Cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii)

g, sau đó chúng sẽ khác nhau rõ theo giới tính. Tôm đực sinh trưởng nhanh hơn tôm cái và có thể đạt trọng lượng gấp đôi tôm cái trong cùng một thời gian nuôi. Tôm cái khi bắt đầu thành thục (trọng lượng khoảng 30-40g) thì sinh trưởng giảm vì nguồn dinh dưỡng tập trung lại cho sự phát triển của buồng trứng. Một hiện tượng thường thấy trong nuôi tôm càng xanh là sự phân đàn khá rõ kể cả trong cùng một nhóm giới tính. Tôm càng xanh đẻ quanh năm nhưng ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có hai mùa tôm đẻ chính là tháng 4-6 dương lịch và tháng 8-10 dương lịch. Tôm cái lần đầu thành thục vào khoảng 90-115 ngày kể từ tôm bột. Tuy nhiên, tuổi và kích cỡ thành thục của tôm còn phụ thuộc rất nhiều yếu tố như môi trường và thức ăn (Dương Nhựt Long, 2004). 2.2 Một số bệnh thường gặp trên tôm càng xanh 2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Bệnh đục cơ của tôm càng xanh Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 6 Tác nhân gây bệnh là cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida) gram dương, hình quả trứng. Tôm kém ăn, hoạt động chậm chạp, đầu tiên cơ phần đuôi chuyển sang màu trắng đục sau lan dần lên phía đầu ngực. Vỏ tôm mềm (khi luộc chín chuyển sang màu đỏ ít) tỷ lệ tôm chết cao. Khi tôm càng xanh bị bệnh đục cơ, quan sát mẫu cắt mô dưới kính hiển vi có hiện tượng phù nước ở giữa vỏ và cơ dưới. Trong cơ có các ổ hoại tử với khuẩn lạc vi khuẩn. Có thể tìm thấy ổ hoại tử trong mặt cắt mô gan tụy. Cầu khuẩn Lactococcus garvieae làm cơ tôm bị hoại tử, mất cấu trúc ban đầu và có hiện tượng xuất huyết (Bùi Quang Tề, 2003). 2.2.2 Bệnh do ký sinh trùng Bệnh do Epistylis, Zoothamnium, Tokophrya, Acineta, Vorticella là các ký sinh trùng đơn bào dạng hình loa kèn. Tôm yếu, hoạt động khó khăn. Các sinh vật bám làm cản trở hoạt động và làm mất chức năng hô hấp của tôm, đặc biệt gây tác hại lớn đối với ấu trùng tôm. Nếu các sinh vật bám này cảm nhiễm trên tôm ở mức độ thấp thì chỉ cần lột xác thì tôm sẽ khỏi bệnh, nhưng nếu tôm bị cảm nhiễm ở mức độ cao thì chúng sẽ ngăn cản quá trình lột xác ức chế sinh trưởng và có thể gây chết (AAHRI, 1997). Kiểm tra mô bệnh học trên mang tôm thì phát hiện Epistylis và Zoomthamnium ký sinh trên mang của tôm, chúng bắt màu tím của thuốc nhuộm H&E và làm hoại tử mang tôm (Bùi Quang Tề, 2003). 2.2.3 Bệnh do vi-rút Bệnh Hepatopancreatic parvovirus (HPV) Do nhóm Parvovirus có cấu trúc acid nhân là ADN, đường kính 22-24 nm. Vi-rút ký sinh trong nhân tế bào gan tụy, biểu bì ruột trước, chúng làm hoại tử và sưng to nhân ký chủ. Tôm nhiễm vi-rút HPV thường bỏ ăn hoặc ăn ít, hoạt động yếu. Gan tôm bị teo lại hoặc hoại tử, hệ cơ bụng đục mờ, hiện tượng chết thường xảy ra ở tôm ấu trùng, tỷ lệ chết từ 50-100%. Kiểm tra mô bệnh học, tế bào gan tụy của tôm nhiễm bệnh HPV thì quan sát thấy có thể vùi nằm trong tế bào biểu bì mô gan tụy dạng hình ống. Thời kỳ đầu thường nhỏ nằm ở trung tâm của nhân, sau lớn dần nằm gần kín nhân (bắt màu Eosin màu đỏ đến đỏ sẫm). Trong thể vùi có chứa nhiều vi-rút (Bùi Quang Tề, 2003). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 7 2.3 Phương pháp mô học 2.3.1 Quá trình phát triển của kỹ thuật nghiên cứu mô học Việc nghiên cứu tế bào và mô học bắt đầu từ thế kỷ XVII nhưng mãi cho đến gần cuối thế kỷ XIX, Tế bào học và Mô học mới thực sự được coi là ngành khoa học. Cuối thế kỷ XIX, sau khi học thuyết tế bào ra đời thì ngành Mô học mô tả bắt đầu phát triển mạnh. M. Malpighi (1624-1694) là một trong số những nhà khoa học Châu Âu đã có hàng loạt các phát hiện có giá trị trong việc nghiên cứu tế bào và mô. Vào khoảng những năm 1675-1680, ông đã mô tả cấu tạo của da, thận, lách và một số cơ quan khác trên cơ thể, do đó một số cấu trúc đã mang tên ông. Năm 1677, người thợ kính Hà Lan Anatolie Leeuwenhoek đã chế tạo được chiếc kính hiển vi có độ phóng đại đối tượng quan sát tới 300 lần. Từ đó, ông đã có khả năng mô tả hồng cầu và sự vận chuyển chúng trong các mao mạch máu, phát hiện tinh bào, nhìn thấy những vạch sáng, tối của sợi cơ vân, cấu tạo sợi thần kinh, sợi gân. Tuy vậy, việc nghiên cứu cấu tạo vi thể của cơ thể động vật được tiến hành muộn hơn so với việc nghiên cứu thực vật. Vào năm 1825-1827, Purkinje mô tả nhân của noãn trong trứng gà và sau đó chính ông đã mô tả bào tương của tế bào. Ít năm sau, Brown (1831) cũng mô tả nhân của tế bào thực vật. Những kết quả nghiên cứu của những nhà khoa học kể trên cũng như những công trình nghiên cứu của Dutrochet, Valentin, Schleiden đã giúp cho T. Schwann xây dựng và công bố học thuyết tế bào vào năm 1839 (trích dẫn bởi Phạm Phan Địch, 2004). Những thành công lớn lao trong kỹ thuật mô học ở nửa thế kỷ XIX như việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtone) cho phép nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu cấu tạo vi thể tế bào đã cho phép tách việc nghiên cứu tế bào thành một phần riêng biệt trong Mô học gọi là Tế bào học. Học thuyết tế bào không chỉ là cơ sở của việc nghiên cứu cấu tạo mô bình thường mà còn là cơ sở của việc nghiên cứu những thay đổi bệnh lý của mô, cơ quan và đồng thời nó cũng là cơ sở của việc nghiên cứu những hoạt động sinh lý. Mô học, một môn học của sinh học và là khoa học nghiên cứu sự phát triển, cấu tạo và hoạt động của các mô, các cơ quan, các bộ máy của cơ thể. Mô học có quan hệ qua lại với nhiều môn học khác trong ngành Sinh học như Hình thái học, Sinh lý học, Phôi học… (Trần Đắc Định, 2004). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 8 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu mô học Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng bị tổn thương. So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán. Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả mô học. Phương pháp mô học chỉ nên sử dụng khi kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi đặt lên lam, nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đều vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm trung tính (Trần Đắc Định, 2004). Tế bào và mô phải được quan sát bằng các loại kính hiển vi, do đó khi nghiên cứu mô và tế bào cần phải cắt mẫu với các độ dầy thích hợp đảm bảo cho ánh sáng xuyên qua trong quá trình quan sát dưới kính hiển vi. Qui trình xử lý mẫu và tạo tiêu bản bắt đầu từ cố định mẫu, cắt tỉa định hướng mẫu, khử nước, ngấm mẫu trong paraffin, đúc khối và cắt lát mỏng, dán lát cắt lên lam và nhuộm màu. Phủ lamelle lên tiêu bản, lúc này lát cắt có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Tương tự, qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật lạnh cũng có thể được áp dụng. Qui trình này tương đối đơn giản hơn, mẫu được đông lạnh nhanh, cắt, nhuộm, phủ lamelle lên tiêu bản. Phương pháp này được ứng dụng trong các nghiên cứu về các enzyme nội tiết vì các enzyme dễ bị mất đi trong phương pháp xử lý mẫu thông thường, nhưng kết quả xử lý mẫu thường không Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 9 ổn định và khó nhận biết được các cấu trúc chi tiết, qui trình xử lý mẫu vì thế tùy thuộc vào từng trường hợp nghiên cứu cụ thể (Trần Đắc Định, 2004). Sơ đồ các bước xử lý mẫu trong nghiên cứu mô học (Hinton, 1990) QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU QUI TRÌNH XỬ LÝ MẪU THÔNG THƯỜNG LẠNH Cố định mẫu Đông lạnh Cắt tỉa và định hứơng mẫu Khử nước Làm trong mẫu Đúc khối Cắt mẫu Dán tiêu bản Hydrate hóa Nhuộm Hoàn tất tiêu bản Đông khô mẫu Định hướng mẫu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 10 2.3.3 Một số nghiên cứu về mô học trên tôm Theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2007), về cơ bản cấu trúc mô của tôm bao gồm: Lớp kitin (lớp vỏ bảo vệ) Bao gồm nhiều lớp như: lớp mô tâm sừng, lớp kitin ngoài, lớp kitin trong, lớp trong cùng. Dưới lớp vỏ là lớp mô liên kết, lớp biểu mô và lớp cơ. Lớp kitin được tạo ra từ lớp biểu mô dưới lớp vỏ và được làm trơn từ dịch nhày của tuyến dưới vỏ. Hình 2.2 Cấu tạo của lớp kitin Mang Là cơ quan hô hấp chính của tôm, nằm ở gốc các đôi phần phụ. Chức năng chính của mang là bài tiết Ammonia, hấp thu chất khoáng và điều hòa áp suất thẩm thấu. Mang được cấu tạo bởi nhiều phiến mang hình lông chim, trên phiến mang có nhiều sợi mang. Cấu tạo chi tiết của sợi mang gồm: trục chính, sợi mang thứ cấp, sợi mang sơ cấp. Mặt trong của sợi mang được lợp bởi các tế bào biểu mô lát đơn. Trên sợi mang sơ cấp và thứ cấp có hai ống mạch: hướng tâm và ly tâm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 11 Hình 2.3 Cấu tạo của mang. Tuyến râu Tuyến râu là cơ quan bài tiết của tôm nằm ở phần đầu gần gốc râu. Chức năng của tuyến râu là bài thải những sản phẩm trung gian như: Urê, acid uric, NH3, hợp chất sunfua. Tuyến râu được cấu tạo gồm: túi lọc hay xoang cùng, ống lượn gần, ống lượn xa và bàng quang. Ống bài tiết của tuyến râu nằm khắp nơi trong phần đầu. Bàng quang là nơi phình to của tuyến râu và chứa sản phẩm thải, bàng quang được cấu tạo bởi những tế bào biểu mô hình cột đơn. Hình 2.4 Cấu tạo của tuyến râu Cơ quan lymphoid Cơ quan lymphoid là một hệ thống hai thùy đóng vai trò như một túi lọc. Chức năng chính của cơ quan lymphoid là bảo vệ môi trường bên trong cơ thể, chống lại sự xâm nhập và gây hại của vi sinh vật và các vật lạ bên trong cơ thể. Cơ quan lymphoid được cấu tạo bởi hai thùy nằm phía trước gan tụy. Cơ quan này do nhiều động mạch nhỏ tạo thành, bên trong động mạch là xoang rỗng, xung quanh là lớp tế bào đệm cơ bản, mô liên kết, mô kẻ. Bao xung quanh ống mạch là xoang mạch máu. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 12 Hình 2.5 Cấu tạo chi tiết ống mạch của cơ quan lymphoid. Hệ tiêu hóa Hệ tiêu hóa của tôm bao gồm: Miệng, thực quản, dạ dày, ruột giữa, gan tụy. Miệng nằm ở mặt bụng của đầu, xung quanh các phần phụ và thực quản. Thực quản của tôm ngằn hình chữ J, nằm thẳng góc với trục của cơ thể, đổ vào dạ dày. Dạ dày là bao cơ dày, phía sau phình to ra thành hai túi nhỏ ở hai bên. Xoang trên rất lớn, chiếm hầu hết xoang của dạ dày. Dạ dày bắt đầu phía trên thực quản, kéo dài đến gần giữa gan. Msl: Bó cơ Csn: Lớp mô liên kết Cep: Lớp tế bào biểu mô Cut: Lớp kitin mỏng Lum: Xoang trước dạ dầy Hình 2.6 Cấu tạo vách xoang trước dạ dày Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 13 Msx: Cơ vòng Msl: Cơ dọc Cns: Mô liên kết Emp: Lớp biểu mô Hình 2.7 Cấu tạo của ruột giữa Hta: Đoạn đầu Htm: Đoạn giữa Htp: Đoạn cuối Hình 2.8 Cấu tạo 3 đoạn của ống tiểu quản gan tụy Mid: Ruột giữa Hsd: Ống dẫn mật sơ cấp Hep: Gan Shj: Điểm nối gan với dạ dầy Htp: Ống tiểu quản gan tuỵ Hpd: Ống dẫn mật sơ cấp Mhj: Điểm nối ruột với gan tuỵ Gss: Sàng lọc Hình 2.9 Cấu tạo chung của gan tụy Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 14 2.4 Một số nghiên cứu mô học trên tôm càng xanh Kiran et al. (2002) nghiên cứu sự nhạy cảm về bệnh đốm trắng (WSSV) ở các vòng đời khác nhau trên tôm càng xanh. Kết quả Post-larvae, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và tôm trưởng thành có biểu hiện mô học tương tự như những dấu hiệu tìm thấy trên tôm sú nhưng sự hoại tử và thể vùi ít hơn. Pillai et al. (2005) nghiên cứu mô bệnh học về bệnh phồng nước trên nắp mang tôm càng xanh. Kết quả mô học cho thấy rằng lớp tế bào biểu mô dưới vỏ bị phân mảnh, tế bào biểu mô kết thành khối có cấu trúc như bào nang hình cầu. Cấu trúc này được tìm thấy trên nhiều cơ quan như tế bào biểu mô, cơ và trên gan tụy. Khi tôm bị bệnh này trên mang còn thấy có sự hiện diện của nhóm kí sinh trùng. Tung et al. (1999) nghiên cứu mô học và quan sát bằng kính hiển vi điện tử trên tôm càng xanh bị bệnh vi-rút trên cơ Macrobrachium muscle virus (MMV) ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh lý tôm có màu trắng đục ở phần bụng, ăn yếu, bơi lờ đờ. Về mô học tương tự bệnh hoại tử cơ (IMP) và tác giả đã tìm thấy thể vùi trên cơ bị hoại tử. Theo C-Y Hsieh et al. (2006) bệnh đuôi trắng trên tôm càng xanh xuất hiện tại Đài Loan về dấu hiệu tổn thương mô bệnh học cho thấy có sự hiện diện của một lượng lớn tế bào ưa kiềm bất thường hoặc hình oval, các thể ẩn trong tế bào chất ở những mô cơ và gan bị nhiễm bệnh. Kỹ thuật RT-PCR và lai tại chỗ (in situ hybridization-ISH) cho thấy có sự hiện diện của M. rosenbergii nodavirus (MrNV) nhưng không tìm thấy extra small virus. Các phân tích cây di truyền cho thấy có một sự tương đồng rất cao (99.5–100%) của trình tự acid nucleic giữa sáu chủng được nghiên cứu, tương đồng vừa phải (98.2–98.6%) với chủng phân lập từ Caribbean và Ấn Độ, và ít tương đồng nhất (95.2%) với chủng phân lập từ Trung Quốc. Đây là báo cáo đầu tiên xác nhận sự hiện diện của MrNV trên tôm càng xanh bằng phương pháp RT-PCR và ISH tại Đài Loan. Theo Nguyễn Kim Cương nghiên cứu về kí sinh trùng, mô học và thử nghiệm cảm nhiễm bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm càng xanh nuôi ruộng lúa (Macrobrachium rosenbergii). Như vậy, đã có nhiều nghiên cứu về mô học của tôm càng xanh, nhưng chủ yếu là những nghiên cứu về những biến đổi mô học trên những cơ quan của tôm bệnh. Chưa có một nghiên cứu nào về cấu trúc mô bình thường của tôm và các nghiên cứu trước ít có sự so sánh về cấu trúc mô khỏe và cấu trúc mô bệnh của các cơ quan trên tôm. Do đó, đề tài “Cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên tôm càng xanh khỏe (Macrobrachium rosenbergii)” được thực hiện nhằm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15 xác lập bộ sưu tập về cấu trúc mô bình thường của các cơ quan trên tôm càng xanh và làm cơ sở cho việc nghiên cứu về mô bệnh học. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 16 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) Phương pháp thu mẫu phân tích  Thời gian: thu và phân tích mẫu trong quá trình thực hiện đề tài từ 03/2008 đến tháng 06/2008.  Địa điểm phân tích mẫu: phòng thí nghiệm Mô học, bộ môn Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy sản trường Đại Học Cần Thơ. ● Vật liệu nghiên cứu: mẫu tôm càng xanh dùng cho nghiên cứu được thu từ tự nhiên ● Chọn địa điểm thu mẫu: Cần Thơ. Thu mẫu Phương pháp thu mẫu: tiến hành thu mẫu tôm càng xanh trưởng thành được đánh bắt tự nhiên. Khi thu chọn những con tôm càng xanh khỏe mạnh, màu sắc tươi sáng, các phần phụ còn đầy đủ. Tôm thu mua được đưa vào thùng mướp có máy sục khí và chuyển ngay vào phòng thí nghiệm để cố định mẫu. - Tổng số lượng mẫu: 40 mẫu tôm thịt (mỗi con khoảng 20g). - Ghi mã số mẫu theo ký hiệu: CT-P-N (CT: Cần Thơ; P: đợt thu mẫu; p = ao; N: Số mẫu) 3.2 Phương pháp phân tích mẫu 3.2.1 Kỹ thuật mô học Vị trí của các hệ cơ quan trên tôm càng xanh khỏe Qua đề tài, các cơ quan cần được nghiên cứu bao gồm: mang, gan tụy, dạ dày, cơ quan lympho, cơ. Các cơ quan này được lấy từ những vị trí trên cơ thể tôm như hình 3 ( Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 17 Hình 3 Cấu tạo cơ thể của tôm Phương pháp cố định (Lightner, 1996) Chuẩn bị dung dịch cố định Davidson’s AFA Thành phần Thể tích -Ethyl alcohol 95% 330 ml -Formalin 200 ml -Acid acetic 115 ml -Nước cất 335 ml Cố định mẫu 1. Dùng kéo sắc rạch một đường trên vỏ kitin, từ đốt bụng thứ 6 đến cuống mắt (lưu ý là không cắt sâu đến lớp mô vì nếu cắt sâu sẽ làm tổn thương đến các nội quan bên trong đầu tôm). Đường rạch trên khu vực đầu là một đường giữa của mặt lưng và chỉ một phần bên. Trong khi đó, ở khu vực bụng đường rạch là đường giữa. 2. Do tôm lớn hơn 12g, cắt đôi tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, và tiếp tục chia phần bụng làm hai. 3. Cho tôm vào dung dịch cố định. Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 24-72 giờ. 4. Sau 24 giờ, chuyển tôm sang cồn 50-70% để bảo quản mẫu. Mang Giáp đầu ngực Mắt Gan tụy Cơ thân Cơ đuôi Chân ngực và Chân bơi Gai telson Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 18 5. Sau 24 giờ, cắt tỉa định hướng và xử lý mẫu tôm. 3.2.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô Cắt tỉa định hướng Do tôm lớn hơn 3cm nên cắt tôm ra thành những phần nhỏ tại các vị trí khác nhau như: mang, gan tụy, cơ. Sau đó lấy những phần nhỏ của tôm cho vào khuôn nhựa xử lý mẫu. Xử lý mẫu Tiếp theo quá trình cắt tỉa định hướng là quá trình xử lý mẫu. Qui trình xử lý mẫu mô tôm được cài đặt trong máy xử lý mẫu (Microm, STP 120-2) theo các bước sau (Shreck & Moyle, 1999) Kích cỡ khối mô/Thời gian T T Hóa chất sử dụng >=5mm <5mm <3mm <1mm 1 Cồn 80% 30’ 20’ 10’ 5’ 2 Cồn 95% 60’ 20’ 10’ 5’ 3 Cồn 95% 30’ 30’ 10’ 5’ 4 Cồn 100% 60’ 40’ 20’ 5’ 5 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’ 6 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’ 7 Cồn 100% 180’ 60’ 30’ 5’ 8 Xylen 30’ 20’ 20’ 5’ 9 Xylen 30’ 30’ 20’ 5’ 10 Paraffin + Xylen (7:3) 60’ 60’ 20’ 5’ 11 Paraffin + sáp ong (1:1) 60’ 60’ 30’ 5’ 12 Paraffin + sáp ong (7:3) 60’ 60’ 30’ 5’ Sau khi hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và cho chương trình cài đặt trên vận hành theo chương trình 4 (program 4). Đúc khối Sau khi xử lý, chuyển khuôn nhựa chứa mẫu sang vị trí số 2 của máy đúc khối (Microm, EC 350-1). Để khối mô trong paraffin khoảng 30’, sau đó tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C. Định hướng mẫu mô, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 19 cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí của mẫu trong khuôn. Khi mẫu mô được tẩm vào trong paraffin, đặt khuôn nhựa có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua máy làm lạnh nhanh (Microm, EC 350-2) để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn. Cắt lát mẫu mô a. Chuẩn bị máy cắt (Microtome, Yamato, PR-50) Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lát cắt được hình thành. b. Cắt mẫu Trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dầy của lát cắt. Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 12-16 m. Sau khi đã cắt khối mẫu đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt ở cỡ 4 m. Dán lát cắt vào phiến kính (lame) Chuẩn bị dụng cụ và dung dịch - Phiến kính (lame) - Nước ấm nhiệt độ khoảng 400C - Bàn sấy (Slide warmer, PS-53) nhiệt độ khoảng 500C Phương pháp dán mẫu Sử dụng nước ấm khoảng 400C, cho lát cắt vào chậu nước ấm. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong chậu nước, nhúng phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt, cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng bàn sấy ở nhiệt độ 500C để loại bỏ paraffin. Nhuộm màu Chuẩn bị dung dịch - Xylen. - Cồn (65%,90%,95%,100%). - Nước cất. - Dung dịch nhuộm Haematoxylin. - Dung dịch Eosin. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 20 Phương pháp nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin (H&E) theo quy trình của Harris (1990) có điều chỉnh và mẫu được nhuộm thủ công STT Hóa chất sử dụng Thời gian 1 Xylen 10 phút 2 Xylen 10 phút 3 Xylen 10 phút 4 Cồn 100% 1 phút 5 Cồn 100% 1 phút 6 Cồn 100% 1 phút 7 Cồn 95% 1 phút 8 Cồn 90% 1 phút 9 Cồn 65% 1 phút 10 Nước máy 1 phút 11 Haematoxylin. 2 phút 12 Nước máy 1 phút 13 Acid Alcohol 1% 10 giây 14 Potassium 5 phút 15 Eosin 3 phút 16 Nước máy 1 phút 17 Cồn 65% 1 phút 18 Cồn 90% 1 phút 19 Cồn 95% 1 phút 20 Cồn 100% 1 phút 21 Cồn 100% 1 phút 22 Cồn 100% 1 phút 23 Xylen 5 phút 24 Xylen 5 phút 25 Xylen 5 phút Cho phiến kính có chứa mẫu vào trong giá và cho vào các khay nhuộm với thứ tự và thời gian như trên. Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ bắt màu xanh dương. Vùng tế bào với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím. Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm. Sử dụng keo Canada balsam để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ một giọt keo lên trên lame, dán “lamella” lên trên ngay vùng có miếng mô. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 21 vì nếu trong lame có bọt khí thì khi quan sát dưới kính hiển vi gây khó khăn trong việc quan sát. 3.2.3 Thu thập và xử lý số liệu Sau khi đã hoàn thành xong tiêu bản, ta có thể quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (Novex-Holland). Chụp hình bằng máy ảnh kỹ thuật số (LG 3.0 pixel-Korean) và quan sát cấu trúc tế bào của từng cơ quan trên tiêu bản. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 22 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.1 Cấu tạo vi thể của mang Mang là cơ quan hô hấp của tôm càng xanh nằm ở gốc các đôi phần phụ của phần đầu ngực, từ đôi chân hàm số 1 đến đôi chân hàm số 5. Khoảng trống giữa nội quan và giáp đầu ngực gọi là xoang mang. Sự hoạt động của các đôi phần phụ ở phần ngực ngoài việc đưa thức ăn vào miệng còn có ý nghĩa là tạo dòng nuớc lưu thông qua xoang mang. Do đó hàm lượng oxy hòa tan trong nước ở mang luôn cao, giúp cho quá trình hô hấp ở mang được thuận lợi. Ngoài ra, mang còn có chức năng bài tiết Ammonia, hấp thu các chất khoáng có trong môi trường và điều hòa áp suất thẩm thấu (trích dẫn theo Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). Mang được cấu tạo bởi những phiến mang có hình lông chim (hình 4.1). Trên phiến mang có các sợi mang, gọi là các sợi mang sơ cấp (hình 4.1-B), một đầu nối với trục còn một đầu hướng ra ngoài và giữa các sợi mang tạo thành một khoảng không gian gọi là các khe mang. Trên sợi mang sơ cấp có các sợi mang thứ cấp (hình 4.2-B). Các sợi mang có khung cutium (hình 4.4-A) nâng đỡ và bên trong có nhiều mạch máu phân bố (hình 4.2-C). Qua quan sát tiêu bản mô học hình 4.4 cho thấy trong những sợi mang có những vật chất bắt màu hồng đậm của thuốc nhuộm H&E và có hình trụ, kéo dài bên trong mang (hình 4.4-C), đây có thể là những tế bào biểu mô lát đơn theo sự miêu tả của Phạm Trần Nguyên Thảo (2007). Những tế bào biểu mô này sẽ được chuyên hóa tạo thành những tế bào trụ (pillar cells), chức năng của chúng là giúp nâng đỡ khung mang (Na Li và ctv, 2006). Nghiên cứu của Liliana Sousa và ctv (2007) cho rằng bề mặt của mỗi sợi mang được phủ bởi một lớp cutium mỏng chạy dọc theo và bắt màu hồng đậm hơn so với toàn sợi mang, những dấu hiệu này tương tự với những dấu hiệu ở hình 4.4. Các sợi mang được cấu tạo bởi những tế bào biểu mô (hình 4.4-C). Lớp biểu mô bao bọc sợi mang sơ cấp và sợi mang thứ cấp thì rất mỏng và nó thường dầy hơn ở đầu của sợi mang. Qua lát cắt có thể thấy bên trong những tế bào máu hình cầu, bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm H&E phân bố khắp nơi trong sợi mang. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 23 Hình 4.1 Cấu trúc đại thể của mang (H&E, 10X) Cấu trúc phiến mang có hình lông chim A Trục chính B Sợi mang sơ cấp C Mạch máu Hình 4.2 Cấu tạo vi thể của sợi mang sơ cấp (H&E, 40X). A Tế bào biểu mô B Sợi mang thứ cấp C Mạch máu D Lớp cutium A B C D B A C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 24 Hình 4.3 Cấu trúc đại thể của mang (H&E, 10X). A Trục chính B Mạch máu C Sợi mang sơ cấp D Sợi mang thứ cấp Hình 4.4 Cấu trúc vi thể của mang (H&E, 10X). A Lớp cutium B Mạch máu C Tế bào biểu mô mang. A B C D A B C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 25 4.1.2 Cấu tạo vi thể dạ dày Ruột trước của tôm càng xanh biệt hóa thành dạ dày. Dạ dày là cơ quan tiêu hóa thức ăn của tôm, bắt đầu từ phía trên thực quản kéo dài đến giữa gan tụy (hình 4.5-A, hình 4.6-A). Chức năng của dạ dày là nghiền nát và tiêu hóa thức ăn (trích dẫn theo Lightner, 1996). Qua quan sát tiêu bản mô học ở hình 4.5 thì dạ dày có dạng túi dài, phía sau phình ra hai túi nhỏ hai bên và bao xung quanh dạ dày tôm là một lớp bắt màu tím của thuốc nhuộm H&E (hình 4.6-D). Dưới vật kính 40X, (hình 4.7) thì bên trong lớp này chứa một hàng những tế bào hình trụ bắt màu tím đậm, đây là những tế bào biểu mô trụ đơn (hình 4.7-B) và cũng là loại biểu mô có khả năng tái tạo mạnh nhất. Bao bên ngoài xoang dạ dày là những lớp tế bào bắt màu hồng nhạt và có nhân bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm H&E. Đây là lớp mô liên kết (hình 4.7-C) và kế đến mới là lớp cơ trơn (hình 4.5-F) bắt màu hồng đậm của thuốc nhuộm H&E. Nghiên cứu của Lightner và ctv (1988) cho rằng dạ dày là một phần của hệ tiêu hóa của tôm. Nó kéo dài từ thực quản đến phía sau của gan tụy. Dạ dày tách biệt ra làm hai phần: phần mặt lưng (hình 4.5-E) và phần mặt bụng (hình 4.5-B), thuật ngữ khác còn gọi là dạ dày tuyến trước (cho phần mặt lưng của dạ dày) và dạ dày tuyến sau (cho phần mặt bụng của dạ dày). Cả hai phần này được viền bởi một lớp kitin hay còn gọi là bề mặt nghiền. Tuy nhiên, qua các tiêu bản đã làm thì không quan sát được lớp kitin như hình 2.6. Nguyên nhân có lẽ do lớp kitin này quá mỏng, theo Lin (1996) thì lớp kitin này mỏng chỉ bắt màu hồng rất nhạt của thuốc nhuộm H&E và làm cho việc quan sát nó sẽ bị ảnh hưởng. Ở bên ngoài phần mặt lưng, có một lớp cơ hoành (hình 4.6-B) và lớp mô liên kết (hình 4.6-C) bao xung quanh dạ dày. Ngoài ra, còn có thế thấy các ống nhỏ của cơ quan lymphoid. Bên trong xoang mặt bụng thường thấy nhiều nếp gấp lớn (hình 4.6), chức năng của nó như là một sàng lọc, giúp chọn lọc thức ăn để đưa đến gan tụy. Sàng lọc này được cấu tạo bởi những lông cứng bằng kitin (hình 4.6-E) và những khe rãnh. Theo Nguyễn Kim Cương (2006) dạ dày tôm càng xanh chia làm 2 xoang: xoang mặt lưng (hình 4.5-E) và xoang mặt bụng (hình 4.5-B). Dạ dày có gờ cutium (hình 4.5-C) lát mặt trong là cơ quan nghiền mồi, đây là đặc điểm chung của lớp giáp xác. Đối với giáp xác bậc thấp thì cơ quan này đơn giản và hàm dưới phức tạp còn đối với giáp xác bậc cao thì ngược lại, các gờ này phát triển thành cối xay vị (hình 4.5-C). Tôm càng xanh có 3 gờ cutium dọc, gờ giữa lớn hơn. Lớp biểu mô bên trong thành ống dạ dày bắt màu tím đậm (hình 4.7-A) là biểu mô trụ đơn gồm một hàng tế bào hình trụ (hình 4.7-B) xếp sát Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 26 vào nhau tạo thành lớp với khoảng gian bào không đáng kể và tựa trên màng đáy ngăn cách với mô liên kết (hình 4.7-C), tiếp theo dạ dày là ruột. Hình 4.5 Cấu tạo đại thể của dạ dày (H&E, 10X). A Gan tụy B Xoang mặt bụng C Gờ cuticum (cối xay vị). D Lớp mô liên kết E Xoang mặt lưng F Tầng cơ trơn. Hình 4.6 Cấu tạo đại thể của dạ dày ở mặt cắt dọc (H&E, 10X ). A Gan tụy B Cơ hoành C Lớp mô liên kết D Lớp biểu mô E Lông cứng bằng kitin A B D C F A B C D E E B Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 27 Hình 4.7 Cấu tạo vi thể lớp biểu mô dạ dày (H&E, 40X). A Lớp biểu mô B Tế bào biểu mô C Lớp mô liên kết D Xoang dạ dày Hình 4.8 Cấu tạo vi thể lớp sàng lọc dạ dày (H&E, 40X). A Lớp biểu mô B Tế bào biểu mô C Lớp mô liên kết D Xoang dạ dày E Sàng lọc. A B C D C B D E A Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 28 4.1.3 Cấu tạo vi thể của gan tụy Gan nằm ở phần đầu ngực của tôm, có dạng khối, tuyến gan tụy giữ vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, gan tiết ra dịch tiêu hóa biến thức ăn thành nhũ tương, đồng thời cũng có chức năng hấp thụ thức ăn ( trích dẫn theo Phạm Trần Nguyên Thảo, 2007). Qua quan sát các tiêu bản mô học thì cơ quan gan tụy bắt màu tím của thuốc nhuộm H&E. Gan tụy ở mặt cắt dọc (hình 4.9) có thể thấy nó là một hệ thống ống phân nhánh gồm nhiều ống nhỏ và có kết nối với ống dạ dày và ruột. Ở đầu mút của ống có nhiều tế bào bắt màu tím đậm, càng xa đầu mút (ở đoạn giữa và đoạn cuối) thì càng xuất hiện nhiều khoảng không bào (hình 4.9). Ở mặt cắt ngang của cơ quan gan tụy (hình 4.10) thì gan tụy bao gồm nhiều ống nhỏ hình tròn bắt màu tím của thuốc nhuộm H&E và trong mỗi ống có đều có xoang. Ống gan tụy sơ cấp liên kết với ống dạ dày-ruột, ống này nằm phía sau của buồng dạ dày và phía trước của đoạn cuối ruột giữa. Tuy nhiên qua quan sát các tiêu bản mô học đã làm thì không thấy được ống gan tụy này. Nguyên nhân có lẽ do thùy bụng của gan tụy nằm trải dọc và chèn phía trên ống dạ dày-ruột và khi cắt mẫu mô thì lát cắt không đủ sâu để có thể thấy được cấu trúc này. Nhánh của ống gan tụy thứ cấp bắt nguồn từ các ống gan tụy sơ cấp và được ghi nhận là chứa nhiều loại tế bào hơn. Theo Lightner và ctv (1988) gan tụy là một hệ thống dày đặc các ống nhỏ, chúng gọi là các ống tiểu quản gan tụy (hình 4.10-A). Các ống này được xây dựng bởi các tế bào biểu mô và sợi co giãn (hình 4.12-C), khoảng giữa hai ống là xoang (hình 4.12-A). Mỗi xoang được bao bọc bởi lớp mô liên kết và sợi co giãn, bên trong chứa những tế bào máu và tế bào hai nhân. Ở mặt cắt ngang, xoang của ống tiểu quản gan tụy có “hình sao” (hình 4.10-B). Trong xoang của ống tiểu quản chứa những hạt vật chất và các tế bào bề mặt của xoang, chúng được bao bọc bởi diềm bàn chải (hình 4.12-E). Trong đoạn đầu của ống tế bào F chiếm đa số (fibrillenzellen). Ở cuối ống thường chứa những tế bào E (embryonalzellen) hoặc những tế bào hai nhân. Càng xa đầu mút của ống càng có nhiều tế bào khác như tế bào R (restzellen) hoặc tế bào B (blasenzellen). Tế bào B bên trong chứa không bào lớn, còn tế bào R chứa một lượng lớn nội bào tương thô dạng lưới và những hạt lipid. Theo Bhavan và Geraldine (2000) mô tả, gan tụy bao gồm nhiều ống nhỏ hay còn gọi là những ống tiểu quản được chia làm 3 phần: đoạn đầu (hình 4.9-A), đoạn giữa (hình 4.9-B), đoạn cuối (hình 4.9-C). Các ống tiểu quản này kết lại rồi tập trung thành ống và đổ vào ruột giữa. Các ống này khi đóng khi ở xa tâm và mở khi ở gần tâm. Ở mặt cắt ngang của ống tiểu quản, có các xoang mạch máu (hình 4.12-A) bao quanh các ống tiểu quản, bên trong chứa các tế bào máu (hình 4.12-B). Bao xung quanh ống tiểu quản là sợi co giãn (hình Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 29 4.12-C, hình 4.13-E). Khoảng trống ở giữa các ống có “hình sao” gọi là xoang ống (hình 4.11-A, hình 4.12-D, hình 4.13-A), có một lớp biểu mô lót ống và diềm bàn chải (hình 4.12-E, hình 4.13-B) Trên ống có 4 loại tế bào: tế bào E (embryonalzellen), tế bào R (restzellen) (hình 4.12-F), tế bào F (fibrillenzellen) (hình 4.12-G) và tế bào B (blasenzellen) (hình 4.14-A). Tế bào E nằm ở phần hẹp, xa tâm, cuối ống. Tế bào R (hình 4.13-C) và tế bào F (hình 4.12-G, hình 4.13-D) nằm ở một khoảng ngắn cách xa vùng ngoại biên. Tế bào R chứa một lượng lớn lưới nội chất sần sùi và các hạt lipid. Trong khi đó tế bào F (hình 4.13-D) không có không bào và bắt màu đậm. Tế bào B nằm ở chính giữa và ở vùng gần đầu của ống. Tế bào B có chứa các hạt nhỏ là sản phẩm tiết. Ở giữa ống là các tế bào kẽ. Hình 4.9 Cấu tạo 3 đoạn của ống tiểu quản gan tụy ở mặt cắt dọc (H&E, 10X). A Đoạn đầu B Đoạn giữa C Đoạn cuối. A B C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 30 Hình 4.10 Cấu trúc đại thể của ống tiểu quản gan tụy ở mặt cắt ngang (H&E, 10X). A Các ống tiểu quản gan tụy B Xoang ống “hình sao” Hình 4.11 Cấu tạo đoạn đầu của ống tiểu quản gan tụy (H&E, 40X). . A Xoang ống tiểu quản gan tụy B Sợi biểu mô cơ. A B A B B Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 31 Hình 4.12 Cấu trúc vi thể bình thường của ống gan (H&E, 40X). . A Xoang mạch máu B Tế bào máu C Sợi co giãn D Xoang ống tiểu quản E Diềm bàn chải F Tế bào R ( tế bào không bào nhỏ) G Tế bào F. Hình 4.13 Cấu tạo đoạn giữa ống tiểu quản gan tụy (H&E, 40X). . A Xoang ống tiểu quản B Diềm bàn chải C Tế bào R D Tế bào F E Sợi co giãn. A B C D E F A B C D G E Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 Hình 4.14 Cấu tạo đoạn cuối ống tiểu quản gan tụy (H&E, 40X). A Tế bào B (tế bào không bào lớn) B Diềm bàn chải C Xoang ống tiểu quản 4.1.4 Cấu tạo vi thể ruột Tiếp theo sau dạ dày là ruột. Ruột là một đoạn gần như thẳng chạy qua gan tụy về phía sau. Ruột giữa là nơi tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của tôm (trích dẫn theo Nguyễn Kim Cương, 2006). Qua quan sát tiêu bản mô học thì ruột của tôm nằm kế dạ dày (hình 4.15). Quan sát dưới vật kính 40X (hình 4.16) cho thấy ruột được cấu tạo bởi những hạt vật chất hình trụ bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm H&E, những hạt vật chất này xếp thành hàng bên trong ruột. Theo Na Li và ctv (2006) thì đây là lớp biểu mô do những tế bào biểu mô hình trụ liên kết với nhau. Quan sát hình 4.15, có nhiều phần gợn sóng. Martin và ctv (2004) gọi đây là những phiến nền (hình 4.15-D). Có hai loại tế bào trên phiến nền. Nhiều nhất là loại tế bào thuôn dài (hình 4.16-C) với mép bàn chải và đỉnh các tế bào chất có chứa đầy các tiểu thể và các túi rỗng chứa chất thải của tế bào. Xung quanh màng bao của nhân có các nhân hình trứng ở giữa mỗi tế bào, phần nền của mỗi tế bào chứa đầy các lưới nội chất trơn. Loại tế bào thứ hai có hình trứng nằm dọc phiến nền. Bên ngoài phiến nền là lớp mô liên kết lỏng lẻo có chứa cơ vòng và cơ dọc (hình 4.15-C), mạch máu và một lớp phi bào nội mạc bên ngoài. Theo Lightner và ctv (1988) toàn bộ vùng phía trước của ruột giữa chạy dọc theo suốt chiều dài thân, đi qua các thùy mặt lưng và mặt bụng của gan tụy, A B C A Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 còn vùng phía sau liên kết với dạ dày (hình 4.15-A). Ruột giữa được cấu tạo bởi lớp biểu mô do các tế bào cột đơn cấu thành (hình 4.17-C). Các tế bào này được chống đỡ gồm lớp màng cơ bản (không nhìn thấy được), một lớp cơ vòng và cuối cùng là một lớp cơ dọc (hình 4.15-C, hình 4.17-A). Bên cạnh đó, cấu trúc vi thể của một tế bào biểu mô cột đơn (hình 4.16-C) gồm nhân ở giữa và các hạt nhân lồi. Sát bề mặt của xoang tế bào là một đường viền là các chồi hoặc các lông nhỏ. Bên ngoài nhân là một vùng dày đặc các hạt cơ quan, đó có thể là các ty thể, các tiểu thể bài tiết và các hạt Golgi. Gần kề với nhân thường tìm thấy các tế bào gốc. Ngoài ra, có thể tìm thấy màng bao chất dinh dưỡng trong khoang và diềm bàn chải của ruột giữa. Hình 4.15 Cấu tạo đại thể của ruột (10X)(H&E). A Dạ dày B Ruột C Cơ dọc D Phiến nền A B C D Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34 Hình 4.16 Cấu tạo vi thể của ruột (H&E, 40X). A Tế bào biểu mô hình trụ B Lớp biểu mô Hình 4.17 Cấu tạo vi thể của ruột giữa (H&E, 40X). A Lớp cơ dọc B Lớp biểu mô C Tế bào biểu mô hình trụ D Nhân A B A A D B C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 35 Hình 4.18 Cấu tạo vi thể của của phiến nền (H&E, 40X) A Lớp cơ dọc B Lớp biểu mô C Tế bào biểu mô hình trụ 4.1.5 Cấu tạo vi thể cơ quan lymphoid Cơ quan lymphoid của tôm càng xanh là một hệ thống hai thùy, nằm ở gần dạ dày và nằm phía trước cơ quan gan tụy (A-hình 4.19). Chức năng chính của cơ quan lymphoid đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch, bảo vệ môi trường bên trong cơ thể, chống lại sự xâm nhập và gây hại của vi sinh vật cũng như các vật lạ trong cơ thể ( trích dẫn theo Phạm Trần Nguyên Thảo, 2007). Qua quan sát tiêu bản mô học ở hình 4.19 thì lymphoid là một cơ quan bao gồm hai thùy, nằm gần dạ dày và gan tụy. Cơ quan lymphoid do nhiều ống nhỏ cấu tạo thành. Bên trong mỗi ống đều chứa một xoang rỗng (hình 4.20-A), thành ống chứa nhiều vật chất bắt màu tím đậm của thuốc nhuộm H&E (hình 4.19). Theo Lightner và ctv (1988) đây là các tế bào đệm cơ bản (hình 4.20-B), tế bào bạch cầu ưa kiềm, tế bào máu, mô liên kết, mô kẻ. Trong đó, các tế bào đệm cơ bản chiếm số lượng nhiều nhất. Các ống động mạch nhỏ (hay còn gọi là các ống bạch huyết) (hình 4.19-B) được kết nối với động mạch dạ dày rồi đến động mạch chủ bụng. Thường khó trông thấy tế bào nội bì, loại tế bào này thường trong, ít hoặc không có vết nhơ của tế bào chất, trong khi các loại tế bào khác bao xung quanh xoang thường bắt màu tối. Khoảng không gian giữa các ống tiểu quản được giữ bởi các xoang mạch máu và sợi mô liên kết mỏng. A B C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 36 Theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) thì gan tụy do nhiều động mạch nhỏ tạo thành. Thành ống được lợp bởi tế bào nội mô, bên trong lòng ống có một số tế bào máu và xung quanh ống mạch là xoang mạch máu. Dưới kính hiển vi quang học, cấu tạo hiển vi của tổ chức lympho biểu hiện 2 vùng nhuộm màu khác nhau, vùng giữa ít nhuộm màu bazơ (màu của Hematoxylin) gọi là trung tâm vùng sáng hay trung tâm sinh sản, vùng chung quanh phản ứng màu bazơ mạnh hơn gọi là vùng ngoại vi vùng tối. Vùng ngoại vi tối chứa nhiều lympho bào. Những nang bạch huyết không có trung tâm vùng sáng gọi là nang sơ cấp, những nang bạch huyết có trung tâm vùng sáng gọi là nang thứ cấp. Tuy nhiên, qua quan sát tiêu bản mô học thì chưa tìm thấy mô liên kết, mô kẻ cũng như trung tâm vùng sáng. Hình 4.19 Cấu tạo vi thể của cơ quan lymphoid (H&E, 10X). . A Gan tụy B Ống động mạch nhỏ (ống bạch huyết) C Tế bào đệm cơ bản. A B C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 37 Hình 4.20 Cấu tạo vi thể của ống mạch cơ quan lymphoid (H&E, 40X). . A Xoang B Tế bào đệm cơ bản C Sợi mô liên kết. Hình 4.21 Cấu tạo vi thể của ống mạch cơ quan lymphoid (H&E, 40X). A Xoang B Tế bào đệm cơ bản 4.1.6 Cấu tạo vi thể của cơ Chức năng của cơ là giúp cơ thể vận động và bảo vệ các nội quan bên trong cơ thể (trích dẫn theo Lightner, 1996). A B C A B Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 38 Cơ tôm phân bố trên khắp cơ thể của tôm càng xanh. Trên từng cơ quan khác nhau thì có những loại cơ khác nhau. Có một số cơ quan trên tôm càng xanh mà xung quanh nó có sự hiện diện của cơ như: dạ dày tôm có lớp cơ hoành (hình 4.6-B), chống đỡ cho những tế bào biểu mô của ruột giữa có một lớp cơ vòng và cuối cùng là một lớp cơ dọc (hình 4.15-C), các chi tiết này tương tự với sự mô tả của C-Y Hsieh1 et al. (2006). Theo Lightner và ctv (1988) phần bụng tôm có lớp cơ vân bao gồm các sợi cơ (hình 4.22-A) và bó cơ (hình 4.24-A) bắt màu hồng, nhân (hình 4.23-B) của cơ hình trụ bắt màu tím. Hình 4.22 Cấu tạo vi thể của cơ tôm càng xanh ở mặt cắt dọc (H&E, 10X). . A Sợi cơ. A Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 39 Hình 4.23 Cấu tạo vi thể của cơ tôm càng xanh ở mặt cắt dọc (H&E, 10X). A Sợi cơ B Nhân Hình 4.24 Cấu tạo vi thể của cơ tôm càng xanh ở mặt cắt ngang (H&E, 10X). A Bó cơ A A B Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 40 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua quá trình thu mẫu phân tích thực hiện đề tài xác định cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên tôm càng xanh khỏe cho phép có những nhận định như sau: 1. Đã quan sát được cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên tôm như: mang, dạ dày, gan tụy, ruột giữa, cơ quan lymphod, cơ. 2. Xác lập được bộ sưu tập hình ảnh về cấu trúc mô học các cơ quan trên tôm càng xanh với 24 hình. 5.2 Đề xuất 1. Khi thu mẫu tôm cần chọn những mâu tôm có khối lượng từ 10-15g, không nên chọn những mẫu tôm có kích thước và khối lượng lớn. Do mẫu tôm lớn khi cắt tỉa định hướng sẽ không lấy hết được toàn bộ phần đầu tôm dẫn đến khi quan sát sẽ không quan sát hết được tất cả các cơ quan của tôm. 2. Tiếp tục nghiên cứu về các cấu trúc chưa quan sát được trên tôm càng xanh như: lớp kitin ở dạ dày, tế bào E ở cơ quan gan tụy, mặt cắt ngang của ruột, trung tâm vùng sáng cũng như mô liên kết, mô kẻ của cơ quan lymphoid. 3. Cần nghiên cứu thêm về các cơ quan khác trên tôm càng xanh như: tim, tuyến râu, cơ quan sinh dục. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. AAHRI, 1997. The Aquatic Animal Health Research Institute. ( (truy cập ngày 30/01/2008) 2. A Paulraj, S Peixoto, C Vasumathi and K Altaff, 2008. Ovarian histology of stunted pond-reared Macrobrachium rosenbergii females. 3. Bhavan, S.P., P. Geraldine, 2000. Histopathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium rosenbergii exposed to endosulfan. Aquaculture Toxicology 50:331-339. 4. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2007. Báo cáo nghề cá tháng 12/2007. Báo điện tử Tuổi Trẻ.com.vn. 5. Bộ môn sinh học và bệnh thuỷ sản, 2007. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thuỷ sản. Đại Học Cần Thơ. 6. Bùi Châu Trúc Đan, 2003. Bước đầu nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp. Đại Học Cần Thơ. 7. Bùi Quang Tề, 2003. Một số bệnh thường gặp và biện pháp phòng trị trên tôm nuôi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp (184 trang). 8. C-Y Hsieh1, Z-B Wu1, M-C Tung1, C Tu2, S-P Lo1, T-C Chang1, C-D Chang1, S-C Chen1, 2006. In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), in Taiwan. Journal of Fish Diseases. 2006, 29, 665­671. 9. C. W. Tung, C. S. Wang and S. N. Chen, 1999. Histological and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan. Journal of Fish Diseases 1999, 22, 319­323. 10. Donald V. Lightner, 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of cultured penaeid shrimp. Published by the World Aquaculture Society. 11. Dương Nhựt Long, 2004. Kỹ thuật nuôi thủy sản nước ngọt. Giáo trình nuôi trồng thủy sản. 12. Đặng Thị Hòang Oanh, 2007. Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đóan bệnh thủy sản. Giáo trình bệnh học thủy sản. 13. Hoàng Tuấn, 2007. Xác định mầm bệnh virus phân lập trên tôm sú (Penaeus monodon) bị bệnh phân trắng. Luận văn tốt nghiệp. Đại Học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42 14. Holthuis, L.B., 1980. FAO Species catalogue. Vol.1. Shrimps and Prawns of the world. An annotated catalogue of species of interest to fisheries. FAO. Fish. Synop., (125). Vol.1, 1980, 261 pp. 15. Jean–Michel Arcier1, Francois Herman2, Donald V.Lightner3, Rita M.Redman3, Jocelyne Mari3, Jean-Robert Bonami1, 1999. A viral disease associated with mortalities in hatchery postlarvae of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. 16. Kiran, R. B., K. V . Rajendran., S. J. Tung and M. J. Oh, 2002. Experimental susceptibility of different life- stages of giant fresh- water prawm, Macrobracchium rosenberggi (de Man) to white spot syndrome virus (WSSV). Journal of fish diseases 25: 201- 207. 17. K K Vijayan, V Stalin Raj, S V Alavandi, V Thillai Sekhar & T C Santiago, 2001. Incidence of white muscle diasease, aviral like disease associated with mortalities in hatchery-reared postlarvae of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (De Man) from the south-east coast of India. 18. Lavens & Sorgeloos, 1995. Composition for feeding prey organisms on aquaculture. ( - 18k - ) (truy cập ngày 01/01/2008). 19. Lightner & Redman, 1985. Health management in Asian aquaculture.( M-34k-) (truy cập gày 30/01/2007). 20. Liliana Sousa & Ana Maria Petriella, 2007. Morphology and histology of P.argentinus (Crustacea, Decapoda, Carieda) digestive tract. 21. Lin FY, 1996. Structure of the gland filters in the pyloric stomach of Penaeus japonicus (Decapoda: Penaeidae). 515-521. 22. Lưu Minh Bé, 2002. Điều tra bệnh tôm càng xanh trong hệ thống nuôi ao và tôm lúa tỉnh An Giang. Tiểu luận tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ. 23. Martin, G.G., N.Rubin, E.Swanson, 2004. Vibrio parahaemolyticus and V.harveyi cause detachment of the epithelium from midgut trunk of the penaeid shrimp Sicyonia ingentis. Disease of Aquatic Organism. 60:21-29 24. Na Li, Yunlong Zhao, Jian Yang, 2006. Impact of waterborne copper on the structure of gills and hepatopancreas and its impact on the content of metallothionein in juvenile giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii (Crustacea: Decapoda). 25. New và Singholka. Hatchery culture of Macrobrachium rosenbergii (cherabin), 1982. ( - 29k -) (truy cập ngày 28/01/2008). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 43 26. Nguyễn Hữu Thọ, 2004. Mối quan hệ giữa một số môi trường và bệnh tôm. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học và công nghệ. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 494-503. 27. Nguyễn Kim Cương, 2006. Khảo sát ký sinh trùng, mô học và thử nghiệm cảm nhiễm bệnh đốm trắng trên tôm càng xanh nuôi ruộng lúa. Luận văn tốt nghiệp. Đại Học Cần Thơ. 28. Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 1999. Kỹ thuật nuôi tôm càng xanh. 29. Phạm Phan Địch, Trịnh Bình và Đỗ Kính, 2004.Mô học. Nhà xuất bản y học. Hà Nội. 739 trang. 30. Phạm Thanh Liêm và Trần Đắc Định, 2004. Phương pháp nghiên cứu sinh học cá. Giáo trình bệnh học thủy sản. Đại Học Cần Thơ. 31. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003. Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp. Đại Học Cần Thơ. 32. Phạm Trần Nguyên Thảo, 2007. Mô bệnh trên tôm. Trình duyệt PowerPoint, giáo trình Bệnh Học Thủy Sản. Đại Học Cần Thơ. 33. Pillai1 D., J-R Bonami2 and J. Sri Widada2, 2006. Rapid detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV), the pathogenic agents of white tail disease of Macrobrachium rosenbergii, by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases 2006, 29. 275­283. 34. Shreck & Moyle, 1999. Methods for Fish Biology. 35. Sousa LG, Petriella AM (2000). Histology of the hepatopancreas of the fresh water prawn palaemonetes argentinus (Crustacea, Caridae) during moult. 275-281. 36. S.Pornata, T.Sumateb, S.Rommaneeb, K.Sumolayac, W.L.Kerrd, 2007. Changes in ultrasculture and texture of prawn muscle (Macrobrachium rosenbergii) during cold store. 37. Thomas A.Bell and Donald V.Lightner, 1988. A handbook of normal Penaeid Shrimp histology. Published by the World Aquaculture Society. 38. Trần Tấn Huy, Tạ Văn Phương và Dương Thị Hoàng Oanh, 2004. Thực nghiệm nuôi tôm càng xanh theo mô hình tôm lúa ở Thoại Sơn – An Giang. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ: 230-236. 39. Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2004. Thành phần loài và khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn vibrio phân lập từ hệ thống ương tôm càng xanh. Tạp chí khoa học Đại Học Cần Thơ. 40. Triệu Thanh Tuấn, 2007. Khảo sát mối quan hệ giữa kiểu gen của white spot syndrom virus (WSSV) với bệnh đốm trắng trên tôm sú Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 44 (Penaeus monodon) nuôi tại Bạc Liêu và Cà Mau. Luận văn tốt nghiệp. Đại Học Cần Thơ. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 45 PHỤ LỤC CÔNG THỨC PHA CHẾ MỘT SỐ CHẤT HÓA HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH MÔ HỌC 1. Dung dịch cố định Davidson’ AFA Ethyl alcohol ................................................................330 ml Formol thương mại.......................................................220 ml Acid acetic ...................................................................115 ml Nước cất.......................................................................355 ml Giữ ở nhiệt độ phòng. 2. Thuốc nhuộm Hematoxylin Nước cất đun nóng ......................................................2000 ml Hematoxylin.................................................................20 g Sodium Iodate ..............................................................2 g Potasscium aluminium sulfate ......................................180 g Acid citric ....................................................................0,4 g 3. Dung dịch Eosin-Phloxine Stock eosin (1% eosin Y trong nước) ...........................100 ml Stock ph oxine (1% phloxine B trong nước).................10 ml Cồn 95% ......................................................................780 ml Acid glacial acetic ........................................................4 ml