Chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ đậu nành (Glycine max)

ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta có được những điều kiện thuận lợi về vị trí địa lý và khí hậu nên nguồn dược liệu phong phú là một trong những lợi thế để ngành Dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y học cổ truyền , thuốc có nguồn gốc dược liệu. Mặt khác, các chế phẩm dược liệu có tính an toàn và đạt hiệu quả điều trị không kém so với các chế phẩm tân dược. Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (Glycine max) là loại cây họ Đậu (Fabaceae) giàu hàm lượng chất đạm protein. Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng. Từ trước đến nay, sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara... đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người. Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra flavonoid, là những chất chống oxy hóa, có nhiều trong các loại thực phẩm khác nhau như trái cây, rau củ, thảo mộc, ngũ cốc và chocolate, rất tốt cho sức khỏe con người. Trong cây cỏ, flavonoids giúp điều hoà sự sống và tăng trưởng, chống tác dụng nguy hại của ánh sáng cực tím. Tiến sĩ Catherine Rice Evans thuộc International Antioxidant ResearchCentre, Luân Ðôn báo cáo rằng: genistein và daidzein thuộc nhóm isoflavones có khả năng chống oxi hóa hữu hiệu nhất. Năm 1989, Viện Nghiên Cứu Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National CancerInstitute, NCI) đã trợ cấp cho chương trình 5 năm nghiên cứu về những thực phẩm ngăn chận ung thư. Qua đó, giới khoa học gia khám phá ra đậu nành là một thực phẩm đặc biệt, vừa bổ dưỡng vừa có thể ngăn ngừa bệnh ung thư. Người Á Ðông nhờ ăn nhiều đậu nành, nên có tỷ lệ bệnh ung thư thấp hơn người dân Mĩ gấp 4 lần. Theo nghiên cứu của các bệnh viện, thực đơn với đậu nành có thể làm hạ thấp cholesterol dưới mức mục tiêu. Phytoestrogen là thành phần có thể gặp với hàm lượng tương đối cao ở nhiều thực phẩm quen thuộc của dân cư châu Á, đặc biệt trong đậu nành và các thực phẩm được chế biến từ đậu nành. Phytoestrogen trong đậu nành, là isoflavones có cấu trúc hóa học rất gần với estrogen, một nội tiết tố nữ, có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ xương, bằng cách làm giảm tỷ lệ tiêu hao xương và kích hoạt hình thành các tế bào tạo xương. Đậu nành đang được nghiên cứu vì nó có khả năng bảo vệ cơ thể trước nguy cơ bệnh Alzheimer, tiểu đường type 2, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, giảm các triệu chứng mệt mỏi của phụ nữ ở tuổi mản kinh. Vì thế, phụ nữ Châu Á ít bị bệnh tim mạch hơn phụ nữ Mỹ và châu Âu. Bên cạnh đó, flavonoid từ thực phẩm đậu nành hoạt động như chất chống viêm trong phổi và giúp phòng chống các tác nhân gây ung thư của thuốc lá. Ðậu nành cũng tạo ích lợi cho nam giới. Ðậu nành bảo vệ nam giới tránh bệnh ung thư tuyến tiền liệt (prostate gland). Do genistein ngăn cản sự tăng trưởng của bướu. Theo tiến sĩ Wing-Ming Keung của đại học Harvard thì các hoạt chất của isoflavones ngăn cản không cho kích thích tố nam bị phá hoại. Ngoài ra, đậu nành cung cấp vitamin B, amino axit và chất béo có lợi cho tim. Mặc dù trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây đậu nành, nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học trong đậu nành, đặc biệt là các isoflavonoid. Hơn nữa, nguồn nguyên liệu đậu nành ở Việt Nam rất đa dạng và có giá trị sinh học cao. Từ những lí do trên, đề tài “chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ đậu nành (Glycine max)” được xây dựng. Phần I : TỔNG QUAN VÀI NÉT VỀ CÂY ĐẬU NÀNH Tìm hiểu chung về cây đậu nành Đậu nành có tên khoa học là Glycine max L, thuộc họ đậu (Fabaceae), còn được gọi là đậu tương hay đại đậu . [1]trên thới giới có 1000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng và kinh tế rất cao.[2,3] Đậu nành là loại cây thân thảo, hằng năm. Thân cây mảnh, cao từ 0.8-0.9m, có lông, cành hướng lên phía trên. Lá mọc cách có ba lá chét hình trái xoan, mũi gần nhọn, không điều ở gốc. hoa có màu trắng hay tím sếp thành chùm ở nách cành. Quả thõng, hình lưởi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu vàng, thắt lại ở giữa các hạt. các hạt thứ 2, 3, 5 gần hình cầu, các hạt còn lại hình thận dài, có màu vàng gơm nhạt, [1] ở nước ta phân biệt rỏ ràng đậu nành (hạt màu vàng nhạt) với đậu đen, đậu đỏ nhưng trong các tài liệu thực vật nước ngoài người ta miêu tả hạt đậu nành có thể màu vàng, đỏ, lục hay đen với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà Lan cho tới lớn nhất như trái anh đào.[1,3] Theo từ điển thực phẩm, đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc, sau đó được truyền bà sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, vào nhiều thế kỷ sau đó có mặt ở các nước Á Châu như Thái Lan, Malaixia, Hàn Quốc, Việt Nam… Từ cổ xưa đậu nành đã được sử dụng ở những nước này làm thực phẩm. Cây đậu nành có mặt ở Châu Âu vào đầu thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ vào thế kỷ 18, việc trồng trọt bắt đầu phát triển lớn ở Liên Xô củ nhưng phát triển nhanh chóng tại những nước Châu Mỹ: những nước thuộc miền trung và đồng bằng sông Mitsixipi.[1,2,3]. Theo tài liệu [4]đậu nành có nguồn gốc ở phía Bắc và Đông Châu Á, là một trong những thực phẩm quan trọng. Đậu nành có thể dể trồng trong suốt mùa hè và mùa thu, trồng xen trên các cánh đồng lúa. Ngày nay, Hoa Kì là quốc gia đứng đầu sản xuất đậu nành chiếm 50% sản lượng trên toàn thế giới, rồi đến Trung Quốc, Ấn Độ. Cây đậu nành là một trong năm cây thực phẩm quan trọng ở Hoa Kì, theo số liệu thống kê của bộ nông nghiệp Hoa Kì năm 2008 diện tích trồng cây đậu nành chuyển gen chiếm 92% trong tổng diện tích trồng cây đậu nành trên cả nước.[2].


Một số ứng dụng chính từ đậu nành Xưa nay, đậu nành vẩn được các nhà dinh dưỡng học đánh giá rất cao vì giàu protit và lipit. Trong 100g đậu nành có từ 34-40g protit và khoảng gần 20g lipit, nhiều hơn bất cứ loại thịt động vật nào. Chất protein trong đậu nành ở đưới dạng các casein thực vật không khác với casein động vật có trong sữa, có đầy đủ các axic amin cần thiết cho sự phát triển và duy trì cơ thể con người. ngoài ra, đậu nành còn rất giàu vitamin và khoáng chất. Từ đậu nành, nhân dân ta đã chế biến nhiều thức ăn ngon như : Bột đậu nành, sữa đậu nành, đậu phụ, tào phớ, tương…[5] Hạt đậu nành có giá trị và kinh tế rất cao. Cùng một mẫu đất, số thu hoạch chât đạm đậu nành nhiều hơn 33% với bất kỳ một thứ nông sản nào khác. Hàm lượng protein của đậu nành cũng cao hơn của thịt, cá và gần gấp đôi các loại đậu khác.[2] Đậu nành chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu khác nên được coi là loại cây cung cấp dầu thảo mộc. Chất béo lipit của đậu nành có chứa một tỷ lệ cao chất fatty axid không bão hòa, có mùi vị thơm ngon, cho nên dùng dầu đậu nành thay thế cho mở động vật.[2] Dầu đậu nành còn được sử dụng để nghiên cứu tổng hợp biodiezen trên xúc tác NaOH/MgO. Biodiezen là nhiên liệu sinh học nhằm thay thế cho nhiên liệu diezen khoáng đang ngày càng cạn kiệt.[6] Ở Trung Hoa, Nhật Bản và Hàn Quốc người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn một nửa loại thực phẩm được chế biến theo phương pháp cổ truyền dưới dạng tươi, khô và lên men cho đến các sản phẩm hiện đại bằng kỉ thực mới như: cà phê, thịt chay nhân tạo, socola…[2] Ngày nay, tại các nước Á Châu, đậu hũ được xem là thức ăn hằng ngày và coi như một nền văn hóa Á Đông giống như văn hóa Humburger của Hoa Kì vậy.[2] Đậu nành sau khi đã ép lấ dầu, người ta dùng bã Đậu chế biến thành thức ăn nuôi gia súc. Ở những quốc gia phát triển, họ dùng đậu nành vào các kỹ nghệ khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, sơn, xà phòng, chất tơ nhân tạo, chất nhiên lỏng, dầu làm trơn trong kỹ nghệ hàng không ….[2]. Bột đậu nành sau khi đã loại dầu hay nước đậu nành sau khi đã tinh chế được dùng chế men ureaza, thuốc thử đặc hiệu đối với Ure trong hóa sinh.[1] Cây đậu nành còn có khả năng tồn trữ chất đạm của khí trời và làm giàu chất đạm cho đất. Do đó kỹ nghệ trồng cây đậu nành không những không làm hư đất mà còn làm cho đất thêm màu mỡ.[2] Ngoài giá trị dinh dưỡng, đậu nành và những món ăn chế biến từ đậu nành còn có giá trị phòng và chữa bệnh.[5] Đậu nành có tác dụng làm cho cơ thể con người trẻ lâu sung sức, tăng thêm trí nhớ và tái tạo các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng cho cơ thể[2]. Trong Y dược, bột đậu nành (đã làm mất mùi bằng hơi nước) trộn với bột ngũ cốc, ca cao dùng làm thức ăn cho trẻ sơ sinh, người bệnh tiểu đường, người bị thấp khớp, bệnh gút, người mới ốm dậy, người lao động quá sức.[1] Lexitin và casein dùng riêng hay phối hợp làm thuốc bổ dưỡng làm ta dược Stigmasteron dùng trong tổng hợp progesterone[1] Trong công nghiệp dược phẩm, bột đậu nành được dùng chế môi trường nuôi cấy nấm mốc kháng sinh chế biến một số axit amin như acginin, axit glutamic bằng thủy phân acid bột đậu nành.[1] Các nhà khoa học còn khám phá ra các hóa thảo mộc đậu nành có đặc tính chống lại các mầm ung thư như: ung thư vú, ung thư kết tràng, ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư nhiếp hộ tuyến.[2,3,7] Hơn thế nữa, đậu nành có khả năng làm hạ cholesterol trong máu những người bị xơ vữa động mạch, phòng ngừa các chứng bệnh về tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh xốp xương, bệnh thận…[5,2] THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG ĐẬU NÀNH Theo GS. Ðỗ Tất Lợi [1], toàn cây chứa 12% nước, 16% gluxit, 14-15% protein, 6% muối khoáng và các chất khác không có nito. Hạt cây là thành phần có giá trị sử dụng nhất vì nó không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết mà còn tồn tại các hoá thảo mộc có tác dụng phòng ngừa và trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời đại như: bệnh ung thư, các bệnh liên quan đến tim mạch. Các thành phần có giá trị dinh dưỡng trong đậu nành Protein: Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hạt Đậu nành có giá trị dinh dưỡng rất cao. Người ta đã xác định thành phần protein trong hạt Đậu nành chứa đầy đủ 8 loại amino axit thiết yếu : tryptophan, threonine, isoleuxin, valin, lysin, methionin, phenylalanin và leucin. Hàm lượng của các chất amino axit này tương đương với hàm lượng của các chất amino axit trứng gà đặc biệt là tryptophan gần gấp rưỡi của trứng. [2,7]. Protein trong hạt Đậu nành chứa khoảng trên 38% tuỳ loại, hiện nay nhiều giống Đậu nành có hàm lượng protein đặc biệt cao tới 40-50%. Có những chế phẩm của Đậu nành mang tới 90-95% protein, dây là nguồn protein thực vật có giá trị cao cung cấp cho con người. [3] Protein của Đậu nành dễ tiêu hoá, không có cholesterol và ít chất béo bão hoà thường có nơi thịt động vật. Hàm lượng protein của Đậu nành cũng cao hon cả thịt cá và gần gấp đôi các lọai Đậu khác. [2] Chất sinh tố và chất khoáng. Không chỉ giàu protein hơn bất cú loại thực phẩm nào, kể cả thịt động vật. Ðậu nành còn rất giàu chất sinh tố và chất khoáng như: sắt, canxi, photpho, kẽm, các vitamin nhóm B: B1, B2, B3, B6 ngoài ra còn có vitamin E. Trong Ðậu nành còn chứa nhiều chất xơ rất tốt cho tiêu hoá. [2,3] Theo GS. Ðỗ Tất Lợi [1], hạt Ðậu nành chứa trung bình 8% nước, 4-5% chất vô cơ, trong đó rất nhiều Kali 2%, Natri 0,38%, Canxi 0,23%, photpho 0,65%, Magiê 0,24%, lưu huỳnh 0,45%. Ðậu nành chứa các vitamin tan trong nước như: các vitamin B1, B2, B3, B6; vitamin PP và chứa các vitamin tan trong dầu như: vitamin A, vitamin D, vitamin E (trong Ðậu nành ở châu Á và châu Mỹ), vitamin K, vitamin F không có vitamin C. Các vitamin A và D xuất hiện khi hạt mới chín, sau đó bị men oxy hoá phá hủy. Trong nhóm vitamin B, Ðậu nành chứa lượng vitamin B1 gấp 3 lượng vitamin B1 trong sữa bột và trong bột những loại hạt Ðậu khác chứa tinh bột, lượng vitamin B2 chứa ít hơn trong sữa bột khoảng 1/3 nhưng lại gấp 6 lần so với một số loài Ðậu khác. Chất béo và chất cholesteron. Ðậu nành là thực phẩm nhiều protein nhưng lại ít calorit, ít chất béo bão hoà và hoàn toàn không có cholesteron. [2] Chất béo chiếm khoảng 15-20% có khi đạt tới 23%. Tỷ lệ phần trăm của các glyxerit axit béo: linolein 49,3%, olein 32%, linolenin 2%, panmitin 6,5%, stearin 4,2%, aracgidin 0,7%, lignoxerin 0,1% và 0,5% axit panmitoleic. [1] So sánh với các loài Ðậu khác thì Ðậu nành có chứa các axit béo thiết yếu cao hơn, tổng số chất béo chứa khoảng 18%, thành phần cacbonhydrat chiếm 31%.[8] Dầu đậu nành Dầu đậu nành thuộc loại dầu khô như dầu hạt lanh, chứa khoảng 14% chất béo bão hoà, 59% chất béo không bão hoà đa tính, 23% chất béo không bão hoà đơn tính. Trong số lượng chất béo không bão hoà đa tính lại chứa 8% linoleic axit (omega – 3- fatty acid), hiếm có trong các thực phẩm nguồn gốc thực vật. [1,2] Trong dầu béo Ðậu nành còn có photpholipit chủ yếu là lexitin 1-5%. Lexitin hoặc nằm trong dầu béo (tách ra bằng lạnh), hoặc còn nằm trong phần bã (tách ra bằng dung môi bay hơi). Ngoài ra dầu béo còn có các chất steron nhu: stigmasteron, sitosteron và một số sapogenon khác. [1] Thành phần hoá thảo mộc trong Ðậu nành Ðiều làm các nhà khoa học thích thú nhất trong những năm nghiên cứu gần đây là sự khám phá ra các hoá thảo mộc có trong Ðậu nành và những ứng dụng của chúng trong linh vực y khoa trị liệu. Viện ung thư quốc gia Hoa Kì, viện đại học Havard, viện đại học Alabama, Minnesota, Helsinki và Finland đã thực hiện nhiều công trình khảo cứu khoa học đã xác định những lợi ích của các hoá thảo Đậu nành. Họ đã thấy rằng sự tiêu thụ những chất này không những có khả năng ngăn ngừa mà còn có khả năng trị liệu một số bệnh như: bệnh đau tim, bệnh tai biến mạch máu não, ung thư vú, ung thư nhiếp hộ tuyến và ung thư kết tràng…[7] Protease inhibitor Năm 1980, Dr. Walter troll thuộc trường đạii học y khoa New York university Medical Center đã khám phá ra rằng Đậu nành nguyên sơ có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển trên các loài động vật, do tác động của chất protease inhibitors. Tiếp sau đó, nhiều nhà khoa học đã khảo sát và thử nghiệm chất protease inhibitors Đậu nành trong phòng thí nghiệm và thấy rằng nó có tác động chống lại sự phát triển mầm ung thư kết tràng, ung thu phổi, ung thu miệng… Protease inhibitor ngăn ngừa sự tác động của một số gen di truyền gây nên chứng ung thư. Nó cung bảo vệ các tế bào cơ thể không cho hư hại, gây nên bởi sự tác động của môi trường xung quanh nhu tia nắng phóng xạ và các chất có thể tấn công ADN. [2,7] Phytate[2,7] Phytate là một hợp thể chất khoáng phosphorus và inositon. Các nhà khoa học đã chứng minh phytate không những có tác động ngăn ngừa mầm ung thư mà còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch. Hai nhà nghiên cứu Drs.E.Graf và J. W.Eator đã cho biết phytate bảo vệ chúng ta khỏi bệnh ung thư kết tràng, kết quả trong phòng thí nghiệm cho thấy phytate đã liên tiếp ngăn cản không cho bệnh ung thư kết tràng phát triển và không cho phát sinh mầm ung thư vú. Mặt khác phytate có tác động ngăn cản sự hấp thụ sắt trong ruột do đó bảo vệ chúng ta khỏi chứng có quá nhiều chất sắt vì chất sắt thặng dư cũng là một trong những yếu tố nguy hại đến chứng nhồi máu cơ tim. Phytates hành xử giống nhu chất antioxydant, vitamin C, Beta – carotin. Phytosteron [2,7] Phytosteron có liên hệ với cholesteron, tuy nhiên cholesteron chỉ có nơi các thực phẩm có nguồn gốc từ thịt động vật còn phytosteron chỉ có trong các thực phẩm rau đậu. Không giống như cholesteron, phytosteron có tác động ngăn ngừa các bệnh về tim mạch qua việc dành chổ thẩm thấu qua ruột của cholesteron để vào máu.Do đó cholesteron không vào máu được mà phải bài tiết ra ngoài, lượng cholesteron trong máu giảm, mức độ giảm tuỳ từng cá thể. Phytosteron cung có khả năng làm giảm sự phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống lại ung thư da. Saponin Năm 2007 các nhà khoa học Hàn Quốc và Nhật Bản dùng bột Đậu nành đã khử dầu đem chiết xuất trong metanol, butanol 80%. Dịch chiết sau khi làm khô trong chân không được đem định tính bằng sắc kí lớp mỏng, sỏc kí lỏng hiệu năng cao HPLC và xác định cấu trúc bằng cách ghi phổ. Sau khi xác định thành phần saponin trong Đậu nành, các khoa học gia tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính của saponin trên chuột đực 5 tuần tuổi bằng cách tiêm qua tĩnh mạch đuôi. Kết quả cho thấy saponin trong Đậu nành có tác động ngăn cản sự di căn của những tế bào ung thu. [9] Nhiều công trình nghiên cứu khác đã chỉ ra, saponin là một loại hoá thảo có đặc tính giống như antioxydant. Saponin có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng đồng thời làm giảm lượng cholesteron trong máu. Phenolic axit [2,7] Phenolic axit là một hoá thảo chống oxy hoá anti – oxidant và phòng ngừa các nhiễm sắc thể AND khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thư. Lecithin [2,7] Khi nghiên cứu thành phần hoạt chất trong Đậu nành các nhà khoa học đã nhận thấy, đạm chất Đậu nành có chứa 3% lecithin bằng với lượng lecithin có trong lòng đỏ trứng gà. Lecithin là một hoá chất thực vật quan trọng, đóng một vai trò quyết định trong việc kích thích sự biến dưỡng ở khắp các tế bào co thể. lecithin có khả năng làm gia tăng trí nhớ bằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào não và hệ thần kinh, làm vững chắc các tuyến và tái tạo các mô tế bào cơ thể. Ngoài ra, lecithin có tác động cải thiện hệ thống tuần hoàn, bộ xương và tăng cường sức đề kháng. Khi hệ thần kinh thiếu năng lượng, chất lecithin ở Đậu nành sẽ phục hồi năng lượng đã mất. Browman– Birk Inhibitor (BBI) [2] BBI là một hoá thảo mới nhất tìm thấy trong Đậu nành, có khả năng ngăn cản tiến trình phát triển mầm ung thư. Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã thí nghiệm và thành công trên các mẫu tế bào trong ống thí nghiệm và trong các thú vật qua hai dạng tinh chế PBBI và cô đặc BBIC. Theo báo cáo kết quả tường trình tại hội nghị khoa học thế giới về vai trò của Đậu nành trong việc phòng và trị bệnh (1996) thì PBBI và BBIC đã kiểm soát được sự phát triển tiến trình ung thư miệng, vú, ruột già, gan, phổi, thực quản cả các tế bào trong ống thí nghiệm lẫn ở các con chuột bạch và chuột đồng. Hiện nay BBI đã được dùng trên con người ở vài trung tâm nghiên cứu và kết quả sơ bộ rất khả quan. BBIC đã được thẩm định là loại thuốc mới bởi cơ quan F.D.A(the U.S.Food and Drug Administration). Omega – 3 fatty axit [2] Omega – 3 fatty axit là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm luợng cholesterol xáu LDL đồng thời làm gia tăng lượng cholesterol tốt HDL trong máu. Nhiều nghiên cứu khoa học đã xác nhận tiêu thụ nhiều Omega – 3 fatty axit giúp ngăn chặn sự phát triển của các bệnh tim mạch. Isoflavone Do những tính năng kì diệu trong việc phòng và điều trị bệnh, đặc biệt là các căn bệnh thời đại, isoflavone đang là hoá thảo thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học hiện nay. THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH ISOFLAVONE TRONG ĐẬU NÀNH Thành phần isoflavone trong Đậu nành Năm 2005, các nhà khoa học Brazil dã tiến hành phân tích 18 mẫu Đậu nành. Mục đích của thí nghiệm là xác định thành phần hợp chất isoflavon từ đó so sánh tỷ lệ các chất trong 18 mẫu. Qua phân tích, cho thấy isoflavon trong Đậu nành là một hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein, genistein và glyxitein), ß – glucozit (genistin, daidzin, glyxitin), ß – glucozit kết hợp với nhóm malonyl ( 6 ” - O – malonyldaidzin, 6 ” – O – malonylgenistin và 6 ” – O – malonylglycitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm axetyl ( 6 ” – O – axetyldaidzin, 6 ” – O - axetylgenistin và 6 ” – O – axetylglycitin). [10] Bằng các phương pháp sắc kí HPLC/DAD và phổ UV các nhà khoa học Bồ Ðào Nha cũng đã xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt Đậu nành. Sau khi so sánh với các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện trước đó với kết quả phân tích trong thí nghiệm, các khoa học gia khẳng định trong hạt Đậu nành các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính trong hạt Đậu nành là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß – glucozit. Báo cáo còn chỉ ra trong hạt Đậu nành còn chứa các aglucone : sissotrin, ononin; các dẫn xuất axetyl của ß – glucozit : 6 ” – axetylsissotrin, 6 ” – axetylononin; các dẫn xuất malonyl của ß – glucozit : 6 ” - malonylsissotrin, 6 ” – malonylononin. [11] Năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt Đậu nành. Kết quả nhận được, tổng tỷ lệ trung bình của isoflavone là 2887µg/g trong phôi, 575µg/g trong hạt, 325µg/g trong lá mầm, 33µg/g trong vỏ hạt. Các khoa học gia cũng đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone trong 90 phút/mẫu thí nghiệm bằng phương pháp HPLC – PDA. [4] Cấu trúc cơ bản của isoflavon gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một dị vòng pyron. [12]
Hình 1 Cấu trúc hóa học của các Aglucon  R1  R2  R3   Daidzein  -H  -H  -OH   Genistein  -H  -OH  -OH   Glyxitein  -OCH3  -H  -OH   Formononetin  -H  -H  -OCH3   Biochanin A  -H  -OH  -OCH3  
Daidzin
Genistin
Glycitin Hình 2 cấu trúc hóa học của các β Glucozit. Hoạt tính của isoflavon trong Đậu nành. [4] Các hoạt chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt Đậu nành gồm chủ yếu là daidzin, genistin. Genistin và daidzin là những phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, tính phân cực cao, nên khó hấp thu qua ống tiêu hoá. Muốn cho dễ hấp thu và trở nên có giá trị sinh học, phải thuỷ phân chúng thành các aglycon, tức làm mất thành phần glycozit trong phân tử. Muốn vậy, cần có xúc tác enzym đặc hiệu là glycosidase. ống tiêu hoá của người không tạo được glycosidase, nên cơ thể không thể thuỷ phân được isoflavon và isoflavon chưa có giá trị sinh học. Ngược lại, một số tạp khuẩn định cư trong ruột sẽ tạo glycosidase cần cho quá trình thuỷ phân nêu trên, giúp cho sự hấp thu các isoflavon. Các aglycon sẽ hấp thu ở ruột non. Nồng độ đỉnh của aglycon trong máu chỉ đạt được 4-6 giờ sau khi uống chất chiết xuất từ hạt Đậu nành, tức là khi các glycozit đã được thuỷ phân qua xúc tác enzym của tạp khuẩn tại ruột. Lactobacillus sporogenes là vi khuẩn chính sản xuất glycosidase giúp cân bằng tạp khuẩn ruột, xúc tác cho thuỷ phân daidzin và genistin sang daidzein và genistein có hoạt tính “phytoestrogen”. Sau khi hấp thu, genistein và daidzein sẽ trãii qua các quá trình chuyển hoá khác nhau, chủ yếu xảy ra tại gan, ưa nước hơn, dễ đào thải qua pha giải độc (pha II) qua thận và mật (có chu kì ruột – gan), qua cả sữa mẹ. Chất chuyển hoá chính của genistein là hydroxy – O – demethylangolensin. Những chất chuyển hoá chính của daidzein là O – demethylan – golensin, glyxitein và equol. Equol là thành phầ rất quan trọng cho hoạt tính của isoflavon Đậu nành trong điều trị các triệu chứng mãn kinh, vì hoạt tính estrogen của equol mạnh gấp 5 lần hoạt tính này của chất mẹ daidzein và lần gấp 2 lầnhoạt tính của genistein. Các phytoestrogen của Đậu nành có nhiềutác dụng sinh học khác nhau. Một trong những tác dụng quan trọng là sự gắn thuốc chỉ vào các thụ thể estrogen đặc hiệu, sau dó kích thích thụ thể tạo nên “tác dụng estrogen”. Thụ thể estrogen (ER) thuộc một họ lớn các thụ thể hormon trong tế bào. ER kích thích quá trình dinh dưỡng của các mô có chứa thụ thể. Người ta chia ra hai loại ER là alpha ER (αER) và beta ER (ß ER), phân phối khác nhau trong các mô: αER có mặt tại màng trong tử cung, trong chất đệm của buồng trứng và ở tuyến vú. Còn ß ER mặt khác, tồn tại trong các tế bào nội mô của thành mạch máu, ở não, thận và trong các tế bào của bàng quang và niệu đạo, trong tế bào của niêm mạc ruột và phổi, tế bào xương. Vậy những tác dụng khi kích thích αER sẽ khác hăn tác dụng khi kích thích ß ER. Estradiol là hormon estrogen sinh lý chủ yếu, sự kích thích chủ yếu αER và cho những tác dụng nội tiết rất quen thuộc trên màng trong tử cung và ở vú. Trái lại, genistein, daidzein và các chất chuyển hoá của chúng kích thích chủ yếu vào ß ER, vì vậy rất khó có tác dụng trên màng trong tử cung và vú, trong khi đó lại có nhiều tác dụng thuận lợi khác nhau trên các triệu chứng của mãn kinh. Ái lực của isoflavon trong Đậu nành tại ER thấp hơn ái lực của hormon estrogen hàng 500 – 10000 lần. Vì vậy những tác dụng của isoflavon trong Đậu nành luôn luôn yếu hơn rất nhiều so với tác dụng của hormon estrogen thực thể, nên thoả mãn được sự cân bằng tinh tế về hormon cần xác định sau khi mãn kinh. Hơn nữa, tính ưu việt của isoflavon là kích thích được sự tổng hợp globulin trong máu có chức năng gần các hormon sinh dục ( Sex Hormone Binding Globulin; SHBG). Kết quả là nếu SHBG (vừa được tăng sinh) mà làm tăng sự gắn được cơ chất estradiol trong tuần hoàn, sẽ khiến tác dụng estrogen chậm lại, từ dó trung hoà được một số tác dụng không mong muốn của estradiol tại màng trong tử cung và tại vú. Tác dụng của isoflavon Đậu nành trong phòng và điều trị bệnh [8] Nghiên cứu thăm dò trên lâm sàng, đã chỉ ra những tác dụng có lợicủa Đậu nành trên các triệu chứng vận mạch ở tuổi mãn kinh: isoflavon trong Đậu nành làm giảm cường độ bốc hoả, giảm số lần đổ mồ hôi đêm, mang lại lợi ích hiển nhiên nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Phụ nữ dùng placebo sẽ thức giấc trung bình 1,89 lần do bốc hoả và đổ mồ hôi, nhưng ở nhóm điều trị bằng isoflavon Đậu nành, số lần thức giâc sẽ giảm chỉ còn 1,52 lần. Isoflavon Đậu nành không gây thay đổi có ý nghĩa về FSH hoặc về độ dày của màng trong tử cung. Không có người nào phàn nàn về rối loạn vú, không thấy tăng các tác dụng phụ estrogen không mong muốn. Những nghiên cứu khác ở phụ nữ mãn kinh cho thấy có giảm tuần tự số lần bốc hoả trong mỗi tuần, giảm ở nhóm dùng isoflavon rõ hơn hăn so với ở nhóm dùng placebo, không gây tác dụng phụ nào, dù không đặc hiệu hoặc có liên quan tới tác dụng estrogen (tới màng trong tử cung, qua xét nghiệm tế bào học của âm đạo hoặc trên các thông số hormon). Vì vậy, có thể khuyến cáo dùng isoflavon Đậu nành cho phụ nữ nào có chống chỉ định dùng liệu pháp hormon thay thế (HRL) hoặc không muốn dùng HRL vì lý do cá nhân. Isoflavon trong Đậu nành cũng thu được sự cải thiện toàn bộ về chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh. Ăn các thực phẩm giàu isoflavon đã cải thiện rõ rệt những triệu chứng của tuổi mãn kinh (bốc hoả, đổ mồ hôi đêm, mất ngủ, trầm cảm, khô âm đạo, đau khi giao hợp) so với ở nhóm phụ nũ dùng chế độ dinh dưỡng thông thường. Uống isoflavon Đậu nành còn cho thấy có cải thiện ý nghia về quá trình dinh dưỡng da. Tuy nhiên, không nên dùng liều quá cao đề tránh gây ra những tác dụng estrogen không mong muốn. Tác dụng trên chuyển hoá của xương Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ châu Á thấp hon hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế từ Đậu nành. Hiệu lực của isoflavon Đậu nành trên quá trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho thấy tăng có ý nghĩa về mật độ khoáng ở xương (BMD) tới các đốt sống L2 – L4 khi so sánh với phụ nữ theo chế độ ăn nghèo Đậu nành. Hiệu lực của isoflavon Đậu nành trên chuyểnhoá của xương cũng được khẳng định trong các nghiên cứulâm sàng khác và còn được xác minh qua các nghiên cứu trên chuột cống cắt bỏ buồng trứng. Isoflavon còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính của huỷ cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính estrogen của thuốc này. Tác dụng trên tim mạch Chế độ dinh dưỡng giàu Đậu nành sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành (CHD). Isoflavon Đậu nành có những tác động khác nhau chống rối loạn lipit – máu ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy co tim mạch. Đậu nành và chiết xuất của Đậu nành cũng có những tác dụng khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn kinh Bắc Mỹ: - Làm giảm huyết áp tâm trương - Làm giảm cholestreron toàn phần, giảm cholesteron “xấu” (tức LDL – cholesteron), giảmtriglyxerid, tăng HDL – C, giảm tỷ số cholesterol toàn phần / HDL – C, giảm tỷ số LDL – C / HDL – C; - Chống tiểu cầu; - Ngan chặn sự tiến triển của các mảng xơ vữa - Cải thiện tính đàn hồi độngmạch; - Chống oxy hoá, loại bỏ các gốc tự do, đối kháng với tác hại của sự lipoperoxy hoá của lecithin và của LDL – cholesterol sản sinh ra các sản phẩm cuối cùng có hại, vì các sản phẩm này có ái lực rất cao với thành động mạch và gây ra những mảng xơ vữa. Dựa vào các kết quả trên, cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) Hoa Kỳ đã chấp nhận từ năm 1999, dùng Đậu nành cùng chế độ dinh dưỡng nghèo axit béo no, nghèo cholesterol để làm giảm nguy cơ bệnh động mạch vành. Tác dụng trên các chức năng nhận thức Liệu pháp thay thế hormon (HRT) đã chứng tỏ có tác dụng thuận lợi trong điều trị sự suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ ở phụ nữ cao tuổi. Vì vậy, có thể suy ra là phytoestrogen cung có thể có các lợi ích tương tự. Tác dụng trên các khối u phụ thuộc hormon Tỷ lệ một số loại u phụ thuộc hormon (như u ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng) thay đổi rất rõ rệt từ quần thể nọ sang quần thể kia, nhưng tỷ lệ này rất thấp ở phụ nữ châu Á. Nhận xét này về dịch tễ cho thấy có liên quan tới chế độ dinh dưỡng giàu đạu nành ở dân cư châu Á. Các nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng đã chứng minh hiệu lực của phytoestrogen làm giảm nguy cơ ung thư ở màng trong tử cung, ở vú và buồng trứng. Kết quả chưa hoàn toàn chắc chắn, cần các nghiên cứu tiếp theo để mang lại một kết luận rằng isoflavon đậu nành có thể ngăn ngừa hữu hiệu các loại u nêu trên. Nhưng chắc chắn rằng isoflavon đậu nành không làm tăng nguy cơ ung thư, mặc dầu isoflavon có tác dụng estrogen, có thể do isoflavon đậu nành chủ yếu kích thích β ER. Tác dụng phụ có thể gặp với isoflavon của đậu nành Đậu nành và isoflavon của đậu nành dung nạp tốt, loại trừ một vài trường hợp hiếm gây rối loạn nhẹ đường tiêu hóa. Đậu nành thuộc họ đậu (Fabaceae). Người dị ứng với rau đậu có thể dị ứng với thức ăn chế từ đậu nành ( sữa đậu nành, đậu phụ, bột đậu nành, tương,…). Những phản ứng này là do protein chứa trong đậu nành. Một số qui trình chiết tách isoflavon trong đậu nành Tại Hàn Quốc [4] Các nhà khoa học đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavon trong phôi, lá mầm, vỏ hạt và hạt đậu nành. Trong quá trình nghiên cứu, các khoa học gia nhận định, phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) là phương pháp tối ưu nhất để phân tách isoflavon từ các mẫu thí nghiệm. Quá trình phân tách được thực hiện như sau: Chín mẫu đậu nành sử dụng trong thí nghiệm có kích cỡ hạt đa dạng từ trung bình đến lớn, trọng lượng 25-40g/100 hạt. Điều kiện gieo trồng và chăm sóc các mẫu tốt, thu hoạch vào vụ mùa 2004 tại Hàn Quốc, sau đó cất giữ bảo quản trong kho và đem phân tích vào năm 2005. Mẫu được nghiền sơ bộ qua máy nghiền để tách riêng các thành phần: phôi, mầm, vỏ hạt.Các mẫu được đê khô, làm lạnh, sau đó nghiền thành bột mịn. Trộn 2 gram bột mẫu với10ml axetonitrit (ACN) và 2ml HCl 0,1N. Hỗn hợp được để trong 2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc Whatman. Sau khi lọc kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở - 40oC rồi hoà tan lại trong 10ml metanol 80% và lọc qua tia lọc 0,45µm. Phân tích bằng sắc kí lỏng cao áp dựa theo phương pháp đã được thực hiện bởi Wang và Murphy (1994) và Kim, Jung, Ahn và Chung (2005). Hệ thống sắc kí lỏng cao áp được sử dụng dể nghiên cứu gồm : máy sắc kí lỏng cao áp hãng Shimadzu, sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( hãng SPD M10A) cùng với lắp cột sắc kí 250mm x 4,6 mm I.D x 5µm; quá trình dò bằng detector UV 254nm. Bộ tổng hợp dung môi linear HPLC gradient, sử dụng pha động gồm dung môi A ( 0,1 % glacial axetic axit trong nước cất ) và dung môi B ( 0,1% glacial axetic axit trong ACN ). Bơm 20µl mẫu vào máy sắc kí lỏng cao áp. Quá trình tách các pic tốt nhất khi dung môi B tăng từ 15% đến 35% trong thời gian là 60 phút, giữ ở 35% trong 5 phút, và trở về 15% trong 5 phút với tốc độ dòng 1ml/phút. Tổng thời gian phân tách một mẫu khoảng 85 phút, sau dó chuyểnsang mẫu kế tiếp. Cả dung môi và nước cất sử dụng trong sắc kí lỏng cao áp HPLC phải đạt độ tinh khiết 99,9% và đã hút chân không. Tại Brazil [10] Cũng bằng HPLC, các nhà khoa học Brazil đã xác định được thành phần isoflavon trong 18 mẫu Đậu nành khác nhau. Quá trình phân tách được thực hiện như sau: Mười tám mẫu cây Đậu nành được gieo trồng tại các thời điểmm khác nhau trong vụ mùa 2002/2003 tại Brazil. Sự phân loại mẫu dựa trên số ngày kể từ khi gieo trồng đến khi thu hoạch. Các mẫu được đem phân tích thành phần isoflavon và độ hoạt động của ß- glucosidase. Nghiền 30g hạt mỗi mẫu thành bột, lấy khoảng 250mg mẫu chiết trong ống nghiệm với 3ml hệ dung môi dimetyl sunfoxit ( DMSO) : metanol ( 1:4 v/v ) trong 15-17h ở nhiệt độ phòng và sau đó li tâm. Phần nổi trên mặt được lọc qua tia lọc 0,43µm. Bơm 20µl mẫu vào sắc kí lỏng cao áp hãng Shimadzu ( LC – 10AT VP), sử dụng detector photodiot array phân giải cao ( SPD – M10A VP) và lò ( CTO – 10AS VP) gia ở nhiệt độ 26oC. Sử dụng cột sắc kí CLC – ODS (M) C18 kích cỡ 250mm x 4,6 I.D x 5µm. Pha động gồm dung môi 1 là nước và dung môi 2 là axetonitrit. Quá trình tách các pic, ban đầu 100% nước và 0% axetonitrit, thay đổi tới 45% nước và 55% axtonitrit trong thời gian 25 phút. Isoflavon được dò ra ở 260nm. Giữ 100% axetonitrit trong 2 phút và quay trở lại điều kiện ban đầu trong khoảng thời gian 8 phút kế tiếp. Tổng thời gian phân tách một mẫu khoảng 40 phút. Tốc độ dòng là 1ml/phút. Thành phần isoflavon được biểu thị mg/100g bột khô. Tại Bồ Ðào Nha [11] Quá trình phân tách được thực hiện như sau: 100 mgram của hạt Đậu nành đem tán thành bột ( kích cỡ 250 mesh) hoà với1000µl etanon : nước( 1:1). Dịch chiết được quay li tâm tốc độ 10.000 rpm/10phút. Sau dó bơm 50µl mẫu dung dịch nổi trên mặt vào máy sắc kí lỏng cao áp, tốc độ dòng 0.8ml/phút. Pha động H2O /CH3CN được bơm vào cột LichroSorb RP18, nhiệt độ 24oC . Quá trình dò được thực hiện bằng detector diot phân giải khoảng buớc sóng từ 200nm – 400nm. Xác định cấu trúc của flavonoid dựa vào phân tích phổ UV. Tại Australia Một nhóm các nhà khoa học cũng sử dụng HPLC để phân tích sự thay đổi thành phần isoflavon trong các sản phẩm chế biến từ Đậu nành [13 ] Ngoài phương pháp HPLC để phân tách và xác định thành phần isoflavon trong Đậu nành. Bằng viềc kết hợp các phương pháp phân tích khác nhau, các nhà khoa học đã tách và xác định được hầu hết các thành phần hoạt chất chứa trong Đậu nành Nhóm các nhà khoa học Hàn Quốc và Nhật Bản đã thực hiện qui trình chiết tách saponin từ Đậu nành như sau: Bột Đậu nành được tách dầu trong bộ chiết Soxhlet với n- hexan. Sau khi tách dầu được chiết xuất với metanol. Thu hồi dung môi, phần còn lại tiếp tục chiết với butanol 80%. Thu hồi butanol bằng phễu tách. Dịch chiết được làm khô trong chân không. Phần bã được hoà tan lại trong nước và làm lạnh khô. Sắc kí lớp mỏng chỉ ra hai vết y hệt nhau. Ngược lại sắc kí lỏng cao áp, sử dụng pha động Choloroform và metanol đã chỉ ra dịch chiết chứa soyasaponin I và soyasaponin II. [10]. Khi phân tích thành phần polyphenol trong hạt Đậu nành, các nhà khoa học Serbia đã định tính được tannin bằng sắc kí lớp mỏng xenlulo, định tính được các flavonoid và proanthoxyanidin sử dụng sắc kí lớp mỏng silicagen. [14]. Trong một nghiên cứu của nhóm các nhà khoa học Hoa Kỳ và Tây Ba Nha đã đề cập đến phương pháp chiết các protein từ Đậu nành của nhóm các tác giả De Mejia, Vasconez, De Lumin, Nelson (2004), phương pháp phân tích các amino axit bằng HPLC của nhóm tác giả Martinez – Villaluenga, Gule – Wicz, Frias, Gule Wiczand Vidal– Valverde (2007). [15] Phần 2 THỰC NGHIỆM MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC FLAVONOID TỪ ĐẬU NÀNH Chiết xuất hai aglycones isoflavone (daidzein, genistein) và coumestrol từ rễ đậu nành bằng Dimethyl sulfoxide. Phân lập bằng HPLC xac định bằng GC MS.[16] Thực nghiệm Hóa chất, dung môi, thiết bị Genistein chuẩn (ICN Pharmaceuticals, Inc. of Plainview, NY). Daidzein chuẩn (Dr. John Ingham, Đại học Reading, Anh). Coumestrol chuẩn (công ty Eastman Kodak, Rochester, NY). Methanol quang phổ ( Burdick & Jackson, Inc, Muskegon, MI). Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Fisher, Pittsburgh, PA). Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) (Supelco Inc, Bellefonte, PA). Khí Nitơ (D & R, Decatur, IL). Máy khuấy Eberbach. Máy ly tâm Damon IEC B-20A. Hệ thống HPLC bao gồm: bộ điều khiển model Beckman 420, đầu dò thay đổi bước sóng model Beckman 100-40, cột ODS Ultraphere C18 (4.6mm × 25cm), bơm tiêm tự động Micromeritics 725 với cỡ loop 100µl. Phát hiện ở bước sóng 280nm. Bộ phận ghi tín hiệu model Beckman C-R1A. Bộ phận thu gom phân đoạn model Beckman 204. Máy sấy đông khô model Uni-trap 10-100 (Virtis, Inc). Hệ thống GC-MS Packard Hewlett 5985. Cột GC là cột thủy tinh dài 6 foot, lỗ hẹp, được nhồi với SP-2100 3%. Khí mang là Helium và tốc độ dòng 30ml/ phút. Nhiệt độ tăng từ 50-200 0C với tốc độ tăng 25 0C/ phút. Chiết xuất Đậu nành “Wells II” (Glycine max (L.) Merrill) trồng trong nhà kính, lấy rễ ở giai đoạn tăng trưởng R-2. Rễ được rửa sạch rồi trộn đều với DMSO (tỉ lệ 2 : 1) bằng máy khuấy Eberbach trong 2h ở tốc độ chậm. Gạn lấy dịch chiết DMSO đem ly tâm với tốc độ 294.000 m/(giây)2 trong 10 phút, lọc qua một màng lọc Millipore 5µm. Phân tích HPLC và GC – MS Pha động HPLC gồm dung môi A và B. Dung môi A bao gồm 65% methanol và 35% nước. Dung môi B gồm 15% methanol và 85% nước. Chạy gradient như sau: 0-21 phút, gradient tuyến tính từ 80- 30% B; 21-70 phút, chạy đẳng dòng 30% B; 70-70.5 phút, gradient tuyến tính từ 30-80% B; và ở 80 phút, chu kỳ được lặp lại. Tốc độ dòng là 1.0ml/ phút. Bảng 1. Thời gian lưu của Daidzein, Genistein, Coumestrol   Hợp chất  Thời gian bắt đầu thu chất (phút)  Thời gian kết thúc thu chất (phút)   Daidzein  29.2  32.3   Genistein  38.2  42.0   Coumestrol  55.3  58.8   Để tăng lượng chất rửa giải, gom chất rửa giải từ 12 mẫu dịch chiết rễ đậu nành. Chất rửa giải được sấy đông khô để loại dung môi methanol và nước. Các tinh thể thu được hòa tan trở lại trong methanol dùng cho quang phổ. Chuẩn bị mẫu cho GC – MS: bốc hơi tới khô một phần của mỗi dung dịch methanol dưới khí N2. Phân tích trực tiếp các tinh thể thu được và dẫn chất trimethylsilyl (TMS) của các tinh thể. Dẫn chất TMS được tạo ra từ việc hòa tan một phần tinh thể trong 0.2ml chất silylation BSTFA, sau đó đun nóng nhẹ dung dịch ở 60oC trong 15 phút. Kết quả và bàn luận Phổ đồ HPLC điển hình của dịch chiết rễ đậu nành được biểu diễn ở hình 1. Trên 80 phút phân tích, phương pháp này mất 16h. Việc sử dụng cột lớn hơn nên giảm đáng kể thời gian phân tích, nhưng phải bảo đảm phân tích đầy đủ của những hợp chất quan tâm từ dịch chiết DMSO. Phổ UV của dịch methanol tương ứng mỗi peak 1 được thể hiện ở bước sóng hấp thu cực đại là 238, 249, 259 và 303nm. Những giá trị này tương tự như các chất thu được từ daidzein chuẩn và những chất được báo cáo trong thư viên phổ. Phổ khối của peak 1 thể hiện phân tử ion là M/Z = 254 và những phân mảnh ion chính là 137 và 118. Phổ khối của dẫn chất TMS của peak 1 có phân tử ion M/Z = 398 và những phân mảnh ion chính là 353 và 184. Những phổ này là cần thiết cho việc xác định những phổ thu được là của daidzein chuẩn. Peak 2 có bước sóng cực đại tại 264 và 340nm. Phổ đồ trên 250nm thì giống như phổ của genistein chuẩn và như phổ được báo cáo trong thư viện phổ. Sự hấp thu dưới 250nm xác định sự không tinh khiết. Phổ khối của peak 2 thể hiên phân tử ion là M/Z =270 và phân mảnh ion chính là 153 và 118. Phổ khối của dẫn chất TMS của peak 2 không hiển thị phân mảnh ion mong muốn là 471, 414 và 399. Những phổ này của peak 2 là cần thiết cho việc xác định những phổ thu được là của genistein chuẩn. Phổ của dẫn chất TMS của genistein chuẩn chỉ thể hiện peak ion phân tử rất nhỏ ở M/Z = 486. Bước sóng hấp thu cực đại của peak 3 là 212, 242, 307 và 347 nm. Phổ UV ở peak 3 thì giống với coumestrol chuẩn. Phổ khối có ion phân tử là M/Z= 268 và phân mảnh ion chính là 240. Những giá trị này thu được với coumestrol chuẩn và tương ứng với phổ được báo cáo trong thư viện phổ. Dẫn chất TMS của peak 3 có ion phân tử là M/Z = 412 và phân mảnh ion chính là 397 và 369. Chất rửa giải tương ứng với peak 4 được thu thập từ 62 -66 phút và được phân tích. Phổ UV của dung dịch methanol tương ứng với peak 4 thể hiện bước sóng hấp thu cực đại ở 227, 291, 313 và 325 nm. Ion phân tử trong phổ khối của peak 4 là M/Z = 338, với phân mảnh ion chính là 323 và 305. Dẫn chất TMS có ion phân tử là M/Z = 482 và phân mảnh ion chính là 467, 393 và 377. Dữ liệu này đề nghị rằng peak 4 là một hỗn hợp của glyceolin I, II, III, tất cả chúng được biết như là phytoalexins ở phần trên mặt đất của đậu nành. Kĩ thuật được mô tả ở trên cung cấp một phương pháp nhanh và đơn giản cho việc chiết xuất và phân lập những loại hợp chất này. Sự phân tích định lượng cũng có thể sử dụng các kĩ thuật này. Chiết xuất các isoflavone (daidzin, genistin, daidzein và genistein) từ trụ dưới lá mầm của đậu nành bằng n – hexan.[17] Nguyên tắc Loại chất béo ra khỏi đậu nành đã được lên men bằng vi sinh bằng một dung môi không phân cực. Chiết với dung môi phân cực và cô đến cắn. Hòa tan cắn với 1 dung môi phân cực thứ hai, rồi pha loãng với nước tạo tủa. Các aglycone isoflavone phân cực kém hơn các glycosid isoflavone sẽ kết tủa. Tách và rửa kết tủa với dung môi phân cực thứ hai ở trên rồi bay hơi loại dung môi. Chất rắn thu được chứa một hoặc nhiều aglycone của isoflavone đậu nành. Ví dụ Chuẩn bị nguyên liệu bằng cách lên men trụ dưới 2 lá mầm đậu nành với koji – kin, một loại nấm thuộc chi Aspergillus oryzae. Xay thành bột thô với cỡ hạt khoảng 100 meshes. Trộn bột với lượng n-hexane gấp khoảng 3 lần, đun hồi lưu ở nhiệt độ sôi của n-hexane (690C) trong 3 giờ (dao động 2 – 5 giờ tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu). Dùng máy sấy hơ nóng loại dung môi. Lặp lại quy trình chiết trên vài lần nữa để loại hoàn toàn chất béo. Chấm sắc kí cho thấy dịch n – hexan không chiết luôn các isoflavone (đó là lí do dùng dung môi này để chiết xuất). Nguyên liệu đã được loại chất béo thu được có khối lượng khoảng 89% so với nguyên liệu ban đầu. Cho thêm lượng ethyl acetate gấp khoảng 3 lần, đun hồi lưu ở nhiệt độ xấp xỉ nhiệt độ sôi của ethyl acetate (77.1 0C) trong trong 3 giờ (dao động 2 – 5 giờ tùy thuộc lượng nguyên liệu). Dịch ethyl acetate được cô áp suất giảm. Lượng cắn thu được bằng 2 – 5% khối lượng nguyên liệu ban đầu. Có thể lặp lại qui trình này vài lần để tăng tỉ lệ phục hồi. Cắn này hòa tan với một lượng nhỏ ethanol 99% rồi pha loãng với nước tới độ cồn khoảng 20% để tạo tủa. Để yên một thời gian. Lọc qua giấy lọc tách lấy kết tủa rồi sấy ở áp suất giảm. Sản phẩm rắn thu được chứa phần lớn aglycone isoflavone. Phân lập isoflavone bằng sắc kí cột Diaion HP-20, thu được daidzin, genistin, daidzein có độ tinh khiết cao.Như vậy, với qui trình chiết xuất và phân lập trên thì sản phẩm thu được có hàm lượng các glycosid isoflavone tăng 10 – 13 lần và các aglycone isoflavone tăng 57 – 64 lần so với nguyên liệu ban đầu. Tỉ lệ phục hồi từ 40 – 70%. Bảng 2. So sánh hàm lượng các isoflavone trong nguyên liệu ban đầu và sản phẩm rắn   Isoflavone  Nguyên liệu ban đầu  Sản phẩm rắn   Daidzin  0.095%  1.2%   Genistin  0.043%  0.5%   Daidzein  0.68%  43.0%   Genistein  0.12%  7.0%   Chiết xuất các aglycones isoflavone (daidzein và genistein) trong trụ dưới lá mầm của đậu nành sau khi thủy phân các glycosid isoflavone bằng enzyme ß-glucosidase nội sinh theo hai phương pháp chiết rắn – lỏng và SC – CO2. Phân lập và định lượng bằng HPLC.[18] Thực nghiệm Hóa chất, dung môi và thiết bị Carbon dioxide SFE (độ tinh khiết 99.99%) (White Martins, Brazil). Chuẩn genistin, genistein, daidzin, daidzein, flavone và p-nitrophenyl-ß-D-glucoside (p-NPG) (Sigma Chemical Co, USA). Acetronitrile, methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), trifluoroacetic (TFA) dành cho phân tích (Vetec Quimica-Brazil). Các dung môi được lọc qua màng lọc Millipore 0.45 μm. Spectrophotometer model 634-S UV/VIS (Varian, USA). Máy li tâm (Beckman, USA). Hệ thống chiết siêu tới hạn (Hewlett–Packard 7680A). Hệ thống HPLC (Hewlette–Packard 1050), bơm tiêm Reodyne 7125, loop 50 và đầu dò UV – Vis. Cột Hypersil-ODS C18 (20 cm x 4.6 mm x 5 μm; Hewlett & Packard, USA). Chuẩn bị mẫu Mẫu thử: hạt đậu nành ngâm với nước (đã được acid hóa với HCl 0.1 N tới pH 5) ở 50 0C trong 6, 12 và 18 giờ để thúc đẩy sự thủy phân bởi enzyme ß-glucosidase nội sinh. Sau đó để ráo rồi rửa sạch với nước lạnh. Thu lấy các trụ dưới lá mầm bằng phương pháp thủ công, xay tới cỡ hạt đường kính 0.297 tới 0.35 mm. Bảo quản trong 1 lọ nhỏ chứa nitrogen ở -200C. Mẫu trắng: hạt đậu nành sấy trước ở 900C trong 6 giờ để bất hoạt các enzyme rồi xử lý tiếp như trên. Định lượng hoạt tính enzyme 100 g trụ dưới lá mầm của đậu nành trộn với 1.5 ml natri phosphate 0.1 M (pH 5) trong 30 phút. Hỗn hợp này được quay li tâm 8000 vòng trong 5 phút. Tách lấy phần nổi trên mặt, thu được dịch chiết chứa enzyme. Đánh giá hoạt tính của ß-glucosidase dựa vào chất nền p-nitrophenyl-ß-D-glucoside (p-NPG). Trộn 500 μl p-NPG 1 mM trong đệm phosphate–citrate 0.1 M (pH 5.0) và 300 μl nước với 200 μl dịch chiết enzyme, ủ trong 40 phút ở 450C. Ngừng phản ứng bằng cách thêm natri carbonat 0.25 M. Sản phẩm có màu vàng được đo quang ngay lập tức ở bước sóng 420 nm. Định lượng p-NPG bị thủy phân dựa vào phương trình đường chuẩn xây dựng với hàm lượng 0.02–0.16 μM p-NPG. Một đơn vị hoạt tính enzyme là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μM p-NPG trong 1 phút. Các phương pháp chiết xuất Phương pháp chiết rắn – lỏng cổ điển Trộn 500 mg trụ dưới lá mầm đậu nành với 10 ml methanol 80% trong nước (v/v) trong 2 giờ bằng một máy trộn từ. Dịch chiết thô được quay li tâm 800 vòng trong 20 phút rồi lọc qua màng lọc Millipore 0.45 μm, chuẩn bị cho HPLC Phương pháp chiết dùng SC – CO2 Nguyên liệu là 80 mg bột đã được rây qua rây 40 mesh. Chiết riêng 6 mẫu ở cùng thời gian tĩnh và động là 15 phút, nhiệt độ 50, 60 và 700C, áp suất 176, 218, 261, 370 và 380 bar. Dung môi phụ trợ methanol, ethanol và acetonitril thêm trực tiếp vào mẫu ở hàm lượng 0, 5 và 10 mol % so với lượng CO2 đi qua hệ thống trong thời gian chiết động (20.7g). Tốc độ dòng CO2 được giữ hằng định 1.5 ml/phút. Với mỗi mẫu, chiết 3 lần (tổng thời gian 3 x 30 = 90 phút, tổng lượng CO2 là 62.1 g, tổng thể tích dung môi phụ trợ là 0, 0.8, 1.2 ml (tương ứng 0, 5 và 10 mol %)). Định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Pha động: dung môi (1) là TFA 0.1 % trong nước, dung môi (2) là acetonitril. Pha động ban đầu là dung môi (1) 100 %, thêm dần dung môi (2) từ 0 đến 54.6 % trong 20.6 phút. Giữ tình trạng này trong 10 phút rồi quay lại tình trạng ban đầu trong 5 phút. Tiêm 50 μl mẫu bằng syringe 100 μl. Tốc độ dòng là 1.0 ml/phút. Phát hiện ở bước sóng 262 nm. Định lượng dựa vào diện tích peak theo phương pháp chuẩn nội. Chuẩn ngoại: dung dịch gốc daidzin, genistin, daidzein và genistein trong DMSO pha loãng với pha động ( 54.6 % dung môi (2) trong dung môi (1)) đến nồng độ 0.2 – 20 μg/ml. Chuẩn nội có hàm lượng 2 μg/ml. Hàm lượng các isoflavone trong mẫu được tính dựa vào phương trình định lượng của chuẩn daidzin, genistin, daidzein và genistein, lần lượt là: y = 0.05089x + 0.06683 (r = 0.9906) y = 0.07375x - 0.04091 (r = 0.9987) y = 0.09058x + 0.04099 (r = 0.9994) y = 0.0379x + 0.0161 (r = 0.996) Tính tuyến tính tương ứng miền giá trị 0.2 – 12 μg/ml, độ tin cậy 95 %. Mỗi dịch chiết được phân tích đến khi độ sao lại trên 95%. Sử dụng kiểm định Turkey để kết luận có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê hay không về hàm lượng các isoflavone trong trụ dưới lá mầm đậu nành thu được từ 2 phương pháp chiết. - Kết quả - Thủy phân isoflavone trong trụ dưới lá mầm của đậu nành bằng enzyme ß-glucosidase nội sinh. Phương trình hàm lượng daidzein và genistein (mg/100g) theo thời gian ủ (giờ) (miền giá trị từ 0 – 18 giờ ủ) Daidzein = 24.62 + 1.8566 (thời gian) - 0.0804 (thời gian)2 (R2 = 0.8312) Genistein = 17.17 + 3.4429 (thời gian) - 0.1439 (thời gian)2 (R2 = 0.8786) Như vậy, hàm lượng daidzein và genistein tăng dần từ 0 đến 12 giờ ủ nhưng giảm dần từ 12 đến 18 giờ ủ. Trong 12 giờ ủ, tỉ lệ bị thủy phân ở daidzein là 60 % và ở genistein là 56 % chứng tỏ daidzin dễ bị thủy phân bởi ß-glucosidase hơn genistin. Bảng 3. Hàm lượng các isoflavone trong trụ dưới lá mầm của đậu nành thu được theo phương pháp chiết rắn – lỏng sau khi thủy phân ở nhiệt độ cao và bảng ANOVA cho thử nhiệm thời gian ngâm ủ.   Isoflavone (giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm)  Thủy phân ở 500C, pH 5    Mẫu trắng  6 giờ  12 giờ  18 giờ   Daidzin  919.54  551.72  597.72  643.68   Genistin  170.92  95.72  99.17  102.55   Daidzein (D)  24.10 ± 0.78  34.46 ± 1.81  33.74 ± 1.10  32.52 ± 1.06   Genistein (G)  16.19 ± 0.53  35.61 ± 1.16  34.80 ± 1.14  34.49 ± 1.81   D + G  40.29  70.07  68.54  66.01   Bảng ANOVA    Tổng bình phương  Bậc tự do  Trung bình bình phương  F %*   Daidzein   Thời gian ủ  138.55  3  46.18  0.341   Biểu mẫu bình phương  127.32  2  63.66    Sai số  6.22  4  1.55    Genistein   Thời gian ủ  514.99  3  171.66  0.026   Biểu mẫu bình phương  475.9875  2  237.99    Sai số  6.20  4  1.55    * Giá trị tới hạn của F(2, 4) là 6.94 với độ tin cậy 95%.   Bảng 3 cho thấy với độ tin cậy 95 %, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về thời gian ngâm ủ đến hàm lượng chiết daidzein và genistein. Định lượng Nhiệt độ và áp suất chất lưu, tỉ lệ dung môi phụ trợ và thời gian chiết là những yếu tố ảnh hưởng chủ yếu tới hiệu suất chiết. Điều kiện chiết ban đầu là áp suất 176 – 380 bar, nhiệt độ 50 – 700C, sử dụng 13.8 g CO2 trong chiết động với 5 và 10 mol % dung môi phụ trợ (0.4 và 0.8 ml methanol 80%) cho mỗi 80 mg mẫu. Hiệu suất chiết bằng CO2 tinh khiết không cao cho dù thay đổi nhiệt độ và áp suất. Do đó, đã tăng độ phân cực của dung môi chiết. Có ít nhất 17 dung môi phụ trợ đã được nghiên cứu trong chiết siêu tới hạn các hợp chất thiên nhiên. Trong đó, methanol được sử dụng phổ biến nhất vì nó cải thiện hiệu quả tính phân cực và có thể hỗn hòa với CO2 tới 20 %.