Chiết xuất và phân lập Acid Glycyrrhizic từ Cam thảo

MỤC LỤC Đặt vấn đề ii Tổng quan tài liệu 1 Thực vật học 1 Phân loại thực vật 1 Mô tả thực vật 1 Phân bố, thu hái, chế biến 2 Thành phần hóa học 3 Tác dụng – công dụng 5 Tác dụng chung của cam thảo 5 Các nghiên cứu về tác dụng của glycyrrhizin 6 Chiết xuất phân lập 9 Các phương pháp chiết xuất 9 Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (Multi–stage countercurrent extraction - MCE) 9 Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave-aissisted extraction) 20 Các phương pháp phân lập 26 Phân lập và tinh khiết hóa bằng cách chiết với dung môi hữu cơ 26 Phương pháp sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao (Hight speed counter-current chromatography) 37 Kết luận – nhận định 43 Tài liệu tham khảo 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong xu thế Việt Nam giai nhập WTO, ngành dược nước ta có nhiều cơ hội phát triển và cũng đối mặt với không ít khó khăn. Dược liệu là thế mạnh của ngành công nghiệp dược nước ta vì vậy đẩy mạnh phát triển dược liệu là một trong những mục tiêu hàng đầu. Cam thảo là dược liệu truyền thống được sử dụng rộng rãi do có nhiều công dụng, gần đây y học hiện đại quan tâm đến cam thảo với hoạt tính chống virus và có nhiều triển vọng trong điều trị HIV với các kết quả nghiên cứu bước đầu trên glycrryhizic acid chiết xuất từ rễ cam thảo. Vấn đề chiết xuất và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cam thảo có vai trò quan trọng, cung cấp các hợp chất tinh khiết làm nguyên liệu để tạo ra các chế phẩm thuốc dùng trong điều trị. Bài báo cáo này được thực hiện nhằm cung cấp một số thông tin về quá trình chiết xuât, phân lập tinh khiết hoạt chất Saponin chính trong cây cam thảo – Glycrryhizic acid. TỔNG QUAN: THỰC VẬT HỌC. [1] 1.1.1 Phân loại thực vật. Cam thảo còn có tên là Bắc cam thảo, Cam thảo, Sinh cam thảo, Quốc lão. Tên khoa học Glycyrrhiza uralensis Fish và Glycyrrhiza glabra L. (G. glandulifera Waldst et Kit). Thuộc họ đậu ( cánh bướm) Fabaceae (Papilionaceae). Cam thảo (Radix Glycyrhizae) là rễ và thân rễ phơi hay sấy khô của cây cam thảo nguồn gốc Uran (Glycyrrhiza uralensis Fish.) hay cây cam thảo Châu Âu Glycyrrhiza glabra L. Tên Cam thảo vì cam là ngọt, thảo là cỏ, cỏ có vị ngọt. Glycyrrhiza vì do chữ Hy Lạp Glykos là ngọt và riza là rễ, rễ có vị ngọt, uralensis vì sản xuất ở vùng núi Uran, dãy núi nằm giữa Châu Á, Châu Âu. 1.1.2 Mô tả thực vật:
Hình 1: Cây Cam thảo Glycyrrhiza uralensis Fish. Cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis) là một cây sống lâu năm thân có thể cao tới 1m hay 1,5m. Toàn thân cây có lông rất nhỏ. Lá kép lông chim lẻ, lá chét 9 - 17, hình trứng, đầu nhọn, mép nguyên, dài 2 – 5,5 cm, rộng 1,5 – 3 cm. Vào mùa hạ và mùa thu nở hoa màu tím nhạt, hình cánh bướm dài 14 – 22cm (cây trồng ở Việt Nam sau 3 năm chưa thấy ra hoa). Quả giáp cong hình lưỡi liềm dài 3 – 4 cm, rộng 6 – 8 cm, màu nâu đen, mặt quả có nhiều lông. Trong quả có 2 – 8 hạt nhỏ dẹt, đường kính 1,5 – 2mm màu xám nâu, hoặc xanh đen nhạt, mặt bóng. Tại Trung Quốc mùa hoa tháng 6 – 7, mùa quả tháng 7 – 9. Hình 2: Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra L Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra rất giống loài Cam thảo Glycyrrhiza uralensis, nhưng khác ở chỗ lá chét thuôn dài hơn, dài 1,5 – 4 cm, rộng 0,8 – 2,3mm, quả giáp thẳng hoặc hơi cong, dài 2 – 3cm, rộng 4 – 4,4mm, mặt quả gần như bóng hoặc có lông ngắn, số hạt ít hơn loài trên. Mùa hoa tháng 6 – 8, mùa quả tháng 7 – 9. 1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến: Cây Cam thảo bắc trước đây không có ở nước ta. Từ năm 1958 được du nhập vào Việt Nam bằng những hạt giống của loài Glycyrrhiza uralensis do Liên Xô cũ cung cấp. Cây mọc khỏe vào mùa xuân hạ và thu. Đến mùa đông thì lụi đi hoặc kém phát triển. Sang năm sau cây lại mọc mới. Lượng chất trong rễ mỗi năm mỗi tăng. Tuy nhiên, sau 3 năm cây vẫn chưa ra hoa. Một số tài liệu nói rằng cây trồng thường không ra hoa. Trồng bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Sau 4 – 5 năm trở lên có thể thu hoạch. Đào rễ và thân rễ vào mùa xuân hoặc thu đông. Nhưng mùa thu đông cam thảo tốt hơn. Mỗi hecta có thể thu hoạch 8 – 10 tấn. Vì là một cây lâu năm mới thu hoạch cho nên trong 2 – 3 năm đầu người ta thường trồng xen các cây thực phẩm. Khi đào thường người ta chỉ lấy rễ, nhưng nhiều khi lấy cả thân rễ. Thân rễ dài, có khi tới 7 – 8m. Sau khi đào rễ, người ta xếp đống để cho hơi lên men, làm cho rễ có màu vàng sẫm hơn, là màu người ta chuộng hơn. Tại Liên Xô cũ, Trung Quốc và nhiều nước khác cây Cam thảo mọc hoang và trở thành một thứ cỏ khó diệt trừ, chỉ một mẫu thân rể có thể trở thành bụi Cam thảo và cứ như vậy lan ra rộng mãi. Những khu vực Cam thảo mọc hoang là nơi có đất khô, đất có Calci, đất cát, đất cát vàng. Những nơi có đất đen cứng chắc, kiềm tính và ẩm thấp thì lượng Cam thảo kém hơn, nhiều xơ, tí bột, ít ngọt, rễ mọc cong queo. THÀNH PHẦN HÓA HỌC. [2] [3] Glycyrrhiza glabra L. Chất vô cơ 4 - 6%, carbohydrate 3 - 5%, malnitol, tinh bột 25 -30%, lipid 0,5 – 1%, asparagin 2 – 4 %, nhựa 5% . Glycyrrhizin là một saponin thuộc nhóm olean, hàm lượng từ 10 – 14% trong dược liệu khô, chỉ có trong bộ phận dưới mặt đất, có vị rất ngọt. Đây là saponin quan trọng trong rễ Cam thảo. Glycyrrhizin được Robiquet phân lập năm 1809 dưới dạng mảnh màu vàng. Glycyrrhizin tinh khiết dạng bột màu trắng dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, ít tan trong nước lạnh, nếu để nguội sẽ tạo thành gel, không tan trong ether và chloroform. Nếu cho vào nước lắc thì tạo bọt. Độ ngọt gấp 60 lần saccharose, nhưng nếu phối hợp với mía, độ ngọt lại tăng lên và có thể gấp 100 lần. Dưới tác dụng của acid vô cơ, acid glycyrrhizic bị đẩy ra khỏi muối của nó. Khi thủy phân bằng acid thì nó cho phần aglycon là acid glycyrrhetic ( còn gọi là acid glycyrrhetinic) và 2 phân tử acid glucuronic. Acid glycyrrhetic có một nhóm OH ở C-3 ( nối với 2 phân tử acid glucuronic) một nhóm carbonyl ở C-11, một nối đôi ở C-12-13 và ở C-30 là nhóm carboxyl. Trên thị trường, glycyrrhizin thương phẩm là amoni glycyrrhizat thu được bằng cách chiết bột cam thảo với nước rồi acid hóa để kết tủa, rửa tủa rồi lại hòa tan trong amoniac, bốc hơi trong các khay mặt bằng sẽ thu được những vảy màu đen nhạt, bóng, tan trong nước và rất ngọt. Hàm lượng glycyrrhizin là 6 – 12% ( dược liệu khô).
Hình3: Glycyrrhizic acid. Trong Cam thảo còn có các dẫn chất triterpenoid khác như: acid liquiritic (acid này khác acid glycyrrhetic bởi nhóm carboxyl ở C-29), acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic, acid 24-α-hydroxyglycyrrhetic, glabrolid, deoxyglaborid, isoglabrolid, 24-α-hydroxyisoglabroid, acid liquiridiolic, aicd 11-deoxyglycyrrhetic, acid 24-hydroxy 11-deoxyglycyrrhetic. Các flavonoid là nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong rễ Cam thảo với hàm lượng 3 – 4%. Có 27 chất đã được biết, quan trọng nhất là hai chất liquiritin (hay liquiritirosid) và isoliquiritin (hay isoliquiritirosid ).

Hình 4: Flavonoid chính trong rễ cây cam thảo. Liquiritin được Shinoda và Ueda (1934) phân lập, chất này thuộc nhóm flavanon, có phần aglycon là liquiritigenin ( 4’,7dihydroxy – flavanon). Isoliquiritin được Puri và Seshadri phân lập (1954). Chất này là đồng phân của chất trên và thuộc nhóm chalcon, phần aglycon là isoliquiritigenin ( 4,4’,6’ – trihydroxy chalcon). Isoliquiritigenin ở môi trường acid thì đồng phân hóa thành liquiritigenin. Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan (gla-bridin), isoflavon (glabron), isoflaven (glabren). Những hoạt chất estrogen steroid: phần này tan trong ether dầu hỏa, khi thí nghiệm trên chuột cống đã thiến thì thấy xuất hiện những tế bào sừng non trong niêm dịch âm đạo. Những chất coumarin: umbelliferon, herniarin, liqcoumarin (6-acetyl – 5 – hydroxy – 4 – methyl coumarin). Glycyrrhiza uralensis Fisch. Rễ chứa carbohydrate 4,7 – 10,97%, tinh bột 4,17 – 5,92%; glycyrrhizin 5,49 – 10,04%, acid 24 – hydroxy glycyrrhetic, acid 3β – hydroxyolean – 11,13 (18) dien – 30 – oic, acid 3β hydroxyolean – 19 (11), 12 (13) dien – 30 oic; flavonoid có khoảng 20 chất trong đó những chất chính là liquiritin, liquiritigenin , isoquiritin, isoliquiritigenin, neoliquiritin, (dl) – liquiritigenin – 7 - β – D – glucopyranosid, neo – isoliquiritin (trans – isoliquiritigenin – 4- β – D – glycopyranosyl – 2 – β – D – apio – d (hay l ) – furanosid). TÁC DỤNG – CÔNG DỤNG. TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CHUNG CỦA CAM THẢO:[2] Tác dụng dược lý: Tác dụng gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương, giảm vận động tự nhiên, hạ thể nhiệt, giảm hô hấp; giảm ho; giảm co thắt cơ trơn; chữa loét đường tiêu hóa, ức chế tác dụng gây tăng tiết dịch vị của histamin; bảo vệ gan trong viêm gan mạn tính và tăng bài tiết mật; chống viêm gan và chống dị ứng; tác dụng giống oestrogen; chữa bệnh addison; tác dụng giải độc. Tính vị, công năng: Rễ Cam thảo bắc có vị ngọt, tính bình. Để sống ( đồ mềm, sấy khô) có tác dụng giải độc, tả hỏa; tẩm mật, sao vàng ( chích Cam thảo), lại có tác dụng ôn trung, nhuận phế, điều hòa các vị thuốc. Công dụng: Cam thảo sống được dùng chữa cảm, ho mất tiếng, viêm họng, mụn nhọt, đau dạ dày, ỉa chảy, ngộ độc. Cam thảo chích có tác dụng bổ, chữa tỳ vị hư nhược, ỉa lỏng, thân thể mệt mỏi, kém ăn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy Cam thảo bắc còn có thêm một số tác dụng: Chữa loét dạ dày ruột, có tác dụng giảm loét, giảm co thắt cơ trơn, giảm tiết acid hydroclorid; chữa bệnh addison. Cam thảo bắc dùng phối hợp với cortison có thể làm giảm tác dụng của cortison. Cam thảo bắc làm cho thuốc có vị ngọt, dễ uống và thường có trong thành phần các thuốc viên, thuốc phiến, kẹo ngậm, siro chữa ho. Theo tài liệu nước ngoài, trong y học Trung Quốc, Cam thảo bắc dùng phối hợp với một số dược liệu khác làm thuốc long đờm chữa ho gà, thuốc để bao và bảo vệ niêm mạc dạ dày, thuốc chữa lao phổi và viêm phế quản, thuốc giải độc đối với ngộ độc thịt và nấm, thuốc có tác dụng làm trẻ người. Rễ Cam thảo bắc còn có tác dụng nhuận tràng nhẹ, được dùng chữa các chứng bệnh xuất tiết và các chứng kích thích niêm mạc các cơ quan đường tiết niệu. Trong y học dân gian Ấn Độ, Cam thảo bắc còn được dùng nhai với lá trầu không, nhào với bơ sữa trâu hoặc mật ong để đắp ngoài chữa vết chém, vết thương. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG CỦA GLYCYRRHIZIN ( ACID GLYCYRRHIZIC).[4] Giá trị y học của rễ cam thảo là do chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học như triterpen glycoside, hợp chất phenolic, oligo và polysaccharides, lipid, sterine… quan trọng nhất là triterpen glycoside, acid glycyrrhizic (GL) và aglycone của nó, 18β-glycyrrhetinic acid (GLA), một pentacyclic triterpen thuộc nhóm β-amyrin. GA và aglycone của nó có nhiều hoạt tính sinh học (kháng viêm, chống loét, chống dị ứng, chống giảm khả năng nhận thức, chống oxi hóa, chống virut, chống khối u),… muối monoammonium của GL (glycyram, tusillnar) được dùng làm biện pháp khắc phục chống dị ứng, kháng viêm cho chữa bệnh hen suyễn, eczemas, và các bệnh khác. Thuốc này được ứng dụng để giảm hiện tượng dung nạp glucocorticosteroid. Muối Natri của hemisuccinate acid glycyrrhetinic (carbenoxolone) được sử dụng thành công cho điều trị loét dạ dày tá tràng.
Sự tương đồng về cấu trúc của GL aglycone đến 11- ketosteroid xác định cũng tương đồng trong hoạt tính sinh học. Vì thế, GL và aglycone ảnh hương đến chuyển hóa muối nước, ức chế sự oxi hóa do nhiễm độc phospho, quá trình sinh tổng hợp mucopolysaccharic và hoạt tính của men phospholipase A2, cải thiện hoạt tính của glutamic transaminase. GL và GLA ảnh hưởng đến sự tăng acid arachidonic, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandine và leucotriene. Monoammonium glycyrrhizate ức chế hình thành PGE2 và PGF2a ở thận chuột in vitro và invivo tương đương với indomethacin. Tác động chống dị ứng của GL do tác dụng đối kháng với acetylcholine, histamine và các chất kích thích dị ứng. Monoammonium glycyrrhizate và GLA được ghi nhận như là một tác nhân làm giảm lipid và chống oxi hóa. Tác dụng kháng viêm của GL và aglycone của nó được tìm thấy với tác dụng chống loét gây ra bởi quá trình tổng hợp acid nucleic ở niêm mạc dạ dày. Hoạt tính giải độc của GL được xác định chắn bởi sư hiện diện của acid glucuronic trong cấu trúc của nó. GL và muối của nó có thể chống lại liều gây chết của strychnine, nicotinic, caffeine, histamin, và các chất độc khác, và được đề nghị sử dụng như những chất giải độc. GL ngăn sự tổn thương tế bào gan ở chuột do các chất gây độc như allylformiate, acid linolic, galatose amine, và CCl4. Tính chất bảo vệ tế bào gan của GA được cho là liên quan đến tác dụng chống oxy hóa của nó. Vì thế GL ức chế sản phẩm aminotrasferases từ tế bào gan chuột trên vitro và chất gây độc tế bào gan trên vivo và giảm lượng lipid peroxides ở chuột giống như α-tokoferol. GL được sử dụng trên lâm sàng ở Nhật bằng đường tĩnh mạch để trị viêm gan siêu vi B mãn . GL thay đổi sự vận chuyển trong tế bào, ngăn chặn quá trình syalyl hóa của virut viêm gan siêu vi B,C trên bề mặt kháng nguyên trong ống nghiệm. Điều đó chỉ ra rằng chữa trị của SNMC cho bệnh nhân bị nhiễm virut viêm gan C làm giảm transaminase trong huyết tương hoạt động ngay cả trong các bệnh nhân kháng trị với interferon. GL kích thích sản xuất (-interferon trong ống nghiệm. Trên lâm sàng GL tiêm tĩnh mạch kích thích (-interferon diệt thông thường (normal killers) và interferon trong huyết tương. Một tác dụng kích thích của GL trên sự tiết của interleukin-2 được tìm thấy trong những dòng bạch cầu ngoại vi nuôi cấy. GL và muối monoammonium ức chế sự tăng trưởng AND và ARN của virut (vaccinia, bệnh New Castle, mụn nước, bệnh thủy đậu, zona, cúm…) in vitro. GL là một trong những glycoside thiên nhiên đầu tiên ức chế virut gây bệnh HIV type 1 (HIV-1) trong nhóm 4 loại tế bào, được chứng minh bởi các nhà nghiên cứu lâm sàng học, sự kiểm soát của GL đến bệnh nhân AIDS là trì hoãn sự tiến triển của triệu chứng nhiễm HIV. Điều trị đầu tiên với GL được bắt đầu sớm khi HIV-1 chưa có triệu chứng, đã bảo vệ bệnh nhân hơn 11 năm mà không có cảm ứng của thuốc chống lại. Người ta khám phá ra rằng sự trị liệu đồng thời GL cùng với azidotymidine (AZT) làm giảm tác dụng phụ của thuốc AZT. Cơ chế chống lại hoạt động của HIV của GL là nối với cấu trúc polyanionic của nó. GL ngăn cản bằng cách bám vào virut và ức chế proteinkinase C là yếu tố phải có cho sự liên kết của HIV-1 với các receptor của tế bào CD4. Ngày nay GL là thuốc đang được quan tâm trong việc chữa bệnh và thay đổi cấu trúc của nó sẽ tạo ra những hợp chất có hoạt tính sinh học cho y học. CHIẾT XUẤT – PHÂN LẬP. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (Multi–stage countercurrent extraction - MCE)[6]. Thiết kế thí nghiệm. Mẫu cam thảo nguyên liệu. Mẫu rễ cam thảo thô (Glycyrrhiza uralensis Fisch) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ELION. Mẫu được xác thực bởi Giáo sư ShouQuan Lin thuộc Trung Tâm Cây Thuốc, Viện Hàm Lâm Khoa Học và Y Khoa Trung Quốc (Institute of Medicinal Plants, Chinese Academy Medical Sciences). Hàm lượng GA trong mẫu cam thảo thô là 3,72% về khối lượng, được xác định bởi phân tích HPLC. Mẫu cam thảo được cắt thành lát tròn dày khoảng 3mm với đường kính từ 5-10mm Thuốc thử. Acetonitrile, acid trifluoroacetic, ethanol và nước amoniac (25% amoniac trong nước) được sử dụng trong thí nghiệm đều đạt chuẩn phân tích. Thuốc thử được cung cấp bởi công ty hóa chất Sigma. Acid Glycyrrhizic được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ELION. Nước được sử dụng trong chiết xuất cam thảo và dùng làm pha động trong phân tích HPLC đều được cất bởi thiết bị cất nước Millipore (Millipore, USA). Thiết bị. Tất cả các thử nghiệm MCE đều được thực hiện trên thiết bị MCE Model DN-1.5 (Hangzhou Chunjiang Pharmacy Mechine Co., Ltd., Hangzhou, China). Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) được thực hiện trên thiết bị chiết xuất vi sóng Model WCD2S-1 có bộ điều nhiệt tự động và kiểm suất năng lượng (Nanjing Sanle Microwave Technology Co., Ltd., Nanjing, China). Chiết siêu âm (USE) được thực hiện trên thiết bị chiết siêu âm Model SK3200LH (Shanghai Kudos ultrasonic instrument Co., Ltd., Shanghai, China). Chiết bằng Soxhlet (SHE) được thực hiện trên bình chiết Soxhlet thủy tinh thông dụng. Phân Tích HPLC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent Model 1100 (Agilent Co., Ltd., USA) bao gồm thiết bị bơm, đầu dò mảng lưỡng cực (diode array detector - DAD) và bộ phận tiêm mẫu tự động. Trước khi phân tích HPLC, dịch chiết được đem đi quay ly tâm với tốc độ cao (12000 vòng/phút) trong 10 phút bởi Máy quay li tâm đông lạnh MIKRO 22R (Hettich, Germany) Các phương pháp chiết xuất thông thường khác. Chiết xuất ở nhiệt độ thường (RTE) được thực hiện trên một cốc thủy tinh bằng cách trộn 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16ml nước. Ngâm hỗn hợp ở 25-29(C trong vòng 44 giờ, thường xuyên lắc đều. USE được thực hiện bởi bồn chiết siêu âm: 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch được trộn với 16ml nước trong bình nón, sau đó đem chiết siêu âm trong 40 phút. SHE được thử nghiệm bằng cách trộn 4,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 64ml nước trong 4 giờ. Thử nghiệm MAE với 1,0kg bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16l nước. Sau đó chỉnh nhiệt độ cho hệ thống là 60(C và thời gian chiết là 54 phút. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn.
Hình 5: Sơ đồ bố trí hệ thống MCE: A – G là các đơn vị chiết; 2 - bình chiết; 3 - bình dung môi; 4, 5, 8 là các vale đóng – mở; 6 – bơn tái tuần hoàn (re-circulating pump); K – đường ống chính nối các đơn vị chiết từ A đến G; 1, 7 – là các đường ống nối giữa bình dung môi với bình chiết và bơm. Các thiết bị sử dụng bao gồm các đơn vị chiết theo tuần tự từ A đến G, được nối với nhau bằng đường ống dẫn chung K, các đơn vị chiết có cùng một cấu trúc và kích cỡ bao gồm một bình chiết, một bình đựng dung môi và một bơm. Các đơn vị chiết được vận hành trong một chu trình khép kín, dung môi được bơm từ các vale ở đáy bình vào bên trong, hòa trộn với bột dược liệu và chảy ra khỏi bình qua vale ở phía trên và quay trở về bơm. Quá trình chiết xuất ngược dòng có thể phân ra 2 giai đoạn: đầu tiên, là giai đoạn điều hòa (Conditioning stage), sau đó là giai đoạn chiết (extraction stage). Trong giai đoạn điều hòa mẫu khoảng 300g rễ Cam thảo được trộn với một tỷ lệ tương ứng dung môi trong mỗi đơn vị chiết. Sau quá trình này, các bã dược liệu bên trong bình được tiếp tục chiết với một khoảng thời gian được ấn định trước. Những khoảng thời gian này khác nhau đối với những đơn vị chiết khác nhau và được thiết kế trước nhằm tạo ra một gradient nồng độ giữa các bình trong dãy. Ví dụ, gradient nồng độ cho việc chiết xuất 5 giai đoạn (five-stage extractor) thu được bằng cách ngâm các bã (bột – slurry) dược liệu trong các bình tương ứng A – E trong các khoảng thời gian 4T/6, 3T/6, 2T/6, T/6 và 0 phút, với T là tổng thời gian chiết xuất (total running time) của quy trình chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn. Sau thời gian ngâm, dịch chiết với đơn vị A được chuyển sang E, và dịch chiết của đơn vị B được đổi với dịch chiết của đơn vị D. Cùng lúc đó, dung môi mới được thêm vào đơn vị A. Gradient nồng độ của GA trong mẫu dược liệu và trong dịch chiết của các đơn vị chiết khác nhau được minh họa bằng hình sau:
Hình 6: Sơ đồ minh họa cho giai đoạn điều hòa (Conditioning stage): hình (() – bình chiết, (() – bình đựng dung môi chiết, (() – nồng độ GA tương ứng của dược liệu trong bình chiết và trong dung môi. Sau giai đoạn điều hòa là giai đoạn chiết (extraction stage), giai đoạn này được minh họa bằng sơ đồ bên dưới. Quá trình từ 1 đến 5 trong sơ đồ minh họa cho quá trình di chuyển của GA giữa dung môi và bã (bột) dược liệu trong từng quá trình liên tiếp. Trong mỗi quá trình bao gồm 4 công đoạn cơ bản. Hình 7: Minh họa cho một quy trình chiết – five stages MCE. Lấy quá trình 1 làm ví dụ, các công đoạn bao gồm: (1) chiết xuất dược liệu với thời gian định trước; (2) thay bã dược liệu của đơn vị A và thu gom dịch chiết của đơn vị E; (3) chuyển dung môi chiết trực tiếp từ C → E, A → C, D → A, B → D; (4) thêm lượng bột dược liệu mới vào A và dung môi mới vào B. Tiến trình này bao gồm các giai đoạn tiếp nối nhau và sơ đồ bên trên minh họa cho một chu kỳ đầu tiên, quá trình có thể tiếp tục diễn ra với sự bắt đầu một chu kỳ mới với các quá trình từ 1 đến 5. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao. Nồng độ GA trong dịch chiết được định lượng bằng HPLC. Trước khi phân tích, dịch chiết từ MCE và từ các phương pháp khác được quay li tâm 10 phút với tốc độ 12000 vòng/phút để loại bỏ tạp rắn. Cột được sử dụng là cột Kromasil KR100-5 C18 (150mm x 4,6mm). Pha động là CH3CN và nước, với 0,05% acid Trifluoroacetic. Pha động được lập trình để chạy gradient như Bảng 1. Tốc độ dòng được giữ hằng định (0,8ml/phút). Đầu dò mảng lưỡng cực (diode array detector - DAD) với bước sóng được thiết lập là 254nm. Tổng thời gian chạy sắc ký là 15 phút. Thời gian lưu của GA là 9,9 phút, và các peak thu được của quá trình sắc ký sẽ được trình bày bởi hình bên dưới. Đường tuyến tính nằm trong khoảng 0,6 -7,2µg GA. Đường chuẩn thu được là Y= 749,2m – 1,552 với hệ số tương quan r = 0,9999. Độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,22% (n = 5) Bảng 1: Chương trình chạy Gradient của HPLC   Thời gian  0  5  10  15   Acetonitrile (Vol.%)  20  40  50  50   0,05% Acid Trifluoroacetic trong nước (Vol.%)  80  60  50  50   Kết quả và thảo luận. Cơ sở lý thuyết của MCE. Trong các công trình nghiên cứu trước đây có rất ít các nghiên cứu về cơ sở lý thuyết của MCE. Hình bên dưới minh họa cho đường đi của nguyên liệu và dòng dung môi giữa mẫu và dịch chiết trong quá trình chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn. Trong bã cam thảo, một phần dung môi (nước) được tách ra từ mẫu cam thảo trong khi một phần khác được cố định lại tại thể rắn (phần bã) của cam thảo do sự hấp thu mạnh. V trong hình 8 đại diện cho thể tích của phần di động, lượng nước tách ra do thắng được lực hấp thụ. Thể tích nước cố định là L. Với x, y là nồng độ tương ứng của GA trong L và V.
Hình 8: Quá trình trao đổi của GA giữa bột nguyên liệu và dung môi chiết. Trong suốt quá trình MCE, L ở mỗi bình chiết có thể được xem như là một “giai đoạn” (staged) của pha tĩnh được chiết xuất liên tục bởi dòng dung môi V ở trên. Sau khi kết thúc quá trình chiết xuất, phần bã dược liệu được lấy khỏi bình chiết. Dung môi mới được thêm vào từ cuối của giai đoạn chiết thứ N, mà sau đó sẽ chảy từ phải sang trái và cuối cùng được lấy ra như là một sản phẩm chiết của giai đoạn chiết thứ nhất. Giả sử trong mỗi quá trình chiết đều đạt được trạng thái cân bằng ở mỗi giai đoạn, thì nồng độ GA của dung môi sẽ bằng với nồng độ GA còn lại trong bã dược liệu. Ta có: xi = yi (1) Ở giai đoạn thứ nhất ta có: L(x0 − x1) = V(y1 − y2) (2) Gọi R là tỉ lệ của V và L. Và AW là thể tích của lượng nước cố định trên mỗi đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g). m là khối lượng của mẫu cam thảo (g) và n là tỉ lệ của dung môi và cam thảo (ml/g). Ta có phương trình (3):
(3) Nếu Ki là hệ số phân bố của GA trong bột cam thảo và dung môi chiết thì Ki = yi / xi (i = 1, 2, … ,N) ( 1 vì xi = yi. Khi đó hệ số chiết (tỉ lệ khối lượng của GA chiết được từ bột cam thảo) có thể được viết lại như sau:
(4) Thế (1) (3) (4) vào (2) ta được phương trình (5):
(5) Chứng minh tương tự ta có các phương trình sau:
(6)
(7)
(8) Hiệu suất chiết (p), được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết được từ tổng khối lượng của GA trong dược liệu cam thảo được tính như sau:
(9) Đặt M =
, H=
. Thì phương trình (9) có thể đơn giản thành:
(10) Bởi vì trong dung môi mới không có GA nên y0 = 0. Nên ta có:
(11) Phương trình (11) cho thấy, hiệu suất chiết tỉ lệ thuận với M, hoặc có thể nói rằng hiệu suất chiết tỉ lệ thuận với n và tỉ lệ nghịch với AW. Ngoài ra hiệu suất chiết còn bị ảnh hưởng bởi các thông số khác như nhiệt độ, thời gian chiết, kích thước của mẫu cam thảo mà ảnh hưởng đến việc đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình MCE và thời gian để đạt được việc cân bằng đó. Trong các thảo luận ở trên, ta thấy rằng AW (thể tích của lượng nước cố định trên mỗi đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g) là một biến cần được xác định để tính toán hiệu suất chiết lý thuyết. AW được xác định thực nghiệm bằng cách trộn tương ứng 10, 15, 20, 25g bột cam thảo (gọi là m) với 40, 60, 80 và 100ml nước (gọi là V1) trong 4 bình nón 150ml. Giữ hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng (29(C) trong 60 phút. Phần nước không được hấp thu vào bột cam thảo được gọi là V2, đo bằng bình lắng gạn. AW (ml/g) được tính như sau: AW = (V1–V2)/m. Các giá trị đo được được liệt kê trong Bảng 2: Bảng 2: AW thực nghiệm của cam thảo   Khối lượng cam thảo, m (g)  10  15  20  25   Lượng nước thêm vào, V1 (ml)  40  60  80  100   Lượng nước gạn ra, V2 (ml)  20  35  46  55   AW (ml/g)  2,0  1,7  1,7  1,8   Từ dữ liệu thu được ta có AW trung bình là 1,8ml/g. Bởi vì rất khó để gạn hết lượng nước không được hấp thu trong quá trình thử nghiệm, nên thể tích thật của lượng nước không được hấp thu hơi lớn hơn những số liệu đã được liệt kê. Trong các tính toán của phương trình (11) ta sẽ sử dụng một giá trị xấp xỉ của AW = 2,0 ml/g. Giả sử rằng quá trình chiết đạt trạng thái cân bằng, hiệu suất chiết lý thuyết tính theo phương trình (11) ở các giai đoạn khác nhau với các tỉ lệ dung môi / dược liệu được liệt kê trong Bảng 3: Bảng 3: Hiệu suất chiết (% khối lượng) ở các giai đoạn   Tỷ lệ dung môi / dược liệu (ml/g)  Giai đoạn chiết thứ    1  2  3  4  5   6  67,70  85,70  93,30  96,70  98,40   8  75,00  92,30  97,50  99,17  99,70   10  80,00  95,20  98,80  99,70  99,90   Tối ưu hóa quá trình MCE. Các thảo luận ở trên cho ta thấy rằng số giai đoạn (N), tỉ lệ dung môi/dược liệu (n), nhiệt độ chiết (T) và thời gian chiết (t) là những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất chiết trong phương pháp MCE. Hiệu quả chiết sẽ được đánh giá bằng ba chỉ số xác định sẽ được thảo luận sau đây. Đầu tiên là hiệu suất chiết của GA (được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết ra được từ lượng GA có trong mẫu cam thảo thô). Ở đây tổng lượng GA có trong mẫu cam thảo thô được xác định bằng cách chiết xuất hoàn toàn, lặp đi lặp lại mẫu khô của cam thảo thô bằng phương pháp chiết siêu âm và sau đó định lượng bằng HPLC (3,72% như đã được nói đến ở 2.1.1.1.1). Chỉ số thứ hai là nồng độ cuối cùng của GA trong dịch chiết, bao gồm cả số lượng và chất lượng của GA chiết được trong cả quá trình chiết. Chỉ số cuối cùng là tốc độ, là thời gian cần thiết để đạt được hiệu suất cần thiết. Để tối ưu hóa các điều kiện trong quá trình chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn, phương pháp thiết kế mảng trực giao (orthogonal array design) được sử dụng, là một kỹ thuật thiết kế thử nghiệm giai thừa phân số (fractional factorial experimental design technique). Trực giao ở đây có nghĩa là cân bằng, có thể tách rời hoặc không có trộn lẫn, tức là trong khi một tác dụng của một yếu tố đặc biệt đang được tính toán thì ảnh hưởng của các yếu tố khác được loại bỏ. Do đó ảnh hưởng của riêng yếu tố đó được chọn ra một cách độc lập. Phương pháp thiết kế thử nghiệm mảng trực giao (orthogonal array design) được áp dụng là L9 (34): 4 yếu tố và 3 cấp độ. Thiết kế chi tiết được liệt kê trong Bảng 4. Kết quả của phương pháp thử nghiệm này sau khi được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) được tóm tắt trong Bảng 5 và Bảng 6. Bảng 4: Các yếu tố và cấp độ của phương pháp thử nghiệm trực giao L9 (34)   Cấp  Các yếu tố       A, N  B, n (ml/g)  C, T ((C)  D, t (phút)   1  5  6  30  60   2  3  10  50  30   3  7  8  70  90   Bảng 5: Thiết kế và kết quả của thử nghiệm trực giao.   No.  A  B  C  D   p(%)  y (µg/ml)   1  1  1  1  1   44  255,1   2  1  2  2  2   82  259,8   3  1  3  3  3   98  347,3   4  2  2  3  1   100  284,5   5  2  3  1  2   35  122,6   6  2  1  2  3   94  349,9   7  3  3  2  1   93  292,9   8  3  1  3  2   87  412,3   9  3  2  1  3   67  190,4            p (%)          K1/3  75  75  49  79      K2/3  76  83  90  68      K3/3  82  75  95  86      r  7  8  46  18      Tối ưu       A3B2C3D3             y (µg/ml)          K1/3  287  339  189  278      K2/3  252  245  301  265      K3/3  299  254  348  296      r  46  94  159  31      Tối ưu       A3B1C3D3    Bảng 6: Kết quả phân tích ANOVA   Nguồn  Tổng bình phương của phương sai  Bậc tự do  Ước lượng của phương sai  Chỉ số F  Tầm quan trọng    p  y   p  y   p  y   p  y   p  Y   N  98  3488   2  2   49  1744   1,0  2,4   -    n  122  16158   2  2   61  8079   1,2  11,1    *   T  3856  39832   2  2   1928  19916   39,3  27,4   **  **   t  511  1455   2  2   255  727   5,2  1,0    -   Error  98  1455   2  2   49  727         Total  4587  60933   8  8   2293  30466                         F0.01 (2, 2) =99.00 (***); F0.05 (2,2) = 19.00 (**); F0.1 (2, 2) = 9.00 (*). Bảng 5 và Bảng 6 chỉ ra rằng phương pháp MCE được dùng để chiết GA từ cam thảo chịu ảnh hưởng lớn bởi yếu tố nhiệt độ. Hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết thu được đều tăng đáng kể khi gia tăng nhiệt độ, được biểu thị bằng giá trị F rất cao 39,3 và 27,4 trong Bảng 6. Có thể là do GA dễ dàng hòa tan trong nước nóng và rất khó hòa tan trong nước mát. Quá trình chiết không thể đạt được trạng thái cân bằng khi nhiệt độ chiết nhỏ hơn 70(C. Bảng số liệu trên cũng cho ta thấy khi tăng tỉ lệ dung môi/dược liệu, nồng độ GA trong dịch chiết giảm đáng kể từ 339µg/ml ở tỉ lệ 6ml/g xuống còn 245µg/ml ở tỉ lệ 10ml/g, trong khi hiệu suất chiết chỉ chênh lệch một khoảng nhỏ 75% ( 83%. Hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết chỉ tăng nhẹ khi ta tăng thời gian chiết, như đã được liệt kê ở Bảng 5. Khi tăng nhiệt độ từ 60 đến 90 phút hiệu suất chiết chỉ tăng 7% tức là từ 79% đến 86%. Vì vậy việc tăng thời gian chiết vượt quá 60 phút không mang đến lợi nhuận nhiều. Số giai đoạn chiết cũng ảnh hưởng rất ít đến hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết, như đã được chỉ ra trong Bảng 6 với chỉ số F chỉ là 1,0 và 2,4. Theo như các số liệu trong Bảng 3 thì với tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g thì hiệu suất chiết lý thuyết đạt 98,4% với 5 giai đoạn, nhưng chỉ có 93,3% ở 3 giai đoạn. Vì vậy ta chọn số giai đoạn là 5 để được hiệu suất chiết cao hơn. Tóm lại điều kiện tối ưu của qui trình chiết xuất GA bằng phương pháp MCE là A1B1C3D1. Trong đó A1 biểu thị cho số giai đoạn chiết là 5, B1 biểu thị cho tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g, C3 biểu thị cho nhiệt độ chiết là 70(C và D1 biểu thị cho thời gian chiết là 60 phút. Ảnh hưởng của dung môi lên hiệu suất chiết GA. Các thuộc tính của dung môi được sử dụng để chiết và kết quả chiết được liệt kê trong Bảng 7. Các điều kiện tối ưu đã thảo luận ở trên được sử dụng để chiết GA bằng phương pháp MCE với bốn hệ dung môi khác nhau, cụ thể là nước tinh khiết (SW), 10% về khối lương của Ethanol trong nước (SE), 10% về khối lượng của Ethanol và 0,5% về khối lượng của Amoniac trong nước (SEA) và 0,5% về khối lượng của Amoniac trong nước (SA). Kết quả trong Bảng 7 chỉ ra rằng không có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất chiết của 4 hệ dung môi được thử nghiêm. Chính vì vậy nước tinh khiết được lựa chọn làm dung môi chiết vì cả tính an toàn lẫn tính kinh tế. Bảng 7: Hiệu suất chiết GA bằng các hệ dung môi khác nhau    Dung môi    SW  SE  SEA  SA   Hiệu suất chiết (% khối lượng)  97,2  97,8  98,3  98,6   So sánh với các phương pháp chiết khác. Bảng 8 so sánh hiệu suất chiết giữa phương pháp MCE với các phương pháp chiết xuất khác thường sử dụng trong phòng thí nghiệm. Dung môi được sử dụng là nước tinh khiết. Hiệu suất chiết của phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (97,2%) là cao nhất trong số tất cả các phương pháp, mặc dù thời gian chiết của phương pháp này (60 phút) cao hơn phương pháp MAE (54 phút) và USE (40 phút) nhưng vẫn còn thấp hơn nhiều so với phương pháp SHE (240 phút) và RTE (2660 phút). Lượng dung môi tiêu thụ trên mỗi đơn vị khối lượng của dược liệu của phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (6ml/g) cũng ít hơn nhiều so với các phương pháp khác (16ml/g). Bảng 8: So sánh các phương pháp chiết MCE, MAE, USE, SHE VÀ RTE   Phương pháp  Dung môi sử dụng (ml/g)  Thời gian chiết (phút)  Hiệu suất chiết (%)   MCE  6  60  97,2   MAE  16  54  86,6   USE  16  40  93,8   SHE  16  240  87,3   RTE  16  2660  87,3   So sánh phương pháp MCE với phương pháp chiết xuất một giai đoạn (SPE) có thể thực hiện bằng cách xem xét lại dữ liệu đã được liệt kê trong Bảng 3. Hiệu suất chiết của MCE là cao hơn đáng kể so với hiệu suất chiết của SPE ở tất cả các tỉ lệ dung môi/dược liệu. Chiết bằng SPE với nhiều chu kì thì năng suất tăng có giới hạn trong khi tốn kém rất lớn về chi phí và thời gian. Ví dụ ở tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g, hiệu suất chiết của MCE là 98,4% so với hiệu suất chiết của SPE chỉ 67,7% trong cùng thời gian chiết. Lặp lại thêm một lần nữa với phương pháp chiết SPE thì hiệu suất năng lên 85,7%, nhưng lại tăng gấp đôi thời gian và lượng dung môi sử dụng. Thể tích dung môi sử dụng cao hơn kéo theo việc gia tăng chi phí và làm giảm nồng độ của sản phẩm chiết được. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave –assisted extraction)[7]. Thiết kế thí nghiệm. Nguyên vật liệu: Rễ Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch) mua từ công ty Tongrentang medical. Nguyên liệu được chuẩn bị với 3 kích cỡ khác nhau, được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Nguyên liệu A: có kích thước lớn khoảng 5 – 10 mm và bề dày khoảng 3 –5mm; nguyên liệu B: Bột cam thảo thô, được nghiền và rây chọn cỡ hạt khoảng 5 – 10 mesh; nguyên liệu C: Bột cam thảo 50 mesh. Dung môi. Ethanol ( analytical reagent), amonia (25% NH3, chemical reagent), glacial acetic acid (analytical reagent), acetonitrile ( dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC), glycyrrhizic ammoniate (mua từ Viện y học và sinh phẩm Trung Hoa). Ngoại trừ các thí nghiệm về ảnh hưởng của thành phần dung môi lên tỷ lệ glycyrrhizic acid chiết xuất được, tất cả các dung môi đều được cấu tạo gồm: 60% ethanol + 1% amonia + nước. Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng: Lò vi sóng sử dụng trong gia đình (National, Japan, công suất cực đại 700W) được thiết kế lại với máy khuấy từ , sinh hàn, bộ phận ghi nhận nhiệt độ và kiểm soát thời gian. Rễ cam thảo được trộn với khoảng 100ml dung môi, như nước, ethanol, ethanol – nước, dung dịch amonia (với các nồng độ khác nhau) hoặc ethanol – nước – amonia. Hỗn hợp gồm rễ cam thảo và dung môi được chiếu xạ bằng lò vi sóng với điều kiện thiết kế: 15 giây chiếu xạ, 15 giây ngừng, lặp lại 3 lần; nhiệt độ khoảng 85 -90ºC sau đó chiếu xạ tiếp trong 3 giây để làm nóng và 15 giây ngừng chiếu xạ để làm mát, nhưng không được để quá sôi.
Hình 9: Sơ đồ thiết kế máy vi sóng dùng trong chiết xuất Phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Thông thường, phân tách các GA đạt được với cột sắc ký pha đảo RP – 18 và rữa giải với CH3-H2O-CH3COOH (60:34:6) với tốc độ dòng 2ml/phút hoặc cột Zorbax-ODS (150mmx4.6mm Du Pont) và rửa giải với CH3CN- 3%CH3COOH - H2O (47:53, v/v) ở bước sóng 248nm với tỉ lệ dòng tăng theo gradient. Trong thí nghiệm này, hỗn hợp sau khi chiết xuất được bằng MAE được ly tâm và lọc với màng lọc xốp (khoảng 0.5µm) sau đó đem đi phân tích. Quá trình phân tách thực hiện với cột bảo vệ Zorbax-SB và cột sắc ký Zorbax-ODS (5µm, 4.6mm×150mm) và rửa giải với hệ dung môi CH3CN-3%CH3COOH – H2O (41:59, v/v) phát hiện ở bước sóng 248nm với tốc độ dòng 1ml/phút. Thời gian lưu của GA khoảng 4.35 phút. GA được phân tách hoàn toàn khỏi các hợp chất khác. Khoảng tuyến tính từ 0.1 đến 2µg của ammonium glycyrrhizinate. Phương pháp này có RSD là 1.55% (n=7). Quá trình phân tích hoàn tất trong 20 phút.
Hình 10: Đường chuẩn của ammonium glycyrrhizinate. Kết quả và thảo luận. Ảnh hưởng của pH đến tỷ lệ phần trăm GA chiết được. Hình 11 và 12 cho thấy ảnh hưởng của thời gian chiết xuất lên tỉ lệ phần trăm chiết xuất được của GA bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) và chiết xuất ở nhiệt độ phòng (ERT-extraction at room temperature). Kết quả chỉ ra rằng phần trăm lượng hoạt chất chiết được tăng lên với sự tăng lên của thời gian chiết. Đặc biệt là, khi nguyên liệu A là những mảnh lớn của rễ cam thảo, MAE có thể làm giảm thời gian chiết xuất một cách có ý nghĩa để đạt đến cùng một tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được. MAE đạt đến tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được cao hơn trong khoảng thời gian từ 4-5 phút so với ERT ( từ 20 -24h). Các nguyên liệu thường sử dụng để chiết xuất trong công nghiệp thường có kích thước lớn. Do đó những thử nghiệm tiếp sau sử dụng nguyên liệu A để tiến hành.
Hình 11: Ảnh hưởng của thời gian MAE đến % GA chiết được (dung môi: 100ml; nguyên liệu: 10 g).
Hình 12: Ảnh hưởng của thời gian ERT đến % GA chiết được (dung môi: 30ml; nguyên liệu: 3 g).
Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến % chiết xuất của GA – MAE: (dung môi: 100ml, nguyên liệu A: 3g, chiết xuất trong 4 phút ở nhiệt độ khoảng 85 – 90ºC); ERT: (dung môi: 30ml, nguyên liệu A: 3g, chiết trong 20h ở nhiệt độ phòng (khoảng 10±1ºC)). Ảnh hưởng của thành phần dung môi lên tỷ lệ phần trăm GA chiết được. Hình 13 cho thấy tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được chịu ảnh hưởng khá lớn bởi nồng độ ethanol. Khi phần trăm về thể tích của ethanol trong dung môi thấp, tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được tăng lên cùng với sự tăng của nồng độ ethanol. Khi tỷ lệ phần trăm về thể tích của ethanol trong dung môi chiết xuất ở mức cao hơn, tỷ lệ phần trăm của hoạt chất chiết được giảm xuống đáng kể với sự tăng lên của nồng độ ethanol từ 60-100%(v/v). Tỷ lệ phần trăm các chất chiết được ở mức cao nhất đạt được ở tỷ lệ 50-60%(v/v) ethanol không có sự hiện diện của amonia. GA tồn tại dưới dạng kết hợp với muối calcium và potassium trong rễ cam thảo, dạng này rất dễ hòa tan trong nước hoặc trong ethanol. Nếu trong dung môi chiết xuất thêm vào 2% amonia, GA tạo thành dạng glycyrrhizic ammoniate với amonia, vì thế, dễ dàng đạt đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được ở mức cao trong khoảng nồng độ ethanol từ 0-60%(v/v). Tuy nhiên, tinh bột, đường và các protein tan trong dung môi chiết xuất có độ cồn thấp, điều này gây khó khăn trong việc ly tâm và lọc. Vì vậy, nồng độ ethanol được sử dụng được lựa chọn là 50-60%. Tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được cũng tăng lên cùng với sự tăng của nồng độ amonia. Trong nước, 50 hoặc 60% ethanol, tỷ lệ amonia từ 1-2%(v/v) đủ để quá trình chiết xuất đạt đến hiệu suất cao. Hình 13 cũng cho thấy phần trăm GA chiết xuất được tăng lên có ý nghĩa với 2% amonia(v/v) được thêm vào. Nếu nồng độ của ammonia trên 2%, điều này không thuận lợi cho các quá trình xử lý tiếp sau, điều kiện tiến hànhthực nghiệm sẽ trở nên khó khăn hơn. Nồng độ ammonia 1 -2 % là tối ưu cho các thử nghiệm. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được. Bảng 9 cho thấy tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được tăng lên với sự tăng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Tuy nhiên, phải tốn thêm năng lượng và thời gian để xử lý dung môi ngâm chiết ở các tỷ lệ cao. Bởi vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu(ml/g) thích hợp là 10:1. Bảng 9: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu lên hiệu suất chiết bằng MAE. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g)  5:1  10:1  15:1  20:1   Tỷ lệ GA chiết xuất được (%).  1.88  2.26  2.45  2.58   So sánh với các phương pháp chiết xuất khác. Hình 14 trình bày 6 phương pháp chiết xuất cùng đạt đến một tỷ lệ chiết xuất GA tương đương nhau trong cùng một điều kiện kích thước nguyên liệu. Đồng thời, sơ đồ cũng cho thấy rằng kích thước nhỏ (C) dễ dàng đạt đến hiệu suất chiết xuất cao hơn 2 kích thước còn lại. Kích thước của nguyên liệu là một nhân tố chính ảnh hưởng đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được. Từ những điều kiện thực nghiệm, có thể thấy được rằng nếu cùng một tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được, chiết xuất đung hồi lưu cần 4.5 h và 260ml dung môi; chiết xuất có hỗ trợ siêu âm cần 20.5h; chiết xuất bằng Soxhlet cần 10h và 200ml dung môi; Soxhlet-MAE cần 5.07h và 300ml dung môi; ERT cần 20h và 100ml dung môi; MAE chỉ cần 4 phút và 100ml dung môi. Chính vì lý do tiết kiệm đáng kể dung môi và thời gian chiết xuất, phương pháp MAE thích hợp cho việc chiết xuất GA từ rễ cam thảo.
Hình 14: So sánh phương pháp MAE và các phương pháp khác: rễ cam thảo: 10 g; Chiết hồi lưu: tiến hành 3 lần (lần 1, 100ml dung môi, 1.5 h; lần 2, 80ml dung môi, 1.5 h; lần 3, 80ml dung môi, 1.5 h); chiết siêu âm: 100ml dung môi, siêu âm 30min sau khi ERT trong 20 h; chiết Soxhlet: 200ml dung môi, chiết trong 10 h; Soxhlet-MAE: 200ml dung môi, chiết trong 5 h, sau đó lọc, dung dịch chiết được phân tích bằng HPLC và phần bã được chiết với 100ml dung môi trong 4 phút bằng MAE; ERT: 30ml dung môi; nguyên liệu: 3 g, chiết trong 20 h; MAE: 100ml dung môi, chiết trong 4 phút. Trong cấu trúc của GA, có 3 nhóm carboxyl (-COOH) và 5 nhóm hydroxyl ( - OH), do đó GA rất phân cực và dễ hấp thụ vi sóng. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP. Phân lập và tinh khiết hóa bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ[8]. Phương pháp chiết bằng dung môi, với những thuận lợi về kỹ thuật phát triển, dễ tiến hành, hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian, được sử dụng rộng rãi để điều chế và phân lập những hợp chất có hoạt tính trong ngành dược. So sánh với những tác nhân chiết khác, tác nhân chiết dẫn xuất phosphor hữu cơ trung tính và rượu thì thích hợp sử dụng vì ít độc. Thí dụ, sự chiết leucine và isoleucin với di-(2-ethylhexyl)-phosphoric acid (P204), thu hồi acid malic, fumaric acid và hyroxyacetic với trialkylphosphine oxide (TRPO), phân lập penicillin G với tributyl phosphate (TBP), sự thu hồi theophyline với 2-ethyl-hexanol và sự chiết xuất spriamycin với capryl alcohol hoặc rược từ dầu dừa đã được báo cáo. GA, một acid yếu và bao gồm acid glycirrhitinic và acid glucuronic, có 3 nhóm carboxyl và 5 nhóm hydroxyl. Những nhóm phân cực này có khả năng tương tác với những nhóm chức của tác nhân chiết thông qua liên kết hydrogen. Từ đó, những phân tử GA có thể được chiết vào trong dung môi hữu cơ từ dịch chiết nước và phân tách chọn lọc từ những tạp chất. Thiết kế thí nghiệm Nguyên liệu, phương pháp. Rễ cam thảo thô được mua tại Inner- Mongolia, Trung Quốc, và được cắt nhỏ tại phòng thí nghiệm. Mẫu chuẩn GA và muối mono-ammonium của nó được mua từ viện nghiên cứu thuốc và chế phẩm sinh học Trung Quốc. GA và muối mono-amonium của nó (UV, 98%, công ty Yu Jiu, Thượng Hải) được sử dụng mà không cần tinh khiết thêm trong giai đoạn chiết bằng dung môi ban đầu. Nước và acetonitrile được sử dụng trong phân tích HPLC. Acid acetic, ethanol khan, 2-ethyl-hexanol, n-hexanol, TBP, TRPO và ether dầu hỏa là loại thương mại và đạt tiêu chuẩn dùng trong phân tích. Dịch chiết ngấm kiệt cam thảo có được bởi phương pháp chiết hỗ trợ vi sóng. Lò vi sóng (Nhật Bản) sử dụng trong gia đình được điều chỉnh để sử dụng trong phòng thí nghiệm. Bột rễ cam thảo (khoảng 5g) được trộn với nước cất (100 ml) và sau đó được chiếu xạ bằng máy vi sóng (700 W) tại áp suất thường trong khoảng 4 phút tại điểm sôi (khoảng 100ºC ). Dịch đối chứng được chuẩn bị bằng cách hòa tan GA chuẩn trong nước cất. Sự chiết bằng dung môi được tiến hành trong becher với máy khuấy từ (khoảng 500 rpm). Dịch chiết cam thảo hoặc dịch đối chứng được trộn với dung môi chiết và điều chỉnh pH của hỗn hợp bằng acid HCl (2M) đến pH xác định. Sự phân tách pha nước từ pha dung môi hữu cơ dễ dàng đạt được với máy ly tâm. Thể tích của mỗi pha được đo lường và lượng GA trong mỗi pha được phân tích với HPLC. Tiến trình tinh khiết được tiến hành trong một becher với máy khuấy từ (500 rpm), pha hữu cơ chứa GA được trộn với nước cất. pH của hỗn hợp được điều chỉnh với NaOH 1M. Sự phân tách giữa pha nước và pha hữu cơ được thực hiện bởi sự sa lắng trọng lực. Thể tích của mỗi pha được đo lường và lượng GA trong mỗi pha được phân tích với HPLC. Phân tích HPLC Pha nước sau khi chiết hoặc tinh khiết được hòa loãng với nước cất và sau đó được điều chỉnh đến pH 7 để phân tích HPLC. Ethanol khan được sử dụng như là dung môi cho pha hữu cơ. GA trong dịch nước và trong dung môi hữu cơ được phân tích bởi HPLC với cột bảo vệ Zorbax-SB và cột phân tích Zorbax-ODS (5μm, 150mm×4,6mm, Du Pont). Pha động bao gồm acid acetic: acetonitrile: nước ( 3:41:59, v/v), tốc độ dòng 1ml/min. Hệ thống HPLC là hệ thống sắc ký lỏng HP 1090, với thiết bị bơm tư động và đầu dò diode array (DAD). Phát hiện tại bước sóng 248nm, được dùng để định lượng tại nhiệt độ thường. Thời gian lưu của GA là 4.2 phút. Lượng GA trong dịch chiết được xác định bởi sử dụng diện tích đỉnh và diện tích dưới đường cong so sánh với đường chuẩn bởi tiêm dịch GA chuẩn trong pha động với lượng từ 0,1 μg đến 2,5 μg. Thành phần phần trăm của GA trong dịch chiết và sau khi chiết kiệt được xác định bởi : %GA chiết được (% ) =
V0C0 : thể tích và nồng độ GA trong pha hữu cơ sau khi chiết bằng dung môi, ml và mg/ml ViCi: thể tích và nồng độ GA trong dịch ngấm kiệt lúc ban đầu trước khi chiết với dung môi, ml và mg/ml % GA sau khi tinh chế (%) =
Va,Ca: thể tích và nồng độ GA trong pha nước sau khi tinh chế, ml và mg/ml. Vio, Cio: thể tích và nồng độ GA trong pha dung môi hữu cơ trước khi tinh chế, ml và mg/ml. Chuẩn bị mẫu cho quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền (TEM). Sự chuẩn bị mẫu cho TEM được thực hiện với kỹ thuật của Freezing- Etch Replica. Sự đông lạnh được tiến hành bởi nhỏ thuốc thử hữu cơ chứa GA trong nito hóa lỏng. Sau khi làm nứt mẫu đông lạnh trong bình chân không ( máy cô quay chân không JEE-4X), mẫu được tạo bởi bốc hơi lớp mỏng platinum và lớp carbon trên thuốc thử hữu cơ được làm nứt. Lớp mỏng platinum được bốc hới dưới góc 45º trong khi lớp carbon được bốc hơi dưới góc 90○. Bước tiếp theo của sự bốc hơi platinum và carbon, mẫu đông lạnh nằm dưới bản sao được làm tan với ethanol trong khi lớp platinum và carbon thì trơ. Sau đó được rữa bởi nước cất, bản sao được làm sạch cuối cùng được phủ lên bởi lớp mắt lưới mạ đồng để sử dụng cho chọn lọc phần mỏng và sẵn sàng để quan sát với TEM (JEM-100X electron microscope). Đo quang phổ và đo độ nhớt. Quét phổ UV với khoảng cách bước sóng 1nm đươc ghi nhận trên máy đo quang phổ (Perkin Elmer) Lambda Bio 40 UV/ vis. Độ nhớt dung dịch nước của GA được đo với máy đo độ nhớt Ubbelohde. 2.3.1.2. Kết quả và thảo luận. 2.3.1.2.1. Sự chiết GA trong dung dich đối chứng với pH khác nhau. Hình 15 chỉ ra pH có ảnh hưởng sự chiết GA trong dung dịch đối chứng. Tăng pH dẫn đến giảm phần trăm GA chiết được ở tất cả dung môi chiết. Đối với 2- ethylhexanol, phần trăm GA chiết được là trên 90% tại pH = 2, nhưng giảm còn 0 với pH > 6. Đối với n- hexanol, GA có thể được chiết hầu như hoàn toàn vào pha hữu cơ với pH 7. Đối với TBP và TRPO kết quả tương tự, phần trăm GA chiết được giảm từ 90% đến 0 với sự tăng pH . Những vùng pH mà phần trăm GA thay đổi nhanh chóng thì khác nhau một ít, đối với TBP pH = 4,5-6,5 và đối với TRPO pH = 5,5-7.
Hình 15. Ảnh hưởng của pH trên sự chiết GA trong dung môi( điều kiện: pha hữu cơ / pha nước = 10ml/10ml; khuấy từ trong 3 phút ; đối với 2- ethylhexanol và n- hexanol nồng độ GA trong dịch là 0,8 mg/ml, t = 290C; đối với TBP nồng độ GA trong dich là 0,87 mg/ml, t = 25,50C; đối với TRPO nồng độ GA trong dịch là 0,92 mg/ml, t = 21,5 0C) Bởi vì GA là một acid yếu, điều đó hợp lý để suy ra rằng dưới môi trường acid GA tồn tại dưới hình thức không ion hóa, dung dịch có độ nhớt cao bởi vì sự hình thành liên kết hydrogen liên phân tử giữa các nhóm carboxylic. Tương tự dưới môi trường base, GA tồn tại dưới dạng ion hóa, dung dịch có độ nhớt thấp hơn bởi vì không xuất hiện liên kết hydrogen liên phân tử. Sự khác nhau về độ nhớt của dịch chiết nước chứa muối mono- ammonium của GA (khoảng 0,75 mg/ml) đối với pH đã được khảo sát. Trong hình 16 (đường nối được tạo bởi phương pháp B-Spline với phần mềm origin 7, nên nó không đi ngang qua điểm cao nhất).
Hình 16. Ảnh hưởng của pH lên tính nhớt của dung môi ( điều kiện: muối mono- ammonium của GA là 0,75 mg/ml, t = 300C) Có thể thấy rằng khi pH 5, GA thân nước được chiết trở lại với pha nước sau đó.
Hình 17: ảnh hưởng của pH trong quá trình tinh khiết GA trong dung môi chiết (điều kiện: pha hữu cơ/pha nước = 10ml/10ml; máy khuấy từ, 5 phút; nồng độ của GA trong 2- ethylhexanol, n-hexanol, TBP và TRPO lần lượt là 0,97mg/ml; 1,01mg/ml; 0,88mg/ml; 1,13mg/ml; T= 27,5ºC; đối với TRPO T= 180C.