Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ. Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay. Em xin gởi lòng biết ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng kỹ thuật. đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này. Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới. Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con ngƣời, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lƣợc tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái. Những kết quả đạt đƣợc:  Thu đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.  Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.  Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thƣớc 200bp.  Kết quả thực hiện phản ứng RAPD đƣợc xử lý trên mần mềm NTSYS thu đƣợc cây phân loài của những cây đem phân tích. Cây phân loài cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới. v SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD”. This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007. Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem. The obtained results were:  Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.  The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.  The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).  A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in 14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ......................................................................................... iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... xi Phần 1. GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Giới hạn của đề tài ............................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ...................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên ............................................................................................ 3 2.1.2. Cấu trúc ............................................................................................................ 6 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................... 7 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển .................................................................... 9 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................... 9 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) ................................................. 10 2.2.1. Vùng phân bố ................................................................................................. 10 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng ......................................................................... 11 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng .................................................................. 13 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ ....................... 13 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng .............................................. 14 vii 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền ......................................................................... 14 2.3.1. Đa dạng sinh học ............................................................................................ 14 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học .......................................... 14 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................ 15 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái ..................................................................................... 15 2.3.3.2. Đa dạng loài ................................................................................................. 15 2.3.3.3. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam ........................................................ 17 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật ............................................................. 18 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 19 2.5.1 Khái niệm ........................................................................................................ 19 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR .............................. 19 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 20 2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR .......................................................................... 21 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................. 21 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền .................... 22 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .............................................. 22 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR ........................................................................................ 23 2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ............................... 23 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) .......................................... 24 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 25 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................................ 30 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................................... 33 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................... 33 3.1.1. Thời gian tiến hành ......................................................................................... 33 3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33 3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 33 3.2.1. Mẫu thực vật.................................................................................................... 33 viii 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 34 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA ............................................................... 34 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA ............................................................. 35 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD .............................................. 36 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 36 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 37 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích ........................................................................ 39 3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel ...................... 39 3.3.2.2. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế ............................................ 39 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD ............................................................................... 40 3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 ..................................... 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 43 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ............... 43 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu ........................................................................ 44 4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số ............................................................. 44 4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD .................................................... 47 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 ....................................................................................... 47 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................................... 50 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ .......................................................................................................... 50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 54 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 54 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ................... 40 Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 40 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ................ 41 Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 ............................................................ 47 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 5 Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. ................................. 11 Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. ......................................................................... 12 Hình 2.4. Trái mắm trắng. ......................................................................................... 12 Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. ..................................................... 20 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI .................................................... 26 Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. ...................................... 26 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. .......................... 27 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. ................................. 28 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP ................................................... 29 Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR ........................ 30 Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ ......................... 43 Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 ........................................ 45 Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. .............................................................. 45 Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu ....................................................... 46 Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 ............................................................... 46 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 48 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 48 Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) .............................................................................................. 49 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng ............................... 50 Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng ....................................... 51 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích ......................... 52 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µl: microlite  µM: micromol/lite  bp: base pair  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate  Kb: kilobases  mM: milimol/lite  m: mét  nm: nanomét  OD: Optical density.  PCR: Polymerase chain reaction  pmol: picomol  RNA: Ribonucleic acid  Rnase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của enzyme 1 Phần 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển trên Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lƣu quốc tế. Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ. Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ. Quần thể mắm trắng tại đây chủ yếu là phát triển tự nhiên. Tuy nhiên, qua thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trƣớc sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng. Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng. Đáp ứng yêu cầu đó, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, và dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: 2 “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích  Tối ƣu hóa quy trình ly trích DNA và bƣớc đầu hoàn thiện quy trình thực hiện phản ứng RAPD thích hợp cho cây mắm trắng.  Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ. 1.3. Yêu cầu  Thu thập đƣợc nhiều mẫu đặc trƣng, mang tính đại diện cao cho quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, chú ý đến những mẫu đặc biệt, cá biệt trong quần thể, ghi nhận tọa độ chính xác của mỗi cá thể.  Ly trích thành công DNA từ các mẫu đã thu đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch và số lƣợng cho các phân tích tiếp theo.  Thiết lập quy trình RAPD - PCR trên cây mắm trắng cho độ tin cậy cao. 1.4. Giới hạn của đề tài  Số lƣợng các primer đƣợc sử dụng còn bị hạn chế.  Chƣa có điều kiện khảo sát quần thể mắm trắng với số lƣợng mẫu lớn.  Việc tìm kiếm những cá thể đặc biệt bị giới hạn do điều kiện đi lại trong rừng gặp nhiều khó khăn.  Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian ngắn, từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007, do đó chƣa phản ánh đúng đắn và chính xác với tất cả các giống hiện có. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm trên địa bàn huyện Cần Giờ, một huyện ngoại thành của TP Hồ Chí Minh, nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông Đồng Nai, là cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km. Đây là khu dự trữ sinh quyển mang đặc điểm của hệ sinh thái cửa sông ven biển, hệ động thực vật đặc trƣng cho hệ sinh thái rừng ngập mặn. Vùng rừng ngập mặn bị chia cắt bởi hệ thống sông rạch dày đặc gồm sông lớn nhƣ Lòng Tàu nằm giữa khu rừng (đƣờng thủy ra vào cảng Sài Gòn), sông Đồng Tranh, sông Nhà Bè, sông Thị Vải, sông Gò Gia, và nhiều rạch khác [19]. Trƣớc năm 1960, rừng ngập mặn Cần Giờ (có tên gọi thông thƣờng là Rừng Sác) có tới hơn 40.000 ha cây rừng, đƣợc xếp hạng rừng giàu. Rừng có cấu trúc dày đặc với tán rừng dày, cao trên 25 m, đƣờng kính 25 – 40 cm, là sinh cảnh của nhiều động vật hoang dã. Trong rừng, đƣớc (Rhizophora apiculata) là loài chiếm ƣu thế, bên cạnh các quần thể khác nhƣ bần đắng (Sonneratia alba), mắm trắng (Avicennia alba), đƣng (R. mucronata), vẹt (Bruguiera spp.), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnitzera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria agallocha) [5], [19]. Trong suốt thời gian chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ là đối tƣợng tàn phá của nhiều phƣơng tiện chiến tranh, đặc biệt bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do chất độc hóa học, liên tục từ năm 1961 đến năm 1971, hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ biến mất. Một số ít cây dà (Ceriops spp), giá (Excoecaria agallocha) ven bờ kênh rạch tái sinh theo từng cụm nhỏ, nơi đất ngập triều có mắm, trên đất cao có chà là nƣớc (Phoenix paludosa) và các loài ráng đại (Acrostichum aureum), dây mủ (Gymnanthera mitida), cóc kèn 4 (Derris trifoliata), chùm lé (Azima sarmentosa), lức (Pluchea indica), chùm gọng (Clerodendrum inerme) [5]. Sau giải phóng, một chƣơng trình lớn đƣợc thực hiện: khôi phục rừng ngập mặn Cần Giờ vì yêu cầu cấp bách khắc phục hậu quả nghiêm trọng đối với môi trƣờng TP Hồ Chí Minh do chiến tranh hóa học gây ra. Từ năm 1967 đến nay, công việc tái tạo rừng đƣợc thực hiện mạnh mẽ. Đến nay diện tích rừng ngập mặn Cần Giờ vào khoảng 38.000 ha. Sau hơn 30 năm bảo tồn và phát triển, rừng ngập mặn Cần Giờ vinh hạnh đƣợc UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển với tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh và tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ [19], [21]. Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có tọa độ địa lý và các đặc điểm nhƣ sau:  Vĩ độ Bắc: 10o22’14” – 10o37’39”  Kinh độ Đông: 106o46’12” – 107o00’59”  Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000.  Tổng diện tích: 71.370 ha, chiếm tới 1/3 diện tích đất đai toàn TP Hồ Chí Minh. Trong đó diện tích rừng và đất liền là 38.664 ha (chiếm khoảng 54,2%).  Dân số: 57.650 ngƣời (nguồn thống kê tháng 7/1999 của huyện Cần Giờ), với 40% số hộ thuộc diện xóa đói giảm nghèo, sống chủ yếu dựa vào khai thác tài nguyên rừng [5], [8], [19]. 5 Hình 2.1. Bản đồ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp 6 2.1.2. Cấu trúc Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp [5]. Vùng lõi (4.721 ha): đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn, gồm các tiểu khu rừng số 4b, 6, 11, 12 và 13. Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động của con ngƣời và có các chức năng chính nhƣ sau:  Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.  Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.  Bảo tồn hệ thống thuỷ vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.  Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn [5]. Vùng đệm (37.339 ha): tiếp giáp với vùng lõi, là nơi có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn trong vùng lõi, bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 3, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi. Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng Sác, thăm vƣờn chim, vƣờn cò, vƣờn dơi sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ngƣời dân, nâng cao ý thức và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển. Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã nhƣ khỉ, rái cá, kỳ đà kiếm ăn. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung 7 vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm [5]. Vùng chuyển tiếp (29.310 ha): gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thuỷ sản của dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ. Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng, tạo điều kiện thuận lợi và đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng [5]. 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu dự trữ sinh quyển thế giới đầu tiện tại Việt Nam, và là thành viên thứ 368 của mạng dự trữ sinh quyển quốc tế thuộc 97 quốc gia. Đến tháng 7/2002, Rừng ngập mặn Cần Giờ tiếp tục đƣợc Tổ chức Du lịch thế giới (World Tourism Organization) công nhận là Khu du lịch Sinh thái bền vững nhất (là 1 trong 65 khu đƣợc thế giới công nhận). Theo Ủy ban Quốc gia Con ngƣời và Sinh quyển Việt Nam (MAB), rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á, đặc biệt là còn rất ít trên thế giới [5], [19]. Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều loài hải sản, chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ, trên cạn [19]. Rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cƣ. Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35 loài thực vật, phổ biến là đƣớc đôi (Rhizophora apiculata), đƣng (Rhizophora mucronata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans) [19]. 8 Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại nhanh chóng ở nơi đây nhƣ khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá, trong đó có nhiều loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam nhƣ Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa. Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các sân chim tự nhiên đã và đang hình thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nƣớc ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài quí hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới. Động vật không xƣơng sống thủy sinh ở rừng ngập mặn Cần Giờ có hơn 700 loài, đặc biệt những loài giáp xác, nhuyễn thể có giá trị kinh tế cao. Trong rừng Cần Giờ có 137 loài cá, 40 loài lƣỡng thể và bò sát, 130 loài chim, 19 loài thú. Rừng ngập mặn thực sự là cầu nối giữa hệ sinh thái thủy vực và hệ sinh thái trên cạn, giữa hệ sinh thái ngập triều và hệ sinh thái ngập nƣớc lợ và lũ sông nƣớc ngọt [19]. Bên cạnh những giá trị về đa dạng sinh học, Cần Giờ còn là nơi lần đầu tiên ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á phát hiện khu mộ cổ chum (trên 300 ngôi), di chỉ có giá trị về nền văn hoá Óc Eo [19]. Ngoài ra, lịch sử phát triển Cần Giờ còn gắn liền với tên tuổi Nguyễn Huệ (chiến thắng trên sông Soài Rạp), Nguyễn Lữ, Trƣơng Định và những chiến công của quân dân trong thời kỳ kháng chiến chống ngoại xâm trong chiến khu Rừng Sác [19]. Những giá trị văn hoá bản địa của cộng đồng ngƣời dân nơi đây cũng rất phong phú và mang đậm bản sắc, gắn liền với các lễ hội theo ngành nghề cổ truyền: làng chài thờ Thần Nam Hải (Cá voi); làng rừng, làng nông thờ Hà Bá, Thủy Quan sông rạch [ 19]. Rừng ngập mặn ở đây có những tổ hợp gien đặc biệt có thể sống và phát triển tốt trong điều kiện nƣớc mặn, ngập nƣớc triều mà các loại cây khác không thể sống đƣợc. Tuy là rừng trồng nhƣng rừng ngập mặn Cần Giờ đạt đƣợc hệ sinh thái giống nhƣ rừng tự nhiên. Một ƣu thế nữa là rừng ngập mặn Cần Giờ nằm trong một thành phố công nghiệp đông dân cƣ, rất thuận lợi để phát triển du lịch, giáo dục, hợp tác quốc tế vô cùng thuận lợi [5]. 9 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển Các khu dự trữ sinh quyển là đại diện mẫu của các hệ sinh thái trên Trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái, đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng và Quốc tế [5]. Hiện nay trên thế giới có 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 nƣớc [5]. Khu dự trữ sinh quyển có các chức năng sau:  Bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn địa dạng cảnh quan, hệ sinh thái loài và vốn gien di truyền.  Phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế dựa trên cơ sở bền vững môi trƣờng và văn hóa.  Trợ giúp: nghiên cứu, giám sát, đào tạo và giáo dục về bảo tồn và phát triển bền vững địa phƣơng, Quốc gia, khu vực và Quốc tế. 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ Trong chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do chất độc hóa học của Mỹ. Hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây chính của rừng nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ bị biến mất [19]. Sau chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc tái sinh theo kế hoạch trồng và phát triển rừng của thành phố Hồ Chí Minh, nhanh chóng trở thành Khu rừng phòng hộ (1991) và Khu dự trữ sinh quyển thế giới (2000). Tuy nhiên hiện nay rừng ngập mặn Cần Giờ đang đứng trƣớc những nguy cơ đe dọa đáng báo động [21]. Việc nghiêm cấm tỉa thƣa rừng của Ủy ban Nhân dân thành phố Hồ Chí Minh ban hành (6/1999) làm chất lƣợng rừng có xu hƣớng xấu đi, do cạnh tranh không gian, dinh dƣỡng và tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển. Chiều cao của cây quá cao (với tuổi đời 19 – 27 chiếm đa số), cộng với thiếu ánh sáng nên đƣờng kính thân không cân đối, làm thiệt hại đáng kể đến thu nhập từ nguồn gỗ. Mặc khác, việc lƣu thông tàu bè đã làm xói lở ven bờ, khói thải, dầu làm ảnh hƣởng đến môi sinh. Nhiều hộ dân cƣ vẫn còn sinh sống và sản xuất trong rừng làm ảnh hƣởng đến dòng chảy, nguồn nƣớc, tạo các dịch bệnh cho cây rừng. Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu 10 bệnh hại cây rừng, nhƣ sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng của cây rừng. Thêm vào đó, việc mở con đƣờng Rừng Sác băng qua rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay càng làm tăng thêm mối đe dọa đến môi sinh và sinh thái rừng nghiêm trọng [21]. Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài cây rừng có giá trị để làm tiền đề cho công tác chọn giống, khôi phục rừng đang trở thành một vấn đề cấp bách hiện nay. 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba)  Tên Việt Nam: mắm trắng  Tên Latinh: Avicennia alba  Vị trí phân loại cây mắm trắng [17]: 2.2.1. Vùng phân bố Mắm trắng là một nhóm các loài cây rừng ngập mặn phân bổ rộng khắp trên thế giới, trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa lúc triều lên và triều xuống, về phía nam của Bắc chí tuyến, phổ biến ở Rừng Sác Việt Nam (Cà Mau, Cần Giờ) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin, Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline [15]. (Superrgnum): Eukarya Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Lamiales Họ (familia): Acanthaceae hay Avicenniaceae Chi (genus): Avicennia Loài (species): Avicennia alba 11 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng Hình dạng: Thân gỗ, có thể cao đến 20 m, đƣờng kính 0,5 m, thân ít khi thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với rừng đƣớc (Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần [17]. Hình 2.2. Cây mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ 2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dƣới phủ lông màu trắng bạc, gân bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thƣa ở cả mặt dƣới và mặt trên, lá khô có màu đen ở mặt trên [17]. 12 Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài bằng nhau, vành đứng hình ống thẳng có 4 thùy bằng nhau, 4 tiểu nhị (2 dài, 2 ngắn), tua nhị ngắn và trơn, bao phấn có buồng song song, hình bầu dục, bầu nhụy hình bầu dục, hơi mịn ở đầu, có nhựa thơm, 4 tiểu noãn tròn dài gắn ở đầu 1 trục, vòi nhụy rất ngắn 1 mm, trơn đầu chẻ đôi [17]. Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. Trái: Trái là manh nang hình tim, phồng lên ở một bên làm mũi trái cong qua 1 bên, dài 2 cm, vỏ dày lông mịn, xanh lục, 1 hột, không phôi nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trƣớc khi trái rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có nhiều lông trắng [17]. Hình 2.4. Trái mắm trắng. 13 Nơi sống: Mắm trắng là loại cây ƣa sáng, sinh trƣởng nhanh, thích nghi với nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt). Mắm trắng là loài cây cho chồi gốc, thƣờng trổ hoa vào đầu mùa mƣa (tháng 4 – 6 dƣơng lịch), cho trái vào cuối mùa mƣa (tháng 9 – 11 dƣơng lịch). Chỉ vài giờ sau khi trái rụng, cây mầm bên trong hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành cây mới. Mắm trắng thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, nơi có mực thủy triều lên xuống hàng ngày. Nói chung "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trƣởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15]. 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15]. Gỗ cây mắm trắng trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. Vì thiếu nguồn cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đƣớc và vẹt [17]. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm ở lợi ích trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ (riêng Cà Mau vài km²/năm) [15]. 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ Trong tƣơng lai gần quần thể mắm trắng tại Cần Giờ sẽ lâm vào tình trạng nguy cấp do khai thác bừa bãi quá mức, không có kế hoạch, chặt cây phá rừng lấy đất làm đầm nuôi tôm và sản xuất nông nghiệp khác [16]. 14 Bên cạnh đó việc phá rừng, phóng đƣờng đã và đang gây nhiều ảnh hƣởng đến diện tích và môi sinh của cây mắm trắng. Do đó mặc dù diện tích rừng và trữ lƣợng cây rất lớn nhƣng lại bị giảm sút nhanh chóng và ngày càng nghiêm trọng, mức độ đe dọa: bậc V [16]. Do đó các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên các cây rừng ngập mặn nói chung và cây mắm trắng nói riêng rất đƣợc chú trọng đầu tƣ và khuyến khích thực hiện. 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng Những nghiên cứu trên cây mắm trắng chủ yếu đƣợc thực hiện ở trong nƣớc ta, nguyên nhân có thể là do mắm trắng không phải là quần thể thực vật tiên phong chính tại các rừng ngập mặn khác trên thế giới (mà thay vào đó là quần thể mắm biển). Tuy vậy những nghiên cứu đã thực hiện chủ yếu là điều tra, khảo sát các đặc điểm sinh lý, tình hình sâu bệnh, ít có những nghiên cứu thực sự ở mức độ phân tử. Một số đề tài nghiên cứu đã thực hiện: Phân bố rễ Mắm trắng trên các vùng có mức độ ngập triều khác nhau ở Cần Giờ TP Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 2006) 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền 2.3.1. Đa dạng sinh học Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng” [8]. 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta [9]. 15 Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế đƣợc, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và bền vững của loài ngƣời [22]. 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học. Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và có mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Các nhân tố hữu sinh gồm có nhóm sinh vật tự dƣỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp trở lại cho thực vật. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình). Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9]. 2.3.3.2. Đa dạng loài Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất. Sự đa dạng này đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định bởi một trong hai cách:  Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Cách phân loại này thƣờng đƣợc các nhà phân loại học, sinh học vận dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.  Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách 16 này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan hệ về gien [8]. Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992). Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Ngƣợc lại, các phân loài đôi khi giống nhau đến mức tƣởng nhƣ chúng là các thành viên của cùng một loài. Trong thiên nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu tạo hình thái hay sinh lý nhƣng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối đƣợc với nhau [8], [22]. Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết. 2.3.3.3. Đa dạng di truyền Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ. Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau. Sự đa dạng về bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gien là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trƣng cho những protein riêng biệt. Những hình thái khác nhau của gien đƣợc thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gien trong di truyền học đƣợc tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các 17 gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gien trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thƣờng mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng [9], [22]. 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế giới. Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới. Song sự đa dạng này đang bị đe dọa vì môi trƣờng sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây dựng đập nƣớc và đƣờng xá cũng nhƣ việc mở rộng các hoạt động công nghiệp. Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi trƣờng. Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự là vấn đề chất lƣợng. Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất. Hiện có 700 loài sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mức độ ô nhiễm thƣờng xuyên vƣợt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa. Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hƣởng xấu đến đa dạng sinh học [8]. 18 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng sinh học [6]. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Mục đích cuối cùng là để thu đƣợc DNA tinh khiết cho những phân tích tiếp theo [2], [12], [14]. Quy trình chiết tách gồm 3 bƣớc cơ bản sau:  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Mô đƣợc nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc). Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. 19 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1. Khái niệm Kỹ thuật PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu [8]. 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR DNA mẫu: Đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần khiết [1]. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức : DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Primer (mồi): Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác [2]. 20 Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F – primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngƣợc). dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Dung dịch buffer: Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động. Taq DNA polymerase: Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại. Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 40 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 21 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7]. Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép đƣợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 96 0 C). Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung