Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh môi trường

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG ----- Báo cáo: THÍ NGHIỆM VI SINH MÔI TRƯỜNG SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516 Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470 Trần Thiên Ân:3009110373 Nguyễn Dũ:3009110440 TP.HCM,tháng 6 năm 2013 MỤC LỤC PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ............................................................................................................ 1 1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: ......................................................................................... 1 1.1. Dụng cụ ......................................................................................................................................... 1 1.2. Thiết bị ...................................................................................................................................... 5 PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH ............................................ 10 2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời ............................................................................................................. 10 2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường ............................................................................................................... 11 2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : ................................................................................................. 12 2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. ................................................................................................... 13 2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. ....................................................................................................... 15 2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu. ......................................................................................................... 18 2.2.7 Phương pháp hộp đổ ............................................................................................................... 19 2.2.8 Phương pháp hộp trải .............................................................................................................. 20 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn ........................................................................................................ 22 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) ............................................................................... 23 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi ................................................................................................ 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG ................................................................... 28 3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose ......................................................................................................... 28 3.1.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 28 3.1.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 28 3.1.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 31 3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor ........................................................................................................ 31 3.2.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 31 3.2.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 31 3.2.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 32 3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá ............................................................ 32 3.3.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 32 3.3.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 33 3.3.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 35 3.4. E.coli,Coliform ................................................................................................................................ 36 3.4.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 36 3.4.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 36 3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: .................................................................................................... 38 3.5.1. Nguyên tắc .................................................................................................................................... 38 3.5.2. Kết quả .......................................................................................................................................... 40 3.5.3. Nhận xét .................................................................................................................................... 41 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 42 4.1. Kết luận ............................................................................................................................................ 42 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................................................... 42 4.3. Bài học kinh nghiệm ........................................................................................................................ 43 Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 1 PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 1.1. Dụng cụ Dụng cụ Hình ảnh Công dụng Đĩa petri Chứa môi trường nuôi cấy VSV. Ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng hay môi trường thạch. Bình tam giác. Chứa môi trường nuôi cấy hay dung môi hóa chất trong pha chế môi trường. Phiến kính và lá kính. Phiến kính:chứa giọt VSV ở trạng thái sống hoặc nhuộm màu khi quan sát bằng kính hiển vi. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 2 Lá kính : dung để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV. Cốc thủy tinh Dùng để chứa cồn, hóa chất… Que trang Trải giọt sinh khối VSV lên bề mặt thạch. Que cấy vòng Ria trên bề mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch hoăc cấy chuyền trên môi trường lỏng Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 3 Đèn cồn Tạo không gian vô trùng, khử trùng các loại que cấy. Micropipette Định lượng một thể tích chính xác VSV, môi trường nuôi cấy hay dung dịch hóa chất. Kính lúp Quan sát các vật có kích thước nhỏ. Phễu thủy tinh. Chuyển dung môi từ dụng cụ chứa này sang dụng cụ chứa kia dùng khi miệng dụng cụ chứa nhỏ. Ống đong. Sử dụng để định mức lượng hóa chất cần dùng với độ chính xác cao. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4 Cối. Nghiền nhỏ mẫu đất. Bình tam giác có nút mài. Dùng để chứa cồn hoặc các loại hóa chất dễ bay hơi trong không khí. Chậu thủy tinh Chứa rác như giấy báo,gang tay, khẩu trang … đã sử dụng. Giá để ống nghiệm Để ống nghiệm tránh vỡ, lăn ra ngoài… Kẹp sắt Dùng để giữ vật mà yêu cầu không sử dụng tay để giữ, vd : giữ phiến kính hơ trên ngọn lửa cồn, tn phân giải xenlulozo… Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 5 Giá để pipet Dùng để để pipet, đũa thủy tinh. Bình tia Chứa nước cất. Bóp cao su Sử dụng hơi để hút hóa chất thông qua pipet. 1.2. Thiết bị Thiết bị Cách vận hành Hình ảnh Nồi hấp khử trùng - Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox ra ngoài. - Cho nước cất vào nồi hấp đến khi ngập con ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục cho giỏ inox lớn vào nồi hấp. - Cho dụng cụ và môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi hấp. - Đóng nắp và khóa van. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 6 - Bật công tắt ở bên hông, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm lần lượt các nút “set” và “start”. - Khi đã có tín hiệu thì mở nồi hấp ra, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ môi trường ra (nếu muốn hạ áp suất của nồi hấp thì mở nắp nồi hấp ) . Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 7 Tủ sấy - Mở cửa tủ sấy cho vật liệu sấy vào và đóng lại ( đẩy thanh tay cầm sang trái để mở, sang trái để đóng). - Cắm nguồn điện chờ 10s rồi mới bật on/off để mở máy. - Nhấn phím “▲▼” để chọn chương trình P3, chờ 5s để xác nhận chương trình đã chọn . - Nhấn phím X/W để cài nhiệt độ sấy( dùng phím “▲▼” để cài nhiệt độ ). - Nhấn phím X/W để cài thời gian sấy ( dùng phím “▲▼” để cài thời gian), nếu chạy liên tục thì để thời gian cài đặt bằng 0. - Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài ở bước 4 và 5. - Khi đạt nhiệt độ sấy màn hình nhấp nháy liên tục hai thông số đã cài đặt, khi thời gian cài đựt về 0 thì kết thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy lấy vật liệu sấy ra. - Vệ sinh tủ sấy Cân điện tử Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 8 Máy lắc ống nghiệm - Cắm điện. - Đặt ống nghiệm lên phần núm đen . + Bật công tắc lên nếu muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual). Nhấn nhẹ và giữ chặt ống nghiệm trong vài giây rồi nhấc ống nghiệm ra. + Bật công tắc xuống nếu muốn sử dụng chế độ lắc liên tục(Continuous) Lò vi ba Bếp điện Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 9 Máy dập mẫu Kính hiển vi quang học - Đặt tiêu bản lên bàn mẫu, dùng kẹp để cố định tiêu bản. - Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát mà ta chọn vật kính thích hợp. - Nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính khi soi vật kính x100. - Điều chỉnh ánh sáng - Điều chỉnh tụ quang - Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính. - Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc chỉnh thô đến khi thấy hình ảnh mờ, tiếp tục điều chỉnh ốc chỉnh tinh đến khi nhìn rõ vật Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 10 PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Rửa sạch lam và lamen o Cho lam và lamen vào chậu thủy tinh o Đổ dd HCl 10% vào và ngâm trong ... phút o Rửa lại bằng nước Sử dụng gang tay, khẩu trang trong quá trình thao tác. Bước 2: cho một giọt sinh khối VSV lên phiến kính. Nếu là nấm mốc thì ta phải cố định bằng một giọt nước. Bước 3: Đặt lá kính lên phiến kính. o Đặt lá kính song song với phiến kính cách phiến kính khoảng 2 cm o Đặt lá kính từ từ xuống phiến kính, dung khăn giấy khô thấm nước tràn ra bên ngoài. Có thể đặt lá kính lên phiến kính bằng cách: đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu, nghiêng một góc 450 và hạ lá kính xuống để có bọt khí Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 11 2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Cân từng thành phần của môi trường  Cân chính xác lượng hóa chất  Tắt hết thiết bị quạt Bước 2: hòa tan từng thành phần của môi trường trong một lượng nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn tất cả các thành phần dinh dưỡng với nhau và thêm nước cho đủ thể tích  Đối với môi trường đặt như agar phải nấu tan chảy xong mới hòa tan các thành phần khác Bước 3: Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa, đóng nút bông, bao gói giấy báo Bước 4: Đặt tiêu bản lên bàn mẫu, điều chỉnh kính hiển vi để quan sát. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12 Bước 4: Hấp tiệt trùng trong nồi hấp và làm nguội tới nhiệt độ thích hợp và gieo cấy vsv  Hấp tiệt trùng ở 121 0 C, trong 15 phút 2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Rửa sạch dụng cụ và hấp khử trùng Bao gói dụng cụ trước khi hấp Bước 2:Cho vào mỗi ống nghiệm 7-8 ml môi trường o Sử dụng gang tay ,khẩu trang trong quá trình thao tác. o Khử trùng tay và khu vực làm thí nghiệm bằng cồn trước khi tiến hành. o Thao tác nhanh, môi trường rất dễ đông . Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 13 Bước 3: Làm nút bông và bịt nắp ống nghiệm Bước 4: Để các ống nghiệm nghiêng <25 0 , phần thạch nghiêng khoảng 1/2-1/3 ống nghiệm. Chờ môi trường đông lại, bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. Chú ý phần thạch cách miệng ống nghiệm 2 cm. Không di chuyển ống nghiệm khi môi trường chưa đông đặc. 2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị 1 ống nghiệm thạch nghiêng có môi trường phù hợp và 1 ống mẫu chứa VSV. Chuẩn bị mẫu VSV phải đúng và phát triển tốt. o Sử dụng khẩu trang trong suốt quá trình cấy. o Khử trùng sạch tay và bàn làm việc. Bước 3: o Tay trái cầm 2 ống nghiệm (ống chứa Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đỏ Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 14 mẫu và ống cấy) o Tay phải cầm que cấy,ngón út và lòng bàn tay của tay phải cầm và giữ nút bông Không để ống nghiệm ở quá xa đèn cồn Bước 4: o Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm chứa vsv o Lấy một ít sinh khối vsv và đậy nút bông lại Để vào thành ống nghiệm cho bớt nóng Không để đầu que cấy chạm vào miệng và thành ống nghiệm Bước 5: o Mở nút bông ở ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm o Rồi đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzăc từ dưới kéo về hướng miệng ống nghiệm Tránh để vỡ thạch. Không ria nhiều lần. Bước 6: o Rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm o Đóng nút bông lại o Khử trùng que cấy và để Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 15 vào giá Bước 7 : Dán nhãn, bao gói, bảo quản. 2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. 2.2.5.1. Kỹ thuật hộp ria. Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị o Petri chứa môi trường thạch o Ống nghiệm chứa vsv cần cấy,nút bông bằng gạc o Dụng cụ cần thiết (que cấy, cồn, đèn cồn, bông,…) Petri không bị nhiễm sv khác Bước 2: Dùng bông gòn thấm nước thấm cồn sát trùng tay và mặt bàn chuẩn bị cấy. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 16 Bước 3: Dùng máy lắc, lắc đều ống nghiệm chứa VSV Giữ chặt ống nghiệm tránh làm rơi ra ngoài. Bước 4: o Để petri gần đèn cồn o Tay trái cầm ống nghiệm chứa VSV vừa lắc xong, tay phải cầm que cấy, dùng ngón tay út mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn Đặt petri và ống nghiệm gần ngọn lửa đèn cồn trong phạm vi < 15cm Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 17 Bước 5: o Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ. o Đưa que cấy vào giữa ống nghiệm chứa VSV lấy một ít sinh khối VSV. o Khử trùng miệng ống nghiệm, tiệt trùng nút bông và đóng bông ống nghiệm và để que cấy trong không gian vô trùng. o Tay trái mở nắp petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch, đậy nắp petri lại o Để que cấy vào miệng ống nghiệm cho bớt nóng. o Chú ý thao tác cẩn thận để không làm vỡ thạch. Bước 6: o Khử trùng que cấy khi cấy ria xong và để vào giá đựng o Ghi tên sinh viên, môi trường, tên VSV lên đĩa petri và bao gói lại bảo quản. Bao gói cẩn thận bảo quản để không bị nhiễm sv khác Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 18 2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu.  Với mẫu nước Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Hút 10ml mẫu cho vào bình tam giác đã có 90ml nước cất Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta có được mẫu có độ pha loãng 10-1 Bước 2: Dùng pipette vô trùng hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất. Lắc đều ta được mẫu có độ pha loãng 10 -2 Làm tương tự như trên đến khi đạt nồng độ yêu cầu.  Với mẫu đất Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị mẫu đất, dùng cối giã đất nhuyễn ra, cân 10g cho vào bình tam giác có chứa 90ml nước cất. Lắc đều mẫu,ta được nồng độ 10 -1 . Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 19 Bước 2: Lắc đều bình tam giác chứa mẫu, dùng pipette hút 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất. Lắc đều dung dịch ta được mẫu có nồng độ pha loãng 10 -2 . Tiếp tục thực hiên như các bước trên ta sẽ được nồng độ theo yêu cầu. 2.2.7 Phương pháp hộp đổ Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị o Pha chế môi trường cần sử dụng để cấy o Petri, pipette,bao gói giấy báo và đem hấp khử trùng Bước 2: o Khử trùng tay và nơi làm việc bằng đèn cồn o Dùng pipette đã hấp khử trùng hút 1ml dịch vsv cho vào đĩa petri vô trùng chưa có môi trường o Mẫu chứa vsv phải dược lắc đều trước khi hút o Sử dụng găng tay và khẩu trang trong suốt quá trình thao tác thí nghiệm Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 20 Bước 3: Đỗ khoảng 15 – 0ml môi trường nóng chảy ở 450C vào đĩa petri đã cấy giống vsv, đậy nắp đĩa petri Đặt đĩa petri lên mặt phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa petri theo 2 chiều ngược nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần để dịch vsv dàn đều ở mặt đáy của đĩa petri và trộn đều trong môi trường cấy Xoay đều đĩa petri để vsv dàn đều và mặt thạch bằng phẳng. Các thao tác phải được thực hiện trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa đèn cồn). Bước 4: Để đông tự nhiên gần ngọn lửa đèn cồn Dán tên sinh viên ,môi trường, VSV,…lên đĩa petri Đợi môi trường đông, lật ngược đĩa petri lại, bao gói và đem bảo quản ở nhiệt độ thích hợp 2.2.8 Phương pháp hộp trải Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: o Sử dụng các đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị trước o Chuẩn bị dụng cụ và nút bông o Hấp khử trùng dụng cụ Khử trùng tay và bàn làm việc bằng cồn Sử dụng găng tay và khẩu trang trong suốt quá trình tiến hành Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 21 Bước 2: Dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch vsv lên bề mặt môi trường thạch đĩa trong không gian vô trùng Hút trong không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn Bước 3: o Nhúng đầu que trang vào cốc thủy tinh chứa cồn 70 0, đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. o Mở đĩa petri, dùng que trang gạt và xoay đều giọt vsv trên bề mặt thạch Trong khi gạt,xoay đĩa petri tới lui 3 – 4 lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch vsv trải đều khắp trên bề mặt môi trường Thao tác cấy được thực hiện trong không gian vô trùng Bước 4: o Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa,úp ngược petri o Dán nhãn, bao gói, bảo quản ở nhiệt độ thich hợp cho từng vsv mục tiêu Bao gói kỹ và bảo quản đúng thời gian và nhiệt độ Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 22 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chọn 1 phiến kính sạch,cố định vsv bằng cách cho 1 giọt sinh khối vsv trải đều lên phiến kính, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi khô Hơ đến khi khô nhưng không để cháy. Bước 2: Cho 1 giọt lớn phẩm nhuộm đơn (methylene blue) lên vết VSV đã cố định để trong 5 phút Cho giọt dầu đủ lớn để lắp giọt VSV. Bước 3: Hơ lại trên ngọn lửa đèn cồn, để yên khoảng 2 – 3 phút, dùng bình tia rửa sạch,tiếp tục hơ khô, đặt lam kính lên Không hơ cháy Rửa vừa phải cẩn thận tránh để vsv trôi theo nước Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 23 cedre lên vết nhuộm, dưa lên bàn mẫu, điều chỉnh kính hiển vi và quan sát đến khi thấy rõ ảnh 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Cho 1 giọt sinh khối vsv lên phiến kính sạch, hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn Không để quá gần ngọn lửa làm cháy vết bôi Bước 2:Nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh o Nhỏ 2 giọt methyl violet lên vết bôi giữ 30 giây o Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm rồi hơ khô Không rửa trôi hết vsv Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 24 Bước 3: o Nhuộm vết bôi bằng dung dịch Lugol o Nhỏ 2 giọt I2/KI lên vết bôi, để 1 phút o Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm đến khi mất hết màu và hơ khô Sử dụng khẩu trang khi tiến hành thí nghiệm Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 25 Bước 4: o Nhỏ 2 giọt sarafin lên vết bôi, để yên 30 giây o Rửa vết bôi bằng nước, hơ khô o Nhỏ 2 giọt dầu soi kính lên vệt bôi o Đưa lên bàn mẫu chỉnh kính hiển vi và quan sát Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 26 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Kiểm tra kính hiển vi: o Cắm điện, bật công tắc đèn kiểm tra o Kiểm tra ốc,vật kính còn tốt, còn sử dụng được không o Kiểm tra vật kính, lau sạch nếu thấy còn bẩn Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 27 Bước 2: o Đặt tiêu bản đã chuẩn bị trước lên bàn mẫu o Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật sau cho mẫu vsv phải nằm trong vùng thị trường o Hạ tụ quang,đóng bớt chắn sang sao cho nhìn rõ đươc hình ảnh o Tùy loài vsv mà sử dụng vật kính thích hợp (10X,40X,100X) o Dùng ốc chỉnh thô, điều chỉnh cho vật mẫu lên sát vật kính cho đến khi thấy được ảnh vsv o Dùng ốc chỉnh tinh vặn chỉnh để thấy rõ ảnh vsv o Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính lớn hơn và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh Chọn vật kính thích hợp để quan sát từng loài vsv Bước 3: o Sau khi quan sát xong, tắt đèn,hạ bàn mẫu xuống o Lấy tiêu bản ra khỏi bàn mẫu o Vệ sinh các vật kính và bàn mẫu cho sạch o Đem cất giữ khi sử Vệ sinh sạch kính để sử dụng cho lần học tiếp theo Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 28 dụng xong PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG 3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose 3.1.1. Nguyên tắc - Cellulose (C6H10O5)n là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Hằng năm có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc dù là chất cao phân tử, khá bền, chúng vẫn bị phân giải dưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ ẩm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau. - Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa lớn trong quá trình xử lý môi trường. - Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose. Dưới tác dụng của enzyme này, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C12H22O11) lại tạo thành glucose (C6H12O6) nhờ tác dụng của enzyme celloblase. - Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. 3.1.2. Kết quả - Kết quả phân tích : Tính kết quả: Số tế bào/g = N x x n x K=26 x x 10000 x 1= 26.10 5 (tế bào/g) N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào) V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10-4 n=10000) K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1) Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 29 Khuẩn lạc Kích thước Màu sắc Mức độ phân giải Số khuẩn lạc Vi khuẩn đỏ 10-20mm Đỏ 5/10 13 Vi khuẩn trắng 3-5mm Trắng 2/10 5 Vi nấm 5-10mm Đen 3/10 8 - Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ - Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được - Hình ảnh vi nấm phân giải cellulose, mô tả chi tiết Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 30 Hình: Vi sinh vật phân giải cellulose ở môi trường Hutchinson Hình: vi nấm cellulose Nấm tập trung thành từng nhóm nhỏ, mỗi chấm là một khuẩn lạc Màu sắc: xanh,đen tầm 0,5-2mm Hình dạng: chấm tròn nhỏ Có khoảng 26 tế bào trên một đĩa với độ pha loãng 10-4 Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 31 3.1.3. Nhận xét: - Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu. - Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường để tận dụng hết bề mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy . - Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài. 3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor 3.2.1. Nguyên tắc - Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyển hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoị vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác nhau. - Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Ca3(PO4)2 . Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt. 3.2.2. Kết quả Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3 - Nồng độ pha loãng 10-2: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được. - Nồng độ pha loãng 10-3: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có những vòng phân giải trong suốt . - Kết quả phân tích : Tính kết quả: Số tế bào/g = N x x n x K=76 x x 10 3 x 1 = 76.10 5 Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 32 N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào) V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1) - Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chi tiết 3.2.3. Nhận xét: - Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm vi sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử khuẩn của đèn cồn. - Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn. - Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm khác để hoàn thiện bài báo cáo. 3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 3.3.1. Nguyên tắc - Quá trình nitrit hoá NH4 + dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO2 - gọi là quá trình nitrit hoá. NO2 - sẽ tác dụng với dung dịch Griss I và Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng. - Quá trình nitrat NH4 + dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO3 - gọi là quá trình nitrat hoá. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hoá tạo sản phẩm nitrit NO2 - và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO3 - . Xác định sự hiện diện của NO3 - bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dich có màu xanh. - Quá trình phản nitrat hoá. Là quá trình khử NO3 - qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng của vi sinh vật. Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí. Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phần nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thể hiện sự hình thành các bọt khí trong môi trường nuôi cấy. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 33 3.3.2. Kết quả 3.3.2.1. Vi khuẩn amon trong môi trường lỏng: - Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau:  Sự đục môi trường  Sự tạo bông, cặn  Sự nổi váng trên bề mặt - Phản ứng sinh hoá:  Sự biến đổi màu sắc của giấy thử pH: giá trị pH  Sự biến đổi màu của giấy lọc thấm acetate chì  So sánh mẫu đối chứng Độ pha loãng Đục môi trường Tạo bông Tạo cặn pH Màu giấy lọc tẩm acetate Mẫu đối chứng     Mẫu thí nghiệm     Trước Sau Hình : ống nghiệm amon hóa Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 34 Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của giấy pH - Sau vài ngày,trong quá trình nuôi cấy không ngừng sinh ra bọt khí và trên bề mặt môi trường có một lớp bọt khí. Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO3 - và sinh ra khí N2. 3.3.2.2. Vi khuẩn nitrat hoá: - Phản ứng định tính nitrit: Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng. Nhỏ 1 giọt dung dịch Griess I, Griess II : màu hồng - Chọn ống nghiệm dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. - Mô tả,so sánh các hình thái tế bào vi khuẩn quan sát được về: hình dạng,khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 35 Hình: Sự đổi màu của vi khuẩn Nitrat 3.3.2.3. Vi khuẩn phản Nitrat hoá: 3.3.3. Nhận xét: - Ở quá trình phản nitrat hóa : NO3 - được khử đến N2O và N2. Sự giải phóng N2 là sản phẩm ưu thế của quá trình phản nitrat. Vì N2 hòa tan ít trong nước,do đó chúng có Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 36 khuynh hướng thoát ra ngoài như các bong bóng nổi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trên bề mặt môi trường nên không khí bên ngoài không vào được và nito bên rong môi trường cũng không thoát ra ngoài được. Trong quá trình thí nghiệm cần thao tác cẩn thận tránh để không khí bên ngoài vào. - Ở quá trình nitrat hóa: sự đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động của vi khuẩn mạnh. 3.4. E.coli,Coliform 3.4.1. Nguyên tắc - Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable number). - Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy nồng độ thập phân; 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm có môi trường thích hợp có ống Durham bẫy khí. Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. - Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm, đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 3.4.2. Kết quả Nồng độ Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Kết quả + + + + + + + + + 3 3 3 Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 37 Nồng độ Mẫu Nồng độ 10-1 Nồng độ 10-2 Ống 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Kết quả + + + + + + + + + 3 3 3 Hình ảnh Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 38 Hình ảnh E.coli Do mẫu bị nhiễm vi sinh vật nên không có kết quả và hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi Coliform Làm tiêu bản và hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi Hình: nhuộm đơn Coliform 3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: 3.5.1. Nguyên tắc 3.5.1.1. Nguyên tắc xác định Clostridium - Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 39 Những loài thuỷ giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic axid, butyric acid mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết các giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuyy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh. - Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1-2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2 - ) và ion (Fe2 + ) có trong môi trường. 3.5.1.2. Nguyên tắc xác định Streptococcus phân - Streptococcus phân (Feacal Streptococcus) là các liên cầu khuẩn, có nguồn gốc từ phân, có hình cầu hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các ;oài này sống hiếu khí tuỳ ý nhưng phát triển tốt trong điều kiện kị khí, tiết bacteriocin trong quá trình tang trưởng và có thể ức chế sự tang trưởng của các vi khuẩn khác. Streptococcus được dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân của môi trường nước. - Có thể xác định Septoccus phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc hoặc phương pháp MPN. - Phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu được cấy trên bề mặt môi trường chọn lọc, sau khi ủ đếm khuẩn lạc đặc trưng và khẳng định các khuẩn lạc đã đếm bằng các thử nghiệm sinh hoá. Trong trường hợp nghi ngờ có sự hiện diện của Streptococcus phân nhưng có thể bị tổn thương, tiến hành hồi phục các vi khuẩn này bằng cách cấy mẫu vào trong môi trường không chọn lọc, ủ ở 37 o C trong 2 giờ, sau đó phủ lên một lớp môi trường chọn lọc, các đĩa môi tường sau khi cấy được ủ ở 44oC trong khoảng 48 giờ. - Phương pháp MPN Dịch mẫu được cấy vào môi trường canh Azide Glucose. Stretococcus phân có khả năng sinh trưởng trong môi trường này, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Tất cả các ống cho kết quả dương tính sẽ được cấy tiếp sang môi trường khẳng khác. Môi trường khẳng định được sử dụng Bile Esculine Agar. Streptococcus phân thuỷ phân esculine trong môi trường tạo ra sản phẩm cuối cùng là 6,7-hydroxycoumarin, chất này kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 40 khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, việc khẳng định còn được thực hiện bằng thử nghiệm bằng thử nghiệm catalase. 3.5.2. Kết quả - Mỗi mẫu nước trong bề aerotank, SBR thực hiện làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Mẫu ban đầu 2h 4h 6h Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 41 8h - Chụp hình vi sinh vật Mẫu 0h Mẫu 4h Mẫu 2h Mẫu 8h 3.5.3. Nhận xét - Mẫu nước thải ban đầu rất ô nhiễm, mẫu nước có màu đen, có mùi hôi kho chịu - Sau khi cho sục khi thì mẫu nước trong hơn , cặn lơ lửng ít và lắng xuống đáy như hình 2 - Tiếp tục làm như vậy ta được hình 3,4,5 màu nước trong, không có mùi, ít cặn lơ lửng, các bông cặn lớn dần và bị lắng xuống thành bùn Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 42 - Từ đó cho thấy, khi cho sục khí vào thì xuất hiện các vi sinh vật trong nước thải hoạt động, và nhờ đó mà chất lượng nước đã thay đổi - Nước thải càng sục khí lâu thì càng có nhiều vi sinh vật và kích thước lớn - Có ít vi sinh vật trong mẫu quan sát. - Có những vi sinh vật hình bầu dục có thể di chuyển nên không chụp lại được hình ảnh của chúng - Máy ảnh chụp không rõ nét - Kính hiển vi cũ nên hình ảnh soi được không đẹp - Không thể xác định được số lượng vi sinh vật và tên của chúng. PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau môn học sinh viên nắm được các bước tiến hành của từng thí nghiệm. Có kinh nghiệm trong việc thưc hành. Nội dung bài liên kết với nhau dễ hiểu. Nội dung thí nghiệm các phương pháp và các bước tiến hành được trình bày kĩ. Các thiết bị thí nghiệm có một số khuyết điểm rõ ràng. Nhiều bài không tiến hành được các thí nghiệm nghiên cứu và kiến thức chuyên môn còn hạng hẹp các nhận định trong bài chỉ mang tính chất dự đoán, định tính mà không có kết quả chính xác. Do đó kết quả nhóm đưa ra chưa chuẩn xác. Rất mong được sự góp ý sữa chữa của thầy để kiến thức của sinh chúng tôi thêm hoàn thiện. Tuy kết quả chưa cao nhưng chúng tôi biết cách thao tác thí nghiệm và kiểm nghiệm kiến thức 4.2. Kiến nghị Nếu trường có đầy đủ các dụng cụ thí nghiệm, phòng học bộ môn thì sinh viên sẽ suy nghĩ và làm việc độc lập nhằm phát triển hơn về năng lực cá nhân của sinh viên Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 43 4.3. Bài học kinh nghiệm Trong quá trình rèn luyện khả năng làm thí nghiệm thực hành nhóm đã rút ra một số kinh nghiệm sau: • Khi làm thí nghiệm phải nắm được mục đích thí nghiệm. • Nắm chắc các bước tiến hành thí nghiệm. Thao tác thí nghiệm cẩn thận chính xác. Tránh tình trạng làm đi làm lại nhiều lần làm mất tính thuyết phục. • Dự đoán kết quả trước khi làm thí nghiệm để sau đó tiến hành thí ngiệm rồi so sánh kết quả. • Sinh viên tự biết bố trí thí nghiệm và thấy được kết quả làm ra. • Sinh viên tự biết khám phá kiến thức, tự tìm kiến thức trong tâm cho mình để ghi nhớ để tránh việc ghi nhớ máy móc mà hiểu sâu về vấn đề hơn, khả năng diễn đạt rõ ràng. (Hình ảnh các thành viên trong nhóm) Họ và tên Hình ảnh Ngô Thái Bảo Trần Thị Hồng Cẩm Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 44 Trần Thiên Ân Nguyễn Dũ Nhóm 1 Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 45