Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó

LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các thầy cô đã luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi. PGS. TS. Trần Thị Dân và BSTY. Quách Tuyết Anh đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Th.S. Trần Thị Bích Liên và cô Hồ Thị Nga đã tạo mọi điều kiện và hướng dẫn tôi hoàn thành tốt đề tài. Các thầy cô khoa chăn nuôi thú y đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Chú Bình và các cô chú trong xí nghiệp giết mổ gia súc Nam Phong, quận Bình Thạnh, TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho công việc lấy mẫu. Bạn Nguyễn Văn Út cùng toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường. Chân thành cảm ơn. Tháng 09 năm 2005 Nguyễn Bạch Thảo Vy TÓM TẮT NGUYỄN BẠCH THẢO VY, Đại học Nông Lâm TP.HCM, tháng 9/2005. “ÁP DỤNG QUI TRÌNH NUÔI CHÍN NOÃN IN VITRO TRÊN HEO VÀ CHÓ”. Giáo viên hướng dẫn PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Đề tài được thực hiện trên đối tượng heo và chó. Loài heo đã được nghiên cứu nhiều và cung cấp nguồn noãn dồi dào. Chó là đối tượng có tỉ lệ thành công thấp và nhiều giống chó quí hiếm rất khó sinh sản. Do đó sử dụng kĩ thuật nuôi noãn chín in vitro (in vitro maturation – IVM) và nhằm mục tiêu tạo nguồn noãn có khả năng thụ tinh phục vụ tạo phôi in vitro và dùng vào nhiều mục đích khác nhau. Đề tài gồm 3 nội dung chính: đánh giá buồng trứng heo và chó, kết quả IVM và kinh nghiệm trong IVM cũng như trong nhuộm nhiễm sắc thể. Trên heo, mỗi buồng trứng thu được khoảng 15 nang nhỏ, 6 nang trung bình và 0,8 nang lớn với đường kính nang tương ứng 6 mm và hầu như không có hoàng thể. Chất lượng noãn heo ở hai phương pháp thu noãn (xé và hút) không có sự khác biệt về mặt thống kê. Chất lượng noãn thu được ở từng mức đường kính nang noãn khác nhau thì có sự khác biệt về mặt thống kê, nang trung bình và nang lớn có chất lượng noãn loại A và B nhiều hơn nang nhỏ. Trên chó, mỗi buồng trứng thu được khoảng 3 hoàng thể, 2 nang nhỏ, 0,5 nang lớn với đường kính nang tương ứng là < 2 mm và ≥ 2 mm và 1,04 nang đa noãn. Chất lượng noãn chó theo từng mức chiều dài buồng trứng (< 2 cm và ≥ 2 cm) và từng mức đường kính nang (< 2 mm và ≥ 2 mm) không có sự khác biệt về mặt thống kê. Chất lượng noãn ở nang đơn noãn và nang đa noãn cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Noãn thu được trên chó rất tốt, hầu như không có noãn loại C. Về kết quả IVM trên chó, 3 trong 22 đợt thí nghiệm thành công. Nang noãn nhỏ tỉ lệ thành công khoảng 7 %, nang noãn lớn tỉ lệ thành công khoảng 17 %. Tỉ lệ thành công trên chó khá thấp, nhưng chúng tôi cũng đã rút ra được một số kinh nghiệm trong IVM cũng như trong cách đánh giá noãn chín bằng kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể. SUMMARY NGUYEN BACH THAO VY, Nong Lam University, september 2005. “APPLY THE IN VITRO MATURATION (IVM) IN PIG AND DOG OOCYTES” Guided staff TRAN THI DAN, Ph.D QUACH TUYET ANH, Vet Pig and dog ovaries were chosen in this experiment. There were many studies in in vitro pig oocytes maturation. In vitro dog oocytes maturation has also been discribed in several studies but the success rate was rather low, especially on endangered dog. With IVM technique, we could produce oocytes which have capacity to be inseminated and produce embryoes used for different purposes. There are 3 parts: assessed the pig and dog ovaries, IVM results and experiences on IVM and aceto – orcein staining technique. In pig, we could get 15 small, 6 medium and 0.8 large follicles ( 6 mm in follicle diameter, respectively) per ovary. The differences of oocyte quality in two collected methods (dissection and aspiration) were not significant but in different diameters were significant. In medium and large follicles, there were more A and B oocytes than those in small ones. In dog, we could get 3 luteins, 2 small and 0.5 large follicles (< 2mm and ≥ 2 mm in follicle diameter, respectively) per ovary. The differences of oocyte quality in different ovary lengths (< 2 cm and ≥ 2 cm) and in different follicle diameters (< 2 mm and ≥ 2 mm) were not significant. Oocyte quality in monoovular and in polyovular follicles was also not different significantly. Dog oocytes were good, nearly there were no C oocytes. About IVM in dog, the success rate was rather low, 7 % in small follicles and 17 % in large ones. In this study, we also get some experiences in IVM and staining technique. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAS (Bovine adult serum) huyết thanh bò trưởng thành BSA (Bovine serum albumin) albumin huyết thanh bò COC (cumulus oocyte complex) phức hợp noãn và tế bào hạt tụ CSF (cytostatic factor) yếu tố liên quan đến trưởng thành noãn DPBS (Dubecco’s phosphate buffer saline) môi trường muối đệm Dubecco ECS (estrus cow serum) huyết thanh bò động dục EGF (epidermal growth factor) yếu tố tăng trưởng biểu mô FCS (fetal calf serum) huyết thanh thai bò FSH (follicle stimulating hormone) hormon kích thích nang noãn GH (growth hormone) hormon tăng trưởng GV (germinal vesical) giai đoạn túi mầm GVBD (germinal vesical breakdown) giai đoạn vỡ túi mầm H3 histon 3 (protein có trong nhiễm sắc thể) hCG (human chorionic gonadotropin) kích dục tố của nhau thai người HESPES hydroxyethylpiperazine ethanesulfonic acid (môi trường rửa trứng) hMG (human menopausal gonadotropin) kích dục tố của phụ nữ mãn kinh IVM (in vitro maturation) trưởng thành trong ống nghiệm LH (luteinizing hormone) hormon thể vàng MAP (mitogen activated protein) protein kích hoạt phân bào MI (metaphase I) trung kỳ I MII (metaphase II) trung kỳ II mKRB (modified Krebs Ringer) môi trường nuôi noãn chín Krebs Ringer MPF (maturation promoting factor) yếu tố khởi động trưởng thành NST nhiễm sắc thể PBS phosphate buffer saline PGC (primordial germ cell) noãn nguyên bào PVA polyvinyl alcohol RU (rat unit) đơn vị chuột Ser 10 serine 10 (một acid amin có trong protein histon) SOF (synthetic oviductal fluid) dịch ống dẫn trứng tổng hợp TCM 199 (tissue cultured medium 199) môi trường nuôi cấy mô DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Phân loại noãn sau khi nuôi 27 Bảng 4.1: Số lượng nang noãn thu được trên một buồng trứng heo 29 Bảng 4.2: Phân loại chất lượng noãn heo theo phương pháp lấy 29 Bảng 4.3: Phân loại chất lượng noãn heo theo đường kính nang 30 Bảng 4.4: Số lượng hoàng thể, nang noãn thu được trên một buồng trứng chó 30 Bảng 4.5: Phân loại chất lượng noãn chó theo chiều dài buồng trứng 31 Bảng 4.6: Phân loại chất lượng noãn heo theo đường kính nang 32 Bảng 4.7: Phân loại chất lượng noãn chó trên nang đơn noãn và đa noãn 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Estradiol và estriol 3 Hình 2.2: Progesteron 3 Hình 2.3: Các giai đoạn phát triển của nang noãn 6 Hình 2.4: Nội tiết nang 9 Hình 3.1: Buồng trứng heo 19 Hình 3.2: Buồng trứng chó 19 Hình 3.3: Tủ ấm CO2 20 Hình 3.4: Nang đa noãn trên chó 23 Hình 3.5: Noãn trước và sau khi tách tế bào hạt tụ 25 Hình 3.6: Phân loại noãn trước khi nuôi 26 Hình 3.7: Phân loại noãn sau khi nuôi 27 Hình 4.1: Nang nên lấy và không nên lấy 34 Hình 4.2: Vị trí đặt mỡ bò lên lame 37 Hình 4.3: Nhuộm noãn không đạt giảm phân 37 Hình 4.4: Nhuộm noãn đạt giảm phân 37 Hình 4.5: Thu nang noãn trên heo bằng phương pháp cắt 38 Hình 4.6: Thu nang noãn trên heo bằng phương pháp hút 38 Hình 4.7: Thu nang noãn trên chó bằng phương pháp cắt 38 Hình 4.8: Hình các loại môi trường 39 Hình 4.9: Phương pháp lấy noãn bằng kẹp 39 Hình 4.10: Phương pháp tạo môi trường giọt trên chó 39 MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Sumary v Mục lục vi Danh mục các chữ viết tắt ix Danh mục các bảng xi Danh mục các hình xii 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Buồng trứng 2 2.1.1. Cấu tạo 2 2.1.2. Chức năng nội tiết của buồng trứng 2 2.1.3. Buồng trứng heo và chó 3 2.1.3.1. Buồng trứng heo 3 2.1.3.2. Buồng trứng chó 4 2.2. Nang noãn 4 2.2.1. Đặc điểm hình thái 4 2.2.2. Các giai đoạn phát triển của nang noãn 5 2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn 6 2.2.3.1. Nang noãn heo 6 2.2.3.2. Nang noãn chó 7 2.2.4. Nội tiết của nang noãn 8 2.2.5. Sự trưởng thành của noãn 9 2.2.5.1. Quá trình trưởng thành 9 2.2.5.2. Các chất liên quan 10 2.3. IVM (In vitro maturation) 11 2.3.1. Lịch sử IVM 11 2.3.2. Hệ thống IVM 11 2.3.3. Yếu tố ảnh hưởng IVM 12 2.3.4. Thành phần môi trường IVM 14 2.3.5. Vấn đề và triển vọng IVM 16 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 18 3.2. Nội dung khảo sát 18 3.3. Vật liệu 19 3.3.1. Vật liệu 19 3.3.2. Hóa chất 19 3.3.3. Thiết bị 19 3.3.4. Dụng cụ 20 3.4. Phương pháp 21 3.4.1. Thu nhận buồng trứng tại lò mổ 22 3.4.2. Đánh giá buồng trứng heo 22 3.4.3. Đánh giá buồng trứng chó 23 3.4.4. Chuẩn bị môi trường 23 3.4.5. Tìm và rửa noãn 24 3.4.6. Chuyển noãn vào môi trường nuôi 24 3.4.7. Thu nhận noãn sau khi nuôi 25 3.4.8. Đánh giá phân loại noãn 25 3.4.9. Nhuộm noãn 27 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 28 3.5.1. Trên heo 28 3.5.2. Trên chó 28 3.5.3. Kết quả IVM 29 3.6. Xử lý thống kê 29 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát buồng trứng heo 30 4.1.1. Trung bình số nang noãn 30 4.1.2. Đánh giá noãn theo phương pháp lấy noãn 30 4.1.3. Đánh giá noãn theo đường kính nang noãn 31 4.2. Khảo sát buồng trứng chó 32 4.2.1. Trung bình số hoàng thể, nang noãn 32 4.2.2. Đánh giá noãn theo chiều dài buồng trứng 32 4.2.3. Đánh giá noãn theo đường kính nang 33 4.2.4. Tỉ lệ nang đa noãn trong buồng trứng 33 4.2.5. So sánh noãn trong nang đa noãn và nang đơn noãn 34 4.3. Kết quả về IVM 34 4.3.1. Trên chó 34 4.3.2. Kinh nghiệm trong IVM 35 4.4. Kinh nghiệm trong nhuộm nhiễm sắc thể 36 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 40 5.2. Đề nghị 40 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. PHỤ LỤC