Áp dụng phương pháp vntr - Miru định kiểu gene các chủng micobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam

~ 29 ~ …………………………………………………………………………………………………. 2. Vật liệu và Phương pháp 2.1. Đối tượng nghiên cứu (9): Vi khuẩn lao được thu nhận từ bệnh nhân lao màng não được thu nhận tại bệnh viện lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch và bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam trong khoảng 2000 – 2003. Bệnh nhân lao phổi được thu nhận trong khoảng 2003 – 2004 tại 2 phòng chống lao quận huyện của thành phố Hồ Chí Minh. DNA vi khuẩn được tách chiết từ môi trường Lowenstein-Jensen theo phương pháp cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) và được pha loãng đến nồng độ sử dụng là 15 ng/ml. 2.2. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gene dựa trên VNTR – MIRU Bảng 2.1: Tóm tắt quy trình phân tích kiểu gene vi khuẩn lao Mẫu bệnh phẩm Æ Nuôi cấy Æ Tách chiết DNA vi khuẩn lao Tiến hành PCR với 31 cặp mồi trên 95 mẫu Điện di mao quản Thu thập dữ liệu dưới dạng số các đoạn trình tự lặp lại 1. Phân tích sự tương đồng của kiểu gene 95 chủng 2. Đánh giá khả năng đa dạng allele trên từng locus, khả năng phân biệt kiểu gene nhờ từng cách phối hợp các loci ~ 30 ~ …………………………………………………………………………………………………. 2.2.1. Khuếch đại trình tự đích 2.2.1.1. Nguyên tắc PCR là phương pháp khuếch đại trình tự gene đích đã biết nhờ hoạt động của Taq polymerase, kéo dài cặp mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung DNA mạch khuôn, tổng hợp mạch DNA mới. Phản ứng khuếch đại được thực hiện từ 25-40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm ba bước: - Bước biến tính tách mạch ở 940C - Bước bắt cặp mồi lên trình tự đích, nhiệt độ bước này tuỳ thuộc vào đặc điểm cấu trúc từng cặp mồi, có thể thay đổi trong khoảng 40-700C - Bước kéo dài thường được đặt ở nhiệt độ tối ưu của Taq polymerase, khoảng 720C 2.2.1.2. Tiến hành - Các đoạn mồi dùng trong phương pháp (phụ lục bảng 6.1) - Hỗn hợp PCR có thể được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành thí nghiệm, bổ sung DNA bộ gene; một cách khác là chuẩn bị dung dịch mẹ, chia nhỏ và trữ ở -200C cho đến khi sử dụng. Cần phải sử dụng Qiagen Hotstart Taq Polymerase kit có chứa dung dịch Q. Dung dịch này có chứa betaine, là tác nhân xúc tác cho PCR xảy ra và ức chế sự hình thành các sản phẩm phụ tạo nên thang các sản phẩm khi điện di mẫu. - Thành phần phản ứng Chất phát huỳnh quang Hình 2.1: Một ví dụ tiêu biểu cho giai đoạn khuếch đại sản phẩm. Khuếch đại vị trí ETR-B, trong đó mồi PCR bắt cặp với trình tự DNA đặc trưng ở biên và khuếch đại đoạn lặp lại, tạo ra sản phẩm PCR 292bp. DNA của M.tuberculosis H37Rv có 3 lần lặp lại đoạn trình tự lặp 57bp, và thêm 8 bp ở vùng đầu các đoạn lặp lại. ~ 31 ~ …………………………………………………………………………………………………. - Điều kiện phản ứng Bảng 2.3 : Chương trình phản ứng trong máy luân nhiệt 950C 15 phút 950C 1 phút 550C 1 phút 30 chu kỳ 720C 1 phút 720C 10 phút 2.2.2. Điện di mao quản 9 Mục tiêu sử dụng kỹ thuật điện di mao quản trong kỹ thuật định kiểu gene dựa trên VNTR - MIRU ƒ Cần có độ tin cậy của trong khoảng định lượng kích thước 75-500bp ƒ Phân giải đến mức khác biệt 1bp - 350bp để có thể phát hiện các allele có khác biệt nhỏ Bảng 2.2 : Thành phần PCR trong phương pháp MIRU - VNTR Thành phần phản ứng Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ thành phần phản ứng Thể tích 1 phản ứng (μl) DNA bản mẫu 15 ng/μl 15 ng 1 Dung dịch đệm (HotStart) 10 X 1 X 2 Mồi F (gắn màu) 4 pmol/μl 0,4 μΜ 0,4 Mồi R 20 pmol/μl 0,4 μΜ 0,4 dNTPs (HotStart) 10 mΜ 0,2 mM 0,4 Q-solution 5 X 1 X 4 MgCl2 (HotStart) 50 mM 1,5 mM 1,5 Taq (HotStart) 5 U/μl 0,75 U 0,15 Nước ELGA 9,2 Tổng cộng 18 ~ 32 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 2.2: Quy trình thực hiện điện di mao quản bằng máy ABI 3130xl 1. Nạp mẫu: Nạp hỗn hợp các sản phẩm PCR đã đánh dấu 2. Phân tách: dựa trên kích thước sản phẩm 3. Phát hiện: dựa trên sự phân tách màu các huỳnh quang phát ra 4. Diễn giải: nhờ phần mềm GeneMapper 2 1 Ố ng m ao quản CCD panel, kính lọc spectrograph 3 4 ƒ Phân biệt các màu rõ rệt giữa các thuốc nhuộm khác nhau để tránh sự pha trộn màu giữa 4-5 màu khác nhau ƒ Độ chính xác về định lượng kích thước các mẫu khác nhau cho phép so sánh thang chuẩn với các mẫu khác 9 Nguyên tắc điện di mao quản bằng hệ thống DNA analyzer 3130xl Applied Biosystem Inc. Các đoạn sản phẩm trong mỗi nhóm PCR được nhuộm với 3 loại màu khác nhau, cùng với thang chuẩn chứng nội nhuộm bằng loại màu thứ 4, sau đó được phân tích cùng trong ống điện di mao quản trên máy giải trình tự DNA sequencer theo phương pháp định kích thước. Một loại thuốc nhuộm sẽ được gắn vào một mồi trong cặp mồi bằng liên kết cộng hoá trị, mỗi cặp mồi trải qua phản ứng khuếch đại sẽ sản sinh sản phẩm với kích thước đặc trưng và mang theo thuốc nhuộm chuyên biệt . Thuốc nhuộm sẽ bị kích thích bởi ánh sáng bước sóng 488 nm, nhưng các loại thuốc nhuộm khác nhau sẽ phát ~ 33 ~ …………………………………………………………………………………………………. ra huỳnh quang khác nhau. Thiết bị phân tích bước sóng ở các độ dài sáng nhau sẽ giúp khẳng định sự tồn tại của từng loại huỳnh quang, kích thước sản phẩm mang huỳnh quang. Kỹ thuật này giúp phân tích các đoạn DNA có trùng kích thước phân tử nhưng có nguồn gốc khác nhau, chúng được nhuộm các màu khác nhau. 9 Cách tiến hành thao tác mẫu và thu nhận dữ liệu ƒ Mỗi giếng chứa 1 uL từng loại sản phẩm PCR và 0,3 uL thang ROX 1000 và 10 uL HiDi formamide ƒ Khi từng giếng trong đĩa 96 đã được bổ sung đầy đủ các thành phần, vortex đĩa và spin down (<1500 g trong 5 giây) ƒ Gia nhiệt lên 950C trong 5 phút ƒ Lập tức đặt đĩa vào đá trong 2-5 phút ƒ Vortex đĩa và spin down ƒ Đặt đĩa vào máy và bắt đầu khởi động chương trình 'Data collection' để thu nhận dữ liệu thô với matrix set DS 30 (gồm bộ màu 6-FAM (xanh dương), HEX (xanh lá), NED (vàng), ROX (đỏ, thang chuẩn) ƒ Chương trình nhận diện các đỉnh biểu hiện cho sự xuất hiện của sản phẩm đích ƒ Kính lọc hỗ trợ sự phân tách màu phát ra từ sản phẩm đích 2.2.3. Xử lí thông tin thu nhận được - Đánh giá chất lượng dữ liệu thô ƒ Trục Y biểu diễn đơn vị huỳnh quang một cách tương đối (relative fluorescence units, RFUs). Trục X biểu diễn số lần ghi lại kết quả đọc huỳnh quang. ƒ Đỉnh cần phải nhọn, rõ ràng và nằm trong khoảng 150-4000 RFU ƒ Tín hiệu nền cần phải thấp gần mức 0 - Thang chuẩn: MapMarker 1000 (X-Rhodamine labeled) (BioVentures, Inc.) ƒ Thang chuẩn bao gồm 23 mạch DNA đơn gắn một màu huỳnh quang, trong đó kích thước các thang lần lượt như sau: 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 base pairs. ƒ Cường độ đỉnh của từng thang phải lớn hơn 200 rfu (relative fluorescence units) - Các thông số phân tích: ~ 34 ~ …………………………………………………………………………………………………. ƒ Để không đọc nhầm tín hiệu nhiễu do primer có gắn mồi cần phải đọc kết quả từ scan number (trên trục X) thứ 1000 trở đi ƒ Cường độ tối thiểu để được xác nhận là đỉnh thực sự của 1 thang là từ 150 rfu trở lên - Phân tích dữ liệu: Số lần lặp lại = (Kích thước sản phẩm khuếch đại – Kích thước đoạn biên) / Kích thước đoạn lặp lại - Dữ liệu VNTR được nhập vào phần mềm BioNumerics (v4.0, Applied Maths), phân tích như là biến số gián đoạn (mỗi allele có số lần lặp các đoạn lặp lại liên tục khác nhau) - Phân tích sự tương đồng giữa kiểu gene các chủng tạo thành nhóm dựa trên hệ số tương đồng Pearson Linear Correlation và cách vẽ cây tương đồng UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). Đây là những thông số phù hợp cho bản chất sinh học tiến hóa theo từng bước mất hay thêm các đoạn lặp lại trình tự lặp (1).