Ảnh hưởng của nồng độ bsa (bovine serum albumin) trong môi trường nuôi cấy lên khả năng phát triển của phôi chuột giai đoạn trước làm tổ

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN KHOA SINH HOÏC PHAÏM THÒ LAN HÖÔNG AÛNH HÖÔÛNG CUÛA NOÀNG ÑOÄ BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) TRONG MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY LEÂN KHAÛ NAÊNG PHAÙT TRIEÅN CUÛA PHOÂI CHUOÄT GIAI ÑOAÏN TRÖÔÙC LAØM TOÅ KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HOÏC NGAØNH COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Y DÖÔÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC ThS. BS. ÑOÃ QUANG MINH THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH - 2004 Muïc luïc Trang Ñaët vaán ñeà 1 Toång quan taøi lieäu I. SINH SAÛN TREÂN CHUOÄT 2 I.1. Noäi tieát sinh saûn 2 I.2. Söï phaùt trieån vaø tröôûng thaønh cuûa tröùng 2 I.3. Söï ruïng tröùng 2 I.4. Söï thuï tinh 3 I.5. Söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät giai ñoaïn sau laøm toå 3 I.6. Caùc giai ñoaïn phaùt trieån chính cuûa phoâi chuoät 5 II. QUY TRÌNH TAÏO PHOÂI - THU NHAÄN VAØ NUOÂI CAÁY …. 6 II.1. Quy trình giao phoái töï nhieân 6 II.1.1. Söï thuï tinh trong cô theå (in vivo) 7 II.1.2. Söï thuï tinh trong oáng nghieäm (in vitro) 7 II.2. Kích thích buoàng tröùng (superovulation) 8 II.3. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû cuûa kích thích …. 8 II.3.1. AÛnh höôûng cuûa tuoåi vaø troïng löôïng 8 II.3.2. Lieàu kích duïc toá 8á II.4. Thu nhaän phoâi 9 II.4.1. Block (söï kieàm haõm) ôû giai ñoaïn 2 teá baøo 10 II.4.2. Phoâi daâu 10 II.4.3. Phoâi nang 10 III. MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY PHOÂI GIAI ÑOAÏN TRÖÔÙC ….. 11 III.1. Lòch söû nghieân cöùu moâi tröôøng 11 III.2. Caùc loaïi moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi ñoäng vaät coù vuù 12 III.3. Caùc thaønh phaàn chính trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät 13 III.3.1. Nöôùc 13 III.3.2. Ion 13 III.3.3. Carbohydrate 13 III.3.4. Amino acid 14 III.3.5. Chaát baét giöõ kim loaïi naëng 15 III.3.6. Chaát choáng oxi hoùa 15 III.3.7. Khaùng sinh 16 III.3.8. Protein/Caùc ñaïi phaân töû 16 III.3.9. Ammonium 17 IV. THEÅ TÍCH UÛ 17 V. KHOÂNG KHÍ 18 VI. ALBUMIN HUYEÁT THANH BOØ……… 18 VI.1. BSA 18 VI.2. BSA vaø söï toång hôïp BSA trong cô theå ñoäng vaät coù vuù 19 VI.3. Thaønh phaàn amino acid trong BSA 19 VI.4. Ñaëc tính chöùc naêng cuûa BSA 20 VI.4.1. Taïo boït 20 VI.4.2. Khaû naêng ñoâng ñaëc cuûa BSA 20 VI.4.3. Phoái töû keát noái 21 VI.5. Nhöõng nghieân cöùu veà vai troø cuûa BSA trong …. 21 VII. ÖÙNG DUÏNG THÖÏC TIEÃN 23 Vaät lieäu – Phöông phaùp I. ÑOÁI TÖÔÏNG NGHIEÂN CÖÙU 25 II. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 25 III. DUÏNG CUÏ – THIEÁT BÒ – HOAÙ CHAÁT 25 IV.1. Duïng cuï 25 IV.2. Thieát bò 26 IV.3. Hoaù chaát 26 IV. QUY TRÌNH THÍ NGHIEÄM 27 IV.1. OÅn ñònh chuoät – kích thích buoàng tröùng – phoái 29 IV.2. Moå chuoät – thu nhaän phoâi 2 teá baøo 31 IV.3. Theo doõi söï phaùt trieån cuûa phoâi vaø ghi nheän keát quaû 36 V. ÑAÙNH GIAÙ KEÁT QUAÛ 37 Keát quaû – Bieän luaän I. KEÁT QUAÛ 40 I.1. Ñaëc ñieåm loâ thí nghieäm nghieân cöùu 40 I.2. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa noàng ñoä BSA …. 42 I.3. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa soá löôïng phoâi/ 50µl …. 43 I.4. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng trong kích thích buoàng tröùng 45 I.5. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa nguoàn chuoät vaø ….. 45 I.6. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra vai troø cuûa nuùt nhaày aâm ñaïo …. 45 II. BAØN LUAÄN 47 Keát luaän – Ñeà nghò I. KEÁT LUAÄN 51 II. ÑEÀ NGHÒ 52 Taøi lieäu tham khaûo 53 Phuï luïc 1 Phuï luïc 2 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Nghieân cöùu veà nuoâi caáy phoâi laø böôùc khôûi ñaàu cho raát nhieàu lónh vöïc: chuyeån gen, coâng ngheä hoã trôï sinh saûn, coâng ngheä cloning, teá baøo maàm, baûo toàn nguoàn gen….Treân theá giôùi töø naêm 1956, Wesley Whitten ñaõ coâng boá thaønh coâng trong nuoâi caáy phoâi chuoät giai ñoaïn 8 teá baøo vaø moät soá phoâi chuoät 4 teá baøo thaønh phoâi nang, vaø cuõng Whitten vaøo naêm 1957, ñaõ thaønh coâng trong nuoâi caáy phoâi chuoät 2 teá baøo phaùt trieån thaønh phoâi nang. Cho tôùi ngaøy nay, vieäc nuoâi caáy phoâi chuoät ñaõ trôû neân phoå bieán, vaø noù chæ coøn laø böôùc khôûi ñaàu cho nhöõng nghieân cöùu saâu hôn veà gen, vi thao taùc, teá baøo maàm … Ñoái vôùi Vieät Nam, maëc duø laø moät nöôùc coù neàn nghieân cöùu khoa hoïc chæ môùi phaùt trieån vôùi phöông chaâm ñi tröôùc ñoùn ñaàu, vieäc nghieân cöùu taïo ra moät quy trình nuoâi caáy phoâi hoaøn chænh phuø hôïp vôùi ñieàu kieän trong nöôùc vaãn laø moät böôùc khôûi ñaàu cô baûn cho nhöõng thí nghieäm tieáp theo sau trong caùc lónh vöïc nghieân cöùu treân. Taïi tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân, moät trong nhöõng trung taâm ñaøo taïo vaø nghieân cöùu haøng ñaàu trong nöôùc, naêm 2003 vôùi ñeà taøi nghieân cöùu cuûa Phaïm Ngoïc Thuïy Vi, ñaõ böôùc ñaàu thaønh coâng trong nuoâi caáy phoâi chuoät 2 teá baøo leân phoâi nang tuy nhieân keát quaû vaãn coøn thaáp vaø chöa oån ñò 1nh. Keát quaû naøy coù theå do raát nhieàu nguyeân nhaân: ñieàu kieän nuoâi caáy, moâi tröôøng nuoâi caáy, chuûng chuoät … Coù raát nhieàu nghieân cöùu chöùng minh raèng khoâng coù moâi tröôøng nuoâi caáy toái öu chung vaø nhöõng phoøng thí nghieäm khaùc nhau coù nhöõng coâng thöùc moâi tröôøng khaùc nhau ñeå coù theå ñaït ñöôïc keát quaû nuoâi caáy gaàn vôùi söï phaùt trieån trong cô theå. Vì vaäy vôùi khaûo saùt ñaùnh giaù treân nhöõng thí nghieäm vöøa qua cho thaáy yeáu toá coù khaû naêng aûnh höôûng cao nhaát tôùi keát quaû nuoâi caáy laø moâi tröôøng khoâng phuø hôïp. Vì vaäy ñeà taøi naøy ñöôïc tieán haønh vôùi muïc tieâu xaùc ñònh noàng ñoä BSA toái öu trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät töø giai ñoaïn 2 teá baøo leân phoâi nang. Beân caïnh ñoù, trong thí nghieäm naøy coøn tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa soá löôïng phoâi chuoät trong moät theå tích moâi tröôøng nuoâi caáy coá ñònh leân khaû naêng phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 2 teá baøo thaønh phoâi nang, vaø khaûo saùt ñieàu kieän oån ñònh chuoät, nguoàn chuoät cuõng nhö vai troø cuûa vieäc kieåm tra nuùt nhaày aâm ñaïo trong ñaùnh giaù keát quaû thuï tinh. III. SINH SAÛN TREÂN CHUOÄT III.1. Noäi tieát sinh saûn Hormone kích thích nang tröùng phaùt trieån FSH (follicle stimulating hormone) do tuyeán yeân tieát ra kích thích nhoùm nang tröùng tieáp tuïc taêng tröôûng. Hormone kích thích ruïng tröùng LH (Luteinizing hormone) ñöôïc tuyeán yeân tieát ra, phaù vôõ söï kieàm haõm phaân baøo giaûm nhieãm, baét ñaàu söï phaân baøo giaûm nhieãm ñaàu tieân taïo ra theå cöïc thöù I, sau ñoù tröùng tröôûng thaønh vaø ñöôïc phoùng thích. Maëc duø veà cô cheá söï ruïng tröùng vaãn chöa ñöôïc hieåu roõ, vieäc tröùng ñöôïc phoùng thích ra khoûi nang tröùng laø nhôø vaøo söï taêng kích thích cuûa LH. III.2. Söï phaùt trieån vaø tröôûng thaønh cuûa tröùng [5] ÔÛ chuoät caùi 5 ngaøy tuoåi, taát caû tröùng ôû giai ñoaïn diplotene (DNA ñaõ nhaân ñoâi) trong tieàn kì cuûa laàn phaân baøo giaûm nhieãm thöù nhaát. Moãi tröùng chöùa trong nang tröùng vaø ñöôïc bao boïc bôûi lôùp teá baøo haït. Hôn moät nöûa nhöõng nang noaõn nguyeân thuyû hieän dieän trong buoàng tröùng luùc sinh ra seõ thoaùi hoùa tröôùc 3 – 5 tuaàn tuoåi, nguyeân nhaân cuûa ñieàu naøy vaãn chöa bieát roõ. Chuoät caùi thaønh thuïc veà giôùi tính vaøo khoaûng 6 tuaàn ñeán 4 thaùng tuoåi, tuyø thuoäc vaøo chuûng chuoät vaø ñieàu kieän moâi tröôøng. Khi chuoät caùi tröôûng thaønh moãi buoàng tröùng chöùa khoaûng 104 tröùng ôû nhöõng giai ñoaïn phaùt trieån khaùc nhau. III.3. Söï ruïng tröùng Chu kì ruïng tröùng bình thöôøng xaûy ra 4 ngaøy moät laàn. Tuy nhieân, thôøi gian chu kì ruïng tröùng coù theå bò aûnh höôûng bôûi nhieàu yeáu toá vaø coù theå ñöôïc ñieàu khieån bôûi kích thích baèng hormone (kích thích buoàng tröùng). Tröùng taêng tröôûng veà kích thöôùc vaø daàn böôùc vaøo giai ñoaïn cuoái cuûa giaûm phaân khi ñaùp öùng vôùi söï kích thích cuûa hormone. Trong moät chu kì ruïng tröùng töï nhieân chæ coù moät soá nang noaõn ñaùp öùng vôùi söï taêng FSH do tuyeán yeân saûn xuaát. Söï ruïng tröùng xaûy ra khi coù söï taêng LH ñöôïc tuyeán yeân saûn xuaát. Döôùi söï kích thích cuûa LH, nhaân maát ñi maøng, nhieãm saéc theå taäp trung treân sôïi nhieãm saéc vaø chia ñoâi, cuoái cuøng dieãn ra söï phaân baøo giaûm nhieãm thöù nhaát vaø taïo theå cöïc thöù I. Tröùng ñöôïc phoùng thích khoûi nang noaõn.Tröùng ruïng vaøo oáng daãn tröùng, vaøo luùc naøy ñaàu ngoaïi bieân cuûa oáng daãn tröùng trôû neân öù maùu vaø tröông phoøng leân thaønh ñoaïn boùng nôi söï thuï tinh seõ dieãn ra. Trong söï ruïng tröùng töï nhieân, 8 – 12 tröùng ñöôïc phoùng thích (tuyø thuoäc vaøo chuûng chuoät) nhöng tieán trình naøy khoâng ñoàng boä vaø xaûy ra trong khoaûng thôøi gian 2- 3 giôø. III.4. Söï thuï tinh Khoaûng 58x106 tinh truøng ñöôïc phoùng vaøo oáng daãn tröùng trong moãi laàn phoùng tinh. Vaøi tinh truøng tôùi ñöôïc ñoaïn boùng trong khoaûng 5 phuùt vaø söï thuï tinh xaûy ra trong khoaûng 1 giôø. Söï thuï tinh khôûi ñoäng quaù trình phaân baøo giaûm nhieãm thöù 2 vaø taïo theå cöïc thöù 2. III.5. Söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät giai ñoaïn sau laøm toå [13] Hình 1: Sô ñoà söï phaùt trieån ban ñaàu cuûa phoâi Thuï tinh: laø söï keát hôïp cuûa giao töû ñöïc vaø giao töû caùi taïo thaønh hôïp töû vaø cuõng laø moác baét ñaàu söï phaùt trieån cuûa hôïp töû. Söï phaân chia: laø chuoãi phaân baøo nguyeân nhieãm nhôø ñoù moät teá baøo ban ñaàu (hôïp töû) phaân chia thaønh nhieàu teá baøo (phoâi baøo- blastomeres). Caùc ñaëc ñieåm cuûa söï phaùt trieån phoâi ban ñaàu ôû ñoäng vaät coù vuù: − Söï thuï tinh vaø phaân chia sôùm xaûy ra ôû 2 nhaùnh voøi tröùng − Söï phaân chia xaûy ra chaäm töø 12 – 24 giôø. − Söï phaân chia ban ñaàu khoâng ñoàng boä. − Boä gen ñöôïc hoaït hoùa khi hôïp töû baét ñaàu phaân chia. Tröùng Thuï tinh Hôïp töû Phaân chia Phoâi baøo Tinh truøng Hình 2: Söï phaùt trieån cuûa phoâi sau khi thuï tinh. A: tröùng ñaõ thuï tinh B: phoâi 2 teá baøo C: phoâi daâu -phoâi 8 teá baøo D: phoâi 16 teá baøo E: phoâi nang Khoù khaên cuûa vieäc nghieân cöùu ôû nhöõng loaøi ñoäng vaät coù vuù: Theå cöïc Tieàn nhaân ñöïc vaø caùiMaøng pellucida Tröùng ñaõ ñöôïc thuï tinh Phoâi 2 teá baøo 11/2ngaøy Phoâi 8 teá baøo 21/2 ngaøy Phoâi 16 teá baøo 3 ngaøy Phoâi nang 4 ngaøy Keát khoái Khoang phoâi Ngoaïi phoâi bì Khoái teá baøo beân trong A B C D E − Tröùng cuûa chuùng nhoû nhaát trong giôùi ñoäng vaät (hôïp töû cuûa ngöôøi coù kích thöôùc laø 120µm, cuûa chuoät khoaûng 80µm). − Soá löôïng tröùng cuûa ñoäng vaät coù vuù ñöôïc taïo ra ít. − Phoâi cuûa ñoäng vaät coù vuù phaùt trieån beân trong thay vì beân ngoaøi cô theå. III.6. Caùc giai ñoaïn phaùt trieån chính cuûa phoâi chuoät [5,8,9] Giai ñoaïn teá baøo rôøi (Cleavage): soá löôïng teá baøo trong phoâi coù theå ñeám ñöôïc deã daøng cho tôùi luùc xaûy ra söï keát khoái ôû giai ñoaïn 8 teá baøo, laøm hình daïng teá baøo trôû neân môø nhaït. Giai ñoaïn keát khoái (Compaction): xaûy ra vaøo 3,5 – 7,5 giôø sau khi baét ñaàu chu kì teá baøo thöù 4, töùc ôû giai ñoaïn phoâi 8 teá baøo. Phaân chia tôùi giai ñoaïn 16 teá baøo: keát thuùc chu kì teá baøo thöù 4 vaø baét ñaàu chu kì teá baøo thöù 5, dieãn ra söï phaân baøo nguyeân nhieãm sau taùch khoái vaø keát khoái trôû laïi sau khi phaân baøo nguyeân nhieãm keát thuùc. Hình thaønh khoang phoâi (Blastocoel): chu kì teá baøo thöù 6, bieåu thò sôùm nhaát cuûa söï chuyeân chôû chaát dòch xaûy ra khi phoâi tieán gaàn tôùi soá löôïng 32 teá baøo vaø hình thaønh khoâng baøo chöùa ñaày dòch loûng (hoaëc 2 khoâng baøo phoàng to ra vaø sau ñoù hôïp nhaát laïi). IV. QUY TRÌNH TAÏO PHOÂI - THU NHAÄN VAØ NUOÂI CAÁY TRONG OÁNG NGHIEÄM IV.1. Quy trình giao phoái töï nhieân Chuoät caùi ñöôïc oån ñònh theo chu kì saùng toái thöôøng ruïng tröùng theo chu kì 3-4 ngaøy, 3-4 giôø sau khi baét ñaàu chu kì toái. Chuoät ñöïc ñöôïc oån ñònh trong cuøng ñieàu kieän seõ giao phoái vôùi con caùi vaøo chu kì ñoäng duïc khoaûng giöõa chu kì toái. A B Hình 3: A: phoâi giai ñoaïn 8 teá baøo chöa keát khoái; B: phoâi ñaõ keát khoái-khoâng nhìn thaáy roõ teá baøo Coù theå xaùc ñònh chuoät caùi vaøo chu kì ñoäng duïc baèng caùch xaùc ñònh maøu saéc, ñoä nhaày, vaø söï söng ñoû cuûa aâm ñaïo. Giai ñoaïn cuûa chu kì ñoäng duïc Hình thaùi cuûa aâm ñaïo Khoâng ñoäng duïc AÂm ñaïo coù ñoä môû nhoû, phaàn moâ khoâng ñoû vaø raát nhaày. Tieàn ñoäng duïc AÂm ñaïo hôû, moâ ñoû hoàng vaø nhaày, coù nhieàu neáp gaáp theo chieàu doïc hoaëc nhöõng neáp nhaên roõ raøng treân caû meùp löng vaø meùp buïng. Ñoäng duïc AÂm ñaïo töông töï nhö tieàn ñoäng duïc, nhöng moâ hoàng saùng hôn vaø ít nhaày, vaø nhöõng neáp nhaên roõ raøng hôn. Sau ñoäng duïc 1 Moâ aâm ñaïo taùi nhaït ñi vaø khoâ; meùp löng khoâng phuø nhö trong thôøi gian ñoäng duïc. Sau ñoäng duïc 2 Töông töï nhö sau ñoäng duïc 1 nhöng moâi ít nhôït nhaït hôn vaø luøi laïi; nhöõng maûnh vuïn teá baøo hôi traéng coù theå laøm ñaày thaønh trong hoaëc laáp ñaày aâm ñaïo). Baûng 1: Caùch xaùc ñònh giai ñoaïn cuûa chu kì ñoäng duïc chuoät caùi döïa vaøo hình thaùi cuûa aâm ñaïo. Chuoät caùi (töø 6 tuaàn ñeán 4 thaùng tuoåi) ñöôïc kieåm tra vaø cho tieáp xuùc vôùi chuoät ñöïc (1 hoaëc 2 chuoät caùi trong moät chuoàng vôùi 1 chuoät ñöïc). Con ñöïc tröôûng thaønh töø 6-8 tuaàn tuoåi (tuyø thuoäc vaøo chuûng chuoät), neân nhoát trong chuoàng rieâng. Buoåi saùng sau khi giao phoái chuoät caùi ñöôïc kieåm tra söï xuaát hieän nuùt giao phoái- töùc nuùt nhaày aâm ñaïo. Nuùt nhaày goàm protein bò ñoâng laïi töø dòch tinh truøng cuûa con ñöïc vaø coù theå ñöôïc nhìn thaáy deã daøng trong haàu heát caùc chuûng chuoät. Nuùt nhaày aâm ñaïo thöôøng tan raõ khoaûng 12-14 giôø sau khi xaûy ra söï giao phoái. Thoâng thöôøng, 50% chuoät caùi ñöôïc choïn seõ phoái. II.1.1. Söï thuï tinh trong cô theå (in vivo) Ñeå söï thuï tinh vaø söï phaùt trieån tieáp theo sau ñöôïc ñoàng boä, thôøi gian tieâm hormone caàn ñaûm baûo cho söï thuï tinh xaûy ra tröôùc khi ruïng tröùng- nghóa laø tröùng vöøa ruïng ñöôïc thuï tinh ngay laäp töùc, khoâng truøng laáp vôùi thôøi gian LH noäi sinh. Neáu coù söï khaùc nhau trong tuoåi phaùt trieån cuûa phoâi laø do söï leäch cheá ñoä tieâm thuoác laøm keùo daøi thôøi gian ruïng tröùng vaø thôøi gian giao phoái daãn ñeán söï khoâng ñoàng boä ôû phoâi thu nhaän. Tröùng ñaõ thuï tinh coù theå phaân bieät vôùi tröùng chöa thuï tinh baèng caùch quan saùt söï xuaát hieän theå cöïc thöù 2. Neân traùnh söï thuï tinh vôùi tröùng ñaõ ruïng quaù 12 giôø vì seõ laøm taêng hieän töôïng töï phaùt hoaït tính sinh saûn ñôn tính cuûa tröùng (töùc tröùng seõ phaân chia giaû vaø seõ thoaùi hoùa daàn sau ñoù). Chuoät giao phoái hieäu quaû neáu söû duïng caân ñoái vaø khoâng quaù thöôøng xuyeân. II.1.2. Söï thuï tinh trong oáng nghieäm (in vitro) Phöông phaùp naøy coù 2 lôïi ñieåm: Ñoàng boä hôn söï thuï tinh trong cô theå do söï thuï tinh coù theå ñöôïc thieát laäp thôøi gian chính xaùc. Tieán trình coù theå taùch khoûi chu kì ngaøy ñeâm thoâng thöôøng, vì vaäy cho pheùp söï thuï tinh cuûa tröùng dieãn ra theo thôøi gian thí nghiệm cho pheùp. IV.2. Kích thích buoàng tröùng (superovulation) Ñoái vôùi nhöõng thí nghieäm caàn nhieàu phoâi giai ñoaïn tröôùc laøm toå thì phaûi tieâm kích duïc toá cho chuoät caùi tröôùc khi cho phoái ñeå taêng soá löôïng tröùng ruïng. Hormone kích thích nang tröùng phaùt trieån - FSH ñöôïc thay theá baèng kích duïc toá thu töø huyeát thanh ngöïa caùi mang thai - PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin). Hormone kích thích ruïng tröùng - LH ñöôïc thay baèng kích duïc toá maøng ñeäm ôû ngöôøi - hCG (human chorionic gonadotropin). Hieäu quaû cuûa vieäc söû duïng kích duïc toá gaây kích thích buoàng tröùng ôû chuoät tuyø thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá: tuoåi, troïng löôïng chuoät, lieàu kích duïc toá, thôøi gian tieâm kích duïc toá vaø chuûng chuoät. Soá löôïng tröùng ruïng ñöôïc thuï tinh tuyø thuoäc vaøo khaû naêng saûn xuaát tinh truøng cuûa chuoät ñöïc. IV.3. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu quaû cuûa kích thích buoàng tröùng II.3.1. AÛnh höôûng cuûa tuoåi vaø troïng löôïng Söï tröôûng thaønh cuûa con caùi laø yeáu toá aûnh höôûng tôùi soá löôïng cuûa tröùng ñöôïc kích thích. Tuoåi toát nhaát cho söï kích thích buoàng tröùng thay ñoåi tuyø thuoäc vaøo chuûng chuoät. Vaøo giai ñoaïn phaùt trieån toát nhaát, söï chín nang noaõn taêng ñoät ngoät laøm taêng soá löôïng nang noaõn coù khaû naêng phaûn öùng vôùi FSH toái ña. Tuy nhieân, tình traïng dinh döôõng vaø söùc khoeû cuûa chuoät caùi cuõng coù theå aûnh höôûng ñeán söï chín cuûa nang noaõn. Nhöõng con vaät thieáu troïng löôïng vaø beänh daãn ñeán söï chaäm phaùt trieån vaø giaûm soá löôïng tröùng trong vieäc gaây kích thích buoàng tröùng. II.3.2. Lieàu kích duïc toá Hai loaïi kích duïc toá ñöôïc söû duïng gaây kích thích buoàng tröùng: PMSG vaø hCG. Lieàu tieâm cho chuoät töø 5 - 10UI. Thuoác ñöôïc tieâm vaøo khoang buïng chuoät caùi. Thuoác khi ñaõ pha coù theå tröõ ôû -200C trong khoaûng 1 thaùng. Thöôøng pha thuoác sao cho löôïng tieâm 1ml coù chöùa ñuû lieàu caàn tieâm. PMSG laø hormone ñaàu tieân tieâm cho chuoät, coù taùc duïng kích thích söï phaùt trieån cuûa nang noaõn. hCG laø hormone kích duïc toá thöù 2 ñöôïc tieâm cho chuoät trong quy trình gaây sieâu ruïng tröùng, coù taùc duïng laøm tröùng thoaùt khoûi nang noaõn. III.4. Thu nhaän phoâi Söï phaùt trieån cuûa phoâi töø giai ñoaïn 2 teá baøo leân 8 teá baøo vaø 16 teá baøo xaûy ra ôû voøi tröùng trong khoaûng thôøi gian 47 giôø. Chu kì teá baøo thöù 2 cuõng gioáng vôùi chu kì ñaàu keùo daøi khoaûng 20 giôø nhöng traùi laïi chu kì thöù 3 vaø nhöõng chu kì sau laïi gioáng vôùi chu kì cuûa teá baøo sinh döôõng 12 giôø. Vì vaäy, phoâi ôû töøng giai ñoaïn neân ñöôïc thu nhaän töø voøi tröùng trong thôøi gian coù theå ñoaùn tröôùc sau khi tieâm hCG hoaëc thôøi gian ñöôïc phoûng ñoaùn cuûa söï thuï tinh trong cô theå. Hình 4: Söï phaùt trieån vaø di chuyeån cuûa phoâi trong voøi tröùng III.4.1. Block (söï kìm haõm) ôû giai ñoaïn 2 teá baøo Ñoái vôùi phaàn lôùn caùc chuûng chuoät, tröùng vaø phoâi khi nuoâi caáy ôû baát cöù giai ñoaïn naøo tröôùc giai ñoaïn 2 teá baøo thöôøng bò kieàm haõm söï phaùt trieån ôû pha G2 cuûa chu kì teá baøo thöù 2 – ñieàu naøy ñöôïc cho laø söï block ôû giai ñoaïn phoâi 2 teá baøo. Duø vaäy, vaãn coù moät vaøi chuûng chuoät coù tröùng vaø phoâi khoâng bò block ôû giai ñoaïn 2 teá baøo. (Trong thí nghieäm so saùnh giöõa chuûng chuoät bò block vaø khoâng bò block cho thaáy khaû naêng phoâi ngöøng phaùt trieån ôû giai ñoaïn 2 teá baøo ñöôïc xaùc ñònh chæ bôûi kieåu gen cuûa giao töû caùi vaø khoâng lieân quan ñeán kieåu gen cuûa giao töû ñöïc.) Neáu vieäc thu nhaän phoâi töø voøi tröùng ñöôïc trì hoaõn cho tôùi giai ñoaïn phoâi 2 teá baøo muoän (khoaûng 48 giôø sau khi tieâm hCG) thì söï phaùt trieån trong oáng nghieäm vôùi moâi tröôøng thí nghieäm khoâng bò caûn trôû. Vieäc thu nhaän phoâi ôû giai ñoaïn 2 teá baøo muoän raát quan troïng ñeå coù theå coù ñöôïc söï phaùt trieån bình thöôøng cuûa chuùng leân phoâi nang trong nuoâi caáy. Ñieàu naøy coù theå thöïc hieän baèng caùch thu nhaän phoâi töø 36 – 40 giôø sau khi tieâm hCG. III.4.2. Phoâi daâu Phoâi daâu laø söï keát hôïp thaønh khoái cuûa phoâi baøo, ñieàu naøy chæ mang tính chaát moâ taû, coù theå bao quaùt taát caû caùc giai ñoaïn trong quaù trình phaùt trieån töø khoái 8 teá baøo tôùi giai ñoaïn 16 hoaëc 32 teá baøo tröôùc khi tieán leân giai ñoaïn hình thaønh khoang phoâi. Baèng caùch quan saùt söï phaùt trieån cuûa phoâi nuoâi caáy trong oáng nghieäm suoát thôøi gian naøy ngöôøi ta coù theå phaân chia giai ñoaïn phaùt trieån cuûa chuùng töø khi thaønh phaàn phoâi baøo baét ñaàu keát khoái ôû giai ñoaïn phoâi 8 teá baøo, taùch khoái suoát söï giaùn phaân ñeán giai ñoaïn 16 teá baøo vaø sau ñoù thì keát khoái trôû laïi. Giai ñoaïn phoâi daâu muoän ñöôïc quan taâm khi phoâi 16 teá baøo tôùi 32 teá baøo, khi vaãn chöa taïo khoang hoång (khoaûng 84 giôø sau khi tieâm hCG) vaø chuùng di chuyeån xuoáng oáng töû cung choã noái lieàn voøi tröùng vôùi töû cung. Khi thu nhaän phoâi ôû giai ñoaïn naøy neân thu nhaän caû ôû voøi tröùng vaø phaàn ñaàu töû cung. III.4.3. Phoâi nang Phoâi xuoáng tôùi töû cung vaø baét ñaàu taïo khoang hoång vaøo khoaûng 94 giôø sau khi tieâm hCG, khi phoâi coù khoaûng 32 teá baøo (nghóa laø haàu heát caùc teá baøo tieán tôùi keát thuùc chu kì teá baøo thöù 5). Phoâi nang seõ tieáp tuïc nôû phoàng ra khi thaønh phaàn teá baøo cuûa chuùng phaùt trieån qua chu kì 2 teá baøo tieáp theo. Khi chuùng chöùa khoaûng 128 teá baøo (khoaûng 120 giôø sau khi tieâm hCG) maøng zona baét ñaàu moûng daàn vaø phoâi nang thoaùt nang, keát noái vôùi bieåu moâ töû cung, baét ñaàu tieán trình laøm toå. Hình 5: Caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa phoâi chuoät. A-phoâi 2 teá baøo; B-phoâi 4 teá baøo; C- phoâi 8 teá baøo; D-phoâi daâu sôùm; E-phoâi daâu muoän; F-phoâi nang III.5. Moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi giai ñoaïn tröôùc laøm toå III.5.1. Lòch söû nghieân cöùu moâi tröôøng Whitten laø ngöôøi coâng boá ñaàu tieân söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 8 teá baøo thaønh phoâi nang trong nuoâi caáy söû duïng moâi tröôøng Krebs-Ringer bicarbonate ñöôïc boå sung glucose vaø albumin huyeát thanh boø (BSA) vaøo naêm 1956. Cuøng luùc ñoù laø caùc nghieân cöùu veà nhöõng nhaân toá aûnh höôûng leân söï laøm toå (implantation) cuûa McLaren vaø Mitchie naêm 1956; naêm 1958 McLaren vaø Biggers ñaõ thaønh coâng khi chuyeån phoâi nang töø nuoâi caáy trong oáng nghieäm vaøo töû cung cuûa chuoät caùi ñöôïc mang thai giaû. Naêm 1963, R. Brinster ñaõ phaùt trieån phöông phaùp gioït nuoâi caáy vaø phöông phaùp naøy ñöôïc söû duïng roäng raõi tôùi ngaøy nay chuû yeáu treân nuoâi caáy phoâi chuoät. Brinster ñaõ nghieân cöùu veà tính chaát cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy, aûnh höôûng cuûa söï thay ñoåi aùp suaát thaåm thaáu, pH, thaønh phaàn amino acid, nhöõng nguoàn naêng löôïng vaø ñaõ thieát laäp neàn moùng söï nuoâi caáy phoâi chuoät giai ñoaïn tröôùc laøm toå. Vôùi nhöõng nghieân cöùu vaøo naêm 1968 – 1969, oâng ñaõ coâng boá moâi tröôøng caên baûn ñaàu tieân nuoâi caáy teá baøo tröùng BMOC2. Moät vaøi moâi tröôøng khaùc döïa treân BMOC2 ñöôïc phaùt trieån tieáp ñoù, bao goàm moâi tröôøng thay ñoåi Whitten (do Whitten phaùt trieân naêm 1971) vaø moâi tröôøng M1. Vaøo naêm 1982 Quinn ñaõ thay theá thaønh phaàn ñeäm bicarbonate baèng ñeäm HEPES (hypoxyethyl-1-piperazineenthanesulforic acid) ñeå duy trì pH oån ñònh cho choïn A B C D F E phoâi vaø cho nhöõng thí nghieäm maø phoâi ñöôïc thao taùc trong moät thôøi gian daøi beân ngoaøi tuû CO2. Gaàn 20 naêm phaùt trieån, ñaõ coù moät vaøi thay ñoåi trong ñieàu kieän nuoâi caáy phoâi chuoät, söï phaùt trieån moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät theá heä thöù 2 ñöôïc tieán haønh döïa treân nhöõng hieåu bieát toát hôn veà yeáu toá sinh lyù hoïc caên baûn, söï trao ñoåi chaát, vaø cuõng ñaõ coù nhieàu caûi tieán trong kó thuaät nuoâi caáy phoâi. III.5.2. Caùc loaïi moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi ñoäng vaät coù vuù Moâi tröôøng ñöôïc söû duïng cho nuoâi caáy phoâi ñoäng vaät coù vuù thöôøng thuoäc 1 trong 3 loaïi. Dung dòch muoái ñôn giaûn ñöôïc boå sung nhöõng chaát neàn naêng löôïng (KSOM, Earle’s, CZB, M16, T6). Moâi tröôøng naøy ñöôïc hình thaønh ñaàu tieân ñeå cung caáp söï phaùt trieån giao töû nhöõng chuûng chuoät lai naøo ñoù vôùi chuûng lai F1 cuûa chuùng. Töø nhöõng loaïi moâi tröôøng naøy ngöôøi ta ñaõ taïo ra moâi tröôøng dòch oáng daãn tröùng ôû ngöôøi (HTF). Sau hôn 30 naêm phaùt trieån, vieäc taïo ra nhöõng loaïi moâi tröôøng naøy coù moät soá thay ñoåi: moâi tröôøng muoái ñôn giaûn thöôøng ñöôïc boå sung theâm huyeát thanh hoaëc vôùi albumin huyeát thanh. Moâi tröôøng nuoâi caáy moâ phöùc taïp (Ham’s F-10). Moâi tröôøng naøy coù giaù trò veà maët thöông maïi vaø ñöôïc thieát keá cho nuoâi caáy teá baøo sinh döôõng (somatic cell). Loaïi moâi tröôøng naøy phöùc taïp hôn nhieàu, coù chöùa amino acid, vitamin, tieàn thaân nucleic acid, kim loaïi chuyeån tieáp, thöôøng ñöôïc boå sung 5-20% huyeát thanh. Tuy nhieân caàn chuù yù: noù khoâng ñöôïc thieát keá cho muïc ñích nuoâi caáy phoâi. Moâi tröôøng lieân tuïc. Moâi tröôøng naøy ñöôïc phaùt trieån gaàn ñaây, döïa treân nhöõng thay ñoåi sinh lyù cuûa phoâi vaø nhu caàu dinh döôõng khi phoâi phaùt trieån töø giao töû tôùi phoâi nang. Ví duï ñieån hình cuûa loaïi moâi tröôøng naøy laø G1, G2 ñöôïc Gardner (1994) vaø Barners (1995) xaây döïng cho nuoâi caáy phoâi tröôùc vaø sau khi keát khoái. III.5.3. Caùc thaønh phaàn chính trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät II.3.1. Nöôùc Nöôùc luoân laø thaønh phaàn quan troïng cuûa baát kì moâi tröôøng naøo, chieám khoaûng 99% thaønh phaàn. Nguoàn goác vaø söï tinh saïch cuûa nöôùc ñöôïc söû duïng trong moâi tröôøng laø yeáu toá quan troïng nhaát ñaûm baûo chaát löôïng moâi tröôøng. Khaû naêng phaùt trieån cuûa phoâi trong nuoâi caáy coù lieân quan tuyeät ñoái vôùi chaát löôïng cuûa nöôùc. Whittingham ñaõ chöùng minh raèng söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 2 teá baøo tôùi phoâi nang trong nuoâi caáy taêng khi moâi tröôøng söû duïng nöôùc ñöôïc chöng caát 3 laàn so vôùi moâi tröôøng söû duïng nöôùc chöng caát 1 laàn hay 2 laàn. Nöôùc ñöôïc söû duïng neân ñöôïc kieåm tra noäi ñoäc toá vaø löôïng ñoäc toá phaûi ít hôn 0,125IUml. II.3.2. Ion Vai troø cuûa ion trong suoát quaù trình phaùt trieån phoâi chuoät giai ñoaïn tröôùc laøm toå ñöôïc bieát raát ít. Dòch oáng daãn tröùng cuûa ñoäng vaät coù vuù coù noàng ñoä cao Kali vaø Clo, vaø aùp suaát thaåm thaáu toaøn dieän cao. Tuy nhieân khi ngöôøi ta söû duïng dung dòch muoái ñöợc caân baèng aùp suaát thaåm thaáu cao vaø ñöôïc boå sung nguoàn naêng löôïng carbohydrate thì laïi khoâng thu ñöôïc möùc phaùt trieån cao cuûa phoâi. II.3.3. Carbohydrate Carbohydrate hieän dieän trong dòch oáng sinh saûn cuûa con caùi, löôïng carbohydrate khaùc nhau giöõa oáng daãn tröùng vaø töû cung, löôïng naøy cuõng thay ñoåi theo chu kì. Cuøng vôùi amino acid, carbohyrate laø nguoàn naêng löôïng chính cho söï phaùt trieån cuûa phoâi. Haàu heát moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi ñeàu coù chöùa pyruvate, lactate, vaø glucose. Tröùng vaø giao töû chuoät söû duïng glucose ít hôn so vôùi pyruvate. Nhöng vaøo thôøi gian keát khoái chuùng laïi taêng haáp thu glucose, vaø glucose trôû thaønh nguoàn naêng löôïng chính vaøo giai ñoaïn phoâi nang. Nhöõng nghieân cöùu veà vieäc haáp thu chaát dinh döôõng trong nuoâi caáy phoâi sôùm cho thaáy roõ raøng pyruvate laø nguoàn naêng löôïng chính. Ñoái vôùi phoâi chuoät, lactate coù theå ñöôïc söû duïng nhö nguoàn naêng löôïng ôû giai ñoaïn 2 teá baøo vaø hoaït ñoäng hieäp löïc vôùi pyruvate. Ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu ñoái laäp vôùi nhau veà noàng ñoä toái öu cuûa lactate trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät phaùt trieån tôùi giai ñoaïn phoâi nang. Cross vaø Brinster cho noàng ñoä toái öu laø 30mM cho söï phaùt trieån töø giao töû tôùi phoâi nang. Trong khi coù nhöõng nghieân cöùu khaùc cho raèng noàng ñoä toái öu laø 10mM. Nhöõng nghieân cöùu tieáp theo cho thaáy raèng phoâi chuoät töø giao töû tôùi giai ñoaïn 8 teá baøo caàn noàng ñoä lactate cao (20mM), nhöng khi thôøi gian nuoâi caáy keùo daøi tôùi phoâi daâu thì moâi tröôøng toái öu laïi coù noàng ñoä lactate thaáp hôn. Ñieàu quan troïng laø haàu heát lactate trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi troän laãn 50:50 giöõa D- vaø L-isomer trong dòch sodium lactate. Trong ñoù chæ coù L-lactate coù hoaït tính sinh hoïc, vì vaäy noàng ñoä lactate trong moâi tröôøng chæ laø ½ löôïng ñöôïc cho vaøo moâi tröôøng. Lactate laø moät acid yeáu coù theå vaøo phoâi vaø gaây suït giaûm pH noäi baøo vì vaäy sodium lactate ñöôïc söû duïng trong moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi traùnh söï coù maët cuûa D- isomer, maëc duø noù khoâng coù hoaït tính sinh hoïc nhöng noù vaãn coù theå gaây ra söï suït giaûm pH vaø laøm aûnh höôûng tôùi sinh lyù teá baøo. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây ñaõ chöùng minh, glucose hieän dieän ñoàng thôøi vôùi phosphate trong moâi tröôøng nuoâi caáy laøm chaäm hoaëc haõm laïi söï phaùt trieån, phaân chia cuûa phoâi ôû giai ñoaïn 4 teá baøo muoän vaø 8 teá baøo sôùm trong nuoâi caáy. Tuy nhieân, söï öùc cheá cuûa glucose coù theå ñöôïc giaûm bôùt bôûi amino acid vaø vitamin. Toùm laïi, phoâi trong giai ñoaïn tröôùc laøm toå traûi qua söï thay ñoåi ñoät ngoät trong vieäc söû duïng carbohyrate khi phaùt trieån. Pyruvate/lactate luùc ñaàu laø nhöõng chaát dinh döôõng öu tieân vaø vieäc söû duïng glucose taêng roõ reät vaøo giai ñoaïn sau keát khoái. II.3.4. Amino acid Dòch oáng daãn tröùng vaø töû cung coù chöùa moät löôïng ñaùng keå amino acid töï do ñöôïc phoâi söû duïng vaø toång hôïp. Ñieàu naøy cho thaáy amino acid coù vai troø sinh lyù tröôùc vaø trong quaù trình laøm toå cuûa phoâi ñoäng vaät coù vuù. Nhöõng nghieân cöùu cho thaáy, amino acid trong moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng söï phaùt trieån cuûa phoâi ñeán giai ñoaïn phoâi nang. Ñoái vôùi söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät, nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu vaø glutamine trong moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng tæ leä phaùt trieån cuûa giao töû leân phoâi nang vöôït qua söï block ôû giai ñoaïn phoâi 2 teá baøo trong nuoâi caáy trong oáng nghieäm. Nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu, glutamine kích thích söï phaân chia teá baøo, hình thaønh phoâi nang vaø thoaùt nang trong nuoâi caáy phoâi chuoät. Amino acid trong moâi tröôøng nuoâi caáy giuùp cho söï hình thaønh phoâi nang cuøng thôøi gian vôùi trong cô theå. Trong khi, vieäc theâm nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng soá löôïng teá baøo phaùt trieån leân thaønh phoâi nang, ñöôïc cho chæ vaøo giai ñoaïn töø hôïp töû tôùi giai ñoaïn 8 teá baøo. Sau khi keát khoái, nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu vaø glutamine khoâng kích thích söï phaân chia nöõa maëc duø chuùng laøm taêng söï hình thaønh khoang phoâi vaø thoaùt nang. Nhöõng amino acid thieát yeáu vôùi noàng ñoä thaáp trong voøi tröùng laøm giaûm soá löôïng giao töû phaùt trieån leân thaønh phoâi nang trong nuoâi caáy. Vieäc öùc cheá söï phaùt trieån naøy coù theå do aûnh höôûng xaáu cuûa nhöõng amino acid thieát yeáu trong suoát söï phaùt trieån cuûa 4 chu kì teá baøo ñaàu tieân. Tuy nhieân, sau giai ñoaïn 8 teá baøo, nhöõng amino acid thieát yeáu laïi kích thích söï phaân chia vaø laøm taêng söï phaùt trieån cuûa khoái teá baøo beân trong phoâi nang. ÔÛ chuoät, phoâi ñöôïc nuoâi tôùi giai ñoaïn 8 teá baøo vôùi moâi tröôøng coù chöùa nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu vaø chuyeån vaøo con nhaän seõ laøm taêng tæ leä laøm toå vaø phaùt trieån sau khi caáy chuyeån. Traùi laïi neáu phoâi ñöôïc nuoâi caáy tôùi giai ñoaïn phoâi daâu hay phoâi nang roài chuyeån vaøo con caùi thì tæ leä phaùt trieån seõ taêng khi nuoâi trong moâi tröôøng coù chöùa taát caû 20 loaïi amino acid. II.3.5. Chaát baét giöõ kim loaïi naëng Vieäc theâm nhöõng chaát baét giöõ kim loaïi naïêng vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng söï phaùt trieån cuûa phoâi trong giai ñoaïn tröôùc laøm toå. Theâm EDTA (Ethylenediamine tetra-acetic acid) vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng söï phaùt trieån cuûa giao töû chuoät vöôït qua ñöôïc giai ñoaïn phoâi 2 teá baøo vaø taêng söï phaùt trieån leân phoâi nang. Tuy nhieân, EDTA chæ coù hieäu quaû trong khoaûng noàng ñoä giöõa 10µM ñeán 150µM, noàng ñoä 200µM seõ öùc cheá söï phaùt trieån leân phoâi nang. Nhöõng chaát baét giöõ ion kim loaïi töï do khaùc nhö transferrin cuõng ñöôïc chöùng minh laøm taêng söï phaùt trieån cuûa giao töû chuoät leân phoâi nang vöôït qua ñöôïc hieän töôïng block 2 teá baøo. Ngöôøi ta cho raèng transferrin laøm taêng söï phaùt trieån cuûa phoâi baèng caùch baét giöõ nhöõng ion saét, tuy nhieân laïi ngaên chaën trieät ñeå oxy töï do trong moâi tröôøng nuoâi caáy laø nguyeân nhaân gaây ra stress oxi hoaù ñoái vôùi phoâi. Ngöời ta ñaõ chöùng minh vôùi moâi tröôøng coù chöùa EDTA, nhöõng amino acid khoâng thieát yeáu vaø glutamine, vieäc coù theâm transferrin khoâng laøm taêng söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät leân giai ñoaïn phoâi nang. Vì vaäy, khi moâi tröôøng ñaõ coù EDTA vaø amino acid thì transferrin laø khoâng caàn thieát. II.3.6. Chaát choáng oxi hoùa Ngöôøi ta ñaõ chöùng minh raèng moät trong nhöõng nguyeân nhaân laøm chaäm laïi söï phaùt trieån cuûa phoâi ôû giai ñoaïn tröôùc laøm toå trong nuoâi caáy so vôùi söï phaùt trieån trong cô theå laø do stress oxi hoùa. Nguyeân nhaân do noàng ñoä oxy cao, söï phôi baøy ra aùnh saùng vaø söï coù maët cuûa nhöõng kim loaïi chuyeån tieáp trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Vì vaäy, moät vaøi nghieân cöùu ñaõ chöùng minh hieäu quaû cuûa nhöõmg chaát choáng oxi hoùa leân söï phaùt trieån cuûa phoâi giai ñoaïn tröôùc laøm toå, tuy nhieân tôùi nay vaãn coøn raát nhieàu tranh caõi. II.3.7. Khaùng sinh Nhöõng khaùng sinh nhö penicillin, streptomycin hoaëc gentamycin thöôøng coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi. Khi röûa phoâi trong moâi tröôøng coù chöùa khaùng sinh coù theå traùnh ñöôïc söï nhieãm khuaån. II.3.8. Caùc ñaïi phaân töû Ñaïi phaân töû ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng laø albumin huyeát thanh. Boå sung vaøo moâi tröôøng löôïng lôùn albumin huyeát thanh laøm taêng tính caêng beà maët, giaûm xu höôùng troâi lô löûng hoaëc dính chaët vaøo thuyû tinh hay plastic, giuùp cho vieäc thao taùc vôùi phoâi seõ trôû neân deã daøng hôn. Albumin huyeát thanh coù theå hoaït ñoäng nhö chaát baét giöõ laøm baát hoaït caùc kim loaïi naëng vaø nhöõng ñoäc toá khaùc. Albumin huyeát thanh laø chaát ñeäm laøm giảm tối thiểu söï thay ñoåi pH khi moâi tröôøng ñöôïc ñöa ra khoûi tủ CO2. Tuy nhieân, caùc ñaïi phaân töû xuaát phaùt töø huyeát thanh cuõng laø caùc nguyeân nhaân daãn ñeán nhieãm khuaån vaø trong moãi loâ saûn xuaát ñeàu coù söï thay ñoåi ñaùng keå thaønh phaàn albumin. Vì vaäy, caàn kieåm tra tröôùc khi söû duïng ñoái vôùi moãi loâ moâi tröôøng albumin huyeát thanh. Polyvinyl pyrrolidone vaø polyvinyl alcohol ñöôïc nghieân cöùu cho khaû naêng trôû thaønh nguoàn cung caáp ñaïi phaân töû phi sinh hoïc thay cho albumin huyeát thanh boø (BSA) coù nguy cô gaây nhieãm khuaån. Nhöng nhöõng ñaïi phaân töû naøy khoâng coù chöùc naêng nhö BSA trong vieäc giaûm söùc caêng beà maët hoaëc baét giöõ ñoäc toá. Moät ñaïi phaân töû khaùc hieän dieän trong oáng sinh saûn con caùi laø hyaluronan, khoái cao phaân töû polysaccharide. ÔÛ chuoät, löôïng hyaluronan taêng trong thôøi gian laøm toå. Ngöôøi ta ñaõ chöùng minh raèng khoâng chæ hyaluronan coù theå thay theá albumin trong heä thoáng nuoâi caáy phoâi chuoät vaø boø, maø coøn laøm taêng keát quaû ñaùng keå trong vieäc chuyeån phoâi. Töông töï vôùi nhöõng keát quaû cuûa albumin taùi toå hôïp, söï coù maët cuûa hyaluronan trong moâi tröôøng nuoâi caáy laøm taêng khaû naêng toàn taïi trong ñieàu kieän ñoâng laïnh phoâi nang. Ngöôøi ta thaáy albumin vaø hyaluronan cho keát quaû hieäp löïc vôùi nhau ñoái vôùi vieäc nuoâi caáy phoâi. II.3.9. Ammonium Ngöôøi ta ñaõ chöùng minh khi uû ôû 370C, amino acid töï khöû goác amin phoùng thích ammonium vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Ngoaøi ra, phoâi cuõng khöû goác amin cuûa caùc amino acid khi chuyeån hoaù vaø cuõng taïo ra ammonium. Ammonium khoâng chæ laøm chaäm söï phaùt trieån cuûa phoâi trong nuoâi caáy, maø coøn coù theå khieán baøo thai chaäm phaùt trieån vaø khieám khuyeát heä thaàn kinh ôû chuoät. Vì vaäy phaûi thay moâi tröôøng sau 48 giôø ñeán 72 giôø ñeå khoâng bò aûnh höôûng bôûi ñoäc toá cuûa ammonium. Thuû phaïm chính lieân quan tôùi söï khöû goác amin vaø phoùng thích ammonium laø glutamine. Tuy nhieân, amino acid coù theå ñöôïc thay theá baèng ananylglutamine dipeptide, noù oån ñònh ôû 370C vaø giaûm roõ reät söï phoùng thích ammonium vaøo moâi tröôøng nuoâi. III.6. Theå tích uû Toaøn boä heä thoáng nuoâi caáy vôùi moïi yeáu toá: khoâng khí, theå tích nuoâi caáy, soá löôïng phoâi, vieäc boå sung caùc ñaïi phaân töû … ñeàu taùc ñoäng laãn nhau vaø taùc ñoäng leân söï phaùt trieån cuûa phoâi. Vieäc nuoâi caáy phoâi ñoäng vaät coù vuù trong theå tích nhoû moâi tröôøng vaø (hoaëc) trong nhoùm laøm taêng roõ reät söï phaùt trieån leân phoâi nang. Hôn theá, ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu chöùng minh raèng nuoâi caáy phoâi trong theå tích nhoû laøm taêng khaû naêng toàn taïi vaø phaùt trieån tieáp tuïc sau khi chuyeån. Ngöôøi ta cho raèng vieäc taêng söï phaùt trieån cuûa phoâi trong nuoâi caáy vôùi moät theå tích nhoû moâi tröôøng vaø (hoaëc) trong nhoùm laø do phoâi taïo ra nhöõng nhaân toá actocrine/paracrine ñaëc bieät seõ kích thích söï phaùt trieån. Nuoâi caáy phoâi trong moät theå tích lôùn seõ gaây ra söï pha loaõng laøm giaûm caùc nhaân toá treân daãn ñeán khoâng ñem laïi keát quaû mong muoán. 80µl moâi tröôøng Hình 6: Söï pha loaõng trong nuoâi caáy phoâi ñôn leû vôùi moät theå tích lôùn moâi tröôøng. III.7. Khoâng khí Noàng ñoä oxy trong lumen cuûa voøi fallope thoû laø 2-6%, vaø 8% trong voøi tröùng cuûa chuoät ñoàng, noàng ñoä oxy trong töû cung thaáp hôn so vôùi trong voøi tröùng. Caùc nghieân cöùu treân nhöõng loaøi ñoäng vaät coù vuù khaùc nhau ñaõ chöùng minh raèng nuoâi caáy trong noàng ñoä oxy thaáp (ñaëc bieät laø phoâi cuûa loaøi nhai laïi), laøm taêng cao söï phaùt trieån cuûa phoâi nuoâi caáy trong oáng nghieäm. Moät vaøi nghieân cöùu cho thaáy noàng ñoä oxy thaáp (giöõa 5-8%) laøm taêng cao söï phaùt trieån leân giai ñoaïn phoâi nang ôû chuoät. Noàng ñoä CO2 trong heä thoáng nuoâi caáy coù aûnh höôûng tröïc tieáp leân pH moâi tröôøng. Maëc duø haàu heát moâi tröôøng hoaït ñoäng treân moät daõy roäng pH (7,2-7,4), nhöng toát hôn laø ñaûm baûo ñeå pH khoâng vöôït quaù 7,4. Vì vaäy, thích hôïp nhaát laø söû duïng noàng ñoä CO2 trong khoaûng 5-8%. VIII. ALBUMIN HUYEÁT THANH BOØ – BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) VIII.1. BSA Albumin huyeát thanh laø moät trong nhöõng protein ñöôïc nghieân cöùu roäng raõi nhaát vaø laø protein phong phuù nhaát trong huyeát thanh vôùi noàng ñoä 5g/100ml. Troïng löôïng phaân töû: 68000Da (583 amino acid). pH: 7,0 +/- 0,2. Autocrine Paracrine 20-50µl moâi tröôøng ñöôïc phuû daàu Hình 7: Söï hoã trôï laãn nhau khi nuoâi caáy nhoùmphoâi trong theå tích moâi tröôøng nhoû ñöôïc phuû daàu. VIII.2. BSA vaø söï toång hôïp BSA trong cô theå ñoäng vaät coù vuù Albumin ñöôïc quan taâm chính laø albumin huyeát thanh. Töø albumin ñöôïc söû duïng ñeå moâ taû protein hoaëc nhoùm protein ñöôïc xaùc ñònh tính chaát bôûi tính tan trong nöôùc. Albumin laø protein phoå bieán nhaát trong heä tuaàn hoaøn vaø chieám 80% aùp suaát keo cuûa maùu. Ngöôøi ta ñaõ chöùng minh raèng albumin huyeát thanh chòu traùch nhieäm chính cho vieäc duy trì pH maùu. Albumin cuûa ñoäng vaät coù vuù ñöôïc gan toång hôïp ban ñaàu ôû daïng preproalbumin. Sau khi loaïi boû chuoãi peptide tín hieäu thaønh proalbumin vaø tieáp tuïc loaïi boû 6 propeptide coøn laïi ñeå trôû thaønh albumin. Hình 8: Söï toång hôïp bovine serum albumin (BSA) VIII.3. Thaønh phaàn amino acid trong BSA Albumin ñöôïc caáu taïo bôûi löôïng thaáp tryptophan vaø methionine; löôïng lôùn cystine vaø nhöõng amino acid tích ñieän, aspartic vaø glutamic acid, lysine, vaø arginine. Glycine vaø isoleucine trong BSA thaáp hôn trong protein chuaån bình thöôøng. Ala 48 Cys 35 Asp 41 Glu 58 Phe 30 Gly 17 His 16 Ile 15 Lys 60 Leu 65 Met 5 Asn 14 Pro 28 Gln 21 Arg 26 Ser 32 Thr 34 Val 38 Trp 3 Tyr 21 VIII.4. Ñaëc tính chöùc naêng cuûa BSA VIII.4.1. Taïo boït Baûng 2: Caùc thaønh phaàn amino acid trong BSA Preproalbumin H2N-M-K-W-V-T-F-L-L-L-L-F-I-S-G-S-A-F-S-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E- Proalbumin H2N-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E- Albumin H2N-E-A-H-K-S-E- Caét chuoãi peptide tín hieäu Caét boû chuoãi propeptide Taïo boït ñöôïc ñònh nghóa laø söï taïo vaø giöõ oån ñònh boït khí trong dung dòch. Protein ñöôïc khuyeách taùn vaøo maët phaân caùch giöõa khoâng khí vaø nöôùc vaø laøm giaûm söùc caêng beà maët. Taïi maët phaân caùch chuùng hieän dieän vaø keát hôïp ñeå taïo ra maøng dính keát ñaøn hoài giöõa caùc phaân töû. Vieäc taïo boït vaø oån ñònh ñöôïc caûi thieän khi BSA phaûn öùng vôùi nhöõng protein nhö lysozyme vaø clupeine nhôø vaøo lieân keát cheùo giöõa BSA vaø lysozyme taïi beà maët phaân caùch. BSA tieán tôùi ñieåm ñaúng ñieän khi löïc ñaåy tónh ñieän ôû möùc toái thieåu. Khi noù töông taùc vôùi lysozyme, söï giaûn nôû vaø oån ñònh lôùn nhaát ôû pH 8 vaø 9, giöõa ñieåm ñaúng ñieän cuûa BSA (4,7) vaø lysozyme (10,7) khi caùc protein mang ñieän traùi nhau. Clupeine vôùi pH 12 coù aûnh höôûng nhieàu hôn lysozyme. Lipid öùc cheá söï taïo boït baèng caùch chieám choã cuûa caùc phaân töû protein taïi beà maët phaân caùch vaø phaù vôõ maøng protein. Söï öùc cheá naøy cuûa lipid ñöôïc trung hoaø khi BSA phaûn öùng vôùi clupeine taïi beà maët phaân caùch. VIII.4.2. Khaû naêng ñoâng ñaëc cuûa BSA BSA bò ñun noùng taïo thaønh khoái hoaø tan thoâng qua caàu noái disulphide vaø lieân keát khoâng ñoàng hoùa trò. Alpha-lactalbumin khoâng taïo thaønh khoái hoaø tan nhöng phaûn öùng vôùi BSA qua caàu noái disulphide taïo neân khoái hoaø tan. Khoái hoaø tan nhöõng phaân töû polyme hoaù ñöôïc hình thaønh trong suoát giai ñoaïn ban ñaàu cuûa söï ñoâng protein ñöôïc ñun noùng, vaø söï polyme hoùa tieáp theo sau daãn ñeán söï hình thaønh maïng löôùi gel raén. Vieäc theâm alpha- lactalbumin vaøo BSA laøm giaûm khaû naêng taïo gel cuûa BSA vì bò giôùi haïn bôûi phöùc hôïp ñaøn hoài. Söï ñoâng ñaëc bao goàm 2 böôùc: böôùc khôûi ñaàu goàm söï phôi baøy hoaëc söï phaân ly nhöõng phaân töû protein, sau ñoù laø böôùc keát khoái töùc xaûy ra caùc phaûn öùng lieân keát. Cuoái cuøng laø hình thaønh gel döôùi ñieàu kieän thích hôïp. Ñeå hình thaønh ñöôïc gel vôùi nhöõng tieâu chuaån cao, böôùc keát khoái caàn dieãn ra chaäm hôn vôùi böôùc phaân ly. Nhieät ñoä laøm bieán tính cuûa BSA ôû 620C vaø 640C. Nhieät ñoä laøm bieán tính BSA taêng khi keát hôïp vôùi acid beùo nhöng giaûm khi noù phaûn öùng vôùi clupeine. Vì vaäy, nhöõng phaûn öùng cuûa moät polymer sinh hoïc nhö acid beùo vôùi BSA daãn ñeán laøm oån ñònh phaân töû BSA, trong khi nhöõng phaân töû khaùc nhö clupeine laøm khôûi ñoäng böôùc phaân ly cuûa BSA. VIII.4.3. Phoái töû keát noái Khaû naêng quan troïng nhaát cuûa albumin laø khaû naêng keát noái thuaän nghòch vôùi nhieàu phoái töû. BSA laø chaát vaän chuyeån nhöõng acid beùo khoâng tan trong huyeát thanh. Noù cuõng thöïc hieän nhieàu chöùc naêng khaùc nhö coâ laäp caùc goác oxygen töï do vaø baát hoaït caùc ñoäc toá nhö bilirubin. Albumin huùt maïnh vôùi caùc acid beùo, hematin, bilirubin vaø thu huùt chính vôùi nhöõng hôïp chaát thôm nhoû mang ñieän tích aâm. Noù hình thaønh caùc noái ñoàng hoaù trò vôùi pyridoxyl phosphat, cysteine, glutathione, vaø nhieàu kim loaïi khaùc nhau nhö Cu (II), Ni (II), Hg (II), Ag (II), vaø Au (I). Nhö moät protein vaän chuyeån ña chöùc naêng, albumin laø chaát vaän chuyeån chính hoaëc nguoàn cung caáp oxid nitric. VIII.5. Nhöõng nghieân cöùu veà vai troø cuûa BSA trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät Trong thaønh phaàn hoùa hoïc moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi giai ñoaïn tröôùc laøm toå, huyeát thanh hoaëc protein coù nhöõng chöùc naêng vaãn chöa ñöôïc xaùc ñònh. Maëc duø, BSA thöôøng coù maët trong taát caû moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi chuoät giai ñoaïn tröôùc laøm toå. Naêm 1949, Hammond ñaõ coù nhöõng nghieân cöùu ban ñaàu veà vai troø cuûa caùc ñaïi phaân töû trong moâi tröôøng nuoâi caáy, thaáy raèng phoâi chuoät 8 teá baøo phaùt trieån leân thaønh phoâi nang caàn söï keát hôïp cuûa loøng traéng tröùng trong moâi tröôøng. Nhöõng nghieân cöùu tieáp theo sau cuûa Whitten (naêm 1956), cho laø nhöõng thaønh phaàn thieát yeáu trong loøng traéng tröùng khoâng theå phaân tích ñöôïc. Vì theá naêm 1956 Whitten ñaõ thay theá loøng traéng tröùng baèng BSA keát tinh, töø luùc ñoù vieäc söû duïng loøng traéng tröùng trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñaõ giaûm xuoáng thay vaøo ñoù laø BSA. BSA coù theå coù chöùc naêng dinh döôõng, nhö nguoàn nitrogen hoãn hôïp trong moâi tröôøng nuoâi caáy phoâi. Moät chöùc naêng khaùc laø cung caáp amino acid töï do khi thuyû phaân protein. Trong lòch söû nghieân cöùu, vieäc thay theá BSA baèng caùc ñaïi phaân töû khoâng phaûi laø protein ñaõ xuaát hieän ñaàu tieân khi Brinster (naêm 1965) thieát keá nhöõng thí nghieäm ñeå chöùng minh nhu caàu cuûa nhöõng amino acid ngoaïi sinh trong söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät giai ñoaïn tröôùc laøm toå. Trong nhöõng nghieân cöùu veà nhöõng chaát toång hôïp thay theá cho BSA, Brinster (naêm 1965) ñaõ tìm ra moät soá chaát thay theá cho BSA nhöng vaãn khoâng chöùng minh ñöôïc vai troø dinh döôõng cuûa BSA trong söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 2 teá baøo thaønh phoâi nang. OÂng cho raèng “moät soá aûnh höôûng coù lôïi cuûa BSA vaø nhöõng amino acid naøo ñoù coù theå nhôø vaøo hoaït ñoäng cuûa chuùng nhö nhöõng taùc nhaân baét giöõ, ñieàu hoaø quaù trình oxi hoùa, chaát baûo veä beà maët teá baøo, hoaëc chaát baûo veä enzym”. Nhöõng nghieân cöùu tieáp sau ñoù ñaõ chöùng minh raèng BSA laø moät saûn phaåm raát hay thay ñoåi veà maët hoùa hoïc, thaønh phaàn cuûa chuùng tuøy thuoäc vaøo söï khaùc bieät cuûa caùc phoái töû keát hôïp vôùi caùc ñaïi phaân töû. Nhöõng thí nghieäm vôùi moâi tröôøng thay theá BSA ñaõ thu ñöôïc nhöõng keát quaû khoâng phuøø hôïp. Töø nhöõng thí nghieäm söû duïng PVP150 (polyvinylpyrrolidone – mol.troïng löôïng phaân töû 150 000) thay theá BSA, naêm 1965 cuûa Brinster ñaõ tìm ra raèng phoâi chuoät 2 teá baøo F1 lai xa ñoøi hoûi nguoàn nitrogen hoãn hôïp ñeå coù theå phaùt trieån leân phoâi nang. Nguoàn nitrogen naøy laø BSA, hoãn hôïp amino acid laø thaønh phaàn cuûa BSA bò thuyû phaân do Brinster chöùng minh vaøo naêm 1965, hoaëc glutathionine do Brinster chöùng minh vaøo naêm 1968. Traùi laïi, naêm 1970 Cholewa vaø Whitten cuõng söû duïng PVP thay theá cho BSA ñaõ khoâng theå chöùng minh ñöôïc söï caàn thieát cuûa nguoàn nitrogen hoãn hôïp trong nuoâi caáy phoâi chuoät 2 teá baøo lai F1. Brinster vaø Thomson vaøo naêm 1966 ñaõ chöùng minh phoâi chuoät 8 teá baøo lai xa khoâng ñoøi hoûi nguoàn nitrogen hoãn hôïp ñeå phaùt trieån leân thaønh phoâi nang. Keát quaû thí nghieäm cuûa Biggers, Summers, vaø Ginnis vaøo naêm 1997 cho thaáy: hôïp töû CF1 lai xa phaùt trieån thaønh phoâi nang trong moâi tröôøng KSOM ñöôïc thay theá BSA baèng PVA (polyvinyl alcohol), döôùi ñieàu kieän naøy nguoàn nitrogen chæ laø glutamine. Keát quaû naøy khaùc vôùi keát luaän cuûa Brinster naêm 1965 cho raèng coù söï phaân chia cuûa phoâi giai ñoaïn 2 teá baøo nhöng khoâng coù söï hình thaønh phoâi nang khi glutamine ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng vôùi PVP thay theá cho BSA. Lieäu söï khaùc bieät naøy laø do söï khaùc nhau trong thaønh phaàn cuûa 2 loaïi moâi tröôøng vaãn chöa ñöôïc keát luaän. Keát quaû thu ñöôïc töø thí nghieäm naøy cuõng cho thaáy raèng naêng suaát cuûa phoâi nang nuoâi caáy trong moâi tröôøng KSOM vôùi PVA thay theá cho BSA thaáp hôn roõ raøng so vôùi moâi tröôøng KSOM vôùi BSA. Nhö theá BSA ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng KSOM laøm taêng söï taùc ñoäng hình thaønh phoâi nang. KSOM vôùi PVA thay theá cho BSA ñöôïc boå sung amino acid cuõng laøm taêng söï hình thaønh phoâi nang. Fissore vaøo naêm 1989 ñaõ chöùng minh raèng coù theå loaïi BSA ra khoûi moâi tröôøng nuoâi caáy thay vaøo ñoù laø EDTA. Lyù do BSA laøm taêng söï phaùt trieån phoâi vaãn khoâng ñöôïc bieát roõ raøng, coù theå coù ít nhaát 3 khaû naêng: (1) BSA laøm taêng amino acid ñöôïc boå sung (2) BSA cung caáp nhöõng phaân töû khoâng phaûi amino acid ñöôïc keát hôïp kích thích söï phaùt trieån (3) BSA cung caáp nhöõng chöùc naêng baét giöõ. Naêm 1992, Kiernan vaø Bavister ñaõ chöùng minh moät soá loâ BSA kích thích söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 2 teá baøo trong nuoâi caáy, trong khi moät soá loâ khaùc laïi öùc cheá. Nhöõng nghieân cöùu cuûa Evecen, Alkan naêm 2002 thaáy raèng trong nuoâi caáy phoâi chuoät töø phoâi chuoät 2 teá baøo: vôùi moâi tröôøng M16 vaø moâi tröôøng Whitten noàng ñoä BSA ñöôïc boå sung laø 1mg/ml vaø 3 mg/ml laø toái öu cho söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät 2 teá baøo leân phoâi nang vaø khi noàng ñoä BSA vöôït quaù 10 mg/ml öùc cheá söï phaùt trieån cuûa phoâi chuoät. VII. ÖÙNG DUÏNG THÖÏC TIEÃN Ñaây laø nghieân cöùu vôùi muïc ñích cuoái cuøng laø taïo ñöôïc moät quy trình nuoâi caáy phoâi toái öu vôùi ñieàu kieän thöïc tieán hieân taïi. Nghieân cöùu naøy ngoaøi yù nghóa khoa hoïc ñôn thuaàn coøn coù moät soá öùng duïng thöïc teá trong Nhaân gioáng ñoäng vaät, sinh saûn voâ tính, baûo toàn nguoàn gen … Nhaân gioáng ñoäng vaät Moät quy trình nuoâi caáy phoâi hoaøn chænh laø tieâu chuaån caàn hoaøn thieän ñaàu tieân trong coâng ngheä nhaân gioáng ñoäng vaät vôùi caùc muïc ñích thöông maïi hay baûo toàn gioáng loaøi vôùi caùc kó thuaät tieân tieán hôn nhö vi thao taùc, ñoâng laïnh … Coù ñöôïc moât quy trình nuoâi caáy phoâi hoaøn chænh öùng duïng trong nhaân gioáng gia suùc ñoái vôùi neàn chaên nuoâi Vieät Nam seõ mang ñeán moät nguoàn lôïi kinh teá to lôùn, chaám döùt ñöôï c vaán ñeà leä thuoäc nguoàn gioáng nöôùc ngoaøi, cuõng nhö taïo ñöôïc nguoàn gioáng gia suùc doài daøo trong nöôùc, chuû ñoäng choïn löïa ñöôïc nhöõng ñaëc tính toái öu cuûa nhöõng gioáng gia suùc noäi ñòa. Cuõng nhö baûo toàn ñöôïc nguoàn gioáng trong nöôùc. Khai thaùc teá baøo maàm Ngaøy nay, öùng duïng teá baøo maàm laø voâ cuøng to lôùn, taát