Chẩn đoán cúm gia cầm bằng kỹ thuật Elisa

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 1 Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học Nông Lâm TP. HCM Bài tiểu luận CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Quế Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 2 MỤC LỤC Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................. 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM .............................................................................. 4 2.1.1. LỊCH SỬ BỆNH ...................................................................................... 4 2.1.2.CĂN BỆNH .............................................................................................. 4 2.1.2.1 Hình thái và cấu trúc ............................................................................. 4 2.1.2.2 Quá trình tái sản của virus ..................................................................... 7 2.1.2.3 Sức đề kháng đối với tác nhân vật lý và hóa học ................................... 8 2.1.2.4 Độc lực của virus ................................................................................... 8 2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA ....................................... 8 2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ .................................................................................... 8 a. Loài cảm nhiễm .............................................................................................. 8 b.Đường truyền lây và vật mang mầm bệnh ...................................................... 8 c. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................................ 9 2.1.3.3. Triệu chứng và bệnh tích ...................................................................... 9 2.1.3.4 Miễn dịch ............................................................................................... 9 2.1.3.5 Chẩn đoán .............................................................................................. 9 a.Chẩn đoán lâm sàng ........................................................................................ 9 b.Chẩn đoán phòng thí nghiệm .......................................................................... 9 2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm ............................................................ 9 Chương 3: CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA ..... 10 3.2 Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISA 10 ......................................................... 3.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu ...................................................................... 10 3.2.2 Phát hiện kháng nguyên .......................................................................... 11 3.2.3 Phát hiện kháng thể ................................................................................. 12 3.2.4 Một số bộ kit phát hiện kháng thể .......................................................... 14 Chương 4: KẾT LUẬN .................................................................................... 16 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Những ngày này cả thế giới đang nóng lên trước nguy cơ lây lan của dịch cúm gia cầm khắp toàn cầu. Lịch sử nhân loại đã từng chứng kiến nhiều đại dịch cúm cướp đi sinh mạng của hàng trăm triệu người trên thế giới mà điển hình là vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 cùng với những thiệt hại về kinh tế. Do mức độ thiệt hại đáng kể, nhiều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm đã và đang được áp dụng nhằm hạn chế sự lây lan và phát tán của mầm bệnh. Vì vậy việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm một cách có hiệu quả, nhanh, chính xác, rẻ tiền là một vấn đề bức thiết. “ Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA” là một trong những kỹ thuật đáp ứng được những yêu cầu thực tiễn trên và được áp dụng rộng rãi. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 4 TỔNG QUAN 2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM 2.1.1. LỊCH SỬ BỆNH Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây bệnh cho gia cầm với tỷ lệ chết cao với những biểu hiện về hô hấp, tiêu hóa hay thần kinh. Bệnh được ghi nhận đầu tiên vào năm 1878 tại Ý và được gọi là dịch tả gà (fowl plague). Đến năm 1901, Centanni và Savonuzzi đã chứng minh bệnh là do “virus có thể qua lọc” gây ra, nhưng virus không được định danh là virus cúm cho đến năm 1955. Sau đó người ta thấy bệnh xuất hiện ở các nước Áo, Đức, Bỉ và Pháp. Hiện nay, bệnh xuất hiện hầu như ở các nước trên thế giới với các subtyp khác nhau đã được xác định. Một số ổ dịch gần đây ở các nước khác nhau đã được thông báo: subtyp H5N1 (Anh,1991), Subtyp H7N3 ( Úc, 1992-1995), H5N2 (Mexico, 1994), H7N3 (Pakistan, 1995), H5N1 ( Hồng Kông, 1997), H5N2 (Ý,1992), H7N4 ( Úc, 1994), H7N1 (Ý, 1999) và H5N1 (Hồng Kông, 2001). Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm subtyp H5N1 đã xuất hiện tại một số nước châu Á, trong đó có Việt Nam, sau đó lan sang các nước châu Âu và Trung Đông. Bệnh có nguy cơ lan rộng, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và đe dọa sức khỏe cộng đồng. 2.1.2.CĂN BỆNH Giới thiệu chung về virus cúm gia cầm 2.1.2.1 Hình thái và cấu trúc Cúm gà hay cúm gia cầm là một loại bệnh cúm do virus gây ra cho các loài gia cầm (hay chim), và có thể xâm nhiễm một số loài động vật có vú. Virus này được phát hiện lần đầu tiên là tại Ý vào đầu thập niên 1900 và giờ đây phát hiện ở hầu hết các nơi trên thế giới. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 5 Virus cúm gà có tên khoa học là avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A của họ Orthomyxociridae. Đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80- 120nm. Cấu trúc bộ gene của virus gồm 8 phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS. Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA. Đến nay người ta xác định có tất cả 16 subtype HA và 9 subtype NA được phân lập trên các loài dã cầm và gia cầm khắp nơi trên thế giới qua nhiều giai đoạn khác nhau. Sự phối hợp của 16 loại HA và 9 loại NA tạo nên sự đa dạng và phong phú của virus cúm. (1) Haemagglutinin (HA) Là một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa sialic acid, giúp virus nhân lên và gây bệnh. Có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Là kháng nguyên bề mặt, kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể bảo hộ HI. Thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng của kháng nguyên. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 6 Hemagglutinin The hemagglutinin molecule is actually a combination of three identical proteins (shown here as gray, green, and purple) that are bound together to form an elongated cylindrical shape. A mutation that changes just one amino acid in the protein structure can alter the antigenic properties significantly. (2) Neuraminidase (NA) Là protein bề mặt, có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng. Là kháng nguyên bề mặt kích thích cơ thể vật chủ tạo kháng thể NI. Neuraminidase Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 7 The top consists of four identical proteins with a roughly spherical shape. The picture below shows how each of these subunits is rotated by 90 degrees relative to the center of the arrangement. Các yếu tố H và N do các gene quy định nên khi các gene biến đổi, những yếu tố kháng nguyên này biến đổi theo. Có hai loại biến đổi ở mức độ phân tử: (1)Các đột biến điểm (point mutations): Thường xảy ra trên hai gene mã hóa các thành phần kháng nguyên dẫn đến các biến đổi nhỏ của H và N (người ta dùng thuật ngữ biến đổi trôi dạt - antigenic drift để mô tả các đột biến kiểu này). Kết quả hình thành nhiều kiểu kháng nguyên H và N khác nhau được ghi nhận bằng các ký hiệu H1, H2, H3 v.v. và N1, N2, N3, v.v. Vì vậy để ký hiệu mỗi loại virus ta dùng một nhóm gồm hai ký hiệu một từ H và một từ N như: H1N1, H1N2, H2N2, H5N1.... Điều đáng lưu ý là kết quả của biến đổi trôi dạt dẫn đến sự ra đời của chủng virus cúm mới mà kháng thể đối với các chủng virus trước nó không nhận ra được (2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm). Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó khó thể lường trước được. Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát. 2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm). Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó khó thể lường trước được. Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 8 2.1.2.2 Quá trình tái sản của virus: Quá trình sao chép và tái bản RNA xảy ra trong nhân của tế bào ký chủ. (1) Giai đoạn bám của virus trên bề mặt tế bào Nhờ HA của virus gắn lên trên các thụ thể của tế bào ký chủ có chứa acid sialic. (2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid ra khỏi HA và màng tế bào, giúp virus có thể xâm nhập vào bên trong tế bào tạo nên thể nội bào (endosome). (3) Giai đoạn phá vỡ màng PH acid trong nguyên sinh chất tế bào chủ làm phá vỡ màng và giải phóng các ribonucleoprotein. HA bị phân cắt thành 2 tiểu đơn vị HA1 và HA2 bằng protease của ký chủ, khi đó virus mới có khả năng gây bệnh. (4) Tổng hợp mRNA Quá trình tái bản RNA của virus: xảy ra trong nhân tế bào (2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm). Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó khó thể lường trước được. Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 9 RNA (-) => CRNA (+) => RNAs(-) (5) Tổng hợp protein: HA, NA, PB1, PB2, PA, NS,M. Các protein HA và NA được đường hóa tại lưới nội mô có ribosome, gắn kết thành tam phân (trimer) và tứ phân (tetramer) tại bộ máy golgi, sau đó chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ của hạt virus mới. (6) Đóng gói hạt virus Phân tử RNA của thế hệ virus mới sẽ gắn kết với các protein (NP, PB1, PB2, PA,M2), di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi các protein HA. NA và M2 đang tập kết dđể đóng gói hình thành hạt virus. (7) Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào NA đóng vai trò quan trọng trong việc phóng thích virus ra khỏi màng tế bào. Protein làm gia tăng sự gắn kết của màng nguyên sinh chất và sự đâm chồi của hạt virus. 2.1.2.3 Sức đề kháng đối với tác nhân vật lý và hóa học Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 10 Các virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu, không tồn tại lâu ngoài môi trường. Các yếu tố vật lý như sức nóng, pH quá thấp hoặc quá cao, điều kiện khô hạn có thể bất hoạt virus cúm gia cầm. Dễ bị vô hoạt bởi các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa. 2.1.2.4 Độc lực của virus: Dựa trên các chỉ số của tỷ lệ gây bệnh , tỷ lệ chết trên đàn gà gây bệnh… Độc lực của virus cúm gia cầm quyết định bởi 2 yếu tố chính: protein màng glycosylated HA (Hemagglutinin) và NA (neuraminidase). Thường được chia thành 3 nhóm độc lực: độc lực cao (HPAI – High Pathogenic Avian Influenza), độc lực trung bình (MPAI – Medium Pathogenic Avian Influenza) và độc lực thấp ( LPAI – Low Pathogenic Avian Influenza). 2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA 2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ a. Loài cảm nhiễm Chim hoang là vật tàng trữ mầm bệnh quan trọng nhất nhưng rất hiếm khi xuất hiện bệnh lâm sàng do khả năng đề kháng tự nhiên Một số loài vịt, ngan, ngỗng là vật mang virus của loài chim trong nội tạng đặc biệt là ruột và chúng bài thải virus ra môi trường. Virus cúm gia cầm cũng có thể gây bệnh cho nhiều loài như heo, chuột lang, mèo, loài linh trưởng… b. Đường truyền lây và vật mang mầm bệnh Virus cúm bài thải ra môi trường thông qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc và phân. c. Cơ chế sinh bệnh Sự nhân lên trực tiếp của virus trong tế bào, mô, phủ tạng. Tác động gián tiếp của việc sản sinh các chất điều hòa tế bào như các cytokine Tắc mạch cục bộ do hình thành các huyết khối. 2.1.3.3. Triệu chứng và bệnh tích Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 11 Triệu chứng: phá hủy nhiều cơ quan phủ tạng, tim mạch và thần kinh ở những mức độ khác nhau: run rẩy đầu và cổ, rối loạn vận động, uu3 rũ, giảm ăn uống, liệt, rối loạn tiền đình… Bệnh tích: hoại tử, xuất huyết, phù ở các phủ tạng và da. Hầu hết HPAI gây hoại tử điểm ở lách, tim, tuyến tụy… phổi viêm phù, xung huyết hoặc xuất huyết. Túi Bursa và tuyến ức thường bị teo 2.1.3.4. Miễn dịch Gia cầm nhiễm virus hoặc tiêm vaccine cúm gia cầm đều kích thích đáp ứng miễn dịch cục bộ tại niêm mạc và miễn dịch toàn thân. Mức độ đáp ứng miễn dịch đối với virus cúm gia cầm thay đổi tùy loài: gà > gà lôi > gà tây > cút > vịt. Sau 5 ngày gây nhiễm, chủ yếu thấy xuất hiện IgM và một ít IgG. Đáp ứng sinh kháng thể từ các protein bề mặt ( HA và NA) là các kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao. Kháng thể HI có thể ngăn cản hoàn toàn sự bài thải của virus ra bên ngoài, trong khi kháng thể Ni chỉ làm giảm sự bài thải của virus. Miễn dịch cuả các protein bên trong có thể rút ngắn giai đọan nhân lên và bài thải ra ngoài của virus. 2.1.3.5 Chẩn đoán: a.Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh b.Chẩn đoán phòng thí nghiệm: hỗ trợ và kết luận nguyên nhân gây ra bệnh chính xác Phát hiện virus: Phát hiện protein hoặc RNA của virus trực tiếp từ mẫu mô: Miễn dịch mô gắn kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) trên mẫu mô phết kính, ELISA, RT-PCR và real-time PCR… Phân lập virus trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi bằng cách tiêm xoang niệu mô, trên tế bào thường trực (cell line) như MDCK và Vero hoặc tế bào sơ cấp như CEF và thận gà. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 12 Phát hiện kháng thể: Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như ELISA, AGID, HI, miễn dịch huỳnh quang. 2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm Ngăn ngừa và kiểm soát bệnh Giám sát bệnh chặt chẽ để phát hiện sớm và báo cáo dịch. Tăng cường an toàn sinh học tại các trại chăn nuôi gia cầm. Kiểm soát vận chuyển gia cầm và sản phẩm. Thay đổi phương thức chăn nuôi. Tiêu hủy nhanh gia cầm bị bệnh và có nguy cơ bị bệnh. Chủng ngừa: tiêm vaccine Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 13 CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA 1. Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Kỹ thuật ELISA được chia thành 2 loại: ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên (ELISA capture hoặc ELISA sandwich) và ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể (indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA). Sự liên kết giữa kháng nguyên_kháng thể được phát hiện bằng cách thêm cơ chất của một phản ứng tạo màu được xúc tác bởi enzyme. Enzyme thường dùng để đánh dấu là : peroxidase, beta_galactoxidase, alkaline phosphatase,... Mẫu dương tính là có sự hiện diện của kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu đượcc giữ lại trên khay xét nghiệm và cho phản ứng tạo màu khi thêm cơ chất. Khả năng ứng dụng của ELISA Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp ELISA là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm (cho phép phát hiện lượng kháng nguyên virus nhỏ hơn 1ng/ml). Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 14 Dùng để phát hiện nhiều loại protein, nhận diện virus, vi khuẩn, và một số hợp chất phân tử lượng nhỏ trong nhiều mẫu sinh học khác nhau. ELISA thuận tiên cho chẩn đoán xét nghiệm một số lượng mẫu lớn. 2. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA: Lấy mẫu và bảo quản mẫu: Dùng tăm bông lấy mẫu dịch khí quản hoặc mẫu phân ở lỗ huyệt gia cầm sống hoặc chết. Sau đó tăm bong được cho vào môi trường vận chuyển vô trùng chứa kháng sinh để ức chế vi khuẩn phát triển. Một số loại bệnh phẩm khác: mô (gan, lách, thận, tụy, não…) đặt vào túi plastic vô trùng. Để kiểm tra virus trong các cơ quan thu thập và bảo quản riêng các mô đường ruột và đường hô hấp. Nếu thực hiện xét nghiệm mẫu trong vòng 48 giờ sau khi thu thập thì bảo quản ở 4oC, Nếu mẫu được giữ lâu hơn thì bảo quản ở -70oC. TRước khi kiểm tra virus, mô nên được nghiền thành huyễn dịch 5-10% trong môi trường bận chuyển và được lắng lọc bằng ly tâm với tốc độ thấp. Những điều cần thiết để làm thử nghiệm: Kháng thể được tinh sạch (Purified antibody- nếu muốn phát hiện hay định lượng kháng nguyên. Dung dịch chuẩn (đối chứng dương và âm). Mẫu để kiểm tra. Dung dịch rửa (buffer). Kháng thể có gắn enzyme và cơ chất của enzyme. Máy đọc phản ứng PCR (spectrophotometer). a.. Phát hiện kháng nguyên: Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N. Vì vậy để phát hiện được virus cúm gia cầm đồng thời phân biệt được các loại subtype kháng nguyên virus cúm ta phải cần ít nhất 2 bộ kit và 2 lần xét nghiệm. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 15 Lần 1: Xác định yếu tố HA (Hemaglutinin). Lần 2: Xác định yếu tố NA ( Neuraminidase). Phương pháp: dùng ELISA trực tiếp (direct ELISA). Nguyên tắc: Nếu kháng nguyên hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng thể sơ cấp (đã gắn vào bề mặt cứng của giếng), kháng thể thứ cấp (gắn enzyme) được bổ sung vào sẽ gắn với kháng nguyên và những kháng thể thứ cấp không gắn sẽ bị rửa trôi trong quá trình rửa. Khi bổ sung cơ chất tương ứng với enzyme, cơ chất không màu chuyển thành có màu. Nếu kháng nguyên không hiện diện trong mẫu thì không có sự hiện màu. Các bước tiến hành: (1) Người ta gắn kháng thể đã biết trước lên giá thể. (2) Cho dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng. (3) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất) (4) Rửa. (5) Bổ sung kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần xác định có gắn enzyme đánh dấu. (6) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất) (7) Rửa mẫu. (8)Cho cơ chất tương ứng với enzyme. (9) Dung dịch dừng phản ứng. (10) Đọc và so màu. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 16 Direct ELISA: nhanh, tránh được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp với các thành phần trong mẫu. Tuy nhiên direct ELISA đòi hỏi sự đánh dấu tất cả các kháng thể được sử dụng=> tốn thời gian, chi phí. Thêm vào đó một số kháng thể có thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp. Phương pháp trực tiếp thường thiếu sự khuyếch đại tín tín hiệu thêm vào mà có thể đạt được với việc sử dụng kháng thể thứ cấp. b. Phát hiện kháng thể: có thể phát hiện kháng thể trong vòng 1 tuần sau khi nhiễm Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N vì vậy khi virus cúm xâm nhập vào cơ thể nó kích thích cơ thể tạo ra 2 loại kháng thể trung hòa tương ứng với yếu tố HA và NA có tính đặc hiệu cao. HA kích thích cơ thể tạo kháng thể HI. NA kích thích cơ thể tạo kháng thể NI. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 17 Vì vậy ta cũng phải dùng 2 bộ kit ELISA, chẩn đoán 2 lần: Xác định kháng thể kháng HA trước sau đó là kháng thể kháng NA. Phương pháp chẩn đoán: dùng ELISA gián tiếp. Nguyên tắc: Nếu kháng thể hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng nguyên đã được cố định ở với bề mặt rắn trong giếng. Sau đó kháng thể thứ hai (được gắn với enzyme) được cho vào giếng nếu có sự hiện diên của kháng thể cần kiểm tra thì sẽ gắn vào kháng thể này, và không bị rửa trôi trong quá trình rửa, khi bổ sung cơ chất (không màu) => enzyme sẽ chuyển có sự hiện màu. Nếu không có sự hiện diện kháng thể này trong mẫu thì kháng thể thứ hai bị rửa trôi trong quá trình rửa => không có sự hiện màu khi bổ sung cơ chất. Các bước tiến hành (1) Các kháng nguyên đã biết trước (purified antigen) được gắn trên giá thể (các giếng của vỉ nhựa hoặc màng lai…) (30-60 phút). (2) Dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng. (3) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất). (4) Rửa. (5) Bổ sung kháng thể có gắn enzyme. (6) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất). (7) Rửa mẫu. (8) Bổ sung cơ chất tương ứng với enzyme. (9) Dung dịch dừng phản ứng. (10) Đo OD và thực hiện phản ứng so màu. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 18 Indirect ELISA to detect specific antibodies Indirect ELISA: kháng thể thứ cấp (được đánh dấu) được sử dụng rộng rãi với nhiều kháng thể sơ cấp (vd: all mouse monoclonal antibodies – tất cả kháng thể đơn dòng ở chuột). Việc sử dụng kháng thể thứ cấp gia tăng độ nhạy của phản ứng (do khuyếch đại tín hiệu thêm vào). Một số ví dụ về bộ kit phát hiện kháng thể 1. Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus cúm typ A (Avian influenza virus antibody test kit, Idexx laboratories, USA). Thành phần 9 AI coated plate: đĩa 96 giếng đã gắn kháng nguyên của virus cúm. 9 AI positive control: huyết thanh dương tính với virus cúm chuẩn . 9 Negative control: huyết thanh âm tính với virus cúm chuẩn. 9 (goat) Anti-chicken/Turkey: HRPO conjugate: cộng hợp gắn horseradish- peroxidase từ dê chống lại kháng thể gà hoặc gà tây. 9 Sample diluent buffer (SDB): dung môi để pha loãng mẫu huyết thanh xét nghiệm. 9 TMP (Tetremethylbenzidine) subtrate. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 19 9 Stop solution: dung dịch dừng phản ứng. Chuẩn bị (1) CÁc chất dung cho phản ứng phải đạt nhiệt độ phòng (230C +/- 20C) trước khi tiến hành phản ứng. (2) Mẫu huyết thanh được pha loãng 1/25 (120microlit SDB + 5 microlit mẫu huyết thanh) trong đĩa pha loãng mẫu. Tiến hành xét nghiệm Bảng phân bố mẫu trên đĩa 96 giếng Ghi chú: - - (A1, A2) 2 giếng chứa huyết thanh âm tính với virus cúm chuẩn. ++ (A3, A4) 2 GIẾNG CHỨA HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI VIRUS CÚM 11, 22, 33,… (A5, A6,A7,…) các giếng chứa mẫu huyết thanh cần kiểm tra (1) Mẫu đối chứng (không pha loãng) + mẫu xét nghiệm (pha loãng 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu) cho 100microlit theo sơ đồ thích hợp vào đĩa phản ứng . (2) Ủ nhiệt độ phòng 30 phút. (3) Rửa 3-5 lần với nước cất. (4) Nhỏ 100 microlit cộng hợp vào các lỗ giếng. (5) Ủ nhiệt độ phòng 30 phút. (5) Rửa 3-5 lần với nước cất (6) Cho 100 microlit cơ chất tạo màu (TMB) vào các lỗ giếng. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A - - + + 1 1 2 2 3 3 4 4 B 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 … … … … … … … … … … … … … H … … … … … … … … … … … … Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 20 (7) Ủ nhiệt độ phòng 15 phút. (8) Thêm 100 microlit dung dịch dừng phản ứng vào các lỗ giếng. (9) Đo OD và đánh giá kết quả sau 15 phút. 2. Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus cúm –kháng HA ( Influenza A, Avian, H5, Hemagglutinin Antibody (HA) BioAssay™ ELISA Kit (Bird Flu). ELISA cạnh tranh (competitive ELISA). ELISA phát hiện kháng thể kháng HA trong mẫu huyết thanh . Nguyên tắc: Dựa trên pha rắn. Nếu kháng nguyên kháng HA hiện diện trong mẫu sẽ cạnh tranh với kháng thể đơn dòng kháng HA cộng hợp với horseradish peroxidease (anti-HA “mAb” HRP) với kháng nguyên đã chuẩn bị sẵn gắn với bề mặt rắn trong giếng. Nếu không có kháng thể kháng HA hiện diện trong mẫu, anti-HA “mAb” HRP sẽ gắn với HA có trong giếng và những HPR-conjugate không gắn sẽ bị loại bỏ trong quá trình rửa. Cơ chất tạo màu Chromogen A and B solutions được cho vào giếng, Chromogens không màu bị thủy phân (hydrolyzed) bởi HPR-conjugate (đã gắn vào giếng) tạo thành sản phẩm có màu xanh ( a blue colored product). Màu xanh này chuyển thành màu vàng khi dừng phản ứng với sulfuric acid. Không màu hoặc biểu hiện màu ít (no or low corlor) => chứng tỏ sự hiện diện của kháng thể kháng HA trong mẫu. Protocol Tiền xử lý mẫu với buffer ly giải virus (pre-treat the samples with virus lysis buffer) Cho mẫu vào, 100 ul. Ủ, 60 phút. Rửa 5 lần. Cho HRP-conjugate, 100 ul. Ủ, 30 phút Rửa 5 lần. Cơ chất tạo màu 50ul A + 50 ul B. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 21 Ủ 30 phút. Cho 50ul dung dịch dừng phản ứng. Đọc phản ứng ở bước song 450nm hoặc 630 nm. Kit components Đĩa 96 giếng Mẫu âm tính 1x1ml Mẫu dương tính 1x1ml. HRP-conjugate 1x12ml. Dung dịch ly giải virus 1x100ml Buffer rửa 1x50ml Chromogen A/B/ dung dịch dừng phản ứng 1x6 ml. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 22 KẾT LUẬN Việc chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng phương pháp ELISA giúp cho việc phát hiện và phân loại virus nhanh chóng và dễ dàng hơn. Đây là một phương pháp khá đơn giản, đặc hiệu, nhạy và nhanh. Đồng thời ta có thể xét nghiệm được một số lượng mẫu lớn. Phát hiện cúm gia cầm bằng ELISA giúp tầm soát nguồn bệnh tốt hơn. Do đó phương pháp này được ứng dụng rỗng rãi trong thực tế nhất là khi đại dịch cúm bùng phát trên diện rộng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học trong thú y. 2007. Nguyễn Ngọc Hải Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus cúm gia cầm NIBRG-14 subtyp H5N1. Nguyễn Văn Dung dase,_Tamiflu_and_Relenzawww.khoahoc.com.vn l Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng ELISA 24