá thành khi sử dụng nước dừa già vẫn thấp hơn nhiều so với khi sử dụng nguồn nước dừa non. Do đó nếu sử dụng nguồn nước dừa già cho nhân giống cây con thì có thể rút ngắn thời gian nhân giống do thời gian chuyển từ phôi sang dạng PLB ngắn, đồng thời cho hệ số nhân cao, chất lượng tốt và đồng nhất, giảm giá thành cây con giống. Từ thí nghiệm 2 và 3 chúng tôi rút ra kết luận rằng: Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà chúng ta nên sử dụng nguồn nước dừa phù hợp. Nếu sử dụng cho mục đích nhân nhanh và giữ phôi thì nên sử dụng nguồn nước dừa non. Còn nếu sử dụng cho mục đích nhân nhanh tạo cây con giống thì nên sử dụng nguồn nước dừa già. 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nƣớc gạo kết hợp với nƣớc dừa ở các nồng độ khác nhau Trong thí nghiệm này, nguồn nước dừa già được lấy từ những trái dừa có cơm dày 0,5 – 1cm; nguồn nước dừa non được lấy từ những trái có cơm mới hình thành độ dày khoảng 0,1 – 0,2cm. Hai loại nước dừa này được kết hợp bổ sung với nước gạo ở các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần, 8 tuần và 12 tuần nuôi cấy tiến hành cân trọng lượng tươi của mẫu. Kết quả thu được ở bảng 3.4.1 và hình 5. Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng của nước gạo và nước dừa ở các nồng độ kết hợp khác nhau. NT 4 tuần 8 tuần 12 tuần DG2 1,64 ± 0,14 2,00 ± 0,15 2,21 ± 0,40 DG3 1,81 ± 0,25 2,16 ± 0,12 2,46 ± 0,38 G12 2,14 ± 0,21 2,45 ± 0,20 2,88 ± 0,10 G15 2,00 ± 0,53 2,81 ± 0,14 3,64 ± 0,12 NG2 1,09 ± 0,01 1,24 ± 0,02 1,88 ± 0,09 NG3 2,15 ± 0,08 2,53 ± 0,10 2,47 ± 0,06 NG35 2,58 ± 0,14 3,01 ± 0,12 3,16 ± 0,12 44 N11 0,87 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,48 ± 0,04 N12 0,82 ± 0,04 0,84 ± 0,02 1,41 ± 0,05 G11 0,93 ± 0,03 1,20 ± 0,05 1,53 ± 0,11 G21 0,85 ± 0,01 1,05 ± 0,01 1,05 ± 0,01 L0 1,65 ± 0,02 1,92 ± 0,04 1,55 ± 0,02 Sự kết hợp của nườc dừa non với nước gạo cho thấy không có sự g ia tăng đáng kể. Hệ số nhân thu được thấp hơn môi trường đối chứng L 0 (không bổ sung nước dừa). Thậm chí một số mẫu hóa nâu và chết đi sau 3 tuần nuôi cấy. Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy trên môi trường nhân phôi có bổ sung 20% nước dừa non, kết quả là gây cảm ứng làm hóa nâu mẫu và chết đi. Như vậy, nếu sử dụng nguồn nước dừa non từ những trái có cơm dày khoảng 0,3 - 0,4cm (ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2) sẽ gây cảm ứng tăng sinh phôi, nhưng nếu sử dụng nguồn nước dừa non lấy từ những trái có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm lại gây cảm ứng ngược lại. Có thể nguồn nước dừa lấy từ những trái mới hình thành cơm sẽ có hàm lượng cytokinin cao, thêm vào đó các mẫu cấy sử dụng cho thí nghiệm này lấy từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 (tức đã qua 1 - 2 lần cấy chuyền nên có hàm lượng cytokinin nội sinh cao) dẫn tới gây chết mẫu. Nước dừa già khi kết hợp bổ sung với nước gạo gây cảm ứng tăng sinh rõ rệt. Ở giai đoạn đầu, nghiệm thức NG35 cho hệ số nhân cao nhất, sau đó tới nghiệm thức NG3. Tuy nhiên, ở 2 nghiệm thức này các phôi hoàn toàn phát triển thành dạng PLB. Hình thái PLB được quan sát rõ sau 12 tuần nuôi cấy. PLB đã xuất hiện nhiều lông hút, có đường kính lớn, màu xanh đậm và đồng đều nhau (Hình 5). 45 Ở nghiệm thức G12 và G15 gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số nhân cao nhất. Các phôi phát triển đồng đều, xốp, màu vàng xanh. Ở giai đoạn đầu không có sự khác biệt nhiều cả về hình thái và trọng lượng tươi thu được ở 2 nghiệm thức này (Hình 5a1). Sau 4 tuần trọng lượng tươi của mẫu thu được ở nghiệm thức G12 (2,14g) cao hơn so với nghiệm thức G15 (2,00g). Nhưng qua tới tuần thứ 8 thì hệ số nhân ở nghiệm thức G15 (2,81g) lại cao hơn nghiệm thức G12 (2,45g). Qua tuần thứ 12 thì tốc độ tăng sinh của mẫu ở nghiệm thức G15 đã cao hơn rõ rệt so với nghiệm thức G12. Tuy nhiên, qua tới tuần thứ 12, ở nghiệm thức G15 hầu hết các phôi đã chuyển Hình 5: Ảnh hưởng của nước gạo kết hợp với nước dừa. (a1), (a2), (a3): phôi thu được sau 4 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG 2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (b1), (b2), (b3): phôi thu được sau 8 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (c1), (c2), (c3): phôi thu được sau 12 tuần nuôi cấy tương ứng trên các môi trường (DG 2, DG3, G12, G15), (NG2, NG3, NG35, N11), (N12, G11, G21, L0). (d): phôi thu được sau 6 tuần trên các môi trường H0, H1, H2, H3, H15 (Theo thứ tự từ trái sang phải). 46 qua dạng chuyển tiếp có màu xanh, còn ở nghiệm thức G 12 vẫn giữ được trạng thái phôi ở dạng màu vàng xanh. Dó đó nghiệm thức G 15 thích hợp cho công tác nhân giống với hệ số nhân cao. Còn nghiệm thức G 12 thích hợp cho nhân phôi và giữ phôi. Ở nghiệm thức DG3 mặc dù hệ số nhân không cao bằng bốn nghiệm thức trên, nhưng cũng xuất hiện nhiều dạng PLB. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả thu được ở thí nghiệm 3. Ở nghiệm thức DG2 các phôi có hệ số nhân không cao nhưng giữ được phôi ở dạng màu vàng. Như vậy khi sử dụng nước dừa già (30%) và sử dụng nước gạo ở nồng độ cao (30 - 35%) sẽ gây cảm ứng tạo PLB. Nhưng khi nước dừa già được kết hợp bổ sung với nước gạo lại gây cảm ứng tăng sinh phôi với hệ số nhân cao. Trong nước dừa già có hàm lượng cytokinin thấp do chúng đã được dùng để nuôi cơm dừa, vì thế khi sử dụng để nuôi cấy phôi lan thì các phôi chuyển sang PLB. Điều này là hoàn toàn phù hợp vì nồng độ cytokinin thấp không gây cảm ứng tạo và tăng sinh phôi. Thành phần chính trong nước gạo là tinh bột và vitamin đặc biệt là vitamin B 1. Từ đó, chúng tôi đưa ra giả thiết rằng hàm lượng tinh bột và vitamin có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. Nghiệm thức NG2 cũng giữ được phôi ở trạng thái màu vàng và cho hệ số nhân không cao trong giai đoạn đầu. Trong một thí nghiệm riêng biệt khác khi so sánh môi trường này (NG2) với các môi trường P0, P1, P2, P3, P4, P5 (môi trường nhân nhanh phôi có bổ sung 20% nước dừa non lấy từ những trái có cơm dày 0,1 – 0,2cm, nồng độ đường tương ứng là 0, 10, 20, 30, 40, 50 (g/l) các thành phần khác không thay đổi). Thí nghiệm này được đặt trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết quả chúng tôi thu được: ở giai đoạn đầu không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức; hệ số nhân thu được cũng không cao ở tất cả các nghiệm thức. Điều này hoàn toàn phù hợp với các thí nghiệm ở trên, khi sử dụng nguồn nước dừa từ những trái mới hình thành cơm. Đồng thời có thể nguồn ánh áng nhân tạo cũng có ảnh hưởng tới sự tăng sinh của phôi. Về sau các nghiệm thức P 0 , P1, P2, P3, P4, 47 P5 đều gây cảm ứng hóa nâu mẫu do thời gian lâu. Trong các nghiệm thức này ở nồng độ đường 30 g/l phù hợp nhất cho sự phát triển của phôi. Ở nồng độ đường 0 g/l có sự hình thành PLB hình cầu. Điều này phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đó (Nhựt và My, 2008; Nhựt và Thanh, 2007). Sau 21 tuần, kết quả chúng tôi thu được các phôi đã hóa nâu và chết ở hầu hết các nghiệm thức. Chỉ có nghiệm thức P0 vẫn còn tồn tại một số PLB hình cầu ở dạng màu xanh. Riêng ở nghiệm thức NG2 thì tốc độ nhân vẫn tiếp tục tăng lên theo thời gian, tuy nhiên hệ số nhân không cao bằng các nghiệm thức G12 và G15 như ở thí nghiệm trên. Chứng tỏ nếu bổ sung nước gạo (20%) tuy hệ số nhân nhanh không cao nhưng lại cho khả năng giữ phôi cao. Sau 24 tuần nuôi cấy mặc dù các phôi đã chuyển qua dạng chuyển tiếp màu xanh, tuy nhiên không thấy có hiện tượng hóa nâu của mẫu và hệ số nhân vẫn tiếp tục tăng lên. Điều này chứng tỏ nước gạo có khả năng hấp thụ các hợp chất phenol rất tốt. Đồng thời có thể giúp phôi duy trì mức độ tăng sinh tốt ngay cả khi trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo. Kết quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 5.d. Bảng 3.4.2 So sánh môi trường có bổ sung 20% nước gạo với các môi trường có bổ sung 20% nước dừa non kết hợp với sự thay đổi của nồng độ đường trong điều kiện không chiếu sáng nhân tạo sau 21 tuần nuôi cấy STT NT 12 tuần 20 tuần 1 P0 1,67 ± 0,09 1,21 ± 0,14 2 P1 0,69 ± 0,01 0,48 ± 0,04 3 P2 0,73 ± 0,05 0,40 ± 0,05 4 P3 1,67 ± 0,07 0,80 ± 0,08 5 P4 0,86 ± 0,02 0,52 ± 0,03 6 P5 0,88 ± 0,04 0,56 ± 0,02 7 NG2 1,4 ± 0,15 3,65 ± 0,14 48 Để xác định rõ hơn nữa về ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ phôi, chúng tôi tiến hành khảo sát tiếp tục trên 3 loại môi trường np2, np15 và np12. Kết quả thu được ở bảng 3.4.2 và hình 6a. Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng giữ phôi np2 np15 np12 4 tuần 0,72 ± 0,07 0,80 ± 0,03 0,75 ± 0,05 8 tuần 1,02 ± 0,03 2,02 ± 0,09 1,75 ± 0,03 12 tuần 1,66 ± 0,06 3,81 ± 0,08 3,28 ± 0,22 20 tuần 3,25 ± 0,15 3,56 ± 0,11 3,28 ± 0,20 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 4 tuần 8 tuần 12 tuần 20 tuần Thời gian nuôi cấy T rọ n g l ƣ ợ n g t ƣ ơ i np2 np15 np12 Biểu đồ 3.2 Tốc độ tăng sinh của phôi trên ba môi trường np 2, np12, np15 qua các khoảng thời gian khác nhau Sau 4 tuần nuôi cấy không thấy có sự khác biệt về sinh khối thu được cũng như hình thái của phôi trên cả ba loại môi trường, các phôi đều có màu vàng (Hình 6.a1). Sự khác biệt được quan sát rõ từ sau tuần thứ 8 trở đi. 49 Hình 6: Ảnh hưởng của nước gạo tới khả năng tăng sinh của phôi. (a1), (a2), (a3), (a4): sự phát triển của phôi trên các môi trường np2, np15, np12 (theo thứ tự từ trái qua phải) sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần, 20 tuần nuôi cấy. (b1), (b2), (b3), (b4): hình thái phôi thu được tương ứng trên các môi trường np12, np3, NG2, np. 50 Ở tuần thứ 8, môi trường np2 cho hệ số nhân thấp hơn hẳn so với hai môi trường còn lại. Hệ số nhân của môi trường np15 cao hơn so với môi trường np12, tuy nhiên không có sự chênh lệch nhiều giữa hai môi trường này (Hình 6.a2). Tới tuần thứ 12 thì đã có sự khác biệt rõ ràng giữa ba loại môi trường cả về hình thái và trọng lượng tươi thu được. Trọng lượng tươi đạt cao nhất là ở môi trường np15, tuy nhiên các phôi có hình thái màu xanh và dạng chuyển tiếp. Trên môi trường np12 mặc dù hệ số nhân thấp hơn môi trường np15 nhưng vẫn giữ được phôi ở dạng vàng xanh. Môi trường np 2 vẫn cho hệ số nhân thấp nhất và các phôi đã chuyển sang màu xanh. Qua tới tuần thứ 20, trọng lượng tươi của hai môi trường np 12 và np15 giảm dần do có hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả hai môi trường. Tại thời điểm này, mặc dù trọng lượng tươi thu được ở môi trường np 15 vẫn cao hơn ở môi trường np12, nhưng mức độ giảm trọng lượng tươi ở môi trường np15 cao hơn nhiều so với môi trường np12 do ở môi trường np15 hiện tượng hóa nâu mẫu nhiều hơn. Trong khi đó, trên môi trường np 2 chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng tươi thu được, sinh khối vẫn tiếp tục tăng theo thời gian nuôi cấy, đồng thời không có hiện tượng hóa nâu của mẫu, tuy nhiên các phôi đã chuyển sang màu xanh. Điều này chứng tỏ nước gạo có khả năng hấp thu tốt các hợp chất có bản chất phenol, giúp mẫu được duy trì lâu hơn. Như vậy môi trường np15 cho hệ số nhân phôi cao nhất nhưng thời gian giữ được phôi lại thấp hơn so với môi trường np12 và môi trường np2. Do đó qua tuần thứ 12 nên tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Môi trường này thích hợp cho việc nhân giống. Môi trường np 12 vừa có khả năng giữ phôi ở trạng thái màu vàng xanh, vừa cho hệ số nhân cao không kém nhiều so với môi trường np15, do đó thích hợp việc giữ phôi và nhân nhanh phôi làm nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm và các mục đích khác như: tạo hạt nhân tạo, nuôi cấy tế bào đơn, dung hợp tế bào trần, chuyển gen Còn môi trường np2 tuy giai đoạn đầu cho hệ số nhân nhanh 51 thấp, tuy nhiên về sau hệ số nhân tăng lên rõ rệt theo thời gian nuôi cấy, đồng thời không gây hiện tượng hóa nâu mẫu do đó giữ mẫu được lâu, không phải cấy chuyền nhiều lần. Vì vậy môi trường này phù hợp cho việc giữ mẫu làm nguồn nguyên liệu khi cần thiết. 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của proline tới khả năng tăng sinh của phôi Proline đã được chứng minh là gây cảm ứng phát sinh phôi ở nhiều loài. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo nào về cảm ứng của proline tới khả năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Vì vậy thí nghiệm này nhằm xác định ảnh hưởng của proline tới cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Kết quả thu được ở bảng 3.5 và hình 3.d. Bảng 3.5 Ảnh hưởng của proline tới khả năng tăng sinh phôi lan Hồ điệp TLT (g) Ban đầu 4 tuần 6 tuần ĐC 0,08 ± 0,01 0,48 ± 0,12 0,82 ± 0,04 H0,25 0,26 ± 0,08 0,16 ± 0,03 H0,5 0,16 ± 0,07 0,15 ± 0,01 H0,75 0,04 ± 0,02 0,01 ± 0,01 SL ĐC 125 ± 5 370 ± 7 720 ± 10 H,25 250 ± 5 160 ± 5 H0,5 170 ± 5 130 ± 4 H0,75 70 ± 5 5 ± 3 Trọng lượng tươi thu được sau 4 tuần trên môi trường có bổ sung proline ở các nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 g/l và 0,75 g/l đều thấp hơn so với đối chứng. Không có sự tăng sinh đáng kể về sinh khối thu được, đồng thời có hiện tượng hóa nâu của mẫu ở cả ba môi trường. Trong đó, ở nồng độ proline càng cao thì càng gây cảm ứng hóa nâu mẫu. Qua tuần thứ 6 trên 52 môi trường có bổ sung proline, các mẫu bị chết rất nhiều. Chứng tỏ proline không phù hợp cho cảm ứng tăng sinh phôi lan Hồ điệp. Trong thí nghiệm này, ở môi trường đối chứng thu được cũng không cho hệ số nhân cao như ở thí nghiệm 2. Nguyên nhân là do nguồn nước dừa sử dụng cho thí nghiệm này lấy từ những trái còn quá non có cơm dày khoảng 0,1 - 0,2cm. Đồng thời mẫu cấy lấy từ các thí nghiệm trên (tức đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền). Điều này lại một lần nữa khẳng định nguồn nước dừa lấy từ những trái còn quá non để nuôi cấy các mẫu cấy đã qua một số lần cấy chuyền là không phù hợp do hàm lượng cytokinin nội sinh và hàm lượng cytokinin trong môi trường cao. 3.6. Thí nghiệm 6: So sánh ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng ½MS tới khả năng tăng sinh của phôi Nguồn mẫu phôi qua 2 - 3 lần cấy chuyền liên tiếp trên môi trường nhân phôi có bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA sẽ có hàm lượng cytokinin nội sinh cao. Do dó nếu tiếp tục cấy chuyền phôi trên môi trường cũ, đồng thời nguồn nước dừa sử dụng trong trường hợp này lấy từ những trái còn rất non mới hình thành cơm chứa hàm lượng cytokinin cao sẽ dẫn tới khả năng tăng sinh của mẫu giảm đồng thời có hiện tượng hóa nâu. Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy các phôi đã trải qua 2 - 3 lần cấy chuyền trên môi trường có hàm lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng giảm đi một nửa, đồng thời kết hợp với việc thay thế nước dừa non bằng nước dừa già và nước gạo. Kết quả chúng tôi thu được ở bảng 3.6 và hình 5.d. 53 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường MS và ½MS tới khả năng tăng sinh của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền H0 H1 H2 H3 H15 4 tuần 0,29 ± 0,05 0,41 ± 0,05 0,70 ± 0,03 0,59 ± 0,15 0,51 ± 0,04 6 tuần 0,60 ± 0,03 0,75 ± 0,04 0,84 ± 0,01 1,20 ± 0,05 0,95 ± 0,12 8 tuần 0,70 ± 0,05 0,95 ± 0,02 1,20 ± 0,03 1,82 ± 0,06 1,60 ± 0,83 0 0.5 1 1.5 2 H0 H1 H2 H3 H15 Nghiệm thức T rọ n g l ƣ ợ n g t ƣ ơ i 4 tuần 6 tuần 8 tuần Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường ½MS tới khả năng tăng sinh khối của mẫu cấy đã qua 2 - 3 lần cấy chuyền Trọng lượng tươi thu được ở nghiệm thức H1 (môi trường MS có bổ sung 20% nước dừa non) không khác biệt nhiều so với nghiệm thức H 0 (môi trường MS không bổ sung nước dừa), đồng thời hệ số nhân thu được ở nghiệm thức H1 thấp hơn so với môi trường tương tự được sử dụng trong thí nghiệm 1 và 2. Trong khi đó ở các môi trường còn lại có sự giảm đi một nửa về hàm lượng các chất khoáng đa lượng, vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng (môi trường ½MS), đồng thời sử dụng kết hợp nước dừa già và nước gạo thay cho nước dừa non lại thu được trọng lượng tươi cao hơn nhiều. Trong đó, trọng lượng tươi thu được cao nhất là nghiệm thức H3. 54 Tuy nhiên, nếu so sánh với trọng lượng tươi thu được ở thí nghiệm 2 thì ở thí nghiệm này trọng lượng tươi của mẫu thu được ở tất cả nghiệm thức đều thấp hơn. Điều này chứng tỏ số lần cấy chuyền mẫu cũng có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. 3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát khả năng phát triển của cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính Các cây con được nuôi cấy trên môi trường VW cho sự phát triển hoàn thiện sau 12 tuần nuôi cấy sẽ được chuyển ra ngoài vườm ươm. Tổng số lượng cây con chúng tôi thu được là 500 cây (Hình 7.d) Trong quá trình nuôi cấy phôi, một số mẫu phôi phát triển trực tiếp thành chồi sau đó hình thành rễ và phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Tuy nhiên, các cây con hình thành trên môi trường này có số lượng rễ, chiều dài rễ thấp hơn so với các cây con thu được khi đã được cấy chuyền qua môi trường VW, đồng thời các cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi có lá dạng thon dài và đường kính bé hơn so với các cây con có nguồn gốc từ phôi nhưng được cấy chuyền sang môi trường VW. Thí nghiệm này nhằm khảo sát về số lượng lá, số lượng rễ, chiều dài lá, chiều dài rễ và trọng lượng tươi của cây con. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 và hình 7. 55 Bảng 3.7 Kích thước các cây thu được trước khi chuyển ra vườm ươm Cây con thu được sau 12 tuần trên môi trường VW Cây con thu được trong quá trình nuôi cấy phôi Chiều dài lá (cm) 4,87 ± 1,15 4,06 ± 1,44 Số lượng lá (lá/cây) 3,80 ± 0,50 3,40 ± 0,75 Chiều dài rễ (cm) 4,18 ± 1,25 2,20 ± 0,85 Số lượng rễ (rễ/cây) 5,80 ± 1,00 3,60 ± 0,70 Trọng lượng tươi của cây (g/cây) 4,39 ± 1,79 2,83 ± 0,18 Đặc điểm hình thái Cây to khỏe có sức sống cao ; lá màu xanh đậm , hình e lip hoặc thon dài ; hình thành nhiều rễ , rễ dài (Hình 7.b3). Cây mảnh hơn; lá thon dài, mọng nước, đường kính lá nhỏ hơn; số lượng rễ hình thành ít, rễ ngắn (Hình 7.c3). 56 Hình 7: Khảo sát chất lượng cây con thu được. (a1), (a2), (a3): sinh khối thu được từ phôi trên môi trường np ở lần cấy chuyền thứ 2 sau 21 tuần nuôi cấy. Trong đó (a1): phôi đang trong giai đoạn chuyển sang PLB; (a2): PLB; (a3): cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi. (b1), (b2), (b3): cây con sinh trưởng trên môi trường VW. (c1): cây con được cấy chuyền qua môi trường VW sau 6 tuần. (c2): cây con sinh trưởng trên môi trường RC3. (c3): cây con thu được trong quá trình nuôi cấy phôi. (d): cây con có nguồn gốc phôi vô tính trước khi đem ra vườm ươm. 57 Măc̣ dù những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi (Hình 7.c3) có bộ lá phát triển , tuy nhiên lá moṇg nước và thường có hình thon dài , đường kính lá và số lươṇg rê ̃hình thành thấp hơn so với các cây con đa ̃ đươc̣ cấy chuyền qua môi trường VW (Hình 7.b3). Do đó sức sống của những cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi se ̃kém hơn so với các cây con có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền qua môi trường VW khi chuyển ra ngoài vườm ươm . 3.8. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trƣởng của con trong điều kiện in vitro Sau 2 tuần cấy chuyền trên môi trường VW các cây con P.amabilis cảm ứng với môi trường nuôi cấy và bén rễ. Sang tuần thứ tư chúng kéo dài lá và rễ, gia tăng đường kính lá, các cây con ở tất cả các nghiệm thức đều rất khỏe, có bộ lá xanh tốt, bộ rễ khỏe. Tuy nhiên sự gia tăng kích thước ở các nghiệm thức có sự khác nhau. Sau 12 tuần nuôi cấy tiến hành thu kết quả trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật độ cây khi cấy chuyền lên khả năng sinh trưởng của cây con trong điều kiện in vitro NT Số lá (lá/cây) Số rễ (rễ/cây) Chiều dài lá (cm) Chiều dài rễ (cm) TLT (g/cây) Đặc điểm R1 4,00 ± 0,75 7,80 ± 1,25 4,88 ± 1,53 5,29 ± 2,05 5,27 ± 0,90 Cây rất mập, lá xanh đậm, phiến lá dày, nhiều sắc tố tím ở mặt dưới, cây và rễ khỏe. R2 3,50 ± 0,25 6,00 ± 0,50 3,81 ± 1,15 4,25 ± 1,73 3,13 ± 0,98 Cây khỏe, mập, mặt dƣới lá có nhiều sắc tố 58 tím. R3 3,14 ± 0,15 4,60 ± 1,00 2,08 ± 0,60 4,06 ± 1,20 2,12 ± 0,70 Cây chắc, rễ hơi khô, nhiều sắc tố tím. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy ở cùng thể tích bình nuôi cấy (bình thủy tinh 500ml) và ở cùng thể tích môi trường (80ml) thì mật độ càng thấp khả năng sinh trưởng của cây con càng cao, khả năng sinh trưởng của cây con giảm dần khi mật độ cây tăng lên. Khả năng sinh trưởng của cây tỷ lệ nghịch với mật độ nuôi cấy. Ở nghiệm thức R1 các chỉ tiêu sinh trưởng đều đạt cao nhất khi so sánh với các nghiệm thức còn lại. Ở mật độ này các cây con sinh trưởng rất mạnh, cây to khỏe, mập, phiến lá dày có nhiều sắc tố tím ở mặt dưới của lá, rễ khỏe, lá dài và bóng mượt, phiến lá bóng. Sở dĩ các cây con thu được ở nghiệm thức này sinh trưởng và phát triển đạt cao nhất là do câ y con trong nghiệm thức này được cung cấp đủ chất dinh dưỡng, khoảng không gian, cây có điều kiện tiếp nhận nguồn ánh sáng chiếu đến lá nhiều nhất, vì vậy khả năng quang hợp của cây tốt hơn, không xảy ra hiện tượng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng cũng như không có hiện tượng các cây che bóng lẫn nhau dẫn đến thiếu nhu cầu ánh sáng cho quang hợp, không có hiện tượng cạnh tranh về không gian khiến các cây phải mọc chen chúc. Khi tăng mật độ nuôi cấy lên 3 cây trong 1 bình kết quả cho thấy các chỉ tiêu thu được có sự giảm dần. Tuy nhiên, sự chênh lệch không đáng kể. Các cây thu được vẫn to khỏe, mập, lá xanh bóng, dày, rễ khỏe. Sự chênh lệch không nhiều về các chỉ tiêu giữa hai nghiệm thức R 1 và R2 cho thấy mặc dù mật độ nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng , tuy nhiên trong một giới hạn nhất định nào đó, sự thay đổi mật độ nuôi cấy vẫn chưa ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng của cây con, vì vậy kích thước 59 của các cây con thu được ở 2 nghiệm thức R1 và R2 chưa có sự khác nhau nhiều. Ở nghiệm thức R3 các chỉ tiêu thu được thấp nhất. Cây vẫn chắc, nhưng rễ hơi héo, có nhiều sắc tố màu tím ở mép lá và mặt dưới lá. Ở nghiệm thức này cây con sinh trưởng kém nhất, do mật độ cây cao nên xảy ra hiện tượng cạnh tranh về dinh dưỡng, ánh sáng, khoảng không gian tro ng bình nuôi cấy, các cây mọc chen chúc nên có sự ức chế sinh trưởng lẫn nhau, thường thì các cây ở gần thành bình phát triển mạnh hơn do chúng nhận được nhiều ánh sáng chiếu tới hơn, còn các cây phía trong bị che bóng nhiều nên sinh trưởng kém hơn, dẫn đến kích thước cây không đồng đều. Như vậy, ở mật độ cấy chuyền quá cao hoặc quá thấp đều không mang lại hiêu quả kinh tế. Ở nghiệm thức R1 cho cây con thu được tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu, nhưng lại tốn kém chi phí về nhân công cấy chuyền, chi phí bình, môi trường nuôi cấy và diện tích phòng, dàn nuôi cây. Còn ở nghiệm thức R3 mặc dù tiết kiệm được về mặt chi phí nhân công, môi trường nuôi cấy, diện tích nhưng cây con sinh trưởng kém và không đồng đều nhau. Trong khi đó, ở nghiệm thức R2 vừa đảm bảo cho chất lượng cây con thu được sinh trưởng tốt không sai lệch nhiều so với ở nghiệm thức R 1 mà lại tiết kiệm được về mặt chi phí sản xuất, mang lại hiệu quả kinh tế. Từ đó, chúng tôi kết luận rằng mật độ cấy chuyền tốt nhất là 3 cây cho một bình nuôi cấy có thể tích 500ml. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.2. Kết luận Từ những kết quả thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi có một số kết luận như sau: Nguồn mẫu ban đầu có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng sinh và hình thái của phôi. Nguồn mẫu phôi ban đầu tốt nhấ t dùng cho nhân giống 60 và giữ phôi là các phôi có dạng màu vàng và xốp , dính liền thành từng khối. Thời gian cấy chuyền phôi có ảnh hưởng khá rõ rệt tới khả năng tăng sinh cũng như hình thái của phôi . Đối với các phôi màu vàng , xốp thì thời gian cấy chuyền tốt nhất là sau khoảng 6 tuần nuôi cấy. Khi phôi được cấy chuyền ở khoảng thời gian này cho hệ số nhân cao (gấp 66,25 lần mẫu cấy ban đầu chỉ sau 21 tuần nuôi cấy) và giữ cho mẫu không bị hóa nâu. Môi trường tối ưu nhất cho nhân nhanh phôi là: môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than hoạt tính + 20% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,3 – 0,4cm). Môi trường nhân và giữ phôi ở dạng vàng, xốp là: môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than hoạt tính + 10% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,5 – 1cm) + 20% nước gạo. Trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường sucrose + 1 g/l than hoạt tính + 20% nước gạo, mặc dù phôi phát triển chậm nhưng lại giữ được mẫu lâu, không phải cấy chuyền. Các phôi được cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA + 30% nước dừa (lấy từ những trái có cơm dày 0,5 – 1cm) + 1 g/l than hoạt tính + 30 g/l succrose + 8 g/l agar, pH = 5,8. Sau 12 tuần thì tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới. Các phôi được cấy chuyền qua môi trường Hw, còn PLB và chồi được cấy sang môi trường RC3. Đây là quy trình nhân giống cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính tối ưu nhất mà chúng tôi thu được ở đề tài này. Nguồn nước dừa non lấy từ những trái mới hình thành cơm (dày khoảng 0,1 – 0,2cm) không phù hợp cho những mẫu cấy đã qua nhiều lần cấy chuyền. Điều này có thể được giải thích là do hàm lượng cytokinin nội sinh trong mẫu cấy và trong nước dừa quá cao. Khi bổ sung proline vào môi trường nuôi cấy xảy ra hiện tượng hóa nâu mẫu do đó việc bổ sung proline không phù hợp cho sự tăng sinh phôi Hồ điệp. 61 Số lần cấy chuyền cũng có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của phôi. Các phôi càng qua nhiều lần cấy chuyền thì hệ số nhân sẽ càng giảm vì các mẫu đã qua nhiều lần cấy chuyền có hàm lượng cytokinin nội sinh cao, do đó nếu tiếp tục cấy chuyền, thì nên sử dụng môi trường ½MS, đồng thời giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng. Các cây con hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi mặc dù đã phát triển hoàn thiện về các chỉ tiêu sinh trưởng, tuy nhiên các chỉ tiêu thu được vẫn thấp hơn so với các cây có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền sang môi trường VW. Do đó các cụm chồi và cây con được hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi nên được cấy chuyền qua môi trường VW cho sự phát triển hoàn thiện của cây con trước khi đem ra vườm ươm. Mật độ cấy chuyền có ảnh hưởng tới sự phát triển của cây con. Ở mật độ cây quá cao hoặc quá thấp đều không mang lại hiệu quả kinh tế. Mật độ cấy chuyền thích hợp nhất là 3 cây cho 1 bình có thể tích 500ml (thể tích môi trường là 80ml cho mỗi bình). 4.2. Đề nghị Từ kết quả thu được chúng tôi xin đưa ra các đề nghị sau: - Cần khảo sát rõ hơn nữa về sự phát triển của các dạng phôi khác nhau. - Khảo sát ảnh hưởng của các hàm lượng nước dừa già khác nhau tới quá trình tăng sinh của phôi. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn ánh sáng nhân tạo tới khả năng tăng sinh của phôi. - Khảo sát hàm lượng đường thích hợp khi trong môi trường có bổ sung nước dừa già, nước gạo và kết hợp giữa nước dừa già với nước gạo. - Xác định được thành phần nào có trong nước gạo gây cảm ứng tăng sinh và giữ được phôi. - Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng vitamin, tinh bột lên khả năng tăng sinh của phôi. 62 - Khi tiến hành lấy nước gaọ , do chúng tôi tiến hành lấy theo phương pháp thủ công nên hàm lượng các chất có trong nước gạo ở mỗi thí nghiêṃ se ̃có sư ̣sai lêc̣h . Vì vậy cần có phương pháp thu nguồn nước gạo để đảm bảo sự đồng nhất về hàm lượng và nồ ng đô ̣các chất có trong nước gaọ dùng cho các thí nghiêṃ . Măṭ khác , trong gaọ vâñ còn chứa môṭ dư lươṇg nhỏ đôc̣ tố của thuốc trừ sâu , trừ cỏ còn sót laị . Minh chứng là gaọ xuất khẩu của Viêṭ Nam khi nhâp̣ khẩu trong mô ̣ t số trường hơp̣ vâñ chưa đaṭ tiêu chuẩn . Nguồn mâũ phôi dùng cho nuôi cấy in vitro lại nhạy cảm khá cao với những độc tố này . Do đó kết quả thu đươc̣ cũng môṭ phần có sư ̣sai lêc̣h . Vì vậy cần tiến hành xác định chính xác thành phần và nồng đô ̣các chất có trong nước gaọ , từ đó tìm cách loại trừ lượng độc tố còn trong nước gạo . - Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết bổ sung khác như: dịch chiết khoai tây, cà chua, chuối, nhựa cây bulô, dịch chiết nấm men, malt - Khảo sát ản h hưởng của viêc̣ cấy chuyền nhiều lần tới sư ̣phát triển của phôi và cây con đươc̣ hình thành . - Khảo sát rõ hơn nữa ảnh hưởng của môi trường ½MS khi không só sự giảm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng để so sánh với môi trường MS. - Khảo sát khả năng tăng sinh của phôi trên môi trường ½MS có bổ sung nước dừa già và nước gạo. - Khảo sát thể tích của môi trường nuôi cấy đến khả năng tăng sinh của phôi. - Sử dụng các chất làm đặc môi trường khác (gelrite) để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng tới khả năng tăng sinh của phôi. - Khảo sát ảnh hưởng của nước gạo riêng rẽ và nước gạo kết hợp với nước dừa tới sự phát triển của cây con in vitro. - Xác định số cây con được hình thành từ một cụm mẫu cấy ban đầu, so sánh với khả năng phát sinh cây con từ PLB. 63 - Khảo sát khả năng sống sót và phát triển của các cây được hình thành trong quá trình nuôi cấy phôi so sánh với các cây có cùng nguồn gốc nhưng được cấy chuyền qua môi trường VW ngoài vườm ươm. - Khảo sát khả năng sống sót và phát triển của các cây con ở các nghiệm thức R1, R2, R3 ngoài vườm ươm. - Xác định tỷ lệ sống sót và sự phát triển của cây con có nguồn gốc phôi vô tính ngoài vườm ươm để so sánh với các cây con có nguồn gốc khác. - Khảo sát các loại giá thể phù hợp cho sự phát triển của cây lan Hồ điệp có nguồn gốc từ phôi vô tính. - So sánh chất lượng của hoa thu được từ những cây có nguồn gốc phôi vô tính so với hoa của những cây có nguồn gốc khác. PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt 1. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại cương. NXB. ĐHQG TP.HCM. 2. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện (2007). Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ điệp lai Phalaenopsis Hybrid. Dương Tấn Nhựt (chủ biên). Hội nghị khoa học: công nghệ sinh học thực vật trong công tác tạo giống hoa. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM. 3. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật. NXB. ĐHQG TP.HCM. 4. Dương Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật, tập 2. NXB. ĐHQG TP.HCM. 5. Dương Công Kiên (2006). Nuôi cấy mô, tập 3. Kỹ thuật nhân giống – lai tạo trồng một số giống lan (Orchid) thông dụng và có giá trị kinh tế ở Việt Nam. NXB. ĐHQG TP.HCM. 6. Dương Phương Thanh (2007). Ảnh hưởng của một số loại đường khác nhau lên sự phát sinh phôi và tăng sinh PLB lan Hồ điệp. Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học đại học. Trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM. 7. Dương Tấn Nhựt (2006). Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM. 8. Dương Tấn Nhựt (2007). Công nghệ sinh học thực vật, tập 1. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM. 9. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Đức Huy, Lương Ngọc Thuận (2007). Sự phát sinh phôi của các tế bào sinh dưỡng thực vật. Tạp chí công nghệ sinh học. 5(2): 133-149. 64 10. Hoàng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Kim Thanh (2004). Giáo trình sinh lí thực vật. NXB. ĐH Sư Phạm. 11. Hoàng Thị Sản (1999). Phân loại học thực vật. NXB. Giáo Dục. 12. Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga (2006). Hình thái giải phẫu học thực vật. NXB. ĐH Sư Phạm. 13. Lý Thị Phương Loan (2006). Ảnh hưởng của một số nguồn chiếu sáng nhân tạo lên sự phát sinh hình thái của phôi, tái sinh cây con lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) và ứng dụng của nó trong nhân giống vô tính. Khóa luận cử nhân sinh học. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. 14. Nguyễn Cửu Thành Nhân (2006). Tối ưu hóa môi trường phát sinh phôi, protocorm-like body (PLB) và ứng dụng công nghệ bioreactor để nhân nhanh phôi, PLB phục vụ công tác nhân giống cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.). Đồ án tốt nghiệp đại học. Trường đại học Đà Nẵng. 15. Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thành Hải, Dương Tấn Nhựt (2006). Nhân nhanh phôi và protocorm-like body cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis. amabilis) bằng hệ thống bioreactor. Dương Tấn Nhựt (chủ biên). Hội nghị khoa học: công nghệ sinh học thực vật trong công tác chọn tạo giống hoa. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM, trang:17-27. 16. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006). Công nghệ tế bào. NXB. ĐHQG TP.HCM. 17. Nguyễn Phúc Huy (2007). Hệ thống nuôi cấy film (túi nylon) trong nhân giống nhanh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.). Luận văn tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Đà Lạt. 18. Nguyễn Thị Kim Tuyền (2005). Bước đầu nghiên cứu khả năng tạo hạt nhân tạo cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) phục vụ công tác nhân giống và bảo quản. Luận văn tốt nghiệp cử nhân khoa học đại học. Trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM. 19. Nguyễn Thị Thu Sương (2008). Khả năng phát sinh phôi vô tính của dâu tây (Fragaria sp.). Luận văn thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Đà Lạt. 20. Trần Lê Lưu Ly, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh, Nguyên Vũ, Bùi Văn Lê (2007). Thử nghiệm chuyển gen trên lan Hồ điệp (Phalaenopsis. amabilis) bằng phương pháp bắn gen và Agrobacterium tumefaciens. Dương Tấn Nhựt (chủ biên). Hội nghị khoa học: công nghệ sinh học thực vật trong công tác chọn tạo giống hoa. NXB. Nông Nghiệp TP.HCM, trang: 189-194. 21. Trịnh Thị Lan Anh (2007). Nghiên cứu khả năng hình thành protocorm-like body (PLB), phôi vô tính và bước đầu nghiên cứu khả năng hình thành tế bào đơn cây lan hồ điệp (Phalaenopsis.sp) phục vụ công tác nhân giống. Luận văn thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Đà Lạt. 22. Vũ Văn Vụ (1999). Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo Dục. 2. Tài liệu tiếng anh 65 1. Aleith F., Richter G. (1990). Gene expression during induction of somatic embryogenesis in carror cell suspension. Plant. 83: 17-24. 2. Ammirato P.V. (1983). Handbook of Pant Cell Culture, Vol. I. MacMillan, New York, pp. 82-123. 3. Ammirato P.V. (1983). The regulation of somatic embryo development in plant cell culture: Suspension culture techniques and hormone requirements. Bio- Technology. 1: 68-74. 4. Arditti J., Ernst R. (1993). Micropropagation of orchids. Jonh Wiley & Sons, New York, USA. 5. Chen J.T., Chang W.C. (2004). Induction of repetitive embryogenesis from seed- derived protocorms of Phalaenopsis amabilis var. Formosa shimadzu. In vitro Cell. & Dev. Biol. Plant. 40: 290-293. 6. Chen J.T., Chang W.C. (2006). Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants of Phalaenopsis amabilis. Biol. Plant. 50(2): 169-173. 7. Duong T.N., Bui V.L., Nguyen T.M., da Silva J.A.T., Fukai S., Tanaka M., Tran Thanh Van K. (2002). Somatic embryogenetic through pseudo-bulblet tranverse thin cell layer of Lilium longiflorum. Plant Grow. Reg. 37: 193-198. 8. Ernst R. (1967). Effect of carbohydrate selection on the growth rate of Phalaenopsis and Dendrobium seeds. Arm. Orch. Soc. Bull. 36: 386-384. 9. Ernst R. (1967). Effect of organic nutrient additives on growth in vitro of Phalaenopsis seedings. Arm. Orch. Soc. Bull. 36: 694-704. 10. Evans D.A., Sharp W., Flick C. (1981). Growth and behaviour of cell cultures. In: Thorpe T.A. (Ed), Plant Tissure Culture – Methods and Application in Agriculture. Orlando, Florida, USA. Academic Press, pp. 45-113. 11. Fridborg F., Erisksson T. (1975). Effects of activated charcoal on growth and morphogenesis in a cell culture. Physio. Plant. 34: 306-308. 12. Fujimura T., Komamine A. (1975). Effect of various growth regulators on the embryogenesis in a carrot cell suspension culture. Plant. Sci. Lett. 5: 359-362. 13. Hegarty C.P. (1955). Observation on the germination of the orchid seed. Am. Orchid Soc. Bull. 24: 457-464. 14. Ishii Y., Takamura T., Goi M., Tanaka M. (1998). Callus induction and somatic embryogenesis of Phalaenopsis. Plant cell Rep. 17: 446-450. 15. Kims. Y. (1994). Somatic embryogenesis of Phalaenopsis. Ph. D. Thesis. Uni. Of Hawaii, USA. 16. Knudson L. (1951). Nutrient solutions for orchid. Botanical Gazette. 122: 528- 532. 17. Letham D.S. (1974). Regulation of cell division in plant tissure. XX. The cytokinin of cocounut-milk. Physio. Plant. 27: 66-70. 66 18. Morel G. (1974). Clonal mutiplication of orchids. In Withner C.L. (Ed) The orchids: Scientific studies. Weiley-Interscience, New York. 169-222. 19. Murashige T., Skoog F. (1962). Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant. Physio. 15: 473-479. 20. Niimoto D.H., Sagawa Y. (1961). Ovule development in Dendrobium. Arm. Orch. Soc. Bull. 49: 372-373. 21. Polonca., Suzana., Zlata. (2004). Direct shoot regeneration from nodes of Phalaenopsis orchids. Acta Agr. Slo. 83: 283-242. 22. Sagawa Y. (1961). Vegetative propagation of Phalaenopsis by stem cutting. Arm. Orch. Soc. 30: 808-809. 23. Tran Thanh Van K. (2003). Thin cell layer concept. In: Duong T.N., Bui V.L., Tran Thanh Van K., Thorpe T. (Eds.). Thin cell layer culture system – Regeneration and transformation applications. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands, pp. 1-16. 24. Wee-Peng Gow., Chen J.T., Chang J.T. (2008). Influence of growth regulators on direct embryo formation from leaf explants of Phalaenopsis orchids. Acta Physio. Plant. 30: 507-512.