Bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt một số loài sâm thuộc chi panax

Kết quả nghiên cứu 32 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Các mẫu Panax STQ SM SH1 SH2 TTTQ TTVN SVN SH3 Hình 3.1 Các mẫu Panax thu thập được Kết quả nghiên cứu 33 3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng STQ SM SH1 SH2 TTTQ TTVN SH3 SVN Hình 3.2 Sắc kí đồ lớp mỏng dịch chiết các mẫu Bảng 3.1 Sự hiện diện của các vệt trên SKLM theo giá trị Rf Rf 0,26 0,34 0,38 0,47 0,54 0,59 STQ + + + SM + + SH1 + + + + + + SH2 + + + + + + TTTQ + + + + + TTVN + + + SVN + + + + + SH3 + + + + + Kết quả nghiên cứu 34 Nhận xét:  Sắc kí đồ của SH1, SH2, TTTQ, SVN, SH3 có nhiều vết tương đương nhau nhưng độ đậm của các vết khác nhau.  Sắc kí đồ của STQ, SM, TTVN cũng có những vết tương đương nhưng cho ít vết hơn.  Kết quả sắc kí đồ cho thấy các mẫu có các vết sắc kí phù hợp với tiêu chí của Dược điển. 3.3 Chiết tách DNA Chiết tách DNA theo qui trình trên, dịch chiết DNA được kiểm tra bằng cách định lượng trên máy quang phổ UV. Bảng 3.2 Kết quả đo quang DNA Mẫu A260 A280 Tỷ lệ A260/ A280 STQ 0,490 0,270 1,81 SM 0,484 0,252 1,92 SH1 0,485 0,278 1,74 SH2 0,457 0,254 1,8 TTTQ 0,545 0,287 1,9 TTVN 0,483 0,274 1,76 SVN 0,552 0,283 1,95 SH3 0,428 0,238 1,8 Nhận xét: Phương pháp chiết trên phù hợp cho Panax, tuy nhiên dùng nitơ lỏng nghiền mẫu thành bột mịn để phá vỡ tế bào là quan trọng. Kết quả nghiên cứu 35 3.4 Kết quả PCR 3.4.1 Vùng ITS Tiến hành PCR với cặp mồi ITS_AF và ITS_BR trên các mẫu DNA chiết được. Thu được kết quả: M 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.3 Sản phẩm PCR vùng ITS (M: Thang 1000bp) Nhận xét: Các mẫu Panax cho sản phẩm PCR ở vùng ITS có kích thước phù hợp với dự đoán trong khoảng 700 đến 750bp, ngoại trừ mẫu STQ, SH1 (giếng 1, 3) không cho sản phẩm PCR. 3.4.2 Vùng 18S Tiến hành PCR với cặp mồi 18SCOM_F và 18SCOM_R trên các mẫu DNA chiết được. Kết quả thu được 500bp 1000bp Kết quả nghiên cứu 36 M 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.4 Sản phẩm PCR vùng 18S Nhận xét: Các mẫu Panax cho sản phẩm PCR ở vùng 18S có kích thước phù hợp với dự đoán trong khoảng 500 đến 550bp, ngoại trừ mẫu TTVN (giếng 6) không có sản phẩm PCR. 3.5 Kết quả giải trình tự Các sản phẩm PCR được tinh sạch, sau đó được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được Blast trên NCBI. Một trình tự đem so sánh càng tương đồng cao với các trình tự trên NCBI nếu có giá trị E-value thấp (càng về 0) và giá trị Max ident, Query coverage cao (càng gần 100%) 3.5.1 Vùng ITS Kết quả Blast trên NCBI cho thấy các mẫu đều thuộc chi Panax và có kết quả loài gần nhất phù hợp (chi tiết xem ở Phụ lục 1). Tuy nhiên, kết quả giải trình tự không thể phân biệt được nguồn gốc của dược liệu do sự khác biệt không cao giữa các mẫu (mức tương đồng trên 95%). Việc xác định cây phân loài được thực hiện bằng cách dùng phần mềm Bionumeric để so sánh sự liên quan của các mẫu này với các trình tự trong Gen Bank (Hình 3.5). Hình 3.5 Kết quả phân tích các trình tự ITS bằng Bionumerics 500bp 1000bp Kết quả nghiên cứu 37 Bảng 3.3 Kết quả Blast các trình tự vùng ITS trên NCBI 3.5.2 Vùng 18S Kết quả Blast trên NCBI cho thấy các mẫu đều thuộc chi Panax. Tuy nhiên không thể xác định được loài gần nhất vì không có sự khác biệt giữa mẫu được Blast với các trình tự trên NCBI (mẫu đem so sánh có giá trị Max ident và Query coverage giống với nhiều loài thuộc chi Panax trên Genbank) (chi tiết xem ở Phụ lục 2). Điều này có thể là do mức độ bảo thủ cao của trình tự 18S. Nhận xét: Kết quả Blast các trình tự vùng ITS và 18S cho thấy các mẫu dược liệu đều thuộc chi Panax. Tuy nhiên, kết quả trên vùng 18S không thể phân biệt các loài do mức độ bảo tồn cao của vùng này giữa các loài có quan hệ gần. Dựa vào kết quả trên vùng ITS, chúng tôi có thể xác định loài có quan hệ gần nhất với các mẫu (Bảng 3.3), tuy nhiên không thể phân biệt được nguồn gốc của dược liệu do ít có sự khác biệt giữa các mẫu. Hình 3.6 Kết quả phân tích các trình tự 18S bằng Bionumerics Mẫu Loài gần nhất Query coverage (%) Max ident (%) SM Panax quinquefolius 98 98 SH2 Panax ginseng 98 99 TTTQ Panax notoginseng 97 98 TTVN Panax notoginseng 98 97 SVN Panax quinquefolius Panax vietnamensis 96 98 SH3 Panax ginseng 96 99 Pairwise (OG:100%,UG:0%) (FAST:2,10) Gapcost:0% ITS 1 0 0 9 9 9 8 9 7 9 6 P. pseudoginseng var. bipinnatif. P. zingiberensis P. japonicus var. bipinnatifidus P. pseudoginseng var. eleganti. P. vietnamensis specimen-vou. P. ginseng P. ginseng cultivar Chunggyung P. ginseng cultivar Chunpoong P. ginseng cultivar Hwang-Sook P. ginseng cultivar Yunpoong SH3 P. ginseng isolate KGD4 P. ginseng isolate KGD5 P. ginseng isolate KW1 P. ginseng isolate ac22 P. quinquefolius TTVN P. pseudoginseng var. angustifo. SH2 SVN P. notoginseng P. notoginseng specimen-vouc. TTTQ SM P. stipuleanatus 100 99.5 100 99.4 99.2 100 99.3 99.0 99.0 100 99.1 99.2 98.8 98.7 100 99.1 98.9 98.9 98.7 98.8 100 99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100 99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100 100 99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100 100 100 98.8 98.9 98.5 98.4 98.5 99.7 100 100 100 100 100 99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 100 99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 100 100 99.0 98.7 98.6 98.5 98.7 99.7 99.8 99.8 99.8 99.8 99.6 99.7 99.7 99.7 100 99.4 99.2 99.1 99.0 99.1 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.0 99.5 99.5 99.5 99.1 100 98.4 98.1 98.1 98.2 97.9 99.2 99.1 99.1 99.1 99.1 99.2 98.9 98.9 98.9 99.0 99.0 100 98.7 98.4 98.4 98.5 98.2 98.4 98.2 98.2 98.2 98.2 98.1 98.4 98.4 98.4 98.2 98.4 98.4 100 97.5 97.9 97.1 97.3 97.0 98.3 98.5 98.5 98.5 98.5 98.0 98.3 98.3 98.3 98.1 97.6 98.9 97.0 100 97.9 98.4 97.6 97.8 97.9 97.6 98.2 98.2 98.2 98.2 97.4 98.4 98.4 98.4 97.5 97.8 96.6 97.2 96.3 100 97.4 97.3 97.1 96.9 97.4 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.3 97.3 97.3 96.9 97.4 96.8 96.3 95.8 97.4 100 97.6 97.3 97.3 97.2 97.6 97.3 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.3 97.3 97.3 97.2 97.6 97.1 96.6 95.8 96.9 100 100 96.3 96.6 96.0 95.9 96.3 96.0 96.4 96.4 96.4 96.4 96.2 96.6 96.6 96.6 95.9 96.3 96.0 95.3 95.1 96.3 99.0 98.4 100 96.9 96.7 96.6 96.9 96.5 96.8 96.7 96.7 96.7 96.7 96.5 96.8 96.8 96.8 96.6 97.1 97.0 96.1 96.7 95.5 95.4 95.6 94.6 100 96.3 95.8 96.0 95.9 96.3 96.2 95.8 95.8 95.8 95.8 95.9 96.0 96.0 96.0 96.0 96.3 95.3 95.3 95.0 95.4 95.0 95.4 94.1 93.4 100 Pairwise (OG:100%,UG:0%) (FAST:2,10) Gapcost:0% 18S 1 0 0 9 5 9 0 8 5 P. japonicus var. major P. pseudoginseng subsp. himalaic. P. ginseng P. notoginseng isolate:R2 P. vietnamensis P. vietnamensis var. fuscidiscus P. pseudoginseng var. bipinnatifid. P. quinquefolius P. stipuleanatus P. zingiberensis P. notoginseng SVN SM SH3 TTTQ P. notoginseng isolate:R3 SH2 STQ SH1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.2 100 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.6 98.8 100 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.6 97.1 99.5 100 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 97.0 96.7 99.3 98.0 100 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 95.0 96.4 94.7 95.1 100 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 95.8 95.8 98.0 96.5 96.6 93.5 100 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.0 88.5 88.4 86.9 86.3 87.8 87.0 100 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.8 82.5 81.8 81.4 81.8 72.6 79.9 70.9 100 Kết quả nghiên cứu 40 3.6 Phân tích RFLP 3.6.1 Vùng ITS Đoạn ITS sau khi được PCR và tinh chế được cắt bằng 2 enzym HaeIII và HindIII để nghiên cứu sự đa hình các đoạn cắt. Kết quả như sau: M SM SH2 TT TQ TTVN SVN SH3 Hình 3.7 Kết quả cắt giới hạn đoạn ITS (M: Thang 100bp) Kết quả được phân tích bằng phần mềm Bionumerics 3.0 Kết quả nghiên cứu 41 Hình 3.8 Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm RFLP đoạn ITS Nhận xét:  Các mẫu SM, SH2, SH3 có mức tương đồng cao cho thấy chúng có quan hệ gần với nhau.  Các mẫu TTTQ (Trung Quốc), TTVN (Việt Nam) được cho là Panax notoginseng nhưng có độ tương đồng thấp (dưới 50%). Nguyên nhân có thể là do nguồn gốc, điều kiện sinh trưởng, thổ nhưỡng khác nhau.  Mẫu SVN (Sâm Việt nam) có mức độ tương đồng thấp so với các mẫu còn lại. 3.6.2 Vùng 18S Đoạn 18S sau khi được PCR và tinh chế được cắt bằng 2 enzym HaeIII và HindIII để nghiên cứu sự đa hình các đoạn cắt. Kết quả như sau: Kết quả nghiên cứu 42 M STQ SM SH1 SH2 SH3 SVN TTTQ Hình 3.9 Kết quả cắt giới hạn đoạn 18S (M: Thang 100bp) Kết quả được phân tích bằng phần mềm Bionumerics 3.0 Hình 3.10 Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm RFLP đoạn 18S Nhận xét:  Nhìn chung, phân tích trên vùng 18S cho kết quả tương đồng cao hơn trên vùng ITS vì vùng 18S có mức bảo tồn cao hơn.  Các mẫu STQ, SH1 có mức tương đồng khá cao (khoảng 73%) cho thấy chúng có nguồn gốc gần nhau (các mẫu này được thu mua từ các cửa hàng sỉ Kết quả nghiên cứu 43 và lẻ ở quận 5 có nguồn gốc Trung Quốc). Các mẫu SH2, SH3 (nguồn gốc Hàn Quốc) có mức tương đồng cao (khoảng 94%). Như vậy có sự khác biệt giữa các mẫu Nhân sâm có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc (khoảng 20%) giữa hai nhóm. 3.7 Phân tích RAMS 3.7.1 Xác lập điều kiện tiến hành 3.7.1.1 Lựa chọn mồi và nhiệt độ gắn mồi thích hợp Tiến hành PCR với nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho từng mồi RAMS1, RAMS2, RAMS3 và RAMS4. Thu được kết quả như sau: R1 R2 R3 R4 Hình 3.11 Kết quả PCR RAMS với các mồi khác nhau R1: mồi RAMS1, nhiệt độ gắn mồi: 37,5oC R2: mồi RAMS2, nhiệt độ gắn mồi: 53oC R3: mồi RAMS3, nhiệt độ gắn mồi: 53oC R4: mồi RAMS4, nhiệt độ gắn mồi: 33,5oC Nhận xét: Mồi R2, R3, R4 không cho sản phẩm. Mồi R1 cho sản phẩm khi phân tích trên gel nên được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo. Kết quả nghiên cứu 44 3.7.1.2 Dò tìm nồng độ Mg2+ thích hợp Tiến hành PCR với mồi R1, nồng độ Mg2+ khảo sát 1,5; 2; 2,5; 3mM. Thu được kết quả: 1,5 2 2,5 3 Hình 3.12 Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ Nhận xét:  Nồng độ ion Mg2+ ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình PCR.  Kết quả trên cho thấy ứng với nồng độ độ ion Mg2+ 2mM thì sản phẩm PCR cho vết băng rõ và đa hình nhất. Từ các kết quả thực nghiệm trên, các thông số cho kỹ thuật RAMS được xác định như sau: mồi R1, nhiệt độ gắn mồi 37,5oC, nồng độ Mg2+ 2mM. 3.7.2 Tiến hành RAMS Trên cơ sở các thông số đã thiết lập (mồi, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ ), tiến hành RAMS trên các mẫu DNA thu được kết quả như sau: Kết quả nghiên cứu 45 M SM SH1 SH2 TTTQ SH3 SVN Hình 3.13 Kết quả tiến hành RAMS (M: Thang 1000bp) 3.7.3 Phân tích bằng Bionumeric Hình 3.14 Kết quả phân tích đa hình thử nghiệm RAMS Nhận xét: Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm PCR RAMS trên phần mềm Bionumeric cho thấy mức độ đa hình giữa các mẫu không cao (dưới 15%). Điều này có thể do số lượng mẫu phân tích ít và chỉ có một mồi được áp dụng. Như vây, đối với phương pháp RAMS cần dùng số mẫu lớn và kiểm tra nhiều mồi để làm tăng các dấu ấn đa hình.