Chẩn đoán Virus PRSS (porcine reproductive and respiratory syndrome) bằng kỹ thuật Elisa

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC WX Đề tài: CHẨN ĐOÁN VIRUS PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) BẰNG KỸ THUẬT ELISA Người thực hiện: Giáo viên hướng dẫn: Ham Mát Nguyễn Ngọc Hải Mssv: 06126077 Lớp: DH06SH Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2009 I.Đặc vấn đề: Hiện nay trên cơ thể của gia súc đặc biệt là cơ thể của heo, một động vật gần gũi và mang lại lợi ích kinh tế cho người dân đã xuất hiện hội chưng rối loạn sinh sản và hô hấp. Đây là một hội chứng do một loại virus có tên là PRRS, và vấn đề được đặc ra ở đây là làm thế nào để chẩn đoán virus này có tồn tại hay không tồn tại trong cơ thể của heo? Một phương phương pháp được giới thiệu để chẩn đoán virus này đò là phương pháp ELISA. Nội dung: ¾ Đặt vấn đề. ¾ Giới thiệu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, virus PRRS. ¾ Giới thiệu về kỹ thuật ELISA. ¾ Phương pháp chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật ELISA. ¾ Kết luận. ¾ Tài liệu tham khảo. II.Giới thiệu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, virus PRRS. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là một bệnh do virus, gây thiệt hại lớn về kinh tế và được phát hiện tại Mỹ vào năm 1987. Bệnh do Nidovirales, họ Arteviridae gây ra. Các triệu chứng thường gặp của lợn mắc bệnh bao gồm rối loạn sinh sản, gây chết (đối với lợn con) và các biểu hiện rối loạn hô hấp đối với lợn ở mọi lứa tuổi. PPRS được xếp vào nhóm B trong danh mục các bệnh của Tổ chức sức khỏe động vật thế giới. Cho đến nay, lợn là động vật duy nhất mắc hội chứng này. Virus gây bệnh Hiện có các chủng gây bệnh tại Mỹ và Châu Âu. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa viruss gây PRRS tại Châu Âu và Mỹ chỉ tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền (bộ gene virus). PRRS virus thuộc nhóm RNA virus (RNA mạch đơn). Virus mang gene mã hóa protein trung hòa kháng thể (ORF 5, khoảng 24-25 kDa), nucleocapsid (N protein khoảng 15kDa). Virus có khả năng đề kháng với nhiệt độ thấp (giữ độc lực trong thực phẩm được bảo quản lạnh). Các đại thực bào với các "chân giả" có tác dụng bắt giữ các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus và tiêu diệt chúng (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) Khi bị virus phá hủy, đại thực bào không còn các "chân giả", mất khả năng bắt giữ và tiêu diệt tác nhân gây bệnh (Nguồn Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH). • Phân bố của bệnh Tuy được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu dịch tễ học cho rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada. Bệnh xuất hiện ở Châu âu vào năm 1990 và hiên đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục này. Các kiểm tra huyết thanh học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê... Trong những ngày gần đây, bệnh đã xuất hiện tại nhiều địa phương ở nước ta. Cũng như các virus khác, virus gây PPRS cũng tạo điều kiện cho nhiều loại vi khuẩn cư trú trong cơ thể như liên cầu khuẩn tăng độc lực và gây bệnh. • Triệu chứng lâm sàng Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia thành hai giai đoạn khác nhau: Giai đoạn 1 là biểu hiện các triệu chứng rối loạn sinh sản đối với lợn nái và giai đoạn hai là sự biểu hiện của các triệu chứng hô hấp. Trong khoảng 6-12 tuần sẽ có biểu hiện bệnh trong đàn lợn. • Các triệu chứng trong giai đoạn 1 hay các triệu chứng sinh sản bao gồm: - Sốt 39-40 độ - Bỏ ăn - Mệt mỏi - Giảm tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra - Sảy thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn mới bị nhiễm virus) - Giảm tiết sữa hoặc mất sữa hoàn toàn - Thai khô (thai gỗ), chết thai - Đẻ non - Chậm động dục hoặc không động dục trở lại - Rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng • Giai đoạn biểu hiện các triệu chứng hô hấp: - Loạn hô hấp - Lợn biểu hiện đau khi thở • Các triệu chứng ở lợn con: - Tỷ lệ chết trước cai sữa cao - Lợn gày yếu - Bỏ ăn • Các triệu chứng thuộc giai đoạn 2 ở lợn con: - "Hắt hơi" - Tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng - Gày, yếu - Phù mắt, các nốt phồng rộp trên da - Ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân. Lợn lớn có các biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn. Các triệu chứng khác nhẹ hơn. Lợn đực giống có các biểu hiện giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và nồng độ tinh trùng). • Bệnh tích * Đối với lợn nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỷ lệ thai chết, lợn mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù. - Lợn con thường mang bệnh tích rõ hơn lợn lớn, bao gồm: -Dịch thẩm xuất trong đướng tiêu hóa và đường hô hấp (đặc biệt trong các phế quản). -Phù. -Thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực, xoang phế mạc và tung cách mạc. -Sưng hạch bạch huyết. -Da nhiều vùng có màu xanh tím. III.Giới thiệu về kỹ thuật ELISA • Khái niệm ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. • Lịch sử phát triển -Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định KN, KT . Trong phương pháp này, KT hay HN có gắn chất đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ. Tuy vậy, các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ. Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị). -Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như chất phóng xạ trong radioimmunoassay, tín hiệu màu phát ra phải đồng nghĩa với sự có mặt của KT hay KN. Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với KN hay KT. Kỹ thuật gắn kết enzyme với KN hay KT được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce . Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn KN và KT trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà KN hay KT không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi . -Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên. Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971. • Các phương pháp ELISA 1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: - Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. - Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. - Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. - Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme). - Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. - Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). -Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. 2. Sandwich ELISA: -Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT. ƒ Các bước trong Sandwich ELISA: (1) Phủ đĩa bằng KT. (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT. (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN. (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện. (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. . 3. ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN. (2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN. (3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh". (4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym. (5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu. -Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu. - Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT. • Ứng dụng Một số ứng dụng của ELISA: - Xác định nồng độ của KT trong huyết thanh; - Kiểm tra sự có mặt của KN; - Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm; - Xác định sự có mặt của dược phẩm; - Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học ... IV.Phương pháp chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật ELISA. • Lấy mẫu - Mẫu máu. - Mẫu các cơ quan: Phổi, hạch hạnh nhân, hạch bạch huyết, lách. • Tiến hành chuẩn đoán -Xử lý mẫu -Thực hiện các bước trong kỹ thuật ELISA với bộ kit đặc hiệu để có kết quả chính xác, tránh hoặc giảm tối đa hiện tương dương tính giả. -ngoài ra một số kit ELISA thương mại cho phép thực hiện được các chuẩn đoán phân biệt hai dòng virus châu âu và châu mỹ khi sự khác biệt về gen từ 0.5% - 1%. -Kháng thể được phát hiện sau khi nhiễm 1-2 tuần: khoảng thời gian có thể phát hiện kháng thể khoảng 4 tháng sau khi bị nhiễm. -Đọc kết quả. *Bộ kít chuẩn đoán virus V.Kết luận -Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là một bệnh do virus, gây thiệt hại lớn về kinh tế và được phát hiện tại Mỹ vào năm 1987. -Hiện có các chủng gây bệnh tại Mỹ và Châu Âu. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa viruss gây PRRS tại Châu Âu và Mỹ chỉ tương đồng 60% về nguyên liệu di truyền (bộ gene virus). - Tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khỏe là đường truyền lây chính của bệnh nên bệnh có thể lây giữa các cá thể trong một đàn hay từ đàn này sang đàn khác (nếu lợn bị bệnh được chuyển đàn, chuyển trại...). Lợn mang virus có thể giải phóng virus trong thời gian 3-4 tháng gây khó khăn cho công tác theo dõi và phát hiện và khống chế bệnh. - Áp dụng các phương pháp phòng tránh chung đối với mọi loại bệnh truyền nhiễm đặc biệt là bệnh do virus như đảm bảo vệ sinh chuồng trại, nhiệt độ chuồng nuôi, thực hiện luân chuyển chuồng và tiêu độc định kỳ, đảm bảo dinh dưỡng v.v. Làm theo hướng dẫn của cán bộ thú y trong trường hợp nghi đàn có lợn nhiễm bệnh hay khi dịch đã sảy ra. - Thực hiện quy định về kiểm dịch động vật đối với việc nhập khẩu con giống, tinh dịch - Kiểm tra lợn xuất, nhập chuồng và thực hiện vệ sinh thú y trong vận chuyển đàn -Một trong những phương pháp chẩn đoán virus này là phương pháp ELISA với độ đặc hiệu và độ nhạy cao nhờ sự dụng bộ kit ELISA thương mại cho kết quả chính xác hơn so với các phương pháp khác VI.tài liệu tham khảo Công nghệ sinh học trong thú y (nhà xuất bản nông nghiệp tp.hcm). tủ sách khoa hoc của VLOS. Các trang thuộc Bài giảng kỹ thuật công nghệ sinh hoc.