Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

ông thành công. Mô động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mô thực vật mới được nuôi cấy. Năm 1934 White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ nuôi cấy chồi ngọn. Ông đã thành công trông việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy (White (1951),Gauthere (1939),Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)). Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nảy chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỷ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay. Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hoá. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hóa. Ở Việt Nam Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển ở Việt Nam sau chiến tranh thế giới kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào đầu tiên được xây dựng đầu tiên ở viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Các kết quả đầu tiên về nuôi cấy thành công bao phấn lúa và thuốc lá được công bố năm 1978 (Leâ Thò Muoäi vaø cs,, 1978; Leâ Thò Xuaân vaø cs,, 1978). Tiếp đó là thành công về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trong cùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nông Nghiệp I (ĐHNNI) Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào cũng được thành lập chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây . Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện Di Truyền Nông Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà ở cả một số tỉnh và cơ sở sản xuất(Yên Bái ,Hưng Yên, Thanh Hóa.). Giữa những năm 1980 trở lại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(viện Công Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, viện DTNN) và cây công nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước (Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994). Các kết quả về dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN. Nuôi cấy các dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao cũng đã và đang phát triển. Các giai đoạn nhân giống invitro [5] Cho tới nay việc nhân giống invitro đã áp dụng cho nhiều loại cây (350 loài, Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn : Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi. Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro. Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con. Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên. Các phương pháp nhân giống invitro [5] Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và nuôi cấy chồi bên). Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển thân, ra lá và rể để thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển dần ra đất và thích nghi bình thường. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phân hóa của các tế bào đã được phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đạt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các chất thích hợp được bổ sung vào môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. + Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm có mô sẹo. + Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh. Nuôi cấy protoplast-chuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật). Khi tế bào chất mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4] Nguồn gốc Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae. Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con bướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”. Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á như Philippine, Inđônêsia, bán đảo Đông Dương. Quê hương của lan Hồ Điệp là các nước của vùng Đông Nam Á, rừng Việt Nam không có loài Phalaenopsis amabilis, chỉ có 5 loài tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsis lobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi. Lan Hồ Điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài LoanHiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều. Đặc điểm Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau. Hoa nở luân phiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vài tháng. Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh xoè rộng kín, sắc đẹp. Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như con bươm bướm. Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinh xắn đang bay lượn chập chờn. Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứa đầy phấn hoa. Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây. Số lượng càng nhiều thì cây càng sung sức. Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống. Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏLan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày với điều kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hoàn chỉnh. Khi cây có trên 4 lá mới có thể phân hoá mầm hoa. Loài lan này có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Nhưng nó vốn vẫn là loài hoa khó tính. Điều kiện sinh thái [5] Nhiệt độ [3] Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồng Lan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25-280C, ban đêm là 18-200Cgiai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C . Nếu nhiệt độ nhà trông nhỏ hơn 150C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiện các đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là 25 0C, ban đêm 10-200C, kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa. Nước tưới Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho không một lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm. Trong mùa mưa mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng, một lần vào 3 giờ chiều. Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa. Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng 1 ngày 3 lần. Điều kiện thoát nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp không thể chịu được một độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển. Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới với nồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên. Nên nhớ, Hồ Điệp là loài lan thích hợp với giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phôtphoric để giảm pH của nước. Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưa nặng hạt cũng không kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết do những cơn mưa đầu mùa. Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta không kiểm soát được. Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng những tấm tôn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa không cần thiết và tạo được những tia sáng khuếch tán rất lý tưởng. Vào mùa khô, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này ẩm độ trong không khí giảm xuống rõ rệt. Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đích tạo cho cây tăng trưởng liên tục. Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển cây sang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên. Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trong mùa khô rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp. Ánh sáng [3] Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp che sáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng cho thích hợp. Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux, giai đoạn cây bánh tẻ là 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000-30.000 lux. Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75-85% ánh sáng, cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơn chỉ cần che 40-50% là đủ. Độ thông thoáng Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt. Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tôn nhựa xanh để che. Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quả hơn. Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn. Dinh dưỡng Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ . Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15 ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ Cách tưới phân + Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10, sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa. Tuy nhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cường lượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18 (dù là cây con), để cây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh. + Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thời tiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30, đến khi cây bắt đầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn. Không nên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầu héo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây. Khi cắt cành hoa càng sớm thì lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn. Sâu bệnh Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rất khó trị và có thể làm chết cây. Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới và dinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng cho cây. Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâm nhập gây bệnh thối nhũn trên lá. Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị như Malathion, lannat để phòng trị. Chậu, giá thể, cách trồng Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ có thể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được. Chậu phải thật sạch không có rêu bám trên thành chậu. Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút làm giá thể để trồng lan Hồ Điệp. Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng. Nhưng có điểm chung là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cách trồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt. Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thay chậu sớm hơn. Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5] Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi. Đây là cây trồng đem lại hiệu quả cao gấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v.. Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹp thì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả. Không chỉ đẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng và nuôi trồng. Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp với qui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Điển hình là công ty Lâm Thăng của Đài Loan đầu tư và công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán. Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý. Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài LoanNgoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài Loan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 2.4. Nhân giống invitro lan Hồ Điệp Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14] 2.4.1.1. Vật liệu và phương pháp nuôi cấy Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn. Các mắt được làm sạch và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúc mắt được dùng trong thí nghiệm. Chồi nguyên vẹn được dùng để kiểm chứng . Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song với trục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α. Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục. Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc. Điều kiện nuôi cấy Môi trường Murashige và Skoog( M+S). Môi trường Knudson C. pH:5.8. Ánh sáng: 5000 1m/m2. Quang kỳ : 14 giờ. Nhiệt độ: 2100C. Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) do hạt lan không có chứa anbunin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ .Vì vậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấm Rhizoctonia mucoroides. Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu cơ khó hấp thu. Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở và các khoáng chất mà nó thu được từ sương. Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo môi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao. 2.4.2.1.Tiến hành Chọn quả lan: Chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vở, không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt. Khử trùng : Dùng cồn 750 rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút. Rửa lại quả bằng nước vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao tách vỏ quả để lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trong môi trường đã chuẩn bị sẵn. Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại môi trường nền: Knudson, Vacine-Went (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như: Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton 2.4.3. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.4.3.1. Hệ thống nuôi cấy Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thống bình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất . Hệ thống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vô trùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môi trường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật. Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môi trường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gian ngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới . Trong giai đoạn dung dịch ngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khí bên trong bình nuôi cấy, dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ cách lọc vô trùng 0,45µm . Thời gian ngập chìm và tần suất ngập chìm được điều khiển bằng timer. Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11] 2.4.3.2. Mẫu cấy lan Hồ Điệp Đối tượng thí nghiệm là một loài lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida Salu. Mẫu cấy gồm có : Protocorm – like bodies –PLBs của giống Dtps Taida Salu. Mẫu cấy chồi được lấy trong thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs trong các hệ thống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi. 2.4.3.3. Phương pháp thí nghiệm Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau được tiến hành trong nhằm so sánh hiệu quả trong việc nâng cao hệ quả nhân và chất lượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trường thạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc. Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu cho việc nhân PLBs trên hệ thống TIS . Mật độ mẫu cấy và tần xuất ngập chìm. Môi trường nuôi cấy : Môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose, glucose, nước dừa. Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar. Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS Mẫu cấy là những PLBs thu được từ quá trình nhân PLBs. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose. Đối chứng là các mẫu được cấy trên môi trường đặc. Khảo sát các thông số tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi trên hệ thống TIS. Mật độ mẫu cấy và tần suất ngập chìm. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào có chiều dài là khoảng 8-9 mm, chiều rộng là khoảng 3-4 mm, chiều cao thân là khoảng 10mm, không có rễ. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA. Đối chứng là mẫu nuôi cấy trên môi trường đặc . Hình 2: Cây sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm [13] 2.4.4.4. Điều kiện thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM) trong điều kiện nhiệt độ khoảng 25 ± 20C, độ ẩm 80- 85 %, thời gian chiếu sáng 10 giờ / ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux. 2.4.4. Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1] 2.4.4.1. Vật liệu và phương pháp Đối tượng nghiên cứu Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis ). Mẫu thí nghiệm Nguồn mẫu lá phôi và PLB ( có màu xanh, đường kính từ 1-1,5 mm) thu nhận sau 2- 3 tháng cấy chuyền trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa và 30 g/l đường . Nguồn mẫu này được dùng làm nguồn vật liệu để làm thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy Môi trường MS cơ bản có bổ sung kết hợp các thành phần BA, NAA, và nước dừa, sau đó bổ sung 9g/l agar, 1g/l than hoạt tính, pH môi trường được điều chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng . Đối tượng thí nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB. Dùng các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, thể tích môi trường đỏ vào là 40 ml. Bình thủy tinh có độ truyền suốt ánh sáng cao để mẫu cấy có khả năng quang hợp tốt. Đối với hệ thống bioreactor Bioreactor sử dụng trong nghiên cứu có dạng hình cầu, thể tích 3 lít (sản xuất tại Hàn Quốc). Phần đáy có dạng hình trụ (đường kính ngoài 45 mm, cao 100 mm). Phần trên có dạng hình cầu (đường kính ngoài 170 mm). Đáy được nối với máy sục khí, bên dưới là một miếng ceramic (đường kính 20 mm, dày 2mm) có tác dụng tạo bọt khí mịn. Nắp đậy làm bằng vật liệu silicone, hình nón cụt, đường kính trung bình là 100 mm và có khả năng chịu nhiệt tốt (không biến dạng khi hấp vô trùng ở 1210C, 1atm, trong 30 phút). Trên nắp có ống nối với màng lọc khí . Màng lọc khí sử dụng là loại chịu nhiệt, đường kính lỗ màng lọc là 0,2 Mm. Hệ thống nuôi cấy này sử dụng 2 màng lọc, một để lọc khí vào và một để lọc khí ra. Các ống dẫn khí được làm từ silicone chịu nhiệt, chia làm 2 loại: Loại đường kính 7 mm và loại đường kính 13 mm. Sử dụng một máy bơm để cung cấp khí cho bioreactor với lượng khí khoảng 20 lít/ phút. Điều kiện nuôi cấy Thực hiện các quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ ánh sáng khoảng 2000lux, sử dụng ánh sáng trắng từ đèn neon, thời gian chiếu sáng là 10 giờ /ngày, độ ẩm trung bình là 75- 80% . Phương pháp thí nghiệm Các bước thiết lập và vận hành hệ thống nuôi cấy bioreactor được thực hiện như sau: Bước 1: Chuẩn bị các bộ phận của hệ thống bioreactor :bình cầu, nắp silicone, các ống dẫn silicone, máy lọc khí, máy sục khí. Chuẩn bị môi trường nuôi. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và mẫu nuôi cấy . Bước 2 : Gói các bộ phận của hệ thống bioreactor vào trong túi nilon chịu nhiệt và đem hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 40 phút. Đồng thời hấp vô trùng môi trường cùng một lúc . Bước 3 : Tiến hành lần lượt, đổ môi trường nuôi cấy vào bình cầu với thể tích nuôi cấy là 1lít, cấy mẫu phôi và PLB vào, đậy nắp lại và sau đó gắn các màng lọc khí. Nắp đậy được dán bằng keo dán ống nước. Sau cùng gắn máy sục khí vào hệ thống để thực hiện quá trình nuôi cấy. Hình 3: Các thiết lập và vận hành hệ thống bioreactor.[1] Thiết kế thí nghiệm Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BA, NAA) và nước dừa phát sinh phôi vô tính và PLB của lan Hồ Điệp. Các thí nghiệm được bố trí theo các bảng như sau. Sau 8 tuần nuôi cấy, thu nhận phôi và PLB, tiến hành lấy kết quả với các chỉ tiêu sau: Trọng lượng tươi, đường kính phôi, PLB và đánh giá thông qua quan sát thực tế. Bảng 1: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa. Môi trường nuôi cấy BA (mg/ l) V1 3,0 V2 2,0 V3 1,0 V4 0,5 Bảng 2:Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 20% nước dừa. Môi trường nuôi cấy NAA (mg /l) V5 1,0 V6 0,5 V7 0,0 Bảng 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA. Môi trường nuôi cấy Nước dừa (%) V8 30 V9 20 V10 10 V11 5 V12 0 Khảo sát sự tăng sinh của phôi và PLB trong hệ thống nuôi cấy bioreactor Từ kết quả đạt được ở thí nghiệm tối ưu môi trường tăng sinh phôi nhóm nghiên cứu xác định được các thành phần tối ưu cho môi trường nuôi cấy trong bioreactor là: Môi trường MS cơ bản, thể tích nuôi cấy 1lít bổ sung 2,0 mg / l BA , 1,0 mg /l NAA và 20 % nước dừa, chỉnh pH về 5,8 trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 40 phút. Các bước tiến hành nuôi cấy trong hệ thống bioreactor đã được trình bày ở trên. Đồng thời tiến hành nuôi cấy trên môi trường agar truyền thống với thể tích bình và môi trường tượng tự như trong hệ thống bioreactor là 3 lít (thể tích bình)và 1 lít (thể tích môi trường) để làm mẫu đối chứng. Tất cả các thí nghiệm đều được theo dõi và tiến hành lấy số liệu sau 6 tuần nuôi cấy. Kết quả thu nhận phôi và PLB thông qua các chỉ số sau: Trọng lượng tươi, hệ số tăng sinh, tỉ lệ sống, số lượng, đường kính của phôi và PLB được hình thành. Xử lý số liệu Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả thí nghiệm được phân tích bằng Duncan, s test ( Ducan, 1995) với α = 0,05 . Kết quả các thí nghiệm 2.5.1. Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [4] Hai tuần sau, các chồi nguyên vẹn phồng lên và phát triển thành tước, trong khi các chồi bị chấn thương đã phát triển thành mô sẹo. Từ 6-8 tuần người ta có thể quan sát thấy các chồi bất định nhỏ màu xanh, trên mô sẹo. Kết quả thấy rằng mặt cắt nghiêng 2/3 chồi và đâm dọc chồi được coi là phương pháp tốt nhất. Mặc dù phần lớn chồi phát sinh bất định từ mô sẹo, vẫn có một ít phát sinh không bất định từ các chồi bên còn lại trên mặt chấn thương. Sau 10 tuần lễ các chồi bất định vừa đủ lớn thì không lấy ra được, biểu hiện lúc các lá hình thành chồi đạt được chiều dài 5-10 mm và rễ bắt đầu xuất hiện . Cây con được lấy ra trong điều kiện vô trùng, được trồng trên môi trường Knudson C và xử lý như cây con trồng hạt. Khi cây con được lấy ra, các chồi khác vẫn được hình thành và phát triển.Tuy nhiên, nếu để một số lượng quá nhiều trên một mắt thì các chồi lớn cản trở sự phát triển các chồi nhỏ. Để đảm bảo các chồi phát triển liên tục ta cấy chuyền các khúc mắt lúc đầu sang môi trường mới khi các chồi đựơc lấy ra hoặc khi môi trường khô và cạn chất dinh dưỡng. Hình 4: Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa.[6] 2.5.2. Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3] Các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm tìm được tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân giống bằng gieo hạt. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4 và bảng 5 dưới đây: Bảng 4: Ảnh hưởng của các tuổi khác nhau tới quá trình nảy mầm. Chỉ tiêu theo dõi Công thức Thời gian nảy mầm (ngày) Tỷ lệ nảy mầm (%) Chất lượng mẫu 70 ngày sau thụ phấn Hạt chết sau 4 ngày gieo 80 ngày sau thụ phấn 35 60 + 90 ngày sau thụ phấn 32 75 ++ 100 ngày sau thụ phấn 25 95 +++ 120 ngày sau thụ phấn 22 100 +++ Các kết quả ở bảng 4 cho thấy: Chỉ sau khi thụ phấn >100 ngày thì hạt lan Hồ Điệp mới đủ độ chín và có khả năng nảy mầm cao nhất . Hình 5: Hạt lan nảy mầm trong điều kiện in vitro. [12] Kết quả ở bảng 5 chứng tỏ rằng : Tất cả các công thức bổ sung các chất hữu cơ tự nhiên ở dạng riêng lẽ hay tổng hợp đều có thể rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt so với cây đối chứng từ 5-10 ngày. Môi trường bổ sung thêm khoai tây tỏ ra hiệu quả nhất, chỉ sau 20 ngày các hạt đã nảy mầm và chất lượng chồi đạt được rất tốt. Trong khi đó trên tất cả môi trường có bổ sung cà rốt chỉ có 15-60 % số hạt nảy mầm và chất lượng mẫu hình thành rất xấu. Như vậy, sử dụng môi trường nền VW có bổ sung : (100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar) / l để gieo hạt là tốt nhất. Bảng 5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự nảy mầm của hạt lan. Chỉ tiêu theo dõi Công thức Thời gian nảy mầm của hạt (ngày) Tỷ lệ nảy hạt mầm (%) Chất lượng mẫu I (Đ/C ) 30 50 + I +30g KT 20 100 +++ I +30g CR 25 60 + I + 50gKT 20 100 +++ I + 50g CR 25 55 + I + 100g KT 20 100 +++ I + 100g CR 25 45 + I + 30gKT +30g CR 25 75 ++ I+50gKT+50g CR 25 70 ++ I+100gKT+100g CR 25 70 ++ Ghi chú : I :VW + 100ml ND +10g đường + 1g pepton + 6,6g agar. KT : Khoai tây, CR: Cà rốt, ND: Nước dừa. + : Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh vàng. ++: Thể Protocorm nhỏ ,có máu xanh nhạt. +++ : Thể Protocorm phồng to rất đều nhau có màu xanh đậm. Gieo sau 20 ngày hạt nảy mầm, sau 50-60 ngày hình thành thể tiền chồi (Protocorm) kích thước 1-2 mm. Sau đó, chuyển các thể tiền chồi sang môi trường : VW + (100ml ND +10g đường +1g pepton +30g khoai tây + 6,5g agar +30g cà rốt) / l để hình thành các cây non có 2-3 lá sau 60 ngày. Tiếp tục cấy chuyền cây non sang chín môi trường này, khoảng 60 ngày sẽ tạo cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn chuyển ra vườn ươm. Vì vậy, thời gian ra cây sau khi gieo là khoảng 6 tháng. 2.5.3. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.5.3.1. Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau Chu kỳ ngập chìm, mật độ và thể tích môi trường sử dụng trong hệ thống TIS có tác động rất lớn đến chất lượng mẫu cấy . Vì vậy, để đạt được hiệu quả cao nhất khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân PLBs, cần khảo sát và tối ưu hóa các thông số về mật độ, thể tích và chu kỳ ngập chìm của hệ thống TIS. Sau 6 tuần nuôi cấy tiến hành ghi nhận các. Bảng 6: Kết quả khảo sát mật độ PLBs thích hợp cho việc nhanh trên hệ thống TIS. Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g ) Số lượng PLBs/ 1g PLBs ban đầu Số chồi Nhận xét 2g 11,25  ±  1,87 973,27 ± 30,68ab 19,58 ± 4,79 PLBs xanh tốt, tròn, từng cụm. Một số PLBs phát triển thành chồi. Không gian TIS còn trống 4g 23,05  ±  4,65 1020,11 ± 110,36a 36,31 ± 6,91 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi. Không gian TIS còn trống 6g 40,15  ±  5,08 984,60 ± 116,54ab 73,21 ± 6,99 PLBs xanh tốt, tròn, một số PLBs phát triển thành chồi. Không gian TIS còn trống . 8g 53,30  ±  6,80 753,26 ± 151,81b 113,25 ± 8,91 PLBs không được tròn, hơi vàng chồi nhiều, lá chồi bị vàng. Chật kín không gian TIS Kết quả cho thấy nghiệm thức sử dụng 6g PLBs cho kết quả tạo 986,35 PLBs tính trên 1g PLBs ban đầu và sau 6 tuần nuôi cấy lượng PLBs tạo thành vừa đủ lấp kín không gian bình TIS, PLBs có màu xanh tốt, dạng tròn . Mật độ này là thích hợp nhất cho việc nhân PLBs trong bình TIS. Khi sử dụng 6g PLBs để nuôi cấy trong bình Plantimia có chứa môi trường để nhân PLBs có thể tích là 200ml, nhóm nghiên cứu đã nhận thấy rằng: Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 1 giờ cho hệ số nhân PLBs tăng nhiều (8545 PLBs) so với chu kỳ 2 giờ ngập một lần, nhưng PLBs chủ yếu ở dạng trong, mọng nước rất khó chuyển sang dạng chồi để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Như vậy tần số ngập chìm cao đã gây ra hiện thủy tinh thể cho mẫu cấy . Thời gian ngập chìm 10 phút với chu kỳ 2 giờ, các PLBs bị trương to hơn bình thường. Thời gian ngập chìm 5 phút với chu kỳ 2 giờ cho chất lượng PLBs tốt nhất, chồi xanh tốt phát triển bình thường. Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm của hệ thống lên việc nhân PLBs. Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số PLBs hình thành Số chồi Nhận xét 2 giờ /10 phút 50,85 ± 5,31 6276,98 ± 413,26b 125,28 ± 11,65 PLBs rất xanh tốt 2 giờ /5 phút 42,27 ± 6,27 6112,30 ± 326,41b 82,96 ± 6,57 PLBs xanh tốt 1 giờ /10 phút 68,18 ± 6,96 8545,68 ± 612,45a 187,89 ± 9,60 PLBs rất to, một số có dạng trong mọng nước. Tóm lại việc nhân PLBs trên hệ thống TIS cho kết quả tối ưu khi thời gian ngập từ 5-10 phút với chu kỳ 2 giờ, thể tích nuôi cấy 200ml và mật độ 6g PLBs .Sau 6 tuần nuôi cấy mỗi bình Plantima cho khoảng 6100 PLBs từ 600PLBs ban đầu, tức là từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 10-11 PLBs mới, nếu so sánh trên môi trường thạch, cùng thơi gian nuôi cấy, cùng thể tích và mật độ, sau 6 tuần thu được 2200 PLBs tức là 1 PLBs ban đầu tạo ra 3-4 PLBs mới và so sánh với nuôi cấy lỏng lắc trong bình tam giác 250ml với thể tích môi trường 40ml thì từ 1 PLBs ban đầu tạo ra 7-8 PLBs . Vậy, nuôi cấy trên hệ thống TIS cho tỉ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên môi trường thạch và gấp 1,3 lần trên môi trường lỏng. Bảng 8: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs sau 2 tháng nuôi cấy. Hệ thống nuôi cấy Số PLBs tạo ra / 1PLBs ban đầu Lỏng lắc 8,3 ± 0,58 TiS 10,2 ± 1,55 Thạch 3,6 ± 0,31 2.5.3.2.Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS Nghiệm thức Tỉ lệ PLBs tái sinh chồi (%) Trọng lượng tươi (g) Số chồi /PLBs ban đầu Nhận xét 20 PLBs 100 11,54 ± 2,19 4,35 ± 0,38ab Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt, có rễ. 30 PLBs 100 18,41 ± 2,67 4,66 ± 0,71ab Cụm chồi xanh tốt, lá tròn mượt, có rễ. 50 PLBs 100 31,25 ± 5,10 6,30 ± 0,64a Cụm chồi xanh tốt nhưng lá nhỏ hơn nghiệm thức 20, 30 PLBs Đối chứng trên thạch (30 PLBs) 100 7,24 ± 1,04 1,73 ± 0,26c Lá hơi bị dún lại, thân chồi kéo dài Trên hệ thống TIS, từ một PLBs ban đầu rất nhiều cây được tái sinh cho lượng cây tái sinh vượt trội so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Khảo sát mật độ PLBs sử dụng cho giai đoạn tái sinh chồi trong bình TIS ghi nhận kết quả trong bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng của mật độ PLBs lên sự tái sinh chồi và nhân chồi trong hệ thống TIS. Trong bình Plantima ở mật độ 50 PLBs cho trung bình số cây tái sinh từ một PLBs ban đầu là 6,3 so với 1,73 PLBs trên môi trường thạch (gấp 3,6 lần). Thêm vào đó, sự sinh trưởng và phát triển của chồi tái sinh trong hệ thống TIS đều vượt trội hơn trong bình tam giác về các chỉ tiêu chiều cao thân, chiều dài, chiều rộng lá. Bảng 10:Ảnh hưởng của tần xuất ngập chìm lên tái sinh chồi từ PLBs. Nghiệm thức Trọng lượng tươi(g) Số chồi/ PLBs Nhận xét 4 giờ / 3 phút 25,48 ± 4,84 3,17 ± 0,66c Chồi xanh tốt, có PLBs dạng cụm 6 giờ / 3 phút 34,39 ± 6,79 6,46 ± 0,64 a Chồi xanh tốt 8 giờ /3 phút 28,17 ± 4,05 4,46 ± 0,60 b Chồi xanh tốt Kết quả cho thấy: Tần xuất ngập 3 phút trong chu kỳ 6 giờ cho kết quả số chồi tạo thành trên một PLBs là cao nhất.Chu kỳ ngắn (4 giờ) hay dài (8 giờ) cho kết quả tạo chồi thấp hơn hẳn. Điều này cho thấy với chu kỳ 4 giờ cho ngập một lần mẫu được cung cấp chất dinh dưỡng thường xuyên hơn nhưng số chồi tạo ra trên 1 PLBs chỉ là 3,17 và từ gốc lại tiếp tục tạo thêm PLBs mới, còn ở chu kỳ 8 giờ cho ngập một lần cho số chồi tạo thành là 4,46 ít hơn so với chu kỳ 6 giờ (6,46 chồi) có lẽ thời gian quá dài giữa các lần bơm (8 giờ) làm mẫu không được cung cấp dinh dưỡng cũng như sự thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của mẫu, vì vậy PLBs tái sinh và tiếp tục tạo thêm chồi nách và các chồi này phát triển rất đồng đều dẫn đến trọng lượng tươi của mẫu cũng gia tăng đáng kể (34,39). Trong hệ thống TIS, môi trường không khí luôn luôn có sự trao đổi giữa bên trong và bên ngoài bình thông qua hệ thống bơm và các màng lọc, do đó chồi Hồ Điệp tái sinh trong hệ thống TIS phát triển rất tốt so với trong bình tam giác kín thông thường thể hiện qua các chỉ têu trong bảng 11. Hình 6: PLBs nhân nhanh trong hệ thống nuôi cấy TIS.[7] Bảng11: Ảnh hưởng của các hệ thống nuôi cấy khác nhau lên sự tái sinh chồi từ PLBs sau 2 tháng nuôi cấy. Hệ thống nuôi cấy Số chồi /mẫu cấy Chiều cao thân (mm) Chiều cao lá (mm) Chiều rộng lá (mm) Bình tam giác (môi trường thạch ) 1,73 7 ± 0,36 6 ±  0,14 3 ± 0,5 TIS (môi trường lỏng) 6,30 9 ± 0,23 7 ± 0,24 5 ±  0,22 Hình 7: Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS và bình tam giác.[7] a1, a2, a3 :Chồi tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS . b: Chồi tái sinh từ PLBs trong bình tam giác. 2.5.3.3. Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS Kết quả thí nghiệm từ các hệ thống nuôi cấy khác lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp đã cho thấy hệ thống càng có nhiều sự thông thoáng thì chồi Hồ Điệp càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ở hệ thống TIS nhờ hệ thống bơm đẩy môi trường lên để tạo sự ngập chìm cho mẫu cấy, trong quá trình bơm môi trường khí trong bình được trao đổi nên trong bình có sự thông thoáng nhiều hơn so với trong bình tam giác. Những cây Hồ Điệp trong hệ thống TIS có độ thông thoáng tốt hơn phát triển mạnh hơn so với cây trong bình tam giác không thoáng khí thể hiện ở các chỉ tiêu chiều cao, chiều dài và chiều rộng lá, số rễ và chiều dài rễ. Bảng 12: Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự ra rễ và phát triển chồi của Hồ Điệp. Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Số chồi / số chồi ban đầu Chiều rộng lá (cm) Chiều dài rễ (cm) Tình trạng cây. 4 giờ /3 phút 47,39 ± 6,27 3,79 ± 0,65a 0,68 ± 0,06b 0,92 ± 0,16c Xanh mướt 6 giờ /3 phút 60,19 ± 7,78 3,39 ± 0,59a 0,97 ± 0,09a 2,62 ± 0,29a Xanh mướt 8 giờ /3 phút 43,23 ± 5,39 2,59 ± 0 ,26b 0,77± 0,05b 1,67 ± 0,14b Xanh mướt Bảng 13: Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp sau 2 tháng nuôi cấy . Hệ thống nuôi cấy Chiều cao thân (mm) Chiều rộng lá (mm) Chiều dài lá (mm) Số rễ Chiều dài rễ (mm) Bình tam giác 500ml 15 ± 0,4 6 ± 0,2 11 ± 0,3 3 10 ± 0,1 TIS 20 ± 0,6 9,8 ± 0,4 15 ± 0,7 6 26 ± 0,2 Hình 8: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp trong hệ thống TIS và bình tam giác 500 ml .[7] a : Cây con Hồ Điệp trong hệ thống TIS b : Cây con Hồ Điệp trong bình tam giác 500 ml Hệ thống ngập chìm tạm thời đã hội tụ đủ những điều kiện cần thiết như ngập không quá lâu, thoáng khí tốt giúp cây không bị thủy tinh thể, cây tăng cường khả năng quang hợp nên cây phát triển khá đều đặn, thích hợp cho quá trình tạo bộ rễ khỏe mạnh trước khi đưa ra vườn ươm. Tóm lại, khi nuôi cấy trong hệ thống TIS giúp cây phát triển nhanh và mạnh hơn những cây được nuôi cấy trong hệ thống kín thông thường giúp rút ngắn thời gian để cây đạt được kích thước để đưa ra vườn ươm. 2.5.4. Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1] 2.5.4.1. Xác định môi trường tối ưu tăng sinh phôi và PLB Sau 8 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu về trọng lượng tươi, đường kính phôi và PLB của P.amabilis được trình bày ở các bảng sau. Bảng 14: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét V1 3874a Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, không có những cụm lông xum quanh. Đường kính từ 1-1,5 mm. V2 3812b Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, một vài PLB có cụm lông xum quanh. Đường kính từ 1-2 mm. V3 3420c Một số PLB lớn có màu xanh thẫm xuất hiện. PLB có độ đồng đều lớn, đường kính 2 mm. V4 2597d PLB tạo thành chưa hoàn thiện, không có cấu trúc rõ ràng. Ghi chú: Những mẫu tự khác nhau được nêu trong các cột trên biễu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α =0,05 trong Duncan, s test. Bảng 15: Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg / l BA và 20 % nước dừa sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét V5 4312a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có những cụm lông xum quanh, đường kính 1-1,5 mm. V6 3812b Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm, một vài PLB có những cụm lông xum quanh. Đường kính 1-2 mm. V7 4289a PLB tạo thành có màu xanh thẫm, có những cụm lông xung quanh, đường kính từ 1-1,5 mm. Hình 9: Sự phát sinh phôi và PLB trong các môi trường khác nhau.[8] Kết quả thu nhận được cho thấy, ở nghiệm thức V1 và V2 PLB tạo thành có màu xanh đậm, không có những cụm lông xung quanh, đường kính PLB từ 1-1,5 mm. Ở các nghiệm thức, tuy khối lượng PLB tạo ra lớn nhưng PLB kém phát triển. Ở nghiệm thức V3, PLB tạo thành lớn hơn, phát triển hơn, có độ đồng đều cao hơn và có hình dạng rõ ràng hơn. Ở các nghiệm thức V5 và V7, khối lượng PLB tạo ra là lớn nhất, có sự phát triển đồng đều giữa các PLB, đường kính trung bình 1,5 mm. Còn các nghiệm thức V4 và V6 phôi và PLB chưa có sự phân hóa rõ ràng, các cụm phôi và PLB dính vào nhau gây khó khăn cho quá trình cấy chuyền mẫu và quá trình hình thành cây con. Ở nghiệm thức V8, PLB được tạo thành có màu xanh thẫm, đường kính trung bình 1,5 mm, các PLB khá đồng đều nhau, một số PLB phát triển thành cây con. Điều này được giải thích là do tác động kích thích sự hình thành chồi của cytokinin có trong nước dừa, và khi nước dừa ở nồng độ cao thì ta thấy rõ điều này so với các nghiệm thức còn lại là V9, V10và V11. Ở các nghiệm thức này, phôi và PLB nhỏ, các cụm phôi và PLB dính vào nhau gây khó khăn cho quá trình cấy chuyền và quá trình hình thành cây con sau này. Còn ở các nghiệm thức V12, có sự phân hóa phôi rõ ràng nhưng sinh khối tạo ra ít, không có hiệu quả. Tóm lại, môi trường MS cơ bản bổ sung 2,0 mg /l BA, 1,0 mg/l NAA và 20 % nước dừa là môi trường tối ưu cho tăng sinh phôi và PLB của lan Hồ Điệp P. amabilis. Bảng 16: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường Trọng lượng tươi (mg) Nhận xét V8 4137a PLB tạo thành có màu xanh đậm . Đường kính từ 1-1,5 mm. Có sự hình thành cây từ PLB. V9 3812b Phôi và PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm PLB, một số PLB có những cụm lông xum quanh. Đường kính từ 1-2 mm. V10 2480c Phôi va PLB tạo thành có màu vàng nhạt và xanh thẫm. PLB những cụm lông xum quanh. Đường kính từ 1- 1,5 mm . V11 1197d Phôi tạo thành có màu vàng nhạt không có sự tạo thành PLB. Đường kính phôi từ 1- 2 mm V12 850e PLB có màu xanh thẫm. Có sự hình thành cây từ PLB. 2.5.4.2. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy bioreactor lên sự tăng sinh phôi và PLB Một số ưu điểm chính của hệ thống bioreactor là: Các thành phần trong môi trường nuôi cấy được sử dụng tối đa nhờ có sự đảo trộn của quá trình sục khí, mẫu cấy ngập trong môi trường cấy lỏng vẫn không bị úng và không xãy ra hiện tượng thủy tinh thể. Kết quả thu được sau 6 tuần nuôi cấy trong hệ thống bioreactor và hệ thống đối chứng được trình bày ở bảng dưới. Bảng 17: Những kết quả thu được trên hai hệ thống nuôi cấy khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy. Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu Đường kính phôi và PLB (mm) Tỷ lệ sống sót (%) Tỷ lệ tăng sinh (%) Trước nuôi cấy Thu hoạch Trước nuôi cấy Thu hoạch Bioreactor 36,00 172,19a 1 – 1,5a 5,5a 58,32a 4,78a Đối chứng 36,00 67,19b 1 – 1,5a 1 -1,5b 26,55b 1,86b PLB của lan Hồ Điệp thích hợp với hệ thống nuôi cấy bioreactor có sục khí liên tục hơn là nuôi cấy trên môi trường thạch. Với hệ thống bioreactor, không khí bên trong môi trường nuôi cấy được thay mới liên tục và có thành phần CO2/ O2 gần giống với môi trường bên ngoài, điều này làm cho môi trường được thông thoáng hơn nên mẫu cấy có khả năng trao đổi khí nhiều hơn, do vậy mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với trên môi trường thạch. Các chỉ tiêu so sánh giữa hai hệ thống nuôi cấy là : tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tăng sinh, kích thước của phôi và PLB. Tỷ lệ sống sót (58,32), tỷ lệ tăng sinh (4,78 lần) và đường kính (5,5 mm) của phôi và PLB trong hệ thống bioreactor cao hơn tỷ lệ sống sót (26,55), tỷ lệ tăng sinh (1,86 lần), và đường kính (1,5 mm) của phôi và PLB trong hệ thống đối chứng. [9] Hình 10: a) Sự tăng nhanh Phalaenopsis PLB trong hệ thống bioreactor (1lít kiểu cột) sau 6 tuần. b) Sự tái sinh và tăng trưởng từ PLB trong hệ thống bioreactor; c) Sự thích nghi của những cây mới nhú. 2.6. Hiệu quả kinh tế của lan Hồ Điệp [4] Hồ Điệp không chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, Hồ Điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành công nghiệp trồng hoa ở Hà Lan. Chúng còn là những món quà xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản. Ngoài ra các loài hoa đẹp này cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng quà tặng cao cấp. Ngày nay, hoa lan cắm chậu đã trở nên khá phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới. Người ta có thể thấy Hồ Điệp ở mọi nơi, trên truyền hình, trong nhà, trong vườn, tạp chí thậm chí nơi bạn làm việc. Chứng tỏ, càng ngày con người càng nhận thức được tầm quan trọng của những chậu hoa trong cuộc sống thường nhật của mình. Lan Hồ Điệp, là một loài lan có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, cũng là một loài cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa. Hơn nữa, trong vài thập kỉ gần đây nền công nghệ trồng lan phát tiển giúp người trồng đã giảm giá thành đáng kể đối với loại lan này nên giá cả phù hợp với những người mê hoa hay người mới tập trồng, Hồ Điệp rất được ưa chuộng và được trồng ở nhiều nơi. Trước đây, Hồ Điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hoá cao cấp trên thị trường. Trong 20 năm trở lại đây, công nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các ngày lễ. Thêm vào đó, công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu hoa, kích thước hoa Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi lan và tạo nên những cơn sốt hoa lan trên thị trường thế giới. Hồ Điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ. Cây con được nuôi cấy mô ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con lại được xuất khầu cho các nước khác với cả Mỹ để trồng ra hoa. Hàng ngàn các giống được lai và tạo dòng rất có giá trị trên thị trường. Các nhà nhân giống đã gieo hạt được rất nhiều giống Hồ Điệp có chất lượng hoa và cây giống rất có giá trị như các tính trạng qui định màu sắc hoa, và cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, và gần đây là các giống có hương thơm. Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn đến một hệ quả là các giống có giá trị hiện nay có thể không còn giá trị chỉ trong vài năm nữa. Màu sắc hoa tập trung ở các màu chủ đạo như : trắng, vàng, xanh, màu mơ chín, hồng, đỏ tươi hay nâu sẫm. Hoa có thể chỉ có một màu hay sự pha trộn giữa các màu này với nhau, chủ yếu là khác nhau ở vùng giữa, hay mép cánh hoa với nhiều cấu trúc khác nhau như chấm hay sọc trên từng cánh bông. Loại hoa mới được lai tạo gần đây nhất là Harlequin, có màu trắng hay vàng với các mép cánh bông được điểm xuyết bởi các chấm tròn ngẫu nhiên có giá rất cao trên thị trường hiện nay. Hình11: Mô hình sản xuất lan Hồ Điệp.[10] Phần III: Kết Luận Từ những thí nghiệm trên tôi thấy rằng nhân giống Hồ Điệp nhờ hệ thống nuôi cấy ngập chìm và hệ thống bioreactor là tôt nhất. Đối với nghiên cứu giống Hồ Điệp lai Dtps .Taida Salu, nuôi cấy trên hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân PLBs gấp 3 lần trên môi trường thạch và gấp 1,3 lần trên môi trường lỏng. Đối với giai đoạn tái sinh chồi và nhân chồi, hệ thống TIS cho tỷ lệ nhân chồi gấp 3,6 lần so với hệ thống nuôi cấy tên thạch. Từ đó giúp gia tăng tỉ lệ cây con lên 10,8 lần so với các phương pháp truyền thống khác. Đối với hệ thống nuôi cấy bioreactor, môi trường tối ưu cho nhân nhanh phôi và PLB là môi trường MS cơ bản bổ sung 2mg /l BA, 1mg /l NAA và 20% nước dừa. Từ kết quả trên tôi xin đưa ra quy trình nhân giống invitro lan Hồ Điệp như sau Cây mẫu Quả Cành hoa Khử trùng kép Khử trùng MS +Knudson C (trục phát hoa). VW + 100ml + 10 g đường + 30 g KT + 1g pepton + 6,5 g agar ( gieo hạt ). Protocorm, chồi . Nhân nhanh. MS + 2,0 mg /l BA + 0,1 mg /l NAA +20% nước dừa (bioreactor ). MS 1/2 + nước dừa + pepton + dịch khoai tây + sucrose ( ngập chìm ). Cây giống in vitro. Vườn ươm. Tài Liệu Tham Khảo Tài liệu sách giáo khoa [1]. Nguyễn Cửu Thành Nhân, Nguyễn Thanh Hải và cộng sự (2007), trích “Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP.HCM . [2]. Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự (2007 ), trích “Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP.HCM . [3]. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), “Lan Hồ Điệp kỷ thuật chọn tạo giống cây trồng”, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Tài liệu internet [4]. www.longdinh.com [5]. [6]. [7]. [8]. RAPID%20PROPAGATION%20OF%20PHALAENOPSIS%20FROM%20FLORAL%20STALK-DERIVED%20LEAVES.pdf [9]. Application%20of%20bioreactor%20systems%20for%20large%20scale%20production%20of%20horticultural%20and%20medicinal%20plants.pdf [10]. [11]. www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?c... [12]. [13]. [14]. Các Từ Viết Tắt NAA : α – Naphalen axetic axit. BA : 6 – Benzylaminpurin. IBA : Indole -3- butyric axit. MỤC LỤC