Bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối bằng màng BC hấp phụ nisin có nguồn gốc từ Lactococcus lactis

öï nhieân, phaàn lôùn vi khuaån toång hôïp polysaccharide ngoaïi baøo ñöôïc duøng nhö maøng bao voøng quanh teá baøo, maøng BC laø moät ví duï.Nhöõng teá baøo vi khuaån sinh toång hôïp cellulose ñöôïc baãy beân trong maïng löôùi polymer. Maïng löôùi naøy laø vaät choáng ñoõ cho quaàn theå vi sinh vaät luoân ôû beà maët tieáp giaùp giöõa moâi tröôøng loûng vaø khoâng khí. Heä thoáng löôùi polymer laøm cho caùc teá baøo coù theå baùm chaët treân beà maët moâi tröôøng vaø laøm teá baøo thu nhaän chaát dinh döôõng moät caùch deã daøng hôn so vôùi khi teá baøo ôû trong moâi tröôøng loûng khoâng coù maïng löôùi cellulose. Nhôø vaøo tính deûo vaø tính thaám nöôùc cuûa caùc lôùp cellulose maø teá baøo vi khuaån khaùng laïi nhöõng thay ñoåi baát lôïi trong moâi tröôøng soáng nhö giaûm löôïng nöôùc, thay ñoåi pH, xuaát hieän caùc chaát ñoäc vaø caùc vi sinh vaät gaây beänh. Caùc vi khuaån A.xyllinum coù theå taêng tröôûng vaø phaùt trieån beân trong lôùp voû bao. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn nhaän ra raèng cellulose baûo veä teá baøo vi khuaån döôùi taùc ñoäng cuûa tia UV, khoaûng 23% caùc teá baøo vi khuaån sinh acid acetic ñöôïc bao boïc bôûi maøng BC coù khaû naêng soáng soùt sau 1 giôø chieáu xaï tia UV. Vieäc loaïi boû lôùp maøng bao naøy seõ laøm giaûm bôùt khaû naêng soáng soùt cuûa chuùng, chæ coøn 3% [15]. . Con ñöôøng sinh toång hôïp BC. Sinh toång hôïp BC laø moät tieán trình bao goàm nhieàu böôùc ñöôïc ñieàu hoøa moät caùch chuyeân bieät vaø chính xaùc, lieân quan ñeán moät löôïng lôùn enzyme, caùc chaát xuùc taùc vaø protein ñieàu hoøa. Tieán trình naøy bao goàm söï sinh toång hôïp urdine diphosphoglucose (UDPGIc), tieàn chaát cuûa cellulose, tieáp ñeán laø söï polymer hoùa glucose vaøo moãi chuoãi -1,4-glucan vaø söï keát hôïp caùc sôïi môùi vaøo daûi (ribbon), ñöôïc hình thaønh töø haøng traêm, thaäm chí haøng ngaøn sôïi cellulose rieâng leû. Trong quaù trình sinh toång hôïp cellulose vi khuaån, UDPGIc ñöôïc xem laø tieàn chaát cuûa cellulose. Ñaàu tieân glucose ñöôïc phosphoryl hoùa thaønh glucose-6-phosphate, phaûn öùng naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi glucokinase, tieáp theo ñoù phaûn öùng isomer hoùa glucose-6-phosphate thaønh glucose-1-phosphate ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme phosphoglucomutase. Sau ñoù, enzyme UDPGIc pyrophosphorylase xuùc taùc phaûn öùng chuyeån glucose-1-phosphate thaønh UDP-glucose, tieàn chaát cuûa cellulose. Cuoái cuøng, UDP-glucose ñöôïc chuyeån thaønh cellulose nhôø xuùc taùc cuûa enzyme cellulose sythase [15, 16]. Hình 1.4. Con ñöôøng sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån Acetobacter xylinum [1]. Tröùng vòt muoái Qui trình saûn xuaát tröùng vòt muoái Tröùng vòt Röûa saïch Laøm raùo Phaân taùch Ngaâm Vôùt ra, röûa saïch Röûa laàn 1 baèng coàn Röûa laàn 2 baèng nöôùc muoái Loøng ñoû Saáy khoâ beà maët Bao goùi Saûn phaåm Loøng traéng Dung dòch muoái 12% T0C = 650C Thôøi gian: 24h T0C = 800C Thôøi gian: 10 - 15 phuùt Maøng BC haáp phuï nisin Sô ñoà 1.1. Quy trình saûn xuaát loøng ñoû tröùng vòt muoái [4]. Tieâu chuaån tröùng vòt muoái Saûn phaåm tröùng vòt muoái ñöôïc ñaùnh giaù theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67. Yeâu caàu kyõ thuaät Nguyeân lieäu chính vaø phuï: Tröùng: tröùng töôi coù hình baàu duïc, voû tröùng saïch khoâng dính baån, coù muøi hôi tanh cuûa tröùng. Chieàu cao buoàng khí khoâng quaù 9mm. maøng khoâng bò raùch. Loøng traéng, loøng ñoû coøn toát, chöa coù hieän töôïng gì hö hoûng. Muoái: muoái khoâ saïch, khoâng coù taïp chaát. Chæ tieâu vi sinh vaät: khoâng ñöôïc pheùp coù vi sinh vaät gaây beänh vaø khoâng coù hieän töôïng hö hoûng do vi sinh vaät gaây ra. Chæ tieâu hoùa lyù: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 1 Baûng 1.3. Baûng chæ tieâu hoùa lyù. Teân chæ tieâuYeâu caàuLoaïi 1Loaïi 2Khoái löôïng quaû khoâng thaáp hôn55g50gHaøm löôïng muoái aên (Natri clorua) tính theo %4 - 7 [14]. Chæ tieâu caûm quan: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 2 Baûng 1.4. Baûng chæ tieâu caûm quan Teân chæ tieâuYeâu caàuMuøi vòTröùng ñaõ luoäc chín coù muøi hôi ñaäm maën töï nhieân cuûa tröùng muoái. Khoâng ñöôïc coù muøi vò laïLoøng ñoûLoøng ñoû nguyeân veïn, hình caàu, coù maøu vaøng ñoû vaø raén, khoâng cho pheùp bò vöõa, bò aùm ñen, coù nhöõng tia maùu [14] Caùc nghieân cöùu trong vaø ngoaøi nöôùc veà öùng duïng bacteriocin vaø maøng BC haáp phuï bacteriocin ñeå baûo quaûn thöïc phaåm Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Traàn Thò Töôûng An (2006), böôùc ñaàu nghieân cöùu söû duïng maøng moûng BC haáp phuï bacteriocin cuûa Lc. lactis ñeå baûo quaûn thòt sô cheá toái thieåu. Keát quaû coù theå baûo quaûn thòt töôi 3 ngaøy baèng maøng moûng BC haáp phuï dòch thoâ bacteriocin 200 AU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng thòt theo tieâu chuaån TCVN 7046 : 2002[1]. Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009), ñaõ khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch bacteriocin vaøo maøng BC ñeå baûo quaûn möïc moät naéng. Keát quaû coù theå baûo quaûn möïc moát naéng 13 ngaøy baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin tinh saïch 200 IU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng möïc theo TCVN 5649:1992 vaø TCVN 5289:1992. Thôøi gian baûo quaûn möïc moät naéng ñöôïc keùo daøi theâm 8 ngaøy so vôùi maãu ñoái chöùng [7]. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc Siragusa vaø cs (1999) ñaõ keát hôïp nisin vaøo trong maøng polyethylene duøng ñeå bao goùi chaân khoâng thòt boø töôi. Hoaït ñoäng cuûa nisin trong maøng bao giuùp choáng laïi Lactobacillus helveticus vaø B. thermosphacta ñöôïc caáy vaøo treân beà maët moâ cuûa thòt. Sau 20 ngaøy baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh thì maãu ñöôïc bao boïc baèng maøng coù chöùa nisin coù maät ñoä B. thermosphacta thaáp hôn maãu ñoái chöùng (khoâng coù nisin) [33]. Scannel vaø cs (2000) ñaõ tìm hieåu khaû naêng haáp phuï nisin vaø lacticicin 3147 vaøo maøng cellulose ñeå baûo quaûn phomai vaø thòt jambon. Ñaàu tieân, khi khaûo saùt khaû naêng haáp phuï cuûa hai bacteriocin noùi treân thì ngöôøi ta nhaän thaáy raèng lacticicin 3147 khoâng coù khaû naêng haáp phuï toát vaøo maøng, trong khi ñoù nisin laïi coù khaû naêng thaám vaøo maøng raát toát vaø coù theå oån ñònh trong voøng 3 thaùng trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh. Ngöôøi ta bao goùi phomai vaø thòt jambon baèng phöông phaùp MAP vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh ñeà laøm maãu ñoái chöùng. Ñoái vôùi maãu thí nghieäm, ngöôøi ta thöïc hieän bao goùi vôùi maøng cellulose coù haáp phuï nisin. Söï keát hôïp nisin vôùi maøng cellulose ñaõ laøm giaûm soá löôïng L. innocula xuoáng coøn 1.5 log10 CFU/g sau 12 ngaøy baûo quaûn (trong khi soá löôïng ban ñaàu coù trong maãu laø 2 – 4 x105 CFU/g. Vaø soá löôïng teá baøo S. aureus 1.5 log10 CFU/g trong phomai vaø 2.8 log10 CFU/g trong phomai. Nghieân cöùu naøy caøng cho thaáy tính hieäu quaû trong vieäc keát hôïp bacteiocin trong maøng bao thöïc phaåm ñeà keùo daøi thôøi gian baûo quaûn [32]. Coma vaø cs (2001) ñaõ haáp phuï nisin vaøo trong maøng bao aên ñöôïc coù nguoàn goác töø cellulose ( maøng hydroxypropylmethylcellulose). Nhöõng khaûo saùt cho thaáy maøng coù theå choáng laïi söï phaùt trieån cuûa L. innocua vaø S. aureus, nhöng vieäc theâm vaøo chaát phuï gia ñeå taêng khaû naêng thaám nöôùc cuûa maøng laø stearic acid seõ laøm giaûm khaû naêng khaùng khuaån cuûa nisin. Nghieân cöùu naøy ñaõ ñaùnh daáu khaû naêng öùng duïng nisin keát hôïp maøng bao aên ñöôïc vaøo lónh vöïc thöïc phaåm [19]. Hudaa Neetoo vaø cs (2007) ñaõ nghieân cöùu tieàm naêng cuûa nisin keát hôïp vôùi maøng bao plastic söû duïng trong baûo quaûn caù hoài. Nghieân cöùu cho thaáy khi uû caù hoài vôùi maät ñoä ban ñaàu laø 5 x 102 CFU/cm2 Listeria monocytogene ñem uû trong maøng bao coù nisin vôùi hoaït tính 2000IU/cm2 vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä 100C hay 40C. Keát quaû cho thaáy, maãu uû vôùi nisin 2000IU/cm2 thì giaûm ñi 3,9 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng (khoâng chöùa nisin) sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C. Coøn maãu uû vôùi nisin 500IU/cm2 thì giaûm 0.5 ñeán 1,7 laàn sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C [24]. Young-Min Kim vaø coäng söï (2000) ñaõ söû duïng hai loaïi bacteriocin laø nisin vaø lacticicin NK24 haáp phuï vaøo maøng coù maät ñoä polyethylene thaáp keát hôïp vôùi 2% polyamide. Caùc chaát phuï gia cuõng ñöôïc theâm vaøo nhö sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët ñeå laøm taêng hieäu quaû cuûa vieäc haáp phuï vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa bacteriocin treân maøng. Vi sinh vaät chæ thæ ñöôïc söû duïng laø Micrococcus flavus ATCC 10240. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy söï haáp phuï nisin vaøo maøng bao hieäu quaû hôn lacticicin NK24. Hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa maøng bao haáp phuï bacteriocin khoâng bò aûnh höôûng ñôn leû bôûi ñoä haáp phuï cuûa bacteriocin, vaø baûn chaát töï nhieân beân trong cuûa dung dòch choáng laïi vi khuaån laø nhaân toá quan troïng trong vieäc kieåm soaùt söï gia taêng cuûa vi sinh vaät. Söï keát hôïp cuûa sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët khoâng laøm caûi thieän khaû naêng haáp phuï cuûa nisin vaøo maøng vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa nisin treân maøng [35].  CHÖÔNG 2: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP Vaät lieäu Gioáng vi sinh vaät Vi khuaån gaây hö hoûng thöïc phaåm duøng laøm chuûng chæ thò cho hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin: Bacillus subtilis (PTN), Bacillus cereus (PTN), Salmonella typhimurium SA – 1.06, Escherichia coli ATCC 2592. Vi khuaån Acetobacter xylinum BC16 duøng ñeå leân men thu nhaän maøng moûng BC ñöôïc cung caáp töø Boä söu taäp gioáng cuûa Boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Moâi tröôøng nuoâi caáy MT 1: Moâi tröôøng giöõ gioáng Acetobacter xylinum Nöôùc döøa giaø 1lit Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Agar 20g MT 2: Moâi tröôøng nhaân gioáng vaø leân men BC Nöôùc döøa giaø 1000ml Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Acid acetic 5ml MT 3: Moâi tröôøng NB Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml MT 4: Moâi tröôøng NA Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml Agar 20g Vaät lieäu, hoùa chaát HCl, NaOH, thuoác nhuoäm xanh Methylene, thuoác nhuoäm Gram. Bacteriocin vôùi caùc noàng ñoä 100, 200, 300 vaø 500 IU/ml töø cheá phaåm Nisaplin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis. Thieát bò vaø duïng cuï Tuû caáy voâ truøng, tuû aám, tuû saáy, noài haáp tieät truøng, maùy laéc nhieät ñoä thaáp, maùy laéc troøn, loø viba, beáp ñieän, ñóa nhöïa. Thieát bò phaân tích: kính hieån vi, caân kyõ thuaät, caân phaân tích, pH keá. Duïng cuï thuûy tinh duøng trong phaân tích: erlen, becher, ñóa Petri, oáng nghieäm, bình ñònh möùc. Noäi dung thí nghieäm Caùc böôùc tieán haønh thí nghieäm ñöôïc theå hieän ôû sô ñoà 2.1 Nhieät ñoä Thôøi gian Cheá ñoä laéc Noàng ñoä bacteriocin Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình BC haáp phuï dòch nisin Maøng BC haáp phuï dòch nisin ôû ñieàu kieän toái öu Baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái Phöông phaùp A: Nhuùng tröùng vaøo nisin, bao beân ngoaøi 1 lôùp PE Phöông phaùp B: Boïc tröùng maøng BC haáp phuï dòch nisin, bao ngoaøi lôùp PE Ñaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm: Vi sinh Caûm quan Phöông phaùp ÑC1: Loøng ñoû tröùng vòt muoái bao beân ngoaøi 1 lôùp PE. Sô ñoà 2.1. Noäi dung caùc böôùc thí nghieäm cuûa ñeà taøi. Phöông phaùp thí nghieäm Khaûo saùt khaû naêng taïo maøng moûng BC baèng phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Maøng BC ñöôïc thu nhaän töø quaù trình leân men theo sô ñoà 2.2 Gioáng A.xylinum Nhaân gioáng caáp I Nhaân gioáng caáp II Caáy gioáng:10-20% gioáng Leân men tónh (1-2ngaøy) Thu nhaän BC thoâ Sô ñoà 2.2. Caùc böôùc leân men thu nhaän maøng BC [23]. Gioáng ñöôïc nhaân gioáng caáp 1 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä thöôøng trong 24 giôø vôùi tyû leä gioáng laø 20%. Sau ñoù tieáp tuïc nhaân gioáng caáp 2 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä phoøng trong voøng 48 giôø vôùi tyû leä gioáng 20%. Tieáp theo, gioáng ñöôïc leân men trong moâi tröôøng nhaân gioáng ñeå taïo maøng BC. Ñeå thu ñöôïc lôùp maøng coù beà daøy mong muoán, thí nghieäm ñöôïc thieát laäp nhö sau: gioáng vaø moâi tröôøng nhaân gioáng ñöôïc troän vôùi nhau, sau ñoù ñem ñoå dòch gioáng vaøo ñóa nhöïa coù kích thöôùc ñöôøng kính laø 10,5 cm vôùi theå tích dòch gioáng laø: 12ml, 14ml, 16ml, 18ml, 20ml. Phöông phaùp xöû lyù maøng BC tröôùc khi haáp phuï Maøng BC sau khi thu ñöôïc chöùa moät löôïng lôùn moâi tröôøng leân men vaø caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát (acid acetic,…). Muïc ñích cuûa ñeà taøi laø söû duïng maøng moûng BC ñeå haáp phuï nisin ñeå gia taêng thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái neân vieäc xöû lyù maøng BC phaûi ñaït nhöõng yeâu caàu sau: Coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, ñoä tröông nôû oån ñònh, chòu ñöôïc caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän, aùp löïc, nhieät ñoä… Khoâng gaây taùc ñoäng ñoái vôùi chaát ñöôïc haáp phuï vaø thöïc phaåm ñöôïc bao boïc. BC sau khi leân men xong seõ ñöôïc xöû lyù theo sô ñoà Maøng BC thoâ Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Ngaâm trong NaOH 3% (10h) Ngaâm trong HCl 5% (20phuùt) Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Haáp tieät truøng (1210C, 15phuùt) Maøng BC Sô ñoà 2.3. Caùc böôùc xöû lyù maøng BC [24]. Ño beà daøy maøng BC Beà daøy maøng BC ñöôïc xaùc ñònh baèng thöôùc keïp vaø ñoàng hoà ño chieàu daøy. Ta ño ôû nhieàu vò trí khaùc nhau. Sau ñoù xaùc ñònh ñöôïc beà daøy baèng caùch tính toaùn caùc laàn ño. Thí nghieäm ñöôïc boá trí trong baûng Baûng 2.1. Caùch boá trí thí nghieäm ño beà daøy maøng Maãud1 (mm)d2 (mm)d3 (mm)d4 (mm)dtb (mm)A1Vò trí 1Vò trí 2Vò trí 3Vò trí 4A2Vò trí 1Vò trí 2Vò trí 3Vò trí 4A3Vò trí 1Vò trí 2Vò trí 3Vò trí 4A4Vò trí 1Vò trí 2Vò trí 3Vò trí 4Xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï Phöông phaùp gieáng khueách taùn laø phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï [24] Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10l dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Ñuïc loã coù ñöôøng kính 5mm treân thaïch. Nhoû 20l dòch nisin vaøo loã thaïch, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån xuaát hieän treân maët thaïch. Xaùc ñònh hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10l dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Caét maøng maûng BC thaønh nhöõng mieáng nhoû coù kích thöôùc 1 x 1 cm, cho haáp phuï trong dòch nisin. Duøng maøng BC sau khi haáp phuï ñaët vaøo giöõa ñóa Petri ñaõ coù chuûng chæ thò, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån. Xaùc ñònh thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC Thöïc hieän quy hoaïch thöïc nghieäm toái öu hoùa toaøn phaàn 4 yeáu toá (24) Xaùc ñònh thoâng soá cuûa quaù trình: Thoâng soá ñaàu ra: haøm löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC (g), kyù hieäu laø yi. Thoâng soá ñaàu vaøo: caùc yeáu toá taùc ñoäng leân quaù trình haáp phuï dòch nisin ñöôïc kyù hieäu laø Zi. Caùc thoâng soá chính aûnh höôûng tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin laø: noàng ñoä nisin (x1), nhieät ñoä (x2), thôøi gian (x3), cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Xaùc ñònh möùc cô sôû vaø khoaûng bieán thieân yeáu toá ñaàu vaøo. Choïn khoaûng bieán thieân xi laøm 3 möùc: treân, döôùi vaø cô sôû. Caùc möùc naøy ñöôïc maõ hoùa nhö sau: möùc treân +1, möùc döôùi -1, möùc cô sôû 0 Baûng 2.2. Caùc möùc bieán thieân vaø caùc yeáu toá aûnh höôûng trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC Caùc möùcCaùc yeáu toáX1X2X3X4Möùc cô sôû (0)2002030150Khoaûng bieán thieân (±1)100101050Möùc treân (+1)3003040200Möùc döôùi (-1)1001020100x1: noàng ñoä nisin (IU/ml); x2: nhieät ñoä (0C); x3: thôøi gian (phuùt); x4: cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Soá löôïng thí nghieäm ñöôïc xaùc ñònh theo coâng thöùc: Nk = 24 = 16 thí nghieäm. N: soá löôïng nghieäm thöùc; k: soá yeáu toá khaûo saùt. Xaây döïng phöông trình baäc nhaát ñeå xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa 4 yeáu toá khaûo saùt tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC. Phöông trình hoài quy moâ taû thöïc nghieäm coù daïng: y= bo +b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 ….. Trong ñoù: b0, b1, b2, b3, …. laø caùc heä soá trong phöông trình hoài quy [3]. Thöïc hieän thí nghieäm leo doác Döïa vaøo keát quaû quy hoaïch thöïc nghieäm tieán haønh toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôïc thöïc hieän baèng phöông phaùp ñöôøng doác nhaát. Choïn böôùc chuyeån ñoäng cho caùc yeáu toá coù aûnh höôûng trong phöông trình hoài quy. Ñeå tìm ñöôïc caùc thoâng soá toái öu phaûi xaùc ñònh ñöôïc y cao nhaát, töông öùng caùc giaù trò x1, x2, x3, x4 cuûa caùc yeáu toá caàn tìm. Phöông phaùp xaùc ñònh theå tích nisin bò haáp phuï Choïn maøng BC coù khoái löôïng töông ñoái ñeàu nhau, ñem haáp phuï theo caùc thoâng soá thieát keá thí nghieäm qui hoaïch thöïc nghieäm. Caân khoái löôïng mieáng BC sau khi haáp phuï, hieäu soá giöõa khoái löôïng tröôùc vaø sau khi haáp phuï chính laø löôïng nisin haáp phuï vaøo. ÖÙng duïng baûo quaûn tröùng vòt muoái baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin Khaûo saùt khaû naêng öùng duïng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin ôû cheá ñoä toái öu vöøa khaûo saùt vaø thöïc teá baûo quaûn tröùng vòt muoái ôû nhieät ñoä phoøng. Sau khi xaùc ñònh ñieàu kieän toái öu maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin, ta ñem maøng moûng haáp phuï nisin bao boïc tröùng vòt muoái, bao goùi maãu baèng maøng PE, baûo quaûn nhieät ñoä phoøng. Boá trí thí nghieäm: caùc maãu khaûo saùt ñöôïc trình baøy qua baûng 2.3 Baûng 2.3. Caùc maãu khaûo saùt phöông phaùp baûo quaûn tröùng vòt muoái. Maãu thí nghieämPhöông phaùp baûo quaûnTieán haønh thí nghieämÑC1(ñoái chöùng thí nghieäm)Ñoái chöùng theo thôøi gian baûo quaûnABaûo quaûn baèng dòch nisinNhuùng maãu tröùng vòt muoái qua dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PEBBaûo quaûn baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisinBoïc maãu tröùng vòt muoái baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PE.Caùc chæ tieâu theo doõi: tieán haønh kieåm tra ñaùnh giaù chaát löôïng cuûa caùc maãu thí nghieäm thoâng qua: Caùc chæ tieâu vi sinh (667/1998/ QÑ – BYT): toång soá vi khuaån hieáu khí, Coliform, E. coli, Salmonella. Tieán haønh ñaùnh giaù veà maët caûm quan cuûa caùc maãu theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67.  CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Taïo maøng moûng BC Khaûo saùt moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng Acetobacter xylinum Chuûng Acetobacter xylinum BC16 do phoøng thí nghieäm Boä moân Coâng ngheä sinh hoïc cung caáp ñöôïc kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: Kieåm tra vi theå Gioáng Acetobacter xylinum ñöôïc nhuoäm Gram vaø quan saùt döôùi kính hieån vi, chuùng toâi nhaän thaáy: vi khuaån Acetobacter xylinum Gram aâm, coù daïng hình que, teá baøo ñöùng rieâng leû. Hình 3.1. Hình quan saùt vi theå gioáng Acetobacter xylinum qua kính hieån vi. Kieåm tra ñaïi theå Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng ñaëc: Acetobacter xylinum coù khuaån laïc hình troøn, nhaày, beà maët khuaån laïc trôn boùng, maøu traéng ñuïc. Hình 3.2. Khuaån laïc Acertobacter xylinum Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng loûng: Chuûng Acetobacter xylinum BC16 taïo moät lôùp maøng treân moâi tröôøng loûng sau moät ngaøy nuoâi caáy. Beà daøy lôùp maøng taêng daàn theo thôøi gian nuoâi caáy. Hình 3.3. Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng loûng. Kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoùa ñaëc tröng Sau khi kieåm tra vi theå vaø ñaïi theå, chuùng toâi tieán haønh kieåm tra ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa Acetobacter xylinum. Keát quaû kieåm tra caùc ñaëc ñieåm sinh hoùa ñöôïc trình baøy trong baûng 3.1. Baûng 3.1 Keát quaû kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoùa STTÑaëc ñieåmHieän töôïngKeát quaû1Oxy hoùa ethanol thaønh acid aceticMoâi tröôøng maøu vaøng chuyeån thaønh maøu xanh luïc+2CatalaseSuûi boïi khí+4Chuyeån hoùa glucose thaønh acidVoøng saùng xung quanh khuaån laïc+5Chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxy acetoneVoøng CuO xuaát hieän quanh khuaån laïc+6Kieåm tra khaû naêng sinh saéc toá naâuKhoâng coù saéc toá naâu-7Kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp celluloseVaùng vi khuaån xuaát hieän maøu lam+Vôùi keát quaû nhö treân, gioáng Acetobacter xylinum ñaõ ñöôïc kieåm tra gioáng thuaàn. Gioáng naøy seõ ñöôïc söû duïng ñeå leân men taïo maøng BC cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Keát quaû khaûo saùt beà daøy maøng BC. Maøng BC ñöôïc ño ôû 4 ñieåm coù ñoä daøy d1, d2, d3, d4 vaø beà daøy cuûa maøng ñöôïc tính trung bình vôùi kích thöôùc laø dtb. Maøng ñöôïc khaûo saùt ôû caùc theå tích 12ml, 14ml, 16ml, 18ml töông öùng vôùi caùc maãu A1, A2, A3, A4 vôùi keát quaû ñöôïc trình baøy trong baûng 3.2. Baûng 3.2. Beà daøy cuûa maøng BC Maãud1 (mm)d2 (mm)d3 (mm)d4 (mm)dtb (mm)A10.080.070.090.080.08A20.10.110.10.10.10A30.120.120.110.130.12A40.150.150.160.150.15Döïa vaøo baûng 3.2 chuùng toâi coù nhaän xeùt: beà daøy cuûa maøng töông ñoái ñoàng ñeàu. Ñoä cheânh leäch beà daøy maøng raát nhoû ( 0.02 mm). ÔÛ phöông phaùp naøy, tæ leä giöõa beà maët chaát loûng vaø beà saâu chaát loûng lôùn neân löôïng oxy khueách taùn vaøo moâi tröôøng lôùn. Do ñoù, vi khuaån Acetobacter xylinum söû duïng heát moâi tröôøng taïo maøng coù hình daïng xaùc ñònh theo hình daïng chaát loûng chöùa trong ñóa nhöïa. Maøng vi khuaån phaùt trieån theo chieàu saâu ñeán ñaùy cuûa ñóa nhöïa roài phaùt trieån theo chieàu ngang taïo boä khung ñoàng ñeàu cho maøng neân maøng coù ñoä daøy töông ñoái ñeàu. Vôùi theå tích 12ml dòch gioáng vöøa ñuû ñeå traûi moät lôùp moûng dòch heát beà maët ñóa nhöïa, coù beà daøy 0.08mm, moûng vaø khoâng bò raùch döôùi taùc ñoäng cô hoïc trong quaù trình baûo quaûn vaø cho chaát löôïng caûm quan toát. Vôùi theå tích 14ml, 16ml, 18ml dòch gioáng, coù beà daøy hôi daøy, chòu ñöôïc löïc cô hoïc nhöng aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quaûn cuûa saûn phaåm khi bao goùi. Döïa vaøo keát quaû naøy, chuùng toâi choïn maøng coù beà daøy 0.08mm ñeå thöïc hieän caùc thí nghieäm tieáp theo. Khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch vaøo maøng moûng BC. Chuùng toâi khaûo saùt phaàn naøy nhaèm taïo ra maøng baûo quaûn thöïc phaåm. Cuï theå laø chuùng toâi öùng duïng trong baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû khaûo saùt thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm toaøn phaàn. Vôùi beà daøy maøng BC chuùng toâi ñaõ choïn, ñeå xaùc ñònh ñöôïc caùc thoâng soá toái öu trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC, chuùng toâi tieán haønh boá trí thí nghieäm baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm toaøn phaàn vaø toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôøng doác nhaát. Cô sôû ñeå xaùc ñònh caùc möùc cô baûn (x) vaø khoaûng bieán thieân (x) cuûa caùc yeáu ñaàu vaøo: Baûng 3.3. Caùc yeáu toá quy hoaïch thöïc nghieäm Yeáu toáBieán coù thöù nguyeân xBieán khoâng coù thöù nguyeân ZMöùc cô baûnxMöùc cô baûnZ1. Noàng ñoä nisin (IU/ml)200100012. Nhieät ñoä (0C)2010013. Thôøi gian (phuùt)3010014. Cheá ñoä laéc (voøng/phuùt)1505001 Baûng 3.4. Moâ hình quy hoaïch thöïc nghieäm trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng STTX1X2X3X4Z1Z2Z3Z4Y13003040200+1+1+1+11.594923003020200+1+1-1+10.957631003040200-1+1+1+11.484841003020200-1+1-1+11.328053003040100+1+1+1-10.916563003020100+1+1-1-11.462671003040100-1+1+1-11.106481003020100-1+1-1-11.339393001040200+1-1+1+11.6971103001020200+1-1-1+11.2651111001040200-1-1+1+11.6989121001020200-1-1-1+11.1668133001040100+1-1+1-11.6992143001020100+1-1-1-10.8752151001040100-1-1+1-11.6998161001020100-1-1-1-11.183317200203015000001.036818200203015000001.145719200203015000000.953920200203015000001.0636Sau khi tính toaùn, xaùc ñònh ñöôïc heä soá bj cuûa phöông trình hoài qui. Baûng 3.5 Heä soá cuûa phöông trình hoài qui Heä soá bjGiaù tròSbjtjt0.1(3)Keát luaänb01.340.0267.92.13nhaänb1-0.0340.021.72.13loaïib2-0.0680.023.52.13nhaänb30.1450.027.32.13nhaänb40.0570.022.92.13nhaäntj t0,1(3): loaïi bj töông öùng khoûi phöông trình hoài quy. tj t0,1(3): laáy bj töông öùng vaøo phöông trình hoài quy. Sau khi kieåm tra tính töông thích cuûa phöông trình vôùi thöïc nghieäm chuùng toâi xaây döïng ñöôïc phöông trình hoài quy töông thích vôùi thöïc nghieäm sau: y = 1.34 – 0.068x2 + 0.145x3 + 0.057x4 Theo phöông trình hoài qui tuyeán tính treân chuùng toâi nhaän thaáy: Caùc yeáu toá thôøi gian, nhieät ñoä, cheá ñoä laéc coù aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC, coøn yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng. Töø moâ hình toaùn hoïc ta nhaän thaáy raèng caùc heä soá ñöùng tröôùc caùc bieán x3 vaø x4 coù daáu döông, nghóa laø caùc thoâng soá thôøi gian vaø cheá ñoä laéc tæ leä thuaän vôùi löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC. Vaø heä soá ñöùng tröôùc bieán x2 coù daáu aâm, nghóa laø thoâng soá nhieät ñoä tæ leä nghòch vôùi löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC. Do ñoù, ñeå taêng giaù trò cuûa thoâng soá toái öu hoùa caàn giaûm giaù trò x2 vaø taêng giaù trò x3 vaø x4. Khi thôøi gian caøng taêng thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Vì khi taêng thôøi gian haáp phuï, dòch nisin caøng coù nhieàu cô hoäi ñöôïc tieáp xuùc vôùi caùc loã treân maøng BC, daãn ñeán löôïng nisin ñöôïc haáp phuï vaøo trong maøng caøng nhieàu. Khi taêng cheá ñoä laéc cuûa quaù trình haáp phuï thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Vì khi cheá ñoä laéc taêng, taïo ra ñoäng löïc khueách taùn phaân töû nisin vaøo caùc loã nhoû cuûa maøng BC caøng taêng, daãn ñeán löôïng nisin haáp phuï vaøo trong maøng caøng nhieàu [11]. Ngöôïc laïi vôùi söï aûnh höôûng cuûa yeáu toá thôøi gian vaø cheá ñoä laéc, khi nhieät ñoä caøng giaûm thì löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Nguyeân nhaân daãn ñeán hieän töôïng naøy laø do quaù trình haáp phuï laø quaù trình toûa nhieät, do ñoù khi giaûm nhieät ñoä giaûm seõ taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho quaù trình haáp phuï, laøm cho löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng caøng nhieàu [2]. Nhaèm muïc ñích xaùc ñònh giaù trò toái öu cho quaù trình haáp phuï, chuùng toâi thöïc hieän thí nghieäm leo doác. Vôùi böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá x4 laø laø 4: 4 = 10 voøng/phuùt. Treân cô sôû ñoù xaùc ñònh böôùc chuyeån ñoäng cuûa x2 vaø x3 ñöôïc trình baøy trong baûng sau. Baûng 3.6. Caùc yeáu toá trong thí nghieäm leo doác Caùc yeáu toáX2X3X4Möùc cô sôû2030150Heä soá bj0.0680.1450.057Khoaûng bieán thieân101050bjxj0.681.452.85Böôùc j2.385.0810Böôùc laøm troøn2510Döïa vaøo baûng tính toaùn ôû treân, chuùng toâi tính ñöôïc caùc böôùc chuyeån ñoäng cuûa x2 laø 2 = 2.50C vaø böôùc chuyeån ñoäng cuûa x3 laø 3 = 5 phuùt. Keát quaû thí nghieäm leo doác ñöôïc trình baøy ôû baûng. Baûng 3.7. Haøm löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC ôû thí nghieäm leo doác STTx2 (0C)x3 (phuùt)x4 (voøng/phuùt)y117.5351600.7631215401701.0032312.5451801.4966410501900.919Qua baûng keát quaû thí nghieäm toái öu hoùa baèng phöông phaùp leo doác cho thaáy: löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC ôû thí nghieäm thöù 1, 2, 3 coù söï taêng daàn, ñeán thí nghieäm thöù 4 thì löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC coù xu höôùng giaûm roõ reät. Nguyeân nhaân laø do khi tieán haønh thí nghieäm leo doác, chuùng toâi ñaõ taêng yeáu toá cheá ñoä laéc. Khi cheá ñoä laéc taêng thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Nhöng khi taêng ñeán moät giôùi haïn naøo ñoù seõ laøm xaûy ra hieän töôïng nhaû haáp phuï. Vì khi laéc quaù maïnh, dòch nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaøo trong nhöõng loã nhoû cuûa maøng BC seõ bò vaêng ra ngoaøi, laøm löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC giaûm. Nhö vaäy, qua keát quaû naøy, chuùng toâi nhaän thaáy ôû thí nghieäm thöù 4 ñaõ xuaát hieän söï nhaû haáp phuï dòch nisin. Do ñoù chuùng toâi choïn löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC toái öu laø ôû ñieàu kieän thí nghieäm thöù 3, töùc ôû ñieàu kieän thôøi gian laø 45 phuùt, nhieät ñoä 12,50C vaø cheá ñoä laéc 180 voøng/phuùt. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa dòch nisin Vôùi muïc ñích söû duïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC ñeå baûo quaûn tröùng vòt muoái, tröôùc tieân chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa dòch nisin ñoái vôùi moät soá chuûng chæ thò, ñaëc bieät laø nhöõng chuûng gaây hö hoûng vaø gaây beänh thöôøng tìm thaáy trong thöïc phaåm: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Echerichia coli. Hình 3.4. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Bacillus subtilis Hình 3.5. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Bacillus cereus Hình 3.6. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Echerichia coli Hình 3.7. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Salmonella typhimurium Baûng 3.8. Khaû naêng khaùng vi sinh vaät gaây hö hoûng vaø gaây beänh thöôøng gaëp cuûa dòch nisin coù hoaït tính 500IU/ml. Chuûng vi khuaån chæ thòÑöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm)Bacillus subtilis39Bacillus cereus45Echerichia coli15Salmonella typhimurium15Keát quaû ôû baûng 3.8 cho thaáy dòch nisin coù khaû naêng khaùng khuaån roäng, khoâng chæ öùc cheá moät soá vi khuaån Gram döông gaây hö hoûng thöïc phaåm nhö chuûng Bacillus, maø coøn öùc cheá moät soá vi khuaån Gram aâm gaây beänh nhö Salmonella typhimurium, Echerichia coli. Trong ñoù, nisin theå hieän hoaït tính khaùng khuaån maïnh nhaát ñoái vôùi Bacillus cereus, tieáp ñeán laø Bacillus subtilis. Ñoái vôùi hai loaøi vi khuaån Echerichia coli vaø Salmonella typhimurium, nisin theå hieän hoaït tính khaùng khuaån keùm hôn so vôùi chuûng Bacillus Keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin Muïc tieâu cuûa ñeà taøi khoâng söû duïng dòch nisin tröïc tieáp ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái maø taïo maøng BC haáp phuï dòch nisin sau ñoù söû duïng ñem bao goùi baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC cho thaáy yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán khaû naêng haáp phuï. Do ñoù, ñeå kieåm chöùng dòch nisin coù ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC, ñoä haáp phuï coù ñoàng ñeàu khoâng vaø tìm ra noàng ñoä nisin coù hieäu quaû nhaát trong vieäc baûo quaûn. Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau treân chuûng vi khuaån chæ thò laø Bacillus cereus. Hình 3.8. Maøng BC haáp phuï nisin coù noàng ñoä 100IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin coù noàng ñoä 500IU/ml. Hình 3.9. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Hình 3.10. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 300IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Hình 3.11. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 500IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Baûng 3.9. Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml Noàng ñoä nisin maøng BC haáp phuï (IU/ml)Ñöôõng kính voøng khaùng khuaån maøng BC haáp phuï nisin (mm)Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån loã chöùa dòch nisin 500IU/ml (mm)10038.541200404130041415004141Döïa vaøo keát quaû khaûo saùt cuõng cho ta thaáy hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï dòch nisin noàng ñoä 100IU/ml laø thaáp nhaát, hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï dòch nisin noàng ñoä 200IU/ml gaàn baèng vôùi dòch nisin noàng ñoä 500IU/ml töï do. Vaø hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï nisin noàng ñoä 300IU/ml vaø 500IU/ml baèng hoaït tính khaùng khuaån cuûa dòch nisin 500IU/ml töï do. Chuùng toâi nhaän thaáy hoaït tính cuûa nisin ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC taêng daàn töø noàng ñoä thaáp ñeán noàng ñoä cao, vaø coù keát quaû gaàn baèng hoaït tính cuûa dòch nisin 500IU/ml töï do. Do ñoù, chuùng toâi coù theå keát luaän dòch nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaøo trong maøng BC vaø coù ñoä haáp phuï khaù ñoàng ñeàu. Maët khaùc, nisin hieän nay ñaõ ñöôïc tinh saïch baèng nhieàu coâng ngheä khaùc nhau vaø ñöôïc thöông maïi hoùa nhöng giaù thaønh vaãn coøn cao, cuøng vôùi keát quaû qui hoaïch thöïc nghieäm yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC vaø keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC ñaõ haáp phuï dòch nisin. Ñeå tieát kieäm veà maët kinh teá, chuùng toâi choïn dòch nisin vôùi noàng ñoä 200IU/ml ñeå tieán haønh thí nghieäm baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû öùng duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. An toaøn thöïc phaåm laø moät trong nhöõng yeáu toá caáu thaønh neân chaát löôïng thöïc phaåm. Trong quaù trình baûo quaûn thöïc phaåm, coù raát nhieàu phöông phaùp ñöôïc aùp duïng nhö laïnh ñoäng, söû duïng hoùa chaát, chaát khaùng sinh,… Moãi phöông phaùp ñeàu coù öu nhöôïc ñieåm rieâng, chuùng coù theå laøm thay ñoåi caáu truùc cuûa saûn phaåm, hoaëc toàn ñoïng nhieàu dö löôïng hoùa chaát coù theå aûnh höôûng ñeán söùc khoûe cuûa ngöôøi tieâu duøng. Moät khuynh höôùng môùi trong lónh vöïc naøy ñang thu huùt söï chuù yù cuûa nhieàu nhaø khoa hoïc laø söû duïng nisin laøm taùc nhaân sinh hoïc an toaøn trong baûo quaûn thöïc phaåm. Loøng ñoû tröùng vòt sau khi ngaâm nöôùc muoái ôû noàng ñoä 15%, vaãn coøn nhieàu chaát ñaïm vaø chaát beùo, ñoàng thôøi khoâng coù lôùp voû boïc tröùng baûo veä neân seõ laø moâi tröôøng thuaän lôïi cho vi sinh vaät phaùt trieån, ñaëc bieät laø naám moác daãn ñeán gaây hö hoûng tröùng ôû moâi tröôøng nhieät ñoä thöôøng hoaëc nhieät ñoä maùt. Do ñoù, trong khaûo saùt naøy chuùng toâi söû duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái ôû nhieät ñoä 50C. Dòch nisin tinh saïch 200IU/ml ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC thôøi gian 45 phuùt, nhieät ñoä 12,50C, cheá ñoä laéc 180 voøng/phuùt. Loøng ñoû tröùng vòt sau khi muoái ñöôïc chia laøm 3 maãu thí nghieäm vôùi caùc phöông phaùp baûo quaûn khaùc nhau (baûng 2.3). Keát quaû ñaùnh giaù chaát löôïng loøng ñoû tröùng vòt muoái sau 1 thaùng baûo quaûn ñöôïc theå hieän trong caùc baûng 3.10, 3.11. Baûng 3.10. Theo doõi chaát löôïng caûm quan cuûa caùc maãu theo thôøi gian baûo quaûn. MaãuChæ tieâu caûm quan1 tuaàn2 tuaàn3 tuaàn4 tuaànÑC1 MaøuÑaëc tröngHôi nhaït maøuNhaït maøuNhaït maøuMuøiÑaëc tröngHôi keùm ñaëc tröngKeùm ñaëc tröngKeùm ñaëc tröngTraïng thaùi, caáu truùcHôi cöùng, beà maët trôn laùngCöùng, beà maët trôn laùngCöùng, töôm daàuCöùng, töôm daàu nhieàuA MaøuÑaëc tröngÑaëc tröngÑaëc tröngHôi nhaït maøuMuøiÑaëc tröngHôi keùm ñaëc tröngKeùm ñaëc tröngKeùm ñaëc tröngCaáu truùcHôi cöùng, beà maët trôn laùngHôi cöùng, beà maët trôn laùngCöùng, töôm daàuCöùng, töôm daàu nhieàuBMaøuÑaëc tröngÑaëc tröngÑaëc tröngÑaëc tröngMuøiÑaëc tröngHôi keùm ñaëc tröngHôi keùm ñaëc tröngKeùm ñaëc tröngCaáu truùcHôi cöùng, beà maët trôn laùngHôi cöùng, beà maët trôn laùngCöùng, beà maët trôn laùngCöùng, beà maët trôn laùng Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.12. Loøng ñoû tröùng vòt muoái baûo quaûn theo thôøi gian. Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.13. Loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc xöû lyù baèng nisin ñeå baûo quaûn. Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.14. Loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin. Xeùt veà maët caûm quan, döïa theo caùc yeâu caàu veà maët caûm quan theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67, chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt nhö sau: Maãu ÑC1 sau 3 tuaàn baûo quaûn, maøu saéc, muøi vaø traïng thaùi caáu truùc khoâng coøn ñöôïc duy trì nhö ban ñaàu. Maãu bò töôm daàu nhieàu vaø nhaït maøu. Maãu A sau 3 tuaàn baûo quaûn, vaãn giöõ ñöôïc maøu ñaëc tröng nhöng coù daáu hieäu bò töôm daàu vaø coù muøi khoâng ñaëc tröng so vôùi luùc ban ñaàu. Maãu B sau 4 tuaàn baûo quaûn, vaãn giöõ ñöôïc maøu saéc, muøi vaø traïng thaùi caáu truùc ñaëc tröng so vôùi luùc ban ñaàu.Vì vaäy, döïa vaøo maët caûm quan thì maãu B ñöôïc choïn. Xeùt veà chæ tieâu toång soá vi sinh vaät hieáu khí, döïa theo chæ tieâu veà caùc saûn phaåm töø tröùng töôi cuûa Boä y teá (667/1998/ QÑ – BYT) Baûng 3.11. Theo doõi chæ tieâu toång soá vi khuaån hieáu khí theo thôøi gian. Maãu Thôøi gianÑC1 (Cfu/g)A B 1 tuaàn0,55 x1020,35 x 1020,35 x 1022 tuaàn7,42 x 1022,44 x 1022,5 x 1023 tuaàn1,21 x 1034,35 x 1024,16 x 1024 tuaàn6,55 x 1025,98 x 102 Bieåu ñoà 3.1. Toång soá vi khuaån hieáu khí cuûa caùc maãu khaûo saùt theo thôøi gian. Chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt nhö sau: Maãu ÑC1 coù toång soá vi khuaån hieáu khí cao hôn haún so vôùi nhöõng maãu khaùc vaø ñeán tuaàn thöù 3 thì ñaõ khoâng ñaït giôùi haïn cho pheùp. Do nhieät ñoä baûo quaûn ôû 50C chæ coù taùc duïng kìm haõm quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät chöù khoâng coù taùc duïng tieâu dieät vi sinh vaät. Ngoaøi ra, trong loøng ñoû tröùng muoái vaãn coøn haøm löôïng chaát dinh döôõng töông ñoái lôùn vaø chæ ñöôïc boïc 1 lôùp PE neân raát thuaän lôïi cho vi sinh vaät phaùt trieån. Maãu A ñaõ ñöôïc xöû lyù baèng nisin neân coù toång soá vi khuaån hieáu khí thaáp hôn maãu ÑC1 raát nhieàu nhöng vaãn cao hôn maãu B. Vì nisin coù khaû naêng khaùng ñöôïc moät soá vi khuaån hieáu khí, do ñoù maãu A sau khi ñöôïc xöû lyù baèng nisin coù theå öùc cheá söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa nhieàu loaøi vi khuaån hieáu khí coù trong loøng ñoû tröùng vòt muoái. Tuy nhieân, taùc duïng khaùng khuaån cuûa nisin chæ coù giôùi haïn neân moät soá loaïi vi khuaån hieáu khí vaãn phaùt trieån ñöôïc trong loøng ñoû tröùng vòt muoái nhöng vaãn ñaït chæ tieâu theo 667/1998/ QÑ – BYT. Maãu B ñaõ ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin coù toång soá vi khuaån hieáu khí thaáp nhaát trong ba maãu. Vì maãu B ñöôïc boïc baèng maøng BC neân ñaõ haïn cheá bôùt moät löôïng khoâng khí xung quanh loøng ñoû tröùng vòt muoái. Ñoàng thôøi do coù söï taùc ñoäng cuûa nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaø phaân boá ñeàu trong maøng BC neân keát quaû laøm haïn cheá ñöôïc moät löôïng lôùn vi khuaån hieáu khí phaùt trieån trong loøng ñoû tröùng vòt muoái so vôùi hai maãu ñaàu tieân. Chuùng toâi keát hôïp caùc keát quaû khaûo saùt veà maët caûm quan vaø chæ tieâu vi sinh cuûa caùc maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái baèng ba phöông phaùp khaùc nhau, chuùng toâi nhaän thaáy: Maãu ÑC1 bò loaïi do khoâng ñaït veà maët caûm quan vaø chæ tieâu vi sinh. Maãu A ñaït chæ tieâu vi sinh nhöng vaãn bò loaïi do khoâng ñaït veà maët caûm quan. Maãu B ñaït chæ tieâu vi sinh vaø ñaït veà maët caûm quan. Maãu B ñöôïc ñem ñi xaùc ñònh laïi chæ tieâu veà maët vi sinh taïi Dòch vuï Trung taâm phaân tích thí nghieäm (Soá 2, Nguyeãn Vaên Thuû, Q.1) ñeå ñaûm baûo tính khaùch quan cuûa keát quaû luaän vaên, keát quaû ñöôïc theå hieän trong baûng 3.12. Baûng 3.12. Keát quaû kieåm tra vi sinh cuûa maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200 IU/ml. Teân chæ tieâuCfu/gTSVKHK5,72 x 102Coliform0E. coli0Salmonella0Nhö vaäy, so vôùi tieâu chuaån vi sinh cuûa Boä y teá 667/1998/ QÑ – BYT maãu B laø maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml laø maãu toái öu, thôøi gian baûo quaûn 1 thaùng, keùo daøi theâm 15 ngaøy so vôùi maãu ñoái chöùng. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009): duøng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml baûo quaûn möïc moät naéng ñöôïc 13 ngaøy vaø Traàn Thò Töôûng An (2006): duøng maøng BC haáp phuï dòch thoâ nisin 200AU/ml baûo quaûn thòt sô cheá ñöôïc 3 ngaøy. So vôùi keát quaû cuûa Nguyeãn Thò Myõ Leä, keát quaû cuûa chuùng toâi coù thôøi gian baûo quaûn cao hôn vôùi cuøng noàng ñoä nisin. Nguyeân nhaân laø do saûn phaåm loøng ñoû tröùng vòt muoái coù noàng ñoä muoái töø 4 – 7% , cao hôn nhieàu so vôùi saûn phaåm möïc moät naéng (2 – 3%). Muoái aên coù tính saùt khuaån maïnh vì laøm giaûm hoaït ñoä cuûa nöôùc. Ngoaøi ra, muoái aên coøn coù khaû naêng thaåm thaáu cao laøm taêng ñieàu kieän khaéc nghieät ñoái vôùi söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Do ñoù, haøm löôïng muoái cao trong loøng ñoû tröùng vòt muoái cuõng goùp phaàn laøm keùo daøi thôøi gian baûo quaûn. So vôùi nghieân cöùu cuûa Traàn Thò Töôûng An (2006), keát quaû cuûa chuùng toâi cuõng cao hôn raát nhieàu. Ngoaøi nhöõng nguyeân nhaân vöøa neâu ôû treân, coøn coù moät lyù do nöõa ñoù laø dòch nisin chuùng toâi söû duïng laø nisin tinh khieát neân khaû naêng khaùng khuaån cuõng cao hôn. Caùc keát quaû phaân tích ôû treân cho thaáy, maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin coù taùc duïng vöøa laøm taêng giaù trò caûm quan vöøa caûi thieän ñöôïc chaát löôïng vi sinh cuûa saûn phaåm. CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ Keát luaän Qua caùc thí nghieäm khaûo saùt chuùng toâi thu ñöôïc nhöõng keát quaû sau ñaây: Xaùc ñònh ñöôïc thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC vôùi ñoä daøy 0.08mm nhaèm taïo ra maøng baûo quaûn thöïc phaåm: Noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC. Nhieät ñoä haáp phuï: 12,50C. Thôøi gian haáp phuï: 45 phuùt. Cheá ñoä laéc: 180 voøng/phuùt. ÖÙng duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin coù noàng ñoä 200IU/ml baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc 1 thaùng maø vaãn ñaûm baûo caùc chæ tieâu veà maët caûm quan vaø vi sinh (tieâu chuaån 32TCN 30 – 67 vaø 667/1998/ QÑ – BYT). Ñeà nghò Tieáp tuïc theo doõi khaû naêng baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái baèng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin sau 1 thaùng. Nghieân cöùu öùng duïng maøng moûng BC keát hôïp vôùi nisin vaø moät soá nhaân toá khaùc ñeå keùo daøi thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái. Nghieân cöùu öùng duïng baûo quaûn loûng ñoû tröùng vòt muoái vôùi maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin treân qui moâ lôùn hôn. Nghieân cöùu haáp phuï dòch nisin vaøo maøng Chitosan ñeå baûo quan loøng ñoû tröùng vòt muoái. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TIEÁNG VIEÄT [1]. Traàn Thò Töôûng An (2007), Coá ñònh teá baøo Lactococcus lactis treân moät soá chaát mang vaø öùng duïng leân men thu nhaän bacteriocin, Luaän vaên thaïc só, ÑHQG Tp.HCM. [2]. Nguyeãn Bin, Caùc quaù trình thieát bò trong coâng ngheä hoùa chaát vaø thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät. [3]. Nguyeãn Caûnh, Quy hoaïch thöïc nghieäm, Nhaø xuaát baûn ÑHQG Tp. Hoà Chí Minh, 2004. [4]. Nguyeãn Thò Hieàn, Leâ Huyønh My, Nghieân cöùu saûn xuaát loøng ñoû tröùng vòt muoái. Hoäi nghò khoa hoïc vaø Coâng ngheä laàn thöù 10. Phaân ban coâng ngheä thöïc phaåm – sinh hoïc. [5]. Nguyeãn Thuùy Höông (1998), Choïn doøng Acetobacter xylinum phaùt trieån nhanh vaø moät soá bieän phaùp caûi thieän saûn xuaát cellulose vi khuaån, Luaän vaên Thaïc só, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân, Tp. HCM. [6]. Nguyeãn Thuùy Höông (2006), Tuyeån choïn vaø caûi thieän caùc chuûng Acetobacter xylinum taïo cellulose vi khuaån ñeå saûn xuaát vaø öùng duïng ôû quy moâ pilot, Luaän aùn tieán só, ÑHQG Tp.HCM. [7].Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009), Thöû nghieäm öùng duïng maøng BC haáp phuï dòch bacteriocin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis ñeå baûo quaûn möïc moät naéng, Luaän vaên thaïc só, ÑHQG Tp.HCM. [8]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Vi sinh vaät hoïc, NXB ÑHQG Tp.HCM. [9]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghieäm coâng ngheä sinh hoc, taäp 2, NXB ÑHQG Tp.HCM. [10]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghieäm vi sinh vaät, NXB ÑHQG Tp.HCM. [11]. Ñaøo Vaên Löôïng (2005), Nhieät ñoäng löïc hoùa hoïc, Nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät. [12]. Leâ Thò Hoàng Tuyeát (2004), Nghieân cöùu bacteriocin saûn xuaát bôûi Lactobacillus acidophilus NrrIB-2092, Luaän vaên thaïc só Sinh hoïc, ÑHQG TPHCM. [13]. Boä y teá (1998), Caùc tieâu chuaån veà chæ tieâu vi sinh trong caùc saûn phaåm laøm töø tröùng töôi. [14]. Boä ngoaïi thöông (1968), Caùc tieâu chuaån veà tröùng vòt muoái, Thö vieän trung taâm kyõ thuaät tieâu chuaån ño löôøng chaát löôïng. TAØI LIEÄU TIEÁNG ANH [15]. Alexander Steinbuchel, “ Polysacharide and polyamide in the food industry”,Vol. 1, 2005. [16]. Bielecki, S., Krystynowicz, A., Turkiewicz, M., Kalinowska, H. (Technical University of Lodz, Stefanowskiego, Poland), Bacterial Cellulose, p. 37-46, vol.3, 2005. [17]. Brown, R.M (1978), Biosynthesis of natuaral polymer systems with special reference to cellulose assembly and deposition. [18]. Brown, R.M (1999), Cellulose structure ang biosynthesis, Pure Appl. Chem, Vol. 71, No. 5, 765 – 775. [19]. Coma V, Sebti I, Pardon P, Deschamps A, Pichavant FH (2001). Antimicrobial edible packaging based on cellulose ethers, fatty acids and nisin incorporation to inhibit Listeria innocua and Staphylococcus aureus. Applied and enviromantal microbiology. [20]. Davies EA, Bevis HE, Delves Broughton J (1997). The use of bacteriocin, nisin, as a preservative in ricotta – type cheese to control the food – borne pathogen Listeria monocytogenes. Applied and enviromantal microbiology. [21]. Einarsson H, Lauzon HL (1995). Biopreservation of birined shrimp by bacteriocin from lactic – acid bacteria. Applied and enviromantal microbiology. [22]. Gert N. Moll, Wil N. Konings, Arnold J.M. Driesen (1999), “Bacteriocin mechanism of membrane insertion and pore formation”, Antonie van Leeuwehock, 76, 185 – 198. [23]. H.chen, D.G.Hoover, Bacteriocin and their food applications, Comprehensive reviews in food science and food safety. [24]. Hudaa Nettoo, Mu Ye, Haiquiang Chen (2007). Effectiveness and stability of plastic film coated with nisin for inhibition of Listeria monocytogenes. Journal of food protection. [25]. Kung – Ming Lai, Wen – Chung Ko and Tsu – Han Lai (1997), Effect of NaCl penetration rate on the granilation and oil – off of the yolk salted duck egg, Food Sci. Technol Int. Tokyo. [26]. Laukovaù A, Czikkova S, Laczkovaùs, Turek P (1999). Use of enterocin CCM 4231 to control Listeria monocytogenes in experimentally containinated dry fermented Honaùrd Salami. Applied and enviromantal microbiology. [27]. Martin Dworkin, “The prokarotes – A handbook on the Biology of Bacteria: symbiotic asscociations, biotechnology, applied microbiology”, p. 766-775, Vol.1, 2006. [28]. Murray M, Richard JA (1997). Comparative study of the antilisterial activity of nisin A and pediocin Actt in fresh ground pork stored aerobically at 50C. [29]. Nilsson L, Huss HH, Gran L (1997). Inhibition of Listeria monocytogenes on cold – smoked salmon by nisin and carbon dioxide atmosphere. Applied and enviromantal microbiology. [30]. Nykanen A, Weckman K, Lapvetelainen A (2000). Synengistic inhibition of Listeria monocytognenes on cold – smoked rainbow trout by nisin and sodium lactate. Applied and enviromantal microbiology. [31]. Pawar DD, Malik SVS, Bhilegaonkar KN, Barbuddbe SB (2000). Effect of nisin and its combination with sodium chloride on the survival of Listeria monocytogenes added to raw buffalo meat mince. Applied and enviromantal microbiology. [32]. Scannell AGM, Hill C, Ross RP, Marx S, Hartmeler W, Arendt EK (2000). Development of bioactive food packaging materials using immobillised bacteriocin Lacticin 3147 and Nisaplin ®. Int J Food Microbiol. [33]. Siragua GR, Cutter CN, Willett JL (1999). Incorporation of bacteriocin in plastic retains activity and inhibits surface growth of bacteria on meat. Food Microbiol. [34]. Suey – Ring Chi and Kuo – Hsuen Tseng (1998), Physico chemical properties of salted pickled yolks from duck and chicken egg, Journal of food science, volume 63, No.1. [35]. Young-Min Kim, Na-Kyoung Lee, Huyn-Dong Paik, Dong-Sun Lee (2000). Migration of bacteriocin from bacteriocin – coated film and its antimicrobial activity. Food science and Biotechnology, Vol.9, No.5, pp 325 – 329. [36]. Zottola EA, Yezzl TL, Ajao DB, Roberts RF (1994). Ultillization of cheddar cheese containing nisin as an antimicrobial agent in the other foods. Applied and enviromantal microbiology. PHUÏ LUÏC 1 QUY HOAÏCH THÖÏC NGHIEÄM Coâng thöùc tính heä soá phöông trình hoài qui: Phöông saùi taùi hieän: Vôùi n: Soá thí nghieäm taïi taâm. : giaù trò caùc thí nghieäm taïi taâm. : giaù trò trung bình cuûa Kieåm ñònh söï coù nghóa cuûa caùc heä soá hoài qui theo tieâu chuaån Student: Tra baûng tp(f) vôùi p = 0,1, f = n – 1 (vôùi n laø soá thí nghieäm taïi taâm)/ Caùc giaù trò tj  tp(f) ñöôïc xem laø coù nghóa. Caùc heä soá tj  tp(f) thì khoâng coù nghóa vaø loaïi khoûi phöông trình hoài quy. Nhaän phöông trình hoài quy vôùi caùc heä soá coù nghóa. Kieåm ñònh söï töông thích cuûa moâ hình vôùi thöïc nghieäm theo tieâu chuaån Fisher Vôùi N: soá thí nghieäm thöïc hieän khoâng phaûi ôû taâm. l: heä soá coù yù nghóa trong phöông trình hoài quy. Tra baûng vôùi p = 0,1, f1 = n, f2 = n-1 (n: laø soá thí nghieäm taïi taâm). Neáu F  Fp(f1,f2): phöông trình töông thích vôùi thöïc nghieäm. Neáu F  Fp(f1,f2): phöông trình khoâng töông thích vôùi thöïc nghieäm. Toái öu hoùa thöïc nghieäm theo phöông phaùp ñöôøng doác nhaát Sau khi laäp ñöôïc phöông trình hoài qui töông thích, xaùc ñònh chieáu höôùng cuûa caùc yeáu toá thu ñöôïc thoâng soá toái öu cao nhaát. Tieán haønh moät loaït caùc thí nghieäm leo doác theo böôùc chuyeån ñoäng môùi cuûa caùc yeáu toá. Toái öu hoùa theo ñöôøng doác nhaát baét ñaáu töø ñieåm khoâng laø möùc cô sôû. Choïn böôùc chuyeån ñoäng cuûa moät yeáu toá, ví duï xl laø l Caùc böôùc chuyeån ñoäng cuûa caùc yeáu toá xj khaùc ñöôïc tính nhö sau: Coâng thöùc Trong ñoù: : böôùc chuyeån ñoäng ñöôïc choïn cuûa yeáu toá l. : böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá j. bj, bl: nhöõng heä soá hoài quy cuûa phöông trình töông öùng. j, l: khoaûng bieán thieân cuûa caùc yeáu toá töông öùng. Ghi nhaän keát quaû toát nhaát ôû caùc thí nghieäm leo doác. PHUÏ LUÏC 2 Chæ tieâu vi sinh theo tieâu chuaån 667/ 1998/ QÑ – BYT ñoái vôùi saûn phaåm töø tröùng. Chæ tieâu vi sinhCfu/gTSVKHK103Coliforms10E. coli0S. aureus3Salmonella0  TOC \o "1-3" \h \z \u