Báo cáo Thực hành môn công nghệ Protein - Enzyme

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------  ------ BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Sinh viên thực hiện : Đinh Hoàng Yến Lớp : K55 - CNSHB Mã sinh viên : 550513 Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thành Trung Hà Nội, 2012 2 Bài g à r o i ion I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. - Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký. - Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein trong mẫu. – h ng h 1. r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): chung: - Sắc ký là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp và được tiến hành lần đầu bởi nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. - Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh là hợp chất có khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit). - Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh). - Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Hóa sinh.Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký ái lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp. - Trước tiên, chất cần phân tích sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu. - Sau đó, các ion đã trao đổi được chiết rút riêng biệt bằng phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy. Có thể tách chiết bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên chất phân tích bị mất điện tích. b) : - Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. - Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi. Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra. - Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích). - Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất 3 định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl- cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. c) - Có độ phân giải cao. - Đa dạng. - Dễ dàng tiến hành. 2. g (Gel-Filtration Chromatography): Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio- gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0,1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. 3. i Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột. 4 Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. 4. ỏng o : Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh. C h ng h h Sắc ký k nước, sắc ký đảo pha, sắc ký đẳng điện, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký màng, sắc ký nền mở rộng III – h ng h g à r o i ion: Sự tinh sạch của protein rất quan trọng và được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó, sắc kí là một phương pháp phân tách quan trọng trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Có nhiều phương pháp sắc kí như sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí ái lực… g (Gel-Filtration Chromatography): Là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Sắc kí lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel. Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa trên sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, 5 chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước. Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Phương pháp lọc phân tử trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng các dung môi thích hợp, các phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt sephadex bị trương phồng, còn các chất có khối lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là các protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt shephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Vì vậy, ta có thể tách được chất có khối lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có khối lượng phân tử nhỏ. 2 h ng h í r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): Dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme, hay phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein tan được trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh anion hoặc chất cation. Đây là những chất giá trơ, không tan tròn nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện. Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó. Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại. Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định 6 lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme. IV – Tiến hành hí nghiệm C dung dị h ệm: - Đệm phosphate 0.1M, pH 7.5. - Dung dịch NaCl 2M (dung dịch gốc) dùng để pha các nồng độ muối 0.1M, 0.25M, 0.5M, 1M (pha loãng trong đệm phosphate). 2. Chuẩn bị gel: - Cân 6g sephadex G75 ngâm trong 60 ml đệm phosphate. (dùng cho sắc kí lọc gel). - Cân 8g DEAE sephadex A 25 ngâm trong 500ml đệm phosphate ( lượng đệm sử dụng để ngâm gấp 10 lần thể tích sẽ nở được) (dùng cho sắc kí trao đổi ion). - Làm nở gel trong nhiệt độ thường ủ 1- 2 ngày hoặc 2h ở 100ºC hoặc hấp 121ºC trong 30 phút. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4- 25ºC. 3 Nhồi ộ g Rửa và tráng sạch cột rồi dựng cột thẳng đứng trên giá. Tráng qua cột bằng đệm rồi đóng khóa phía dưới cột. Khuấy nhẹ hòa đều gel đổ từ từ vào cột (cần chú ý tránh tạo bọt trong gel và gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng một lúc. Mở khóa để đệm chảy ra và để gel lắng dưới tác dụng của áp suất trong cột. Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến thể tích mong muốn. 4. C n ng g (equilibration): Sau khi nhồi xong cột gel phải được cân bằng lại, với gel sắc kí lọc gel cân bằng bằng đệm phosphate, với sắc kí trao đổi ion cân bằng bằng đệm phosphate có bổ sung NaCl. Cho đệm chảy từ từ vào cột, tháo van để dung dịch đệm cân bằng ra ngoài. 5. G n m u ên ộ (Binding): Sử dụng mẫu protein nấm mốc đã được tủa bằng ethanol. Cho lớp dịch đệm chảy đến sát mặt gel. Dùng pipet hút mẫu cần tách cho từ từ vào cột. 6. T h rử ộ ( u ion) Với sắc kí lọc gel: Cho đệm phosphate chảy qua từ từ và thu các phân đoạn protein (từ 1- 2 ml) cho đến khi đến khi OD280 của dịch rửa khoảng thấp và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa. Với sắc kí trao đổi ion: Cho đệm phosphate có bổ sung muối NaCl với các gradient nồng độ 0,1M, 0,25M, 0,5M, 1M và 2M mỗi nồng độ NaCl cho chạy ½ hoặc 1 thể tích cột (khoảng 20ml) chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h đến khi OD280 của dịch rửa khoảng thấp và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa. Thu liên tục dịch chảy ra từng phân đoạn vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống thu 1  2 ml. Tiến hành đo OD280 từ các ống thu được. 7 Từ kết quả thu được (OD280) của các phân đoạn, tiến hành vẽ đồ thị, xác định các phân đoạn có nồng độ protein cao có thể đem xác định một số hoạt tính sơ bộ hoặc hoạt độ. 7 T i inh g (r g n r ion) Với sắc kí lọc gel cho rửa bằng đệm phosphate. Với sắc kí trao đổi ion: Phụ thuộc vào bản chất của mẫu, tái sinh thường được rửa bằng đệm ion mạnh (ví dụ: NaCl 1M hoặc 2M) hoặc/ và giảm hoặc tăng pH, theo đệm sử dụng cân bằng trong gắn mẫu. Trong một số trường hợp cần phải rửa sạch cột có thể bằng ethylene glycol hoặc ethanol. 8 Bảo quản Khi không sử dụng thêm 0,05% NaN3 vào cột gel bảo quản ở 4- 8ºC. C yếu ảnh h ng ến ế quả - Độ dài cột sắc ký. - Tổng thể tích cột gel. - Tốc độ dòng chảy. - Bản chất hạt gel. - Nồng độ cột gel và sự phân bố của hạt gel trong cột. - Độ dài cột sắc ký. - Môi trường pH trong cột. - Sự phân bố điện tích bề mặt của protein. - Bản chất các ion trong dung dịch. - Các chất được thêm vào như: dung môi hữu cơ… - Đặc tính của chất trao đổi. IV – Kế quả hí nghiệm g Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) 1 0,066 16 0,038 31 0,334 2 0,076 17 0,034 32 0,322 3 0,108 18 0,062 33 0,294 4 0,048 19 0,056 34 0,286 5 0,026 20 0,076 35 0,252 6 0,026 21 0,122 36 0,238 7 0,020 22 0,134 37 0,218 8 0,024 23 0,190 38 0,238 9 0,018 24 0,220 39 0,244 10 0,020 25 0,256 40 0,264 11 0,194 26 0,278 41 0,158 8 12 0,040 27 0,308 42 0,162 13 0,046 28 0,326 43 0,166 14 0,028 29 0,338 15 0,076 30 0,326 Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký lọc gel 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ống nghiệm OD 2 80 (A ) OD280 (A) 2 r o i ion Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) 1 0,272 16 0,028 31 0,212 2 0,110 17 0,020 32 0,210 3 0,112 18 0,041 33 0,195 4 0,106 19 0,116 34 0,192 5 0,126 20 0,106 35 0,294 6 0,482 21 0,120 36 0,070 7 0,067 22 0,128 37 0,223 8 0,241 23 0,158 38 0,191 9 0,123 24 0,106 39 0,163 10 0,066 25 0,101 40 0,208 11 0,002 26 0,096 41 0,099 12 0,005 27 0,088 42 0,133 13 0,046 28 0,290 14 0,041 29 0,109 15 0,021 30 0,155 9 Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký trao đổi ion 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ống nghiệm O D 2 80 (A ) OD280 (A) V – Nhận xé , Trong g - Ta thấy có 4 đỉnh nhọn protein, nhưng chỉ có 2 đỉnh đầu là khả năng phân tách tốt. - Phần đáy không trùng với điểm không, chứng tỏ có những mẫu không đồng nhất một loại protein. - Ở các ống 29, 30, 31, giá trị đo ở ống 30 nhỏ hơn với 2 ống 29 và 31, có thể do lỗi ở máy đo. 2 Trong r o i ion - Ta thấy có 5 đỉnh protein, nhưng chỉ 2 đỉnh đầu là độ phân tách tốt. - Chỉ có ống nghiệm 11 và 12 thì giá trị OD280 gần với giá trị 0 nhất, ở đó nồng độ protein gần như bằng 0. - Từ ống nghiệm thứ 13 trở đi thì giá trị đo OD lên xuống không còn theo quy luật nữa. 3 Nguyên nh n - Trong quá trình thí nghiệm, cột sắc ký chuẩn bị không được tốt. - Protein vẫn còn lẫn tạp. - Dòng chảy protein ra ngoài không đều. - Khi để protein chảy nhanh ra ngoài thì dễ lẫn các protein với nhau. - Máy đo OD cũng có khả năng sai sót thông số. 10 - Nồng độ protein trong ống nghiệm phân bố không đều nên khi đo OD giá trị nhiều lúc thay đổi. 11 Bài X ịnh nồng ộ ro in ng h ng h h nh u (Biur , Lowry, Br dford) I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên biết và giải thích được nguyên lý của các phương pháp xác định nồng độ protein khác nhau. - Xây dựng đồ thị đường chuẩn của các phương pháp khác nhau. - Biết cách xác định hàm lượng protein dựa vào đồ thị đường chuẩn. II – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Biur : Phương pháp Biuret là phương pháp đơn giản nhất để định lượng protein. Phương pháp này nhạy cảm với thành phần amino acid của protein. Độ nhạy của nó là hằng số tương đối cố định từ protein này đến protein khác. Do tiến hành đơn giản và cho kết quả nhanh chóng, nó được sử dụng để định lượng protein chiết xuất thô với khoảng nồng độ lớn. Ngoài ra, phương pháp này còn có thể được sử dụng để xác định nồng độ protein trong quá trình tinh sạch. Nguyên lý của nó dựa trên liên kết giữa ion đồng (Cu2+) với peptide của protein trong môi trường kiềm để tạo thành màu tím hay xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm. Cường độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với số lượng liên kết peptide (- CO – NH -) trong chuỗi polypeptide. Hó hấ : - Thuốc thử Biuret: 1.5 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5 H2O) và 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6 4 H2O). Hòa tan trong 500 ml nước cất. Thêm 300 ml NaOH 10%. Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích 1 lít. Bảo quản trong lọ tối. - Cân 100 mg BSA (albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 10 mg/ml. Bảo quản ở 4ºC. Chỉ dùng trong 2 tuần. 2. Lậ ồ thị ờng chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như bảng sau: Bảng : Lập đồ thị đường chuẩn BSA STT BSA 10 mg/ml ml H2O (ml) Thuốc thử Biuret (ml) Nồng độ protein (mg/ml) 1 0.0 1.0 4 0 2 0.2 0. 8 4 2 3 0.4 0. 6 4 4 4 0.6 0.4 4 6 5 0.8 0.2 4 8 12 6 1.0 0.0 4 10 Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Giá trị OD540 của các ống nghiệm từ 2 – 6 sau khi trừ đi giá trị OD540 của ống 1 sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn). 3 X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Biur : Enzyme ngoại bào được tách chiết từ nấm mốc nuôi trên môi trường xốp. 10g mẫu (cả môi trường và nấm mốc) được cho vào ống falcon 45ml và 30ml nước cất vô trùng, vortex, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút lấy dịch trong. Tiếp tục lọc dịch bằng giấy thấm. Thu được 26 ml dịch chiết enzyme ngoại bào. Bảo quản ở - 20°C. Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu và 4 ml thuốc thử Biuret, lắc đề, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh. Do OD ở bước sóng 540 nm. Lấy giá trị OD540 của mẫu trừ đi OD540 của ống nghiệm thay mẫu bằng nước cất rồi chiếu vào đồ thị chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu. D ng ồ hị ờng huẩn Nồng độ protein (mg/ml) OD540 2 0.003 4 0.012 6 0.024 8 0.034 10 0.039 Đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret) y = 0.0047x - 0.0058 R2 = 0.9848 0 0.01 0. 0.03 0.04 0.05 2 4 6 8 10 Nồng độ protein (mg/ml) OD 54 0 OD540 Linear (OD540) 13 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret): y = 0,0047x - 0,0058 Trong đó: x: là nồng độ protein (mg/ml) y: là giá trị OD540 (A) Kế quả hí nghiệm - Các mẫu đều đã được pha loãng 2 lần trước khi đo OD. Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD540 (A) 0,310 0,311 0,322 Nồng độ protein (mg/ml) 134,383 134,809 139,489 Nồng độ protein (µg/ml) 134383 134809 139489 Nhận xét: - Giá trị OD540 của mẫu vượt ra xa ngoài giá trị OD540 trên đường chuẩn cho nên nồng độ protein có được nhờ tính toán khả năng chính xác không cao. III – Định ợng nồng ộ protein b ng h ng h Lowry: Phương pháp định lượng protein của Lowry là phương pháp được sử dụng rộng rãi để xác định chính xác nồng độ protein. Phương pháp này là một sự kết hợp của phản ứng Biuret và phản ứng Folin-Ciocalteau. Bước đầu phản ứng, protein liên kết với ion đồng trong môi trường kiềm. Bước tiếp theo, phức chất đồng-protein (chủ yếu là protein chứa amino acid nhóm tryptophan và tyrosine) khử hỗn hợp phosphomolipden – phosphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. Hó hấ : - Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 ml nước cất. - Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Citrate (1%) hoặc trong dung dịch Natri Kali Tartrate 1%. - Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi dùng). - Thuốc thử Folin – Ciocalteu của Merck, trước khi dùng pha loãng để có nồng độ bằng 1 N. - Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/ml. 2 X y d ng ờng huẩn B A Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn. 14 Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn. STT BSA (1 mg/ml) (µl) H2O (ml) Nồng độ protein (µg/ml) 1 20 0.98 20 2 40 0.96 40 3 60 0.94 60 4 80 0.92 80 5 100 0.90 100 6 120 0.88 120 - Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm. - Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm. Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. 3 X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Lowry: Sử dụng enzyme ngoại bào nấm mốc như phương pháp Biuret. Thay vì lấy 0.5 ml dung dịch BSA chuẩn, lấy 0.5 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm. Các bước tiếp theo làm tương tự như cách xây dựng đồ thị chuẩn đã trình bày ở trên. Ghi lại giá trị OD660. L u Để đảm bảo độ chính xác, nếu hàm lượng protein trong mẫu quá lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp hoặc nước cất trước khi định lượng. Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. D ng ồ hị ờng huẩn Nồng độ protein (µg/ml) OD660 20 0.060 40 0.105 60 0.153 80 0.173 100 0.206 120 0.271 15 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Lowry): y = 0,002x + 0,023 Trong đó: x: là nồng độ protein (μg/ml) y: là giá trị OD660 (A) Kế quả hí nghiệm - Các mẫu MT1X và MT2Đ được pha loãng 2 lần, còn mẫu MC7 được pha loãng ra 10 lần trước khi đo OD. Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD660 (A) 0,304 0,325 0,196 Nồng độ protein (µg/ml) 281 1510 173 Nhận xét: - Giá trị đo OD660 của mẫu vượt quá giá trị OD660 của đường chuẩn không nhiều nên nồng độ protein tính được có thể chấp nhận. IV – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Br dford: Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng protein trong một mẫu nghiên cứu dựa vào máy đo quang phổ. Phổ biến nhất trong số đó là các phương pháp đo độ hấp thụ trực tiếp ở vùng ánh sáng tử ngoại (UV), Lowry, Smith copper và Bradford. Ở đây trình bày phương pháp Bradford vì có nhiều ưu điểm: nhanh, nhạy, chính xác và ổn định. Tuy nhiên cũng giống với các phương pháp khác, Bradford cũng phụ thuộc vào thành phần axit amin của phân tử protein và ngưỡng nồng độ của protein có trong mẫu. Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion (màu xanh da trời). Dưới điều kiện axit mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở trạng thái bị proton hóa do bị gắn 2 H+ hoặc còn gọi là cation 16 có màu đỏ. Ở trạng thái này Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 470 nm. Tuy nhiên, khi gắn với protein, nó chuyển sang dạng ổn định ở trạng thái không bị proton hóa (unprotonated) hay còn gọi là anion và có màu xanh da trời. Trong quá trình phản ứng tạo phức với protein có 2 dạng tương tác hóa học xảy ra. Dạng cation (màu đỏ) chuyển các điện tử tự do của nó vào các nhóm có thể ion hóa có trong phân tử protein dẫn đến việc bộc lộ một số vùng kị nước trong phân tử protein. Những vùng này sẽ phản ứng với vùng không phân cực của Coomassie G thông qua lực van der Waals (giữa các nhóm amin mang điện tích dương và nhóm mang điện tích âm của chất màu ở khoảng cách rất gần nhau). Liên kết này đồng thời cũng được giữ ổn định thêm bởi sự tương tác ion giữa 2 nhóm này. Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chứa hỗn hợp protein và thuốc thử được đo ở bước song 595 nm. Độ hấp thụ ánh sáng tỉ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu. Hàm lượng protein có trong mẫu sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn albumin. Chú Về bản chất phương pháp Bradford không xác định số lượng các liên kết peptide mà đo sự có mặt của một số amino acid nhất định, chẳng hạn như arginine. Người ta cho rằng arginine chịu trách nhiệm trong việc gắn thuốc thử Bradford với protein. Ngoài ra các amino acid mang gốc kị nước (hydrophobic amino acid) cũng phản ứng với thuốc thử này. 1. Dung dịch thu c thử Bradford 5X: Hòa tan 100 mg (0,1 g) Coomasie Blue trong 50 ml Ethanol tuyệt đối (99,99%). Bổ sung 100 ml axit phosphoric (H3PO4 85%). Hỗn hợp được khuấy đều 10 phút trong tủ hút sau đó bổ sung nước cất cho đến thể tích 200 ml (nếu cần có thể lọc). Chia nhỏ thành các lọ nhỏ hơn và bảo quản trong tối. Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch thuốc thử Bradford thành 1X (pha loãng 5 lần từ dung dịch gốc). Chẳng hạn lấy 10 ml Bradford 5X, bổ sung 40 ml nước cất sẽ có 50 ml dung dich thuốc thử 1X. Thuốc thử 1X chỉ sử dụng trong ngày. 2 Vậ iệu: - Dung dịch protein - Albumin - Các dung dịch đệm 3 Chuẩn ị: - Mẫu protein cần xác định hàm lượng - Dung dịch thuốc thử Bradford - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm và các hóa chất cần thiết Tiến hành hí nghiêm: a) Xây dựng đồ thị chuẩn: 17 Pha dung dịch gốc BSA 10 mg/ml (cân 10 mg BSA hòa tan hoàn toàn trong 1 ml nước cất). Từ dung dịch gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần (xem bảng). (*) Ống s 5: lấy 00 µ dung dịch từ ng s 4, b ung hêm 00 µ H2O (**) Ống s 6: lấy 00 µ dung dịch từ ng s 5, b ung hêm 00 µ H2O X y d ng ờng chuẩn: Chuẩn bị một dãy các ống nghiệm sạch, đánh số trên thành ống Lần lượt cho vào các ống nghiệm các hóa chất theo bảng sau: Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 (Đối chứng) BSA từ các dung dịch chuẩn (μl) 100 100 100 100 100 100 100 ml H2O Bradford 1X (ml) 5 5 5 5 5 5 5 H2O (μl) 0 0 0 0 0 0 100 Hàm lượng protein có trong mỗi ống nghiệm (mg) 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125 0 Để tăng độ chính xác của đường chuẩn, tương ứng với mỗi nồng độ chuẩn BSA nên lặp lại 3 lần (sử dụng 3 lần nhắc lại hoặc 3 ống nghiệm cho 1 lần). Sau khi trộn đều, các ống nghiệm được để trong tối ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm. Vẽ đường chuẩn bằng Excel sử dụng kết quả đo được. Trong đó trục tung là giá trị OD, trục hoành là hàm lượng protein. Tuyến tính hóa thành phương trình tương quan giữa hàm lượng protein và OD. Các hóa chất Ống eppendorf 1 2 3 4 5 6 H2O (µl) 420 450 460 950 * ** Nồng độ BSA gốc 10mg/ml (µl) 60 50 40 50 * ** Tổng thể tích (µl) 480 500 500 1000 * ** Nồng độ cuối cùng (mg/ml) 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125 1 2 3 4 5 6 7 8 18 b) Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford: Giả sử có một mẫu protein chứa biết hàm lượng. Thay vì lấy 100 µl dung dịch BSA chuẩn, lấy 100 (µl) dung dịch protein cho vào ống nghiệm. Bổ sung 5 ml thuốc thử Bradford (1X). Các bước tiếp theo làm tương tự như cách xây dựng đồ thị chuẩn đã trình bày ở trên. Ghi lại giá trị OD. L u Để đảm bảo độ chính xác, nếu hàm lượng protein trong mẫu quá lớn cần phải pha loãng với dung dịch đệm phù hợp hoặc nước cất trước khi định lượng. c) Cách tính hàm lượng: Cách tính: Sau khi đối chiếu giá trị OD thu được với đường chuẩn sẽ tính được nồng độ protein tương ứng của mẫu cần phân tích. Hàm lượng protein tính được là số mg protein có trong X µl mẫu phân tích. 5. D ng ồ thị ờng chuẩn: Nồng độ protein (µg/ml) OD595 0.125 0.006 0.25 0.017 0.5 0.081 0.8 0.129 1 0.188 1.25 0.256 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Bradford): y = 0,222x – 0,032 Trong đó: x: là nồng độ protein (μg/ml) y: là giá trị OD595 (A) 19 6. Kết quả hí nghiệm: - Các mẫu đều được pha loãng 2 lần trước khi đo OD. Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD595 (A) 0,156 0,136 0,154 Nồng độ protein (µg/ml) 1,694 1,514 1,676 Nhận xét: - Giá trị OD595 của mẫu nằm trong giá trị OD595 của đường chuẩn nên có thể chấp nhận kết quả tính toán nồng độ protein của mẫu. IV – Nhận xé hung Mẫu MT1X MC7 MT2Đ Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Biuret) 134383 134809 139489 Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Lowry) 281 1510 173 Nồng độ protein (µg/ml) (phương pháp Bradford) 1,694 1,514 1,676 Từ bảng tổng kết trên ta thấy: - Nồng độ protein tính toán được ở các mẫu sai khác nhau rất lớn. - Nồng độ protein tính được trong phương pháp Biuret và Bradford khá ngang nhau, còn trong phương pháp Lowry thì lại chênh lệch khá lớn. N yê â - Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm. - Phản ứng của mỗi loại protein trong mỗi phương pháp lại khác nhau. - Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn. - Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn. - Máy đo OD không chuẩn. 20 Bài Điện di ro in rên g o y ry mid I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích được vai trò của các hóa chất và bản chất của quá trình điên di protein. - Có thể thao tác điện di protein. II – Nguyên iện di - Dựa trên chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch khi được đưa vào điện trường. - Các phân tử trong điện trường chuyển động với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào: Điện tích Hình dạng Kích thước - Phương pháp đã được phát triển mạnh để tách chúng. - Phương pháp khác đơn giản và nhanh, được sử dụng để phân tích và tách: Các phân tử rất lớn như: protein và acid nucleic. Các phân tử tích điện khác nhỏ hơn như đường, acid amin, peptide, nucleotide, các ion đơn giản. - Các phương pháp phát hiện có độ nhạy cao đã được phát triển để ghi và phân tích các kết quả tách. – Điện di ro in rên g o y ry mid - SDS-PAGE (sodium dodeafl sulphate – polyacrylamide gel electrophoresic): điện di biến tính phá cấu trúc. - Tách protein dựa trên KLPT (MW). - Khi tách bằng SDS-PAGE, sự di động được xác định không phải do điện tích của chuỗi polypeptide, mà do khối lượng phân tử (MW). - SDS là một chất tẩy anion gây biến tính protein bằng cách bao quanh bộ khung polypeptide khiến phân tử duỗi thẳng. - Mỗi phân tử SDS sẽ cung cấp hai điện tích âm, các phân tử protein sẽ được tích điện tỉ lệ với khối lượng phân tử của chúng (hay chiều dài của mạch). - Khi được xử lý bằng SDS và chất khử, các protein đều có dạng hình cầu tích điện âm với cùng số điện tích trên một đơn vị chiều dài. - Độ phân giải của SDS-PAGE là rất lớn: các phức hợp có thể được tách thành hàng trăm vệt băng trên gel. 21 - Vị trí của băng dọc theo giếng cho biết giá trị gần đúng về kích thước và lượng protein trong mẫu (căn cứ vào độ bắt màu sau khi nhuộm), dựa vào đó có thể đánh giá về: Độ sạch Mức độ biểu hiện Điện chuyển miễn dịch Chuẩn bị phân tích trình tự Tạo các kháng thể nhờ SDS-PAGE III – Chuẩn ị hó hấ : A. Mẫu protein: Các mẫu protein đậu tương, amylase nước bọt, amylase khoai lang. B. Chuẩn bị các dung dịch. 1. Đ ( ff 4X 500 , H 8,8 - 1,5 M Tris HCl pH 8,8 - 0,4% SDS Cách pha: - Tris base (KLPT 121,14) 90,83 g - H2O 400 ml - Chỉnh pH 8,8 sau đó mới bổ sung SDS - 10 % SDS 20 ml - Dẫn nước đến 500 ml 2. Đ ô ( ff 250 , H 6,8 - 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 - 0,4% SDS Cách pha: - Tris base 15,14 g - H2O 200 ml - Chỉnh pH 6,8 sau đó mới bổ sung SDS - 10 % SDS 10 ml - Dẫn nước đến 250 ml 3. Đ ẫ 4X ( ff (10 10 ml 20 ml Nồng ộ X 0,5 M Tris pH 6,8 5 ml 10 ml 0,25 M, pH 6,8 SDS 0,6 g 1,2 g 6 % Glycerol 4 ml 8 ml 40 % Bromopjenol Blue 1% 0,4 ml 0,8 ml 0,04 % H2O 8 ml 16 ml 22 Sau khi hòa tan các chất, chia nhỏ ra các ống eppendorf, bảo quản – 200C. 4. Đ ạy d 10X ( ff 1 í H 8,3 - 10X SDS Laemmli Running Buffer (0,25 M Tris, 1.92 M Glycine, 1 % SDS, pH 8,3). Cách pha: - Tris base 30,2 g - Glycine 144 g - SDS 10 g - Hòa tan trong H2O, chỉnh pH 8,3 rồi dẫn nước đến 1 lit. 5. D dị y d (30% T, 0,8% 200 - Acrylamide 58, 42 g - Bis-acrylamide 1,6 g - H2O dẫn từ từ đến 200 ml 6. D dị ộ - Coomassie R250 1 g - Glacial acetic acid 100 ml (10%) - Methanol 400 ml (40%) - H2O 500 ml Tổng số 1000 ml 7. Dung dịch tẩy (Destaining solution) - Methanol 150 ml (15%) - Acetic acid 100 ml (10%) - H2O 750 ml Tổng số: 1000 ml 8. ẩ ị d dị - 10% SDS 10 g SDS/ 100 ml H2O (Bảo quản ở nhiệt độ thường) - 10% APS 10 g APS / 100 ml H2O (Bảo quản ở 4 0C trong vài tuần) IV – Đ g iện di: - Lắp ráp hệ thống điện di theo chỉ dẫn của giáo viên hướng dẫn - Trộn các thành phần theo bảng sau: - Thực hiện các bước theo chỉ dẫn của giáo viên hướng dẫn 23 1. ( , 2 ả Thành hần V Acrylamide (12 %) H2O (ml) 2,19 1,5 M Tris HCl pH 8,8 (ml) 1,5 29:1 Acrylamide:Bis (ml) 2,5 10 % APS (l) 3,25 TEMED (l) 5 T ng hể í h ml 6,19825 ml 2. Gel ô ( , 2 ả Thành hần V Acrylamide (5 %) H2O (ml) 2,32 0,5 M Tris HCl pH 6,8 (ml) 1 29:1 Acrylamide:Bis (ml) 0,68 10 % APS (l) 16 TEMED (l) 8 T ng hể í h ml 4,024 ml V – Điện di protein: - Sau khi gel đã chuẩn bị xong, lắp vào máy, đổ đệm điện di ngập bản gel. - Hút một lượng thể tích mẫu protein (1V), cho vào ống eppendorf sau đó bổ sung 4V đệm mẫu (sample buffer), trộn đều. Đun trong nước sôi 5 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Lưu ý: lượng protein (µg) cho vào mỗi giếng điện di từ 5- 10 µg (tùy thuộc vào nguồn protein). Có thể ly tâm sau khi đun sôi mẫu để loại bỏ cặn. - Cho mẫu vào giếng điện di. - Lắp nguồn, chạy điện di theo sự chỉ dẫn của giáo viên hướng dẫn. VI – Nhuộm à ẩy ản g iện di: - Sau khi chạy điện di hoàn tất, lấy bản gel ra khỏi 2 tấm kính. - Cho vào dung dịch nhuộm. - Lắc trong vòng 1 giờ sau đó lấy bản gel ra và tẩy theo chỉ dẫn. - Quan sát kết quả, chụp ảnh. VII – Kế quả à nhận xé 1. ả Có tất cả 12 giếng và các mẫu đổ vào các giếng thứ tự là: 24 Giếng Mẫu Giếng Mẫu Giếng Mẫu 1 5 Tag 9 GFP 2 6 VK (xử lý 95o) 10 VK (xử lý 95o) 3 GFP 7 VK (ecoli) 11 BSA 4 BSA 8 VK (chưa biết) 12 VK (chưa biết) Trong đó, giếng 3, 4 đổ 1 μl, còn các giếng còn lại đổ 5 μl. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 N - Băng điện di bị lệch. 25 - Các vệt băng đều bị mờ, chỉ có thể thấy rõ nhất là vệt băng BSA. - Cuối vệt băng rơi loe ra hai bên. - Trên vệt băng có những khoảng trắng, bản gel không đều. - Chỉ nhìn rõ vệt băng BSA thể tích 5 μl. 3 N yê â - Bộ đổ bản gel các ốc hơi trượt nên vặn không được chắc, tấm đệm chắn dưới đáy hơi dãn nên không còn khít chặt được nên bản gel hơi lệch. - Thao tác trong lúc đổ gel không chuẩn, hơi chậm dẫn đến bản gel đông không đều nên có một số đường trắng trên bản điện di. - Tiến hành pha hóa chất hơi chậm nên thời gian hóa chất ở ngoài không khí hơi lâu. - Xử lý các mẫu điện di chưa tinh sạch, còn lẫn tạp chất, mẫu VK (chưa biết) khi nhỏ vào giếng hơi nhớt. - Khi lấy mẫu chất nhỏ vào giếng thì do sơ sót nên còn lấy mẫu ở đáy ống nghiệm. 4 ộ ô d a) BSA: - Gồm 607 acid amin. - Số dư lượng acid amin: 585 - Trọng lượng phân tử: 66463Da (= 66,5 kDa) - Điểm đẳng điện trong nước ở 25oC: 4,7 - Hệ số tuyệt chủng: 43824 M -1 cm -1 279 nm - Kích thước: 140 x 40 x 40 3 (dài ra ellipsoid tại a b c) b) GFP (green fluorescent protein) (protein huỳnh quang màu xanh lá cây): - Gồm 238 acid amin - Trọng lượng phân tử: 26,9 kDa