Chiết, tinh chế và ứng dụng của enzyme

toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả. Nhóm sản phẩm dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm. Nhóm sản phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở sự phát triển của VSV hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang. Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại sự lại đường trong sản xuất siro thành phẩm. Một số lưu ý khi sử dụng enzym trong chế biến: - Sự có mặt của enzyme ascorbinatoxidase thường gây ra sự phân giải vitamin C. - Các enzyme tham gia quá trình oxy hoá như phenoloxidase, peroxidase, catalase thường làm biến màu nước quả và làm giảm giá trị cảm quan khác. Do đó, trong chế biến nước quả không nên dùng loại enzyme này. - Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần lưu ý phải bảo tồn chất màu antocian. Chính vì thế không dùng enzyme có khả năng phân giải antocian. - Acid ascorbic là một chỉ tiêu quan trọng của nước quả, do đó khi chế biến nước quả tuyệt đối không sử dụng enzyme ascorbicnatoxidase. - Trong nhiều trường hợp, enzyme protease đóng vai trò làm trong nước quả. Chính vì thế, khi cần làm trong nước quả người ta thường kết hợp protease acid với enzyme phân huỷ pectin. - Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta sử dụng chế phẩm enzyme pectintrancelimitase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzyme pectintrancelimitase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong chế phẩm enzyme này tuyệt đối được có mặt của enzyme polygalacturonase, đặc biệt là không chứa enzyme endopolygalacturonase. Những enzyme này thường làm độ nhớt của nước quả và phá vỡ đồng nhất nước quả. b) Cơ chế tác động của enzyme pectinase Trong chế biến nước quả người ta sử dụng các chế phẩm enzyme với 2 mục đích: - Phá vỡ thành tế bào thực vật nhằm nâng cao hiệu suất thu nước quả. - Làm trong và ổn định chất lượng nước. Cơ chế hoạt động: Phá vỡ propectin (chất làm liên kết), thuỷ phân protid.Phá vỡ nguyên liệu sinh chất của tế bào vỡ tế bào nước chảy ra, hiệu suất tăng. Pectinase được dùng trong một số ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang - Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn - Sản xuất các mặt hàng từ quả: quả cô đặc, mứt. - Sản xuất nước giải khát: nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ táo và quả vải, dâu tây, anh đào, sản xuất nước quả nho, sản xuất nước mận - Sản xuất cà phê. Chế phẩm pecnitase được sử dụng trong sản xuất nước quả từ các nguyên liệu hay để làm trong nước quả ép. Bởi vì khi có pectin thì khối quả nghiền sẽ tạo trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát ra được. Nhờ có pectin mà nước quả trong suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng. Pectinase còn góp phần chiết rút các chất màu, tanin và các chất hoà tan khác, do đó làm tăng chất lượng của thành phẩm. Những nghiên cứu khi ép nho bằng pectinase không những làm tăng hiệu suất mà còn tăng màu sắc. Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đông… pectinase mà dịch quả có nồng độ đậm đặc hơn. 3.2.2.3. Ứng dụng enzyme protease để làm trong và ổn định chất lượng nước quả và rượu vang. Một trong những nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc làm trong nước quả và gây đục nước quả là protein. Hiện nay người ta sử dụng các phương pháp để phá huỷ và loại protein là: xử lý nhiệt, xử lý bằng chất keo tụ, xử lý bằng enzyme trong đó phương pháp enzyme là phương pháp có ưu điểm nhất. Enzyme được sử dụng trong trường hợp này là enzyme protease acid vì phần lớn các loại nước quả có độ pH thấp. Trong sản xuất nước quả hay rượu vang người ta thường dùng enzyme protease acid với liều lượng 0,1-0,3%. Trong sản xuất rượu vang, khi hàm lượng cồn đạt 8% cũng hoàn toàn không ảnh hưởng đến hoạt tính của protease acid. 3.2.2.4. Khử vị đắng của nước quả bằng chế phẩm enzyme Nước quả được sản xuất từ nước quả có múi như cam, chanh, bưởi thường có vị đắng. Vị này có trong nước quả do glucositnarigin (7-ramnocido-β-glucosido-4,5,7 trihydroxiflavon) trong đó ramnoase nối với glucose bằng liên kết glucoside. Khi enzyme naringinase thuỷ phân naringin sẽ tạo ra hỗn hợp raninose và prinin. Hỗn hợp này tiếp tục thuỷ phân tạo thành prinin và naringinin, hoàn toàn không có vị đắng. 3.2.2.5 Ứng dụng của enzyme khác trong công nghê sản xuất rượu vang Việc sử dụng enzyme trong sản xuất rượu vang có những tác động rất lớn - Enzyme làm tăng quá trình trích ly dịch quả. - Enzyme làm trong dịch lên men - Enzyme làm tăng quá trình tạo hương - Enzyme làm tăng chất lượng rượu vang. Ngoài việc sử dụng enzyme pectinase trong sản xuất rượu nho người ta còn sử dụng hỗn hợp chế phẩm enzyme sau: Nhóm phân giải protein Sử dụng các chế phẩm protease từ nấm mốc Asp. Oryzae, Asp. Noger, Asp. Flavusi casein ở pH 7,7. Các chế phẩm này hoạt động cả trong môi trường acid mạnh(pH=1,8-2,0) và ở nhiệt độ 40oC. Nhóm chế phẩm phân giải hemicellulose và cellulose Khi cho các chế phẩm enzyme phân giải pectin vào dịch nho nghiền sẽ làm tăng hàm lượng các chất phenol tinh dầu, các chất hữu cơ chứa nitơ và cả các chất khô chứa trong dịch nho. Trong xử lý nước nho người ta sử dụng cả phức hợp cellulose bao gồm nhiều enzyme khác như: pectinase, protease… Khi sử dụng chế phẩm enzyme để xử lý dịch nho, thành phần hoá học của dung dịch bị biến đổi rất nhiều đặc biệt là hợp chất phenol. Các chất phenol thường tăng lên rất nhiều, do đó làm thay đổi rất nhiều, từ đó làm thay đổi rất mạnh tính chất hoá học và tính chất cảm quan của rượu nho. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng việc xử lý dịch nho bằng chế phẩm enzyme làm tăng giá trị sinh học của dịch nho. Trong đó emtoxian có giá trị sinh học nhất định trong sinh lý người. Ngoài ra việc xử lý dịch nho làm tăng quá trình tạo hương, rút ngắn thời gian sản xuất nho. .3.2.2.6 Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất bia Các nước trên thế giới thường ứng dụng enzyme trong các công đoạn sản xuất bia: - Dịch hoá - Đường hoá - Giai đoạn lên men - Giai đoạn làm trong bia và ổn định chất lượng Bảng 3.2 Một số chế phẩm enzyme từ VSV được sử dụng trong sản xuất bia Đặc điểmα-amylaseβ-amylaseAmyloglucosidasePollulanseMối liên kết bị tác độngα-1,4α-1,4α-1,4 α-1,6α-1,6Sản phẩm của phản ứngDextrinMaltoseGlucoseDextrin mạch thẳngNhiệt độ tối ưu70556560pH tối ưu6545 Sử dụng enzyme trong quá trình dịch hoá: Dịch hoá là quá trình thuỷ phân sơ bộ tinh bột và protein trong khối bột ở nhiệt độ cao. Ở giai đoạn này người ta dùng enzyme amylase và protease của vi khuẩn vì các loại enzyme này có hoạt tính cao và chịu nhiệt tốt. Nhiệt độ cao thường làm biến tính enzyme có trong malt do đó việc bổ sung các enzyme này là rất cần thiết cho quá trình. Sử dụng enzyme trong quá trình đường hoá: Đường hoá là công đoạn sản xuất bia rất quan trọng, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này. Chính vì vậy, nhiều nhà máy bia trên thế giới đã cho thêm enzyem với số lượng lớn trong giai đoạn này Ổn định khả năng lên men: Trong nươc mu sau khi đường hoá có chứa 90% là cacbohydrat, trong số này có đến 75% đường có khả năng lên men. Phần còn lại 25% dextrin mạch thẳng và mạch nhánh. Khi sử dụng enzyme, chúng có khả năng sản xuất bia không có dextrin dư thừa và do đó ít calori (năng lượng) hơn so với loại bia thông thường. Mức giảm này có thể đạt tới 25%. Hiệu quả đường hoá khi sử dụng các chế phẩm enzyme sẽ thấy ngay sau 20-35 phút. Việc tăng thêm lượng enzyme vào không chỉ làm tăng lượng đường hay mức độ trích ly các chất hoà tan mà còn tăng khả năng lọc và lên men sau này. Sử dụng để làm bền vững chất lượng bia và làm trong bia: Độ bền của bia khi bảo quản là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong sản xuất bia. Để ổn định chất lượng bia, người ta sử dụng các chế phẩm protease. Nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficin, chế phẩm protease nấm sợi và papain đều có tác dụng tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia. Trong đó papain được ứng dụng nhiều hơn cả. Khi tiến hành lên men phụ, người ta thường cho papain vào. Kết quả những tác động của papain, dịch bia trở lên trong hơn và trong quá trình bảo quản bia, chất lượng của bia không thay đổi. 3.2.2.6 Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất cồn Cồn được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men. Người ta lên men cồn từ nguyên liệu chứa đường như mật rỉ hoặc từ nguyên liệu chứa hydro carbon. Công nghệ sản cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột qua những công đoạn cơ bản sau: Xử lý nguyên liệu bao gồm nghiền nhỏ nguyên liệu, dich hóa nguyên liệu. Có thể xử lý nguyên liệu bằng acid hoặc bằng kiềm. Chuyển hóa tinh bột bằng enzyme α-amylase để tạo dextrin. Chuyển hóa dextrin bằng β-amylase hay amyloglucosidase để tạo ra đường có khả năng lên men. Lên men dịch đường bằng nấm men Sacharomices cevevisiae. Chưng cất thu nhận cồn. Tinh thế cồn để thu nhận cồn có chất lượng cao. Trong quá trình công nghệ trên, enzyme được ứng dụng ở công đoạn đường hóa ( chuyển hóa tinh bột thành đường). Quá trình đường hóa đóng vai trò quyết định đến khả năng lên men và hiệu suất thu cồn. Vai trò của enzyme trong công nghệ sản xuất cồn: - Vai trò của amylase: α-amylasehoạt động mạnh trong giai đoạn đầu của quá trình đường hóa. Nguyên nhân vì có sự thay đổi pH trong thời gan đường hóa và giới hạn hoạt động của α-amylase tới đường không vượt quá 70-80%. Như vậy vai trò cơ bản của enzyme trong giai đoạn này là làm dịch hóa nhanh ở giai đoạn nấu và cả giai đoạn đầu của quá trình đường hóa, dextrin và tích tụ đường. - Vai trò của glucoamylase: Glucoamylase thủy phân kiên kết α-1,4 glucose trong các polysacharide. Ngoài ra enzyme này còn có khả năng phân cắt liên kết α-1,6 glucoside. Phần lớn các glucoamylase hoạt động ở pH không cao. Nhiệt độ tối ưu là 55-60oC. Sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân này là glucose. Dó đó, việc sử dụng đường glucoamylase trong sản xuất cồn có triển vọng lớn. - Vai trò của pululanase: Đây là enzyme tham gia thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong các poly và oligosacharide. Pululanase phân cắt liên kết α-1,6 glucosidetrong trường hợp liên kết này được bao quanh tất cả các phía nhờ liên kết α-1,4 glucoside. Dextrin có phân tử thấp, dễ bị pululanse phân hủy tạo thành từ 2 gốc maltose, nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Nếu có sự kết hợp của α-amylase và pululanase, dextrin sẽ bị thủy phân hoàn toàn. - Vai trò của hệ enzyme cellulase: Các hệ thuộc nhóm enzyme cellulase (celluláe, hemicellulase, xylanase gia phân huỷ các polysacharidekhoong phải là glucide. Các chất này bao gồm cellulose, hemicellulose, pectin…Các chất này nằm trong thành tế bào của tế bào thực vật, nằm ở gian bào và một số thành phần khác. Việc phá vỡ các thành phần này sẽ làm tăng khả năng chuyển hóa vật chất có trong tế bào. Như vậy việc bổ sung enzyme trên vào trong quá trình đường hoá thấy rằng hàm lượng đường galactose, arabinose,cylose, glucose tăng lên. Khi tiến hành lên men, dung dịch đường hoá bởi amylase và các enzyme cellulase hiệu suất cồn tăng 15%. Hệ enzyme cellulase được coi như biện pháp tăng cường khả năng đường hoá và làm tăng hiệu suất thu cồn sau lên men. - Vai trò của enzyme protease: Khi xử lý nguyên liệu bằng chế phẩm protease, trong dung dịch đường hóa tích tụ nhiều amino acid. Amino acid là thành phần rất cần thiết cho sự phát triển của nấm men. 3.2.2.7 Ứng dụng enzyme trong chế biến thịt Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thuỷ phân một phần protein có trong khối thịt, Ngoài khả năng làm mềm thịt, các chế phẩm enzyme còn làm tăng giá trị dinh dưỡng và gái trị cảm quan của thịt. Các chế phẩm enzyme làm mềm thịt phải đảm bảo những yêu cầu sau: - Có khả năng làm giảm độ bền vững của các mô liên kết khi gia nhiệt. - Có khả năng chịu nhiệt - Không độc với người tiêu dùng. Các phương pháp làm mềm thịt bằng enzyme: -Ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định. - Tẩm hỗ hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) - Tiêm dung dịch enzyme vào thịt: tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ. 3.2.2.8 Ứng dụng trong chế biến sữa Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất pho mát nhờ hoạt tính với chymóin hoặc rennin làm đông tụi protein của sữa. Protease từ một số VSV như A.candidus, P. roquerti, B. mesentericus… được dùng trong sản xuất pho mai. 3.2.2.9 Ứng dụng enzyme trong thuỷ phân protein, chất béo, cellulose và chuyển hoá saccharose a) Ứng dụng để thuỷ phân protein Thực chất của quá trình thuỷ phân protein là chuyển nitơ hữu cơ dạng không hoà tan(protein) sang nitơ hữu cơ hoà tan (peptide và hỗn hợp aminoacid). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng enzyme thuỷ phân protein thường làm tăng tính chất chức năng của protein. Bảng 3.3 Các enzyme sử dụng trong thuỷ phân protein STTCơ chấtEnzymeMức độ thuỷ phân(%)Ứng dụng1Phế liệu thuỷ sảnPapain10-15Tách mỡ cá làm thức ăn gia súc2CáProteinase pancreatin10Protein đậm đặc không đắng, sử dụng nấu soup.3CaseinProteinase pancreatin2-5Sản phẩmthuỷ phân hoà tan, peptide không đắng, làm tăng mức bền bọt4CaseinProteinase pancreatin37Dung dịch huyền phù dùng trong y5GelatinProteinase pancreatinđến 25Sử dụng trong mỹ phẩm6Protein dịch lọc sữaProtease trung tính. Vi khuẩn, protease pancreatin2-8Tăng bột b)Ứng dụng trong chế biến nước mắm. Nước mắm là một dung dịch bao gồm nước, muối, aminoacid, peptide, các chất tạo mùi và màu. Hỗn hợp đó được tạo ra từ quá trình lên men tự nhiên trong thời gian ít nhất là 9 tháng. Để rút ngắn quá trình lên men, người ta bổ sung promelin vào cùng khối chượp. Nhờ hoạt động của bromelin, protein được thuỷ phân nhanh hơn. Vì nước mắm là sản phẩm không chỉ chứa aminoacid, peptide mà mùi có vị trí rất quan trọng làm nên chất lượng nước mắm. Do đó việc tăng nhanh quá trình thuỷ phân protein của các phải hài hoà với quá trình tạo hương cho nước mắm. Việc rút ngắn thời gian lên men phải đảm bảo hai chỉ số quan trọng đó. Người ta sử dụng đọt dứa như chế phẩm bromelin thô và trộn chế phẩm này vào các lớp cá đã trộn muối. Để tránh hiện tượng biến tính ở bromelin, thay vì cho muối vào một lần, trong lên men người ta cho muối vào nhiều lần. Theo cách này ta có thể sản xuất nước mắm từ 5 – 7 tháng thay vì 9 tháng hay hơn 1 năm. c/ Ứng dụng enzim để thuỷ phân chất béo. Người ta tiến hành thuỷ phân chất béo bằng enzim lipasen từ động vật và vi sinh vật. Qúa trình thuỷ phân của lipase được ứng dụng trong các lĩnh vực sau: - Thuỷ phân lipide bằng lipase: Là phương pháp thay thế cho phương pháp thuỷ phân cổ điển bằng hoá chất. - Sử dụng enzim lipase bền trong môi trưòng kiềm từ vi sinh vật được ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa. Trong chất tẩy rửa thông thường, người ta cho enzim lipase để làm sạch lipide. - Sử dụng enzim lipase trong quá trình làm chín phomat d. Ứng dụng enzim để thuỷ phân cellulose. Hiện nay chưa có công nghệ thuỷ phân cellulose theo qui mô công nghiệp. Nhưng trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu dạng pilot sử dụng enzim hemicellulase, lignase, cellulase. Trong tương lai sẽ xuất hiện các công nghệ được sản xuất theo quy mô công nghiệp bằng các loại enzim trên. Tuy nhiên, cũng đã có nhiều công trình ứng dụng hỗn hợp enzim trên trong sự chuyển hoá các chất hữu cơ chứa lignocelluse để làm sạch môi trường. 3.3 Ứng dụng enzyme trong các ngành khác 3.3.1Ứng dụng enzym trong chữa bệnh: Enzym cũng như một số chất dùng trong chữa bệnh cho người và gia súc có những đặc tính không phù hợp chung như sau: Khối lượng phân tử lớn, khó qua màng tế bào. Dễ dàng phân hủy trong đường tiêu hóa. Dễ bị mất hoạt tính sinh học do hoạt động ức chế của các chất hiện diện trong hệ miễm dịch và mô. Có thể biểu hiện như một kháng nguyên. Tuy nhiên enzym có những đặc điểm riêng, được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh có hiệu quả. Hiện nay, enzym được sử dụng chủ yếu chữa các bệnh sau: Enzym như chất cho thêm vào cơ thể để chữa bệnh kém tiêu hóa đối với người. Enzym được sử dụng như chất làm sạch vết thương và làm lành vết thương. Enzym được sử dụng trong các phản ứng miễn dịch. Bảng 3.4 Các enzym sử dụng trong chữa bệnh: Loại enzymNguồnDùng chữa các bệnhα – amylaseTụy lợnBệnh kém tiêu hóaβ – amylase-Bệnh kém tiêu hóaArkistrodon Rhodostoma serine ProteaseNọc rắnBệnh tắc nghẽn động mạch biênAsparaginasee.coliBệnh bạch cầuBatroxobin (bathrops atrox serine protease)Nọc rắn-BromelinChồi dứaBệnh khó tiêu hóaCellulaseTrichodermavirideBệnh khó tiêu hóaChymopapainMủ đu đủChữa bệnh ngoài daChymotrypsinTụy bòBệnh khó tiêu hóaCollagenaseClostridium histolyticumChữa bệnh chảy máuDeoxyribonucleaseStreptococcus spChữa vết thươngFactor VII (proconvertin)Plasma ngườiBệnh chảy máuFactor IX (chric mas factor)Plasma ngườiBệnh chảy máuFractor xaPlasma người hay bòBệnh rối loạn đông tụFactor XIII (fibrin – stabilizing factor)Plasma ngườiBệnh mù lòaHyaluronidase-Chất phát tánKalli krein (kininogenase)Tụy lợnBệnh tắc nghẽn mạch máuLipaseRhizopusarhizusBệnh kém tiêu hóaLysozyme (muamidase)Lòng trắng trứngBệnh nhiễm trùngPancreatinTụy lợnBệnh kém tiêu hóaPapainMủ đu đủBệnh kém tiêu hóaPepsinBao tử lợnBệnh kém tiêu hóaPlasmin (fibrinolysin)PlasmaBệnh hóa xơPlasminogen activatorTế bào melanomaBệnh hóa xơRobinucleaseTụy bòChữa vết thươngSubtisinBacillius sp.Làm sạch vết thươngSuperoxide dismutaseErythrocyt bòChống lão hóa tế bàoThombin (fibrinogenase)Plasma ngườiBệnh chảy máuTryspinTụy bòBệnh kém tiêu hóaUrokinase/urokinaseNước tiểu người, vi khuẩn biến đổi genBệnh hóa xương 3.3.2. Ứng dụng enzym trong chuẩn đoán bệnh. 3.3.2..1.Ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp: Phương pháp xác định điểm cuối (end-point methods) Phương pháp xác đo tốc độ phản ứng (measurement of reaction rate) Phương pháp xác định điểm cuối. Nguyên tác của phương pháp như sau: khi cho enzym tác động vào cơ chất, cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tăng lên. Ta có thể xác định được những chỉ số này. Đối với nồng độ cơ chất thấp hơn giá trị của hằng số (Km) Michaelis, tốc độ phản ứng tuân theo phương trình sau: = eS ×/ Km Ở đây, thời gian cần cho kết thúc phản ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và hằng số Km của enzym sử dụng . Phương pháp xác định glucose với glucose-oxidase glucose-oxidase 10 UI/ml Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hóa bởi glucose oxidase tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau: Glucose + O2 + H2O  gluconate + H2O2 Trong phản ứng thứ hai peroxide hydro, dưới tác dụng của enzym horse-radish peroxidase sẽ tạo màu theo phản ứng sau: horse-radish peroxidase H2O2+ chromogen  gluconate + H2O Trong phân tích này, 2,2’-azino-bis (3-ethyl 2,3-dihydrobenzothiazol sulfonate (ABTS)) được sử dụng như chromogen. Phương pháp xác định urea Urea bị phân hủy bởi urease ở 0,7 UI/ml. Và amoniac được tạo thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase có hoạt tính 6,2 UI/ml tác động. urea + H2O  2NH3+ CO2 2-Cetoglutarate + 2NH4+ + 2NADH 2L-clutamate+ 2NAD+ + 2H2O b). phương pháp động học (kinetic methods) phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km phương pháp xác định glucose: phản ứng xảy ra trong phương pháp này như sau: D-glucose + ATP D-glucose-6-phosphate + ADP D-glucose-6-phosphate + NAD.P+  D-glucono--lactone-6-phosphate + NADPH + H+ Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase. Sau đó, glucose-6-phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động của glucose-6-phosphate dehydrogenase. Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng máy quang điện. Xác định triglyceride. Chất béo được thủy phân bằng lipase và carboxylesterase. Glycerol sau đó sẽ được phosphoryl hóa bởi glycerol kinase. ADP được tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phospho enol pyruvate và pyruvate kinase. Cuối cùng, pyruvate được hydrogen hóa bởi L-lactate dehydrogenase và NADH sẽ giảm dần. Triglyceride + 3H2O  glycerol +3 acid béo glycerol +ADP glycerol 3 phosphate +ADP ADP + phospho enol pyruvate  ATP + pyruvate Pyruvate  + NADPH + H+  L-lactate + NAD+ 3.3.2.2. xác định hoạt tính enzym. Xác định hoạt tính của alkaline phosphatase 4-nitro phenyl phosphate + 3H2O  phosphate +4-nitro phenlate Ở pH tối ưu 9,8 sản phẩm sẽ phân tán và tốc độ phản ứng sẽ tăng theo độ hấp thụ ở bước sóng 405nm. Xác định hoạt tính của creatine kinase. Creatine kinase +ADP Createne +ATP ATP được tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzym Creatine kinase. 3.3.2.3. Thực hành miễn dịch. Enzym được sử dụng ở đây để xác định hỗn hợp kháng nguyên- kháng thể, tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta có thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác định phản ứng. a). enzym alkaline phosphatase. Enzym này được ứng dụng trong phản ứng miễn dịch. Người ta thường sử dụng enzym này với hoạt tính 2500UI/mg, ở nhiệt độ 37OC. Để xác định hoạt tính alkaline phosphatase có thể sử dụng máy huỳnh quang với 4-methylumbelliferyphosphate làm cơ chất. b). β-galactosidase Người ta thường sử dụng enzym này có hoạt tính riêng lớn hơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- β-galactosidase, ở nhiệt độ 37OC. Hoạt tính của β-galactosidase được đo bằng máy quang điện với 4-methylumbelliferyl- β-galactosidase. Ngoài ra ta có thể sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-galactosidase. c). horseral peroxidase Enzym này chứa hai đến ba nhóm hoạt động aminE trong phân tử và chứa 12-14,5% carbohydrate. Xác định hoạt tính enzym này bằng máy quang điện. Cơ chất thường sử dụng là chromogen-2,2’-azinobis [3-ethykbenzothiazoline-sulfonate] (ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25OC. Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là 3,3’; 5,5’-tetramethyl benzidine. 3.3.3 Ứng dụng enzyme để tạo các dược phẩm - Ứng dụng tính đặc hiệu lập thể tuyệt đối nghiêm ngặt của enzyme, chỉ tác động tới một đồng phân quang học không thực hiện được. Dựa vào tính chất này của enzyme cho phép thu nhận đồng phân quang học của hợp chất hữu cơ để làm dược phẩm. - Lactatehydrogenase chỉ làm biến đổi dạng L không tác động tới dạng D của acidlactic. Amino acylase cũng chỉ làm biến đổi dạng L của aminoacid. - Glucosamine sulphat là loại đường amino, tham gia vào các cấu trúc của nhiều kháng sinh, do đó được sử dụng rộng rãi, nhưng sử dụng có hiệu quả nhất là làm thuốc chữa viêm khớp (ostearthritis), có tác dụng cùng với chondroitin sailfate. - để sản xuất glusamine, người ta dùng các enzyme (chitosanase, chitinase aminidase) để thủy phân chitin thành N_acetylglusamine. Sau đó dùng esterase để deacetyl hóa thành glucosamine. Hoặc có thể deacetyl hóa chitin thành chitosan. Sau đó chitisanase, aminidase để thủy phân chitosan thành glucosamine theo sơ đồ: Chitin Deacetyl hóa (kiềm) Chitosan Chinase Aminidase Chitosanase Esterase N_acetylglucosamine Glucosamine Điều chế glucosamine bằng phương pháp enzyme cho phép thu sản phầm sạch với hiệu suất cao hơn so với phương pháp hóa học. Ribonuclease là enzym thủy phân, được tách ra từ nguồn động vật như tụy bò, nọc rắn, ếch châu phi .... Hiện nay, ribonuclease từ nọc rắn độc, để sử dụng nhiều trong y học như một dược phẩm điều trị một số bệnh nhiễm trùng virus. Thí dụ: các ribonuclease tụy từ lâu đã được sử dụng để chữa bệnh viêm não. Ribonuclease_L có khả năng ức chế nhân đôi ADN vi khuẩn trong các đại thực bào màng bụng. Gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng ribonuclease ngăn cản dự phát triển của tề bào gây ung thư. 3.3.4 Ứng dụng của enzym đối với sản xuất và định lượng chất kháng sinh. - Vi sinh và enzym giữ vai trò không thể thay thế trong sản xuất kháng sinh. - Các chất kháng sinh bán tổng hợp, hoặc các dẫn suất của các chất kháng sinh thường có ưu điểm hơn hẳn các chất kháng sinh ở chỗ bền vững, ít độc hơn, hoạt tính kháng sinh mạnh hơn, đặc biệt là không gây dị ứng. Vị vậy, sau khi đã thu nhận được các chất kháng sinh do các chủng vi sinh tổng hợp, cần tiến hành các phản ứng tiếp theo để sản xuất các dẫn xuất của các chất kháng sinh này hoặc là các chất kháng sinh bán tổng hợp. Trong các phản ứng tiếp theo ấy thì enzyme giữ vai trò không thể thay thế được. - Thí dụ: penicillin do chủng vi sinh penicillinum chrysigenum tổng hợp. để chuyển pehicillin thành amino penicillin acid (6_APA) người ta dùng penicillinase cố định trên chất mang, sau đó dùng acylase để chuyển hóa aminopenicillinic acid (6_APA) thành aminooenici ampicillin_(D__amino banzen penicillin) - Cephalosporin C là kháng sinh tự nhiên do chủng Cephalosporium tạo nên, cephalosparin bán tổng hợp như acephalecin và acephaloglicin được sản xuất từ cephalosporin tự nhiên bằng phương pháp enzyme dùng penicillinase cố định trên chất mang. Enzym trong định lượng chất kháng sinh: định lượng chất kháng sinh là vấn đề khó khăn đối với phương pháp hóa học. Vấn đề này có thể giải quyết bằng phương pháp enzyme. Thí dụ: để định lượng penicillin: người ta dùng penicillinamidase, cố định trên thủy tinh lỗ xốp. Phương pháp này cho phép định lượng peniicillin trong nồng độ 5-100mM, hoặc dùng điện cực e cho phép xác định penicillin với độ nhạy tới 0.01mM. 3.3.5 Ứng dụng enzym trong phân tích thực phẩm. Giữa thế kỷ 19, các nhà khoa học đã sử dụng enzym trong phân tích. Tuy nhiên, sử dụng enzym trong phân tích thực phẩm mới áp dụng khoảng 20-25 năm trước đây. 3.3.5.1. Enzym trong phân tích (đặc biệt là phân tích chất độc hóa học). - Ancetylcholinesterase là một ứng dụng quan trọng của enzym trong quân sự để phát hiện các chất độc thần kinh có chứa trong phospho hóa tri V như zoman, zarin. Phương pháp hóa học chỉ phát hiện được các chất độc ở nồng độ lớn gấp 10000 so với liều chết. phương pháp enzym có độ nhạy 106 so với phương pháp hóa học. - Dùng urease hoặc peroxidase cho phép đo Hg2+ ở nồng độ 10-6 mg/ml - Dùng màng có enzym cố định để phủ lên điện cực để phân tích. - Thí dụ: dùng điện cực enzyme glucoseoxidase để phân tích glucose: + Phủ màng polystyrl hoặc gel polyacrylamide có glucoseoxidase cố định lên điện cực platin. Trong màng điện cực cố định glucoseoxidase xảy ra phản ứng sau: Glucose + H2O + O2 glucoseoxidase acidegluconic + H2O2 + Điện cực ghi lại tín hiệu H2O2, sản phẩm sau phản ứng. Qua đó, xác định glucose, cơ chất cần phân tích, hoặc: Glucose + benzoguinon glucoseoxidase acidegluconic + hidroguinon +H2O Hydroguinon được điện cực platin ghi lại như sau: Hydroguinon Platin benzoguinon +2H+ + 2e- Tương tự như vậy: Dùng điện cực thủy tinh để phủ màng gel polyacrylamide có urease cố định để phân tích ure: H2N-CO- NH2 + H2O + H+ urease 2NH4+ + HCO3- Dùng điện cực phổ được phủ màng gel polyacrylamide có alcohol_oxiredutase cố định để phân tích alcohol (methanol, ethanol); Alcohol Alcoholoxireductase Formaldehyde + H2O2 3.3.5.2.Xác định carbohdrate. Trong thực phẩm, carbohdrate chiếm khối lượng lớn và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng. các loại đường là những đối tượng được phân tích thường xuyên. hexokinase Glucose. Glucose được xác định bằng phương pháp enzym hexokinase. Phản ứng của quá trình đó xảy ra như sau: D-glucose + ATP  ADP + glucose 6-phosphate Glucose 6-phosphate dehydrogenase Glucose 6-phosphate + NADP+  D-gluconate-6-phospate + NADPH + H+ Phosphomannose isomerase Fruxtose. enzym hexokinase cũng tác động lên fructose. Ta có thể xác định fructose sau khi xác định glucose. D-glucose + ATP  ADP + fructose 6-phosphate Glucose phosphate isomerase Fructose 6-phosphate  gluconate-6-phospate Galactose dehydrogenase Galactose. Galactose được xác định theo phản ứng sau: D-galatonic acid + NADH +H+  D-galactose +NAD+ Mannose. Xác định mannose tự do theo phương trình sau: hexokinase D-mannose + ATP  ADP + mannose 6-phosphate mannose 6-phosphate  fructose-6-phospate P-Fructosidase Saccharose. Saccharose thường không có trong tế bào động vật. Xác định saccharose theo phương trình sau: saccharose + H2O  D-glucose + D-fructose α-glucosidase Maltose. Xác định maltose theo phương trình phản ứng sau maltose + H2O  2-D-glucose β-galactosidase Lactose. Lactose thường có trong sữa. xác định lactose theo phương trình phản ứng sau: Lactose + H2O  D-galactose + D-glucose α-galactosidase Rafinose. Rafinose có trong củ cải đường. xác định theo phương trình phản ứng sau: Rafinose + H2O  D-galactose + saccharose amyloglucosidase Tinh bột. tinh bột có nhiều trong thực vật và có cả ở một số loài VSV. Xác định tinh bột theo phương trình phản ứng sau: Tinh bột +(n-1) H2O  n-D-glucose 3.5.3. Xác định acid hữu cơ. Acid hữu cơ và muối của chúng có nhiều trong nguyên liệu và trong sàn phẩm thực phẩm. chúng đóng vai trò quan trọng trong sinh lý người, động vật, thực vật và VSV. Chúng còn được tạo ra do quá trình lên men. Acetyl-CoA synthetase Acetic acid. Axetic acid thuộc nhóm acid bay hơi (volatile acids). Người ta sử dụng enzym để xác định acetic acid. Phản ứng trong phương pháp này được trình bày như sau: citrate synthetase Acetate +ATP + CoA  Acetyl-CoA +AMP + Pyrophospate Acetyl-CoA + Oxaloacetate + H2O  citrate + CoA L-malate dehydrogenase L-malate + NAD+  Oxaloacetate + NADH +H+ Phản ứng sau được xem như phản ứng chỉ thị. Acetate có nhiều trong vang. Ascorbic acid. Giống như vitamin, arsobic acid đóng vai trò sinh học lớn trong sinh lý người và động vật. Chúng được sử dụng như chất phụ gia thực phẩm. Người ta sử dụng enzym để xác định ascorbic acid theo phương trình phản ứng sau: PMS L-ascorbic acid (XH2) + MTT  dehydro ascorbic acid (X) + formazan- +H+ Trong đó: PMS : 5-methylpheazinium sulfate; MTT: 3-(4,5 dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide Ascorbate oxidase Ascobate được oxy hóa tiếp: L-ascorbic acid + ½  dehydro ascorbic acid + H2O Người ta thường xác định ascorbic acid trong nước quả, trong rau, quả, sữa, sản phẩm thịt. dehydro ascorbic acid + dithiothreitol (chất khử)  L-ascorbic acid + dithiothreitol (chất oxy hóa) GOT Aspartic acid. Aspartic acid có nhiều trong nước táo và được xác định theo phản ứng sau: LMDH L-Aspartate + α-oxoglutarate  Oxaloacetate + L-glutamate Oxaloacetate + NADH +H+  L-malate +NAD+ Citrate (pro-35) lyase Citric acid. Citric acid đóng vai trò rất cơ bản trong trao đổi chất ở sinh vật. Chúng có nhiều trong trái cây, sữa. Xác định citric acid theo phương trình phản ứng sau: Citrate  Oxaloacetate + acetate Formic acid. Formic acid là sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn và nấm sợi. acid này được xem như chất bảo quản nhiều thực phẩm. Tuy nhiên, việc sử dụng acid này trong bảo quản thực phẩm phải tuân theo luật an toàn và vệ sinh thực phẩm. Người ta xác định lượng formic acid theo phương trình phản ứng sau: Formate dehdrogenase Urease urea + H2O  2NH3+ CO2 Formate + NAD+ + H2O  hydrogencarbonate+ NADH + H+ Gluconate kinase Gluconic acid. Người ta sử dụng enzym gluconate kinase để xác định gluconic acid. Phản ứng xảy ra như sau: D-glucose + ATP  D-gluconate-6-phospate + ADP 6. PGDH D-gluconate-6-phospate + NADP+  D-ribulose-5-phospate + NADPH + H+ + CO2 Trong đó : 6.PGDH : 6-phosphogluconic acid hydrogenase 3.3.5.4. Xác định alcohol a). xác định athenol. ADH Ethanol là sản phẩm lên mem đường bởi nấm men. Ngoài ra những phương pháp bình thường, người ta còn dùng enzym để xác định ethanol. Phản ứng xảy ra như sau: Ethanol + NAD+  Acetaldehyde+ NADH +H+ Glycerol kinase Xác định glycerol. Glycerol phổ biến nhiều trong thiên nhiên và có nhiều trong quá trình lên men. Người ta xác định glycerol bằng enzym glycerol kinase và pyruvate. Phản ứng xảy ra như sau: Glycerol + ATP  Glycerol 3-phosphate + ADP Pyruvate kinase ADP + PEP  ATP +Pyruvate Xác định ancohol đường.Người ta xác định sorbitol bằng enzyme sorbitol dehydrogenase. Phản ứng xác định như sau: Sorbitol dehydrogenase D-Sorbitol + NAD+ D-fructose + NADH + H+ Tương tự, người ta cũng xác định xyitol bằng enzyme sorbitol dehydrogenase. Phản ứng xảy ra như sau: Sorbitol dehydrogenase Xylitol + NAD+ Xylulose + NADH + H+ 3.3.5.5. Xác định các thành phần khác Cholesterol oxidase Xác định cholesterol. Cholesterol là một steroid có ý nghĩa rất quan lớn trong sinh lý người và động vật. Người ta xác định cholesterol bằng enzyme cholesterol oxidase. Phản ứng xảy ra như sau: Cholesterol + O2 Cholestenone + H2O2 catalase H2O2 + methanol formaldehyde + 2H2O Formaldehyde + NH+4 + 2 acetylacetone lutidine + 3H2O Xác định triglyceride. Người ta xác định triglyceride bằng esterase và lipase. Phản ứng xảy ra như sau: Esterae và lipase Triglyceride + 3H2O glycerol + 3 acid béo Xác định acetaldehyde. Đây là chất tạo mùi cho bia, yaourt và các loại nước giải khát. Người ta xác định acetaldehyde bằng enzyme acetaldehyde dehydrogenase. Phả ứng xảy ra như sau: Acetaldehyde dehydrogenase Acetaldehyde + NAD+ + H2O acid axetic + NADH + H+ Xác định amoniac. Đây là chất chứa nitrogen đơn giản nhất. Người ta sử dụng enzyme glutamate dehydrogenase để xác định amoniac. Phản ứng xảy ra như sau: Glutamate dehydrogenase -oxoglutarate +NADH+ H++NH4 L-glutamate +NAD+ + H2O Xác định nitrate. Lần đầu tiên sử dụng enzyme để xác định nitrate. Enzyme được sử dụng để xác định nitrate reductate. Phản ứng xảy ra như sau: Nitate reductase Nitrate + NADPH + H+ Nitrite + NADP+ + H2O Xác định sulfite. Xác định sunlfite bằng enzyme được bắt đầu từ năm 1983. Enzyme được ứng dụng để xác định sulfite là sulfite oxidase. Phản ứng xảy ra như sau; Sulfite oxidase SO32- + O2 + H2O SO42- + H2O2 NADH-peroxidase H2O2 + NADH + H + 2H2O + NAD+ Xác định creatin và creatinine.Hai chất này có trong cơ. Enzyme được sử dụng để xác định creatinine là creatiminase, xác định creatine là creatine kinase. Phản ứng xảy ra như sau: creatininase Creatinine + H2O creatine Creatine kinase Creatine + ATP creatine phosphate + ADP Xác định lacithin. Lecithin (phosphotidylcholine) là một phospholipide quan trọng. Người xác định lecithin bằng phản ứng và những enzyme sau: Phospholipase C Lecithin + H2O 1,2 diglyceride + phosphocrylcholine Aikaline phosphatase Phosphocrylcholine + H2O choline + P Choline kinase Choline + ATP Phosphorycholine + ADP urease Xác định urea.Người ta sử dụng urease để xác định urea. Phản ứng xảy ra như sau : urease Urea + H2O  2NH3 + CO2 3.3.6 Ứng dụng enzyme trong kỹ thuật di truyền 3.3.6.1. Enzyme cắt hạn chế (restrition endonuclease) Các enzyme cắt hạn chế là những enzyme cắt phía trong phân tử DNA thành những đoạn đặc hiệu. Lần đầu tiên vào 1950, các nhà khoa học phát hiện ra một loại enzyme có mặt trong vi khuẩn có khả năng ngăn cản sự phát triển của thực khuẩn thực thể. Các enzyme này cắt DNA của thực khuẩn thể làm chúng không phát triển được trong tế bào chủ. Người ta tách tế bào này ra khỏi tế bào chủ và thực hiện những phản ứng enzyme trong ống nghiệm, các enzyme này không chỉ cắt DNA lạ mà cắt DNA của chính tế bào chủ. Các enzyme cắt giới hạn được đặt tên theo tên của vi khuẩn mà ta dùng để thu nhận giới hạn. Ví dụ: Eco RI: enzyme cắt giới hạn của E.coli Bam HI: enzyme cắt hạn chế của Bacillus amylolique. Trong đó: Chữ đầu chỉ loại Hai chữ sau chỉ loài Chữ số la mã I, II,…chỉ sự tách đầu tiên và thứ hai… Enzyme cắt hạn chế đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích genome. Chúng có khả năng ghi nhận các trình tự (sequence) đặc biệt của nucleotide và tham gia cắt ở vị trí đặc biệt trong DNA. Đây là enzym bắt buộc ở trong những thao tác đầu tiên của tiến trình tái tổ hợp DNA. Enzyme này được miêu tả gồm hai phần: Phần đầu có tính giới hạn (restriction), viết tắt là R PhẦn sau có tính cải biến (modification), viết tắt là M Chính hệ thống R-M này giúp vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của thục khuẩn thể hoặc những nhân tố di truyền lạ khác. Hệ thống R-M tồn tại rất đa dạng không chỉ ở các loài VSV khác nhau mà ngay cả trong một loài VSV. Hiện nay, người ta đã tìm thấy khoảng 2100 type III có tính đặc hiệu rất cao, 190 nhóm DNA modification methyltransferase đang được nghiên cứu và ứng dụng. Hệ thống R-M có hai tác động đặc hiệu : Restriction endonuclease (viết tắt là R-Enase) tác động lên một vị trí nhất định. Ngoài ra chúng có tác động phá hủy DNA lạ. Modification 3.3.6.2. Xác định vị trí trong các chuỗi enzyme : Trong kỹ thuật di truyền, người ta thường dùng nhóm từ recognition sequence, có nghĩa là chuỗi ( trình tự, dỹ) mã xác định. Các enzyme cắt có tính chất đặc hiệu cao với trình tự nucleotit trong DNA. Các enzyme sẽ cắt đúng vị trí mà chúng tìm thấy. Vị trí này được gọi là “targt site” khi đó, DNA sẽ được cắt ra từ đoạn ngắn hoặc dài khác nhau. Trong các type của enzyme cắt giới hạn, type được người ta chú ý nhiều nhất. Chúng có chuổi mã xác định theo kiểu tetra, penta và hexa nucleotit. Những trình tự như vậy sẽ được viết từ trái sang phải thepo hướng 5’-3’(palindromic). Ví dụ: 5’-GAATTC-3’. Trình tự xác định hướng có trục đối xứng theo vòng kín (rotational). Ví dụ, trình tự mã xác định của EcoRI là: 5’-GAATTC-3’, 3’-CTTAAG-5’ Về mặt lý thuyết, có 16 tetranucleotide đối xứng với 64 hexanucleotide. Trong đó, chỉ có 50% thực sự hoạt động tại các Targetsite của nó. enzyme cắt giới hạn các chuỗi DNA theo một số kiểu sau: Cắt theo kiểu blunt end ( dạng hai đầu so với dây đôi). Cắt theo kiểu sticky end hay cohesive, đoạn cuối dây đôi so le tại vị trí 5’. Cắt theo kiểu sticky end, tại vị trí 3’. Các enzyme tham gia phân cắt theo ba kiểu này được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Trình tự xác định vị trí cắt của các restriction endonuclease. 5’-end3’-endBlunt endEnzymeTrình tự nucleotideEnzymeTrình tự nucleotideenzymeTrình tự nucleotideTaq IT/CGAPst ICTGCA/GAlu IAG/CTCla IAT/CGAT Scac IGAGCT/CFnul IICG/CGMbo I/GATCSph IGCATG/CDpn IGA/TCBgl IA/GATCTBde IGGCGC/CHae IIIGG/CCBamHIG/GATCCApa IGGGCCC/CPvu IICAG/CTBcl IT/GATCAKpn IGGTAC/CSma ICCC/GGGHind IIIA/AGCTTNae IGCC/GGCNco IC/CATGHpa IGTT/AACXma IC/CCGGNru ITCG/CGAXho IC/TCGAGBal ITGG/CCAecoRIG/AATTCMst ITGC/GCASal IG/TCGACAha IIITTT/AAAXbal IT/CTAGAEcoRVGAT/ATC 3.3.6.3Tính chất đặc biệt của chuỗi mã xác định. Số lượng enzyme thuộc type II cần thiết để thực hiện phản ứng phân cắt DNA phụ thuộc vào chiều dài của DNA, hợp phần các base có trong DNA, tỷ lệ GC trong toàn bộ base của DNA. Các loại enzyme chứa chuỗi mã xác định thuộc dạng hecxa nucleotide có đũ bốn loại base thường chứa nhiều hơn một vị trí xác định (recognition site) trong phân tử DNA. Ví dụ: Sma I vị trí xác định chỉ bao gồm C và G (CCC/GGG) hoặc Xma III(C/GGCC). Hiện tượng này sẽ không có trong phân tử nhỏ hơn PBR 322 và SV40. hiện tượng này được gọi là tính đặc hiệu của chuỗi mã xác định. Bảng trên cho thấy enzyme FnuDII (CG/CG) cắt plasmil PBR 322 khoảng 23 lần. FnuDII không cắt SV40. Ở bản trên cũng cho thấy PBR 322 và SV40 đều bị cắt cùng một tần suất tương tự bởi HaeIII (GG/CC). Chuỗi mã xác định này không chứa CpG dinucleotide. Các sinh vật eukariotic không chứa chuỗi mã dinucleotide. 3.3.6.4.Phương pháp phát hiện và tinh sạch restriction endonuclease DNA rất dể quan sát dưới tia cực tím nhờ DNA có tính hình quang khi nhuộm với ethidium bromide. Tia sáng có bước sống 254 nm có độ cảm cao nhất. Người ta có thể phục hồi DNA trên gen trong bước sống của tia sáng 366nm. Sự chuyển động của các đoạn DNA trên agarose và polyacry lamide gen tương ứng với logarithm trọng lượng phân tử của DNA Để sử dụng enzyme các giới hạn, người ta trộn lượng enzyme cắt giới hạn với DNA trong dung dịch điệm ở 370C. hoạt tính của enzyme được đo bằng đơn vị tương đương lượng enzyme cần thiết để cắt 1 microgam DNA trong 1 giờ ở 370C. 3.3.6.5.Các enzyme nối kết (ligase) các enzyme nối kết được xem như là thuốc keo phân tử, dùng để nối các đoạn DNA với nhau. Enzyme nối kết được sử dụng nhiều nhất là DNA ligase của T4. enzyme này được chiết tách tử E.coli bị nhiễm phage T4. Enzyme này hoạt động mạnh ở 370C. Khi tiến hành các kỹ thuật gen, người ta lại thực hiện ở nhiệt độ 4-150C để ngăn chặn khả năng biến tính của enzyme. Các phản ứng nối kết xẩy ra theo 2 kiểu sau: methylase của DNA (còn được gọi là methyl-transferase, viết tắt là M-Mtase) tác động vào chuỗi mã đồng nhất. Chúng làm cải tiến và bảo vệ DNA của tế bào không bị R-Enase phá hủy. 3.3.7. Ứng dụng enzym để tạo ra những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Papain mang tính chất như 1 endopeptidase, đồng thời cũng như 1 exopeptidase, thủy phân protein thành polypeptide, oligopeptide và các aminoacid. Tính chất đặc hiệu của papain đối với cơ chất rất lớn. papain có khả năng thủy phân tất cả các liên kết peptide, trừ các liên kết của prolin và các acid glutamic. Papain từ nhựa quả đu đủ xanh có hoạt lực thủy phân mạnh ngang với chế phẩm subsilizin bungary và mạnh hơn chế phẩm neutrase của hãng novo đan mạch. Một số loại tảo như: spirulina, chlorella có hàm lượng protein dự trữ rất cao (từ 55-65% trọng lượng khô) nhưng hệ tiêu hóa của con người không thể sử dụng trực tiếp loại tảo này. Vì vậy khi dùng tảo để sản xuất những loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phải thủy phân chúng. Quá trình thủy phân này được papain với tính chất như trên xúc tác một cách hiệu quả. 3.3.8 Sử dụng enzyme để giải quyết vấn đề năng lượng. Hydrogenase để giải quyết vấn đề năng lượng. Trước tình hình khủng hoảng năng lượng trên thế giới ngày nay càng trầm trọng, các nhà khoa học đã có nhiều phương hướng tìm kiếm nguồn năng lượng cho tương lai. Những nguồn năng lượng có triển vọng nhất có thể kể đến năng lượng mặt trời và năng lượng nhiệt hạch. Nhưng từ năm 1975, năng lượng mặt trời là nguồn năng lượng đã được chọn dứt khoát cho tương lai. Đã qua 3 tỷ năm và 3 tỷ năm tới, hàng năm mặt trời cho trái đất 1 khối lượng năng lượng khổng lồ không thay đổi: 3.1024 J, tương đương 64 nghìn tỷ tấn dầu mỡ, gấp 5000 tất cả các nguồn năng lượng khác mà trái đất có. Năng lượng mặt trời cho trái đất lớn như vậy, nhưng con người chỉ sử dụng được khoảng 0.01%. Số còn lại tán xạ ra ngoài khí quyển. Do đó, nếu có phương án nào sử dụng hiệu quả hơn nguồn năng lượng khổng lồ ấy thì con người sẽ vĩnh viễn thoát khỏi tình trạng khủng hoảng năng lượng. Cơ sở của vấn đề: quá trình quang hợp là quá trình biến đổi năng lượng mặt trời (hv) về dạng dự trữ trong sinh khối (CH2O), được thực hiện trong tự nhiên nhờ các sinh vật có các bộ phận quang hợp: CO2 + H2O hv CH2O + O2 Quá trình quang hợp trên có thể tách thành 2 giai đoạn như sau: Giai Đoạn 1: H2O hv 2H+ + 2e- + 1/2 O2 Giai Đoạn 2: CO2 + 2H+ + 2e- (CH2O) + 1/2 O2 Nếu cho chất mang electron A hóa trị 2 vào giai đoạn 1, chất A sẽ thu nhận e thành chất khử A-2. Chuyển chất khử A-2 này vào giai đoạn 2, thì có thể thực hiện được phản ứng tạo thành H2 từ 2H+ và 2e- 2H+ + 2e- H2 phản ứng tạo thành H2 trên được hydrogenase xúc tác, enzyme này có đặc điểm là chỉ thấy trong rong biển, không có plastid (bào quan) của thực vật. Tổng hợp giai đoạn 1 và phản ứng tạo thành H2 được phương trình quang phân ly nước: H2O hv 1/2 O2 + H2 Như vậy, về nguyên tắc có thể sử dụng ánh sáng mặt trời và các quá trình sinh học để thực hiện quang phân ly nước liên tục, trong đó có hydrogenase xúc tác tạo thành hydro và oxy: A-2 2H+ 1/2 O2 H2 Quang hợp hv A Bảo quản + H2O Hydrogenase (phản ứng tối) Sơ đồ quang phân ly H2O Người ta đã chứng minh được bằng thực nghiệm ý tưởng của phương pháp sinh học nhờ ánh sáng mặt trời và các quá trinh sinh học để chuyển hóa 1 cách liên tục năng lượng mặt trời từ dạng bức xạ về dạng dự trữ (nhiên liệu hydro) Trên đây là một số thí dụ chứng minh cho hiệu quả sử dụng công nghệ vi sinh, công nghệ enzyme phục vụ cho nền kinh tế quốc dân. Các công nghệ này đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ, tỉ mỷ về thực nghiệm cũng như lý thuyết, đồng thời các công nghệ này đã đạt được nhiều kết quả phục vụ đời sống kinh tế quốc dân. 3.3.9 Một số ứng dụng của enzyme điển hình trong các ngành khác 3.3.9. 1.Protease - Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Nhờ vậy đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn khi thuộc da. Hiện nay, các protease tách từ vi khuẩn, (B.mesenterricus, B.subtilis), nấm mốc (A.oryzae, A.falavus) và xạ khuẩn (S.fradiae, S.griseus, S.rimosus...) được sử dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp thuộc da. Các enzyme này, ngoài khả năng hoạt động trong môi trường kiềm, chúng còn phải có khả năng chịu được tác động của NaCl và phải có hoạt tính cao. Người ta thường cho 50-200 gram protease có hoạt tính 100.000LVU/gam để tách một tấn lông. Khi sử dụng enzyme quá trình tách lông sạch hơn, da có chất lượng tốt hơn. - Trong công nghiệp dệt: Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng làm thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng. - Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn da súc có độ tiêu hóa cao có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh... Protease trong chất tẩy rửa Các chất cacbonhydrat và lipid dễ dàng hòa tan trong môi trường kiềm của bột giặt. Protein khó bị loại hơn các chất khác. Chính vì thế, việc tìm ra chất nào đó, khi trộn vào trong bột giặt có khả năng loại chúng ra khỏi quần áo là mục đích của những nghiên cứu kéo dài rất nhiều năm. Người ta đã thử enzyme protease. Trong các loại protease thì protease kiềm thích hợp hơn cả. Các protease ứng dụng trong sản xuất bột giặt phải đáp ứng những yêu cầu sau: Hiệu quả tẩy sạch cao. Có khả năng hoạt động trong môi trường có PH 9-11 và phải chịu được nhiệt độ có khi đến 95oC. Có khả năng giữ được hoạt tính khi có mặt của các chất tham gia thành phần bột giặt. Có khả năng bảo quản và giữ được hiệu lực ít nhất là một năm. Những yêu cầu trên chỉ có serine protease của vi khuẩn là đáp ứng được. Lượng chế phẩm protease đưa vào thành phần của bột giặt chỉ khoảng 0,5-1%. Ngoài các cơ chất tẩy rửa dạng bột, thị trường các chất tẩy rửa trên thế giới có đến 25% thuộc dạng lỏng. Các chất tẩy rửa dạng lỏng có ưu điểm là dễ khuếch tán các thành phần tẩy rửa nhưng có nhược điểm là khó vận chuyển. Trong các chất tẩy rửa dạng lỏng, người ta cũng cho enzyme protase để tăng khả năng phân giải các vết protein có trong quần áo. Nhược điểm của quá trình thủy phân protein bởi enzyme là có thể gây ra vị đắng của peptide và/hoặc axit amin. Điều này có thể xảy ra khi protein (ngoại trừ collagen) được xử lý xuống peptide có khối lượng phân tử dưới 6000. Vị đắng peptide cũng có thể nhận thấy được khi fomát chín. Để hạn chế quá trình này, có thể sử dụng hỗn hợp endo và exopeptidase được chiết xuất từ Latobacilli. 3.3.9.2. Ezyme cellulase. Enzyme cellulase được ứng dụng trong chất tẩy rửa chủ yếu nhằm mục đích làm mềm vải cotton. Việc ứng dụng enzyme cellulase đặc biệt được phát triển ở Nhật và các nước châu Âu. Người ta đã sử dụng enzyme cellulase từ 23 chủng vi khuẩn và 125 chủng nấm sợi. Trong đó, cellulase từ Humicola insolens. Celuula từ Humicola insolens có khả năng hoạt động ở pH 8,5-9,0 và nhiệt độ 500C. 3.3.9.3 Amylase Trong công nghiệp dệt: người ta sử dụng enzyme -amylase của malt hay pancreatic amylase. Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa, đầu tiên người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ sội sau đó làm giảm nhiệt độ xuống 50-60oC và cho enzyme amylase vào. Trong công nghiệp người ta sử dụng enzyme amylase của vi khuển để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm. Trong vải thô thường chứa khoảng 5% tinh bột và các tạp chất khác. Do đó khi sử dụng chế phẩm của enzyme amylase ty nhiên ngoài chế phẩm enzyme amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn, hiện nay người ta đã quan tâm đến việc sử dụng amylase từ nấm sợi. Cho đến nay có rất nhiều nước đã sử dụng enzyme rong công nghiệp dệt để tăng khả năng cạnh tranh các hàng vải, sợi. Những enzyme này không bền pH kiềm và nhiệt độ cao trong một thời gian lâu, nên người ta thường bao chúng lại trước khi phối trộn với các thành phần khác của chất tẩy rửa để bảo quản được lâu và đảm bảo khả năng hoạt động của chúng. Các enzyme amylase của vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbohydrate trong quần áo. Người ta thường sử dụng enzyme a-amylase của vi khuẩn. Enzyme này thường chịu được nhiệt độ cao (đến 900C) và pH kiềm (pH9). 3.3.9.4. Lipase Enzyme lipase thủy phân dầu, chất béo tạo ra acid béo và glicerol. Trong kỹ thuật người ta tiến hành thủy phân dầu béo ở nhiệt độ sối rất cao và áp suất rất cao. Lipase sử dụng trong chất tẩy rửa để phân hủy các vết bẩn lipid. Các lipase được ứng dụng trong chất tẩy rửa hoạt động ở pH 9-10. Người ta sản xuất lipase từ nấm sợi có tên thương mại Liponase. Nấm sợi dùng để sản xuất lipase đã được biến đổi gen này có khả năng hoạt động ở pH<12 và nhiệt độ 60oC. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Công nghệ enzyme, Nguyễn Đức Lượng, NXB Đại học quốc gia thành phố HCM,2004. 2.Công nghệ Vi Sinh Vật, tập 2 Nguyễn Đức Lượng, NXB Đại học quốc gia thành phố HCM,2004. 3.Động học các quá trình xúc tác sinh học, Trần Đình Thoại- Nguyễn Thị Vân Hải, NXB KH và KT 4.Vi sinh vật học, Nguyễn Lân Dũng, NXB KHKT, 2000 5. Hóa sinh công nghiệp, Lê Ngọc Tú (chủ biên), NXB KH và KT, 1998 Và một số tài liệu tham khảo từ internet.