Chiết xuất và phân lập liensinine và các dẫn chất từ sen

LỜI MỞ ĐẦU ( ( ( Dược liệu được sử dụng rộng rãi ở các nước phát triển và đang phát triển như là những phương thuốc gia truyền, hoặc cung cấp nguyên liệu để sản xuất thuốc cho ngành công nghiệp dược phẩm. Với xu hướng quay về với thiên nhiên, hàng trăm nhóm hợp chất đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong cuộc sống. Trong đó, Alkaloid là một nhóm lớn, chất chuyển hóa thứ cấp trong thực vật, vi trùng, hay nguồn gốc động vật. Sen được biết đến với nhiều ứng dụng quan trọng trong cuộc sống, giá trị trong thực phẩm và mang ý nghĩa tâm linh. Với vẻ đẹp thanh khiết, Sen trở thành một biểu tượng không thể thiếu trong một số nền văn hóa, và gắn liền với tâm hồn con người Việt Nam. Ngoài ra, từ lâu Sen đã được biết đến như một dược liệu quý. Sen đã được nghiên cứu và áp dụng để chữa nhiều bệnh, các bệnh trên đường tiêu hóa, tim mạch, tâm thần kinh, sưng viêm,… rất thành công. Hiện nay, càng có nhiều nghiên cứu về thành phần quan trọng trong Sen là alkaloid. Chúng tồn tại trong toàn bộ cây sen: thân, lá, tâm sen và hoa. Các qui trình, các phương pháp chiết xuất ngày càng cải tiến để thu được các alkaloid với hiệu suất cao nhất và chất lượng tốt nhất. Với khuôn khổ của bài báo cáo này, chúng ta hãy cùng tìm hiểu về những thành quả đã đạt được trong nghiên cứu về Sen, cũng như các phương pháp chiết xuất, phân lập alkaloid từ dược liệu này. ”Thảo mộc là những loài cây mà công dụng của chúng, chúng ta khó khám phá hết” Ralph Waldo Emerson 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU: 1.1 Tổng quan về thực vật học: 1.1.1. Tên gọi: Sen còn có tên là Liên, Quỳ. Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn Các đồng danh: Nelumbium nelumbo, Nelumbium speciosa, Nelumbium speciosum và Nymphaea nelumbo. 1.1.2. Vị trí phân loại: Giới  Plantae – Thực vật   Phân giới  Tracheobionta – Thực vật có mạch   Nhóm  Spermatophyta – Thực vật có hạt   Ngành  Magnoliophyta – Thực vật hạt kín (Ngành Ngọc Lan)   Lớp  Magnoliopsida – Hai lá mầm   Phân lớp  Magnoliidae   Bộ  Nymphaeales   Họ  Nelumbonaceae – Họ Sen   Chi  Nelumbo Adans.   Loài  Nelumbo nucifera Gaertn. – Sen   1.1.3. Mô tả hình thái thực vật Cây thảo, sống ở nước, to khoẻ, cao hơn một mét. Thân rễ (ngó sen) mập, mọc dài trong bùn, đính rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá. Lá hình tròn, vượt lên khỏi mặt nước, đường kính 30-40cm, màu lục xám, nếp nguyên lượn sóng, giữa lá thường trũng xuống, mặt sau đôi khi điểm những đốm màu tía, nhân hình khiên, hằng rõ; cuống lá đính vào giữa lá, dài một mét hay hơn, có nhiều gai cứng nhọn. Hoa to, mọc riêng lẻ trên cuống dài và thẳng, phủ đầy gai nhọn, đường kính 8-12cm, màu hồng, đỏ hoặc trắng; lá đài 3-5cm, màu lục nhạt, rụng sớm; cánh hoa nhiều; những cánh phía ngoài to, khum lòng mán, cánh giữa ở trong nhỏ hẹp dần, giữa cánh hoa và nhị có những dạng chuyển tiếp; nhị rất nhiều, màu vàng, chỉ nhị mảnh, có phần phụ (gạo sen) màu trắng và thơm; bộ nhụy gồm nhiều lá noãn rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen). Quả bế có núm nhọn, thường gọi là hạt sen, phần ngoài mỏng và có màu lục tía, phần giữa mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là lá mầm dài màu lục sẫm. Mùa hoa: tháng 5-6 ; mùa quả 7-9. 1.1.4. Phân bố, sinh thái: Nelumbo nucifera là một chi nhỏ, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và châu Mỹ. Trong thời cổ đại, sen mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nile, từ Ai Cập nó được mang đến Assyria, sau đó được trồng rộng rãi khắp nơi trên Ba Tư, Ấn Độ và Trung Quốc. Cây sen phổ biến tại Úc, Trung Quốc, Ấn Độ, Iran và Nhật Bản (Anon., 1966). Sen được mang từ Trung Quốc đến Nhật Bản và gieo trồng hơn 1000 năm (Komatsu et al, 1975.). Tại Trung Quốc trong năm 1999, Sen đã được đưa vào trồng với qui mô công nghiệp trên 40.000 ha. Ở Ấn Độ sen đã có mặt ở khắp nơi ngay cả ở hồ Himalayan độ cao lên đến 1.400 m (Polunin và Stainton, 1984). Ở Việt Nam, chi này có một loài là cây sen mọc hoang dại chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười, tỉnh Đồng Tháp và An Giang. Theo nhân dân địa phương, cây mọc trong trạng thái tự nhiên đã có từ lâu đời. Hàng trăm hecta Sen mọc tập trung ở gần và gần như thuần loại ở đây đã góp phần tạo nên cảnh quan sinh thái đặc biệt của vùng ngập nước Đồng Tháp Mười. Bên cạnh quần thể hoang dại, sen cũng là cây trồng quen thuộc ở các tỉnh Đồng bằng Trung du, suốt từ Nam đến Bắc. Cây được trồng ở các vùng ao hồ nước nông và trung bình. Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới, nên sen cũng được trồng nhiều ở hầu hết các nước khu vực Đông Nam Á đến Nam Á, như Campuchia, Thái Lan, Malaysia. Ở Việt Nam có người đã đưa sen lên trồng thử ở vùng núi cao Sapa (trên 1500m) nhưng cây sinh trưởng kém, thậm chí còn bị chết. Sen có một hệ thống thân phát triển, phân nhánh ngang nằm sâu ở lớp bùn đến 0.5m. Từ các đốt và phần đầu của thân rễ, hàng năm mọc lên nhiều lá. Độ dài của cuống lá tuỳ thuộc vào mức nước nông hay sâu; để phiến lá vừa khỏi mặt nước để thực hiện chức năng hô hấp và quang hợp. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, hoa nở vào buổi sáng, thụ phấn vào buổi trưa hoặc đầu buổi chiều. Gió và côn trùng là tác nhân truyền phấn quan trọng của cây. Khả năng tái sinh tự nhiên của sen chủ yếu từ hạt. Tuy nhiên, các đoạn thân rễ cũng được sử dụng để nhân giống. Đời sống của sen phụ thuộc tuyệt đối vào sự sinh trưởng, phát triển của lá. Nếu trong vòng 2 - 3 năm liền cắt bỏ toàn bộ các lá trên măt nước, phần thân rễ của sen ở dưới bùn sẽ bị chết. Sen là cây bán tàn lụi (chỉ phần lá) vào mùa đông. Cây sinh trưởng mạnh trong mùa Hè Thu. Việt Nam là nước có sản lượng sen lớn, hàng năm cung cấp từ vài trăm tấn đến một ngàn tấn hạt sen cho thị trường trong nước và xuất khẩu. 1.1.5. Cách trồng: Sen chủ yếu được trồng bằng thân rễ ở ao hồ đầm, ruộng trũng. Thời vụ trồng vào mùa xuân, khi thân rễ bắt đầu nảy mầm. Trước hết, tát cạn nước, vét lớp bùn mặt để riêng, rải một lớp lông gà, lông lợn, tóc rối sau đó đặt thân rễ với khoảng cách 0.6-1m rồi dùng bùn mặt phủ dày độ 15-20cm. Đợi lớp bùn mặt khô nẻ mới tháo nước vào. Có thể trồng từng đám trên vài ngàn mét vuông, về sau cây lan ra rất nhanh phủ kín mặt hồ. Những nơi không có điều kiện tát cạn nước có thể để trồng trên bè, thân rễ tự mọc lan xuống bùn ở đáy hồ và phát triển. Nhiều nắng, nước lưu thông trên duới một mét là những điều kiện lý tưởng để trồng sen. Cây ít bị sâu bệnh, hầu như không cần chăm bón. Nhưng phải giữ nước thật sạch. Không được vứt súc vật chêt, phóng uế, rửa đồ bẩn xuống đầm sen. Đặc biệt, không được ngâm ván thôi sẽ làm chết sạch cả đám sen. Sen trồng vào mùa xuân, sang hè đã có thể thu hoạch. 1.1.6. Bộ phận dùng: Hạt còn màng đỏ bên ngoài (liên nhục). Quả thu hái khi chín ( liên thạch ). Tâm sen là cây mầm trong hạt sen ( liên tâm ). Gương sen đã lấy quả ( liên phòng ). Tua sen bỏ hạt gạo ở đầu ( liên tu ). Lá sen thu hái vào mùa thu, bỏ cuống ( liên diệp ). Thân rễ thu hái quanh năm ( liên ngẫu ). Tất cả đều phơi khô hoặc sấy khô. 1.2. TỔNG QUAN VỀ HÓA HỌC: 1.2.1. Thành phần hóa học của Sen: Quả và hạt Hạt sen cấu tạo từ 3 thành phần: lớp vỏ bọc bên ngoài (3.74%), mầm (3.03%) và lá mầm (92.23%). Khối lượng trung bình của 100 hạt sen là 87.35g. Hạt sen chứa nhiều chất béo ( 72.17%), protein (2.70%), acid amin, acid béo chưa bão hòa và một số khoáng chất như: Clor (0.0042%), Natri (1.00%), Kali (28.5%), Calci (22.10%), Magie (9.2%), Đồng (0.0463%), Kẽm (0.084%), Mangan (0.0356%), Sắt (0.1990%). Các thành phần khác bao gồm: carbonhydrat thô (1.93%), chất xơ (10.60%), độ ẩm( 10.50%), tro toàn phần (4.50%). 100 gam hạt sen cung cấp năng lượng là 348.5 cal. Hạt sen còn chứa acid gallic , D (–) – 3’ – bromo – O – methyl armepavin, D - 1,2,3,4 – tetrahydro – 6 – methoxy – 1– (p – methoxy benzyl – 2 – methyl – 7 – isoquinolinol, các saponin và cacbonhydrat. Polysacharid trong hạt sen rất phực tạp, được cấu tạo từ 4 monosacharid chính là D-galactose, L-arabinose, D-mannose và D-glucose. Nuciferine: R1 = R2 =R3 = CH3 N-Nornuciferine: R1 = R2= CH3; R3=H O-Nornuciferine: R1 = H; R2 = R3= CH3 Cấu trúc Nuciferine, N-Nornuciferine, O-Nuciferine Lá sen Phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ cho thấy lá sen có chứa nhiều alkaloid, bao gồm nuciferin, roemerin, anonain, pronuciferin và N-nornuciferine , O-nornuciferine, 2 benzylisoquinolin alkaloid là (+)-1(R)-coclaurine(16), (–)-1(S)-norcoclaurine, N-nornuciferine, liriodenine, armepavine, N-methylcoclaurine, Dehydroemerine, dehydronuciferine, dehydroanonaine, N-methylisococlaurine, remerine, liensinine, isoliensinine, neferine, asimilobine và lirinidin. Lá sen cũng chứa nelumbosid các flavonoid như quercetin, leucoanthocyanidin, leucocyanidin và leucodelphinidin, một số rượu bậc hai như nonacosan-10-ol (16.2 ± 1.1%), triacontan-7-ol (2.4 ± 0.4%), nonacosane-4, 10-diol (18.6 ± 0.5%), nonacosane-5, 10-diol (34.1 ± 1.9%), nonacosane-10, 13-diol (12.0 ± 0.7%), hentriacontane-12, 15-diol (1.8 ± 0.0%), tritriacontane-9, 10-diol (0.7 ± 0.0%) và acid octadecanoic acid (0.7%), nonacosanediols (64.7%). Coclaurine R1 = CH3 Liriodenine Anonaline Norcoclaurine R1 = H Hoa sen Một số flavonoid đã được tìm thấy trong hoa sen: kaempferol và 7 glycosid của nó gồm: kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside, kaempferol 7-O-β-D-glucopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-2)-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol 3-O-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol 3-O-β-D-glucuronopyranosyl methylester, myricetin 3’,5’-dimethylether 3-O-β-D-glucopyranoside, quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside, nelumboroside A và nelumboroside B. Hoa sen còn chứa hai isorhamnetin glycoside là isorhamnetin 3-O-β-D-glucopyranosid và isorhamnetin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1(6)-β-D-glucopyranosid. Các hợp chất khác chứa trong hoa sen bao gồm adenine, myoinositol, arbutin và β-sitosterol glucopyranoside. Nelumboroside A: R1 = H Nelumboroside B: R1 = Rha Thân rễ (ngó sen) Thân rễ sen (ngó sen) được sử dụng như một loại rau ở nhiều nước châu Á. Nó là một trong những thức ăn tốt cho sức khỏe vì có chứa nhiều loại khoáng chất, tinh bột. Ngó sen tươi chứa 83.80% nước, 0.11% chất béo, 1.56% đường khử, 0.41% sucrose, 2.70% protein , 9.25% tinh bột, 0.80% chất xơ. Các vitamin bao gồm thiamine (0.22 mg/100 g), riboflavin (0.6 mg/100 g), niacin (2.10 mg/100 g), ascorbic acid (1.5 mg/100 g, amino acid asparagine(2%), oxalate(84.3 mg/100 ). Các khoáng chất: calci – 1.15%, đồng – 0.0015%, sắt – 0.053%, magie – 0.398%, kẽm – 0.0032%, bari – 0.00064%, kali – 0.756% và natri – 0.10% Dịch chiết methanol của thân rễ sen được xác định có chứa một triterpenoid steroid là betulinic acid Betulinic acid 1.2.2. Thành phần hoạt chất chính: Bài báo cáo này xin đi sâu vào tâm Sen. Thành phần chính của tâm sen có các alkoloid bisbenzylisoquinoline như liensinine, isoliensinine và neferine, cũng được gọi là Alkaloid phenolic. Cấu trúc hóa học: Liensinine R1= R2 = H, R3 = CH3 Isoliensinine R1= R3 = H, R2 = CH3 Neferine R1 = H, R = R3 = CH3 Cấu trúc LIE, ISO và NEF Tính chất lý hóa: Liensinine (C37H42O6N2) Bột trắng, vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 95 - 990C, tan trong CHCl3, ethanol, hay methanol. Dung dịch alcohol của nó cho kết tủa màu hồng hơi nâu với sắt chloride, và cũng cho kết tủa với những thuốc thử của Alkaloid. Isoliensinine (C37H42N2O6) Bột vàng sáng; nhiệt độ nóng chảy 69-71°C;
+ 50,68° (C = 0,302, CH3COCH3); UV (MeOH), (max 284,2 nm; IR (KBr), υmax 3450, 2960, 1620, 1520, 1252, 1125 cm-1; FABMS, m / z 611 [M + H]+; EIMS, m / z 489, 297, 192, 176, 121. Neferine (C38H44N2O6) Bột vàng sáng; nhiệt độ nóng chảy 59-61°C;
- 44,8° (C = 0,306, CHCl3); UV (MeOH), (max 283,1 nm; IR (KBr), υmax 3.421, 2.935, 2.834, 1.612, 1512, 1461, 1372, 1249, 1134 cm-1; FABMS, m / z 625 [M + H]+; EIMS, m / z 503, 297, 206, 190, 121, tương ứng với công thức phân tử. 1.3. Tổng quan về tác dụng - công dụng: Tác dụng dược lý Một vài hợp chất có tác dụng dược lý đã được phân lập từ lá, thân rễ, hạt và hoa sen. Các hợp chất khác nhau đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây sen. Các hợp chất quan trọng bao gồm các alkaloid, steroid, triterpenoid, flavonoid, glycoside and polyphenol. Dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của sen đã cho thấy các tác dụng: chống thiếu máu cục bộ, chống oxy hoá, kháng ung thư, kháng virus, làm giảm lipid huyết, hạ sốt, bảo vệ tế bào gan, làm giảm glucose huyết, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm và lợi tiểu. Công dụng trong y học cổ truyền. Tác dụng dược lý một số bộ phận dùng của sen Quả và hạt sen: chống thiếu máu cục bộ, chống oxy hoá, bảo vệ tế bào gan, chống tăng sinh tế bào, chống loạn nhịp, kháng virus, kháng viêm, ức chế quá trình xơ hóa. Lá sen: chống oxy hoá, kháng virus, chống béo phì, làm giảm lipid và cholesterol huyết Hoa sen: làm giảm ghucose huyết, chống oxy hoá, Hạ sốt, bảo vệ tế bào gan Thân rễ (ngó sen): cầm tiêu chảy, kháng khuẩn, làm giảm glucose máu, Hạ sốt, an thần, lợi tiểu, kháng viêm, chống oxy hóa. Tâm sen: được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc truyền thống ở Trung Quốc trong một thời gian dài. Nó được sử dụng chủ yếu để trị các chứng rối loạn thần kinh, chứng mất ngủ, sốt cao, bồn chồn, và các bệnh tim mạch như tăng huyết áp và loạn nhịp tim. Trong bài báo cáo này, sẽ nghiên cứu các alkaloid trong tâm Sen nên xin được trình bày các tác dụng dược lý của các alkaloid này: Liensinine (LIE), dẫn xuất của nó Isoliensinine (ISO) và Neferine (NEF) là ba alkaloid chính của tâm sen, cả ba đều thuộc nhóm benzyl isoquinolin alkaloid. Các nghiên cứu cho thấy LIE có khả năng làm chậm hoạt động điện của cơ tim, ISO có tác dụng đáng kể trong điều trị chứng xơ hóa phổi, cơ chế có thể là do khả năng chống oxy hoá và/hoặc khả năng chống viêm. NEF được ghi nhận có tác dụng ức chế sự đề kháng một số thuốc. Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây cho thấy ba alkaloid này có khả năng kháng HIV. Công dụng: Tất cả các bộ phận của sen đều được sử dụng làm thuốc. Lá, thân rễ, hạt và hoa được sử dụng trong điều trị viêm họng, đau ngực, di tinh, bạch tạng, đậu mùa, kiết lỵ, ho, chảy máu cam, ho ra máu, tiểu ra máu, chảy máu tử cung, sự tăng lipid huyết, sốt, bệnh tả, bệnh gan và chứng sung huyết. Ngoài ra, sen còn được sử dụng như là một thuốclợi tiểu và thuốc trị giun và được sử dụng trong điều trị tiểu són, nôn, bệnh phong, các bệnh da liễu. Trong y học phổ thông, nó được sử dụng trong các điều trị viêm mô, ung thư, bệnh da, bệnh phong và còn được sử dụng như một thuốc giải độc. Các chế phẩm từ sen - Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 Thành phố HCM đã sản xuất thuốc Sevona gồm có cao lá sen và một số dược liệu khác. - Trường Đại học dược Hà Nội đã được Bộ y tế cấp phép sản xuất trà thuốc Seivo có chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi và cao ích mẫu. - Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 TPHCM đã sản xuất thuốc an thần Seroga có chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao nhân hạt táo và cao thiên ma. - Ngoài ra còn có các sản phẩm chứa cao lá sen như: Lotus leaf capsule (viên nang lá sen) dùng chống béo phì, giảm lipid trong máu và còn có tác dụng long đờm như codein. Slim Tea (chè giảm béo) có chứa cao chè xanh, cao lá sen, cao thảo quyết minh, cao hoa cúc, cao cam thảo. 2. PHẦN THỰC NGHIỆM: Xin trình bày các phương pháp chiết xuất, phân lập các nhóm Alkaloid phenolic (liensinine, isoliensinine và neferine) từ tâm Sen (Embryo Nelumbinis) 2.1. Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm: Chiết xuất: Lấy 10 kg bột tâm sen khô, được làm ẩm với dung dịch Na2CO3 5 % (6:1), ngâm với benzene (36:1) ở nhiệt độ dưới 600C khoảng nửa ngày, thỉnh thoảng khuấy, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 1 ngày rưỡi. Dịch chiết benzene được lọc và phần cắn được rửa với benzene và ép khô cắn. Gộp chung dịch lọc và dịch chiết lại với nhau và chiết lại bằng cách lắc với HCl 3%. Dung dịch sau đó kiềm hóa bằng Na2CO3 đến khi xuất hiện tủa đục, và sau đó được chiết lại với CHCl3. Dịch chiết CHCl3 sau đó được bốc hơi đến cắn, thu được Alkaloid toàn phần là chất rắn có màu nâu nhạt. Thu được 110g sản phẩm, 1,1% so với khối lượng bột khô ban đầu. Alkaloid toàn phần ở trên được đun hồi lưu với ether trong một Soxhlet. Phần không tan trong ether được hòa tan trong CHCl3 và lắc với dung dịch NaOH 2%, làm lạnh bằng nước đá để chiết được alkaloid phenolic. Đối với dịch chiết kiềm, thêm NH4Cl để thu được lượng lớn kết tủa phenolic base, chất này được chiết với CHCl3. Dung dịch CHCl3 sau đó được bốc hơi đến cắn, thu được bột màu nâu của alkaloid phenolic toàn phần, chiếm khoảng 60-70% Alkaloid toàn phần. Phân lập Liensinine dưới dạng muối perchlorate: Hòa tan cắn phenolic base bằng cồn tuyệt đối, thêm từ từ từng giọt dung dịch acid perchloric 70% vào, làm lạnh và khuấy đều đến khi môi trường chuyển sang acid. Dung dịch được để yên qua đêm, đến khi thu được kết tinh trắng. Sản phẩm thu được chiếm 60-70% của phenolic base đã sử dụng. Kết tinh lại từ methanol hay ethanol. * Liensinine perchlorate được kết tinh dưới dạng những tinh thể hình lăng trụ trắng, nhiệt độ nóng chảy là 212 – 2140C. Liensinine perchlorate không tan trong nước và những acid vô cơ thông thường, hơi tan trong acid acetic loãng và acid ascorbic, tan trong dung dịch NaOH, rất tan trong acetone, methanol hoặc ethanol nóng. * Định tính nhóm chức N- methyl: Liensinine (1g) được hòa tan trong dung dịch acid sulfuric (10ml), thêm từ từ từng giọt dung dịch KMnO4 5%, vừa thêm vừa khấy, làm lạnh bằng nước đá. Việc thêm vào mất khoảng 1h, và ngừng lại khi không xuất hiện tủa màu hồng. Toàn bộ được lọc, thu lấy dịch lọc, gộp các dịch lọc lại với nhau và làm lạnh với nước đá. Thêm 50 ml dung dịch dimedone 1% vào dịch lọc, hỗn hợp được đun cách thủy trong vài phút, đến khi xuất hiện dạng nhũ tương trắng. Toàn bộ được để yên qua đêm, sản phẩm đươc ngưng kết, nhiệt độ nóng chảy 1900C, đúng với sản phẩm ngưng kết của formandehyde với dimedone (C8H15O2), không giảm xuống khi trộn lẫn với mẫu chuẩn. Dimedone là một diketone vòng được sử dụng trong hóa học hữu cơ để xác định một hợp chất chứa nhóm aldehyde. 2.2. Phương pháp ngấm kiệt Chiết xuất: Lấy 5 kg tâm sen sạch và khô được cắt nhỏ và ngâm trong MeOH (3 x 72 giờ) ở nhiệt độ phòng. Sau khi thu hồi MeOH, cắn được acid hóa đến pH 3 với H2SO4 1-2% và lọc. Dịch lọc loại chất béo bằng diethyl ether. Phần còn lại được kiềm hóa đến pH 9 với NH3 đậm đặc, và chiết với diethyl ether thu được 30,5g alkaloid toàn phần không tan. Hiệu suất chiết là:
Các chất chiết được sau đó được hòa tan trong một lượng thích hợp CHCl3 và lọc, dịch lọc được chiết xuất với NaOH 3% để có được 5g alkaloid phenolic. Phân lập: Các alkaloid phenolic được tiến hành sắc ký nhanh trên cột silica gel, sử dụng pha động là benzen-ethyl acetate-Diethylamine (7: 2: 1). Chất rửa giải được định tính bằng thuốc thử Dragendorff. Các phân đoạn có thành phần tương tự được gộp chung lại và bốc hơi dưới áp suất giảm đến khi cho ra hai loại hợp chất thân dầu. Mỗi loại được hòa tan trong NaOH 3%, và thêm một lượng thích hợp NH4Cl. Cặn được xử lý với diethyl ether và rửa lớp ether với nước cho đến khi trung tính, sau đó loại nước bằng NaSO4 khan. Loại bỏ ether dưới áp suất giảm, thu được các bột rắn chứa 1,15g (neferine) và 0,513g (isoliensinine). 2.3. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng kết hợp với dung dịch ion (Ionic liquid-based microwave-assisted extraction: ILMAE) Tổng quan: Gần đây, các dung dịch ion (ILs) đã mở rộng sang lĩnh vực phân tích hóa học, bao gồm cả điện hóa (electrochemistry), khoa học phân tích, khối phổ, và quang phổ. Do sự khác biệt về tính năng, quá trình tiền xử lý mẫu dưới sự hỗ trợ của Ils đã được nghiên cứu rất nhiều, chẳng hạn như chiết xuất lỏng-lỏng, vi chiết xuất pha lỏng, vi chiết xuất pha rắn và hệ thống chiết xuất hai pha lỏng- lỏng. Theo xu hướng nghiên cứu chung trong việc phát triển các phương pháp chiết xuất, đã có nhiều nghiên cứu kết hợp phương pháp MAE với ILs và áp dụng phương pháp cải tiến này để chiết xuất các alkaloid phenolic từ tâm sen rất hiệu quả. Phương pháp chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng kết hợp với dung dịch ion (Ionic liquid-based microwave-assisted extraction: ILMAE) đã được áp dụng thành công để chiết xuất hiệu quả các alkaloid phenolic có trong tâm sen. Các dung dịch ion được biết đến bao gồm một loạt bốn anion, bốn dẫn xuất 1-alkyl-3-methylimidazolium khác nhau trong chuỗi dài hydrophobic. Các kết quả cho thấy các anion khác nhau có tác dụng rõ ràng trên hiệu quả chiết xuất. Ngoài ra, ảnh hưởng của một số tham số vi sóng, chẳng hạn như năng lượng chiếu xạ, thời gian chiết xuất và tỷ lệ rắn - lỏng, cũng được nghiên cứu. Khi các điều kiện được tối ưu hóa , phương pháp cải tiến đã được đánh giá so với phương pháp chiết xuất hồi lưu (HRE) và MAE thông thường. Kết quả ghi nhận được là giảm thời gian chiết xuất đáng kể (từ 2h đến 90s) và điều đáng chú ý là hiệu quả chiết xuất rất cao (tăng từ 20% - 50%). Ngoài ra, phương pháp cải tiến này đã được xác nhận bởi tỷ lệ phục hồi, hệ số tương quan (R2), và độ sao chép lại (reproducibility) (RSD, n = 5), tương ứng trong khoảng 98-105%, 0,9994-0,9998, và 1,2 - 5,4%. Chiết xuất Thiết bị Phân tích HPLC với độ dài sóng 2450-MHz, toàn bộ hệ thống được chạy ở áp suất không khí và có thể được làm việc ở công suất tối đa của 700W. Tổng hợp và tính chất của các loại dung dịch ion của 1,3-dialkylimidazolium: ILs của 1-alkyl-3-methylimidazolium, bao gồm: 1-butyl - 3-methylimidazolium clorua ([C4MIM] Cl), 1-butyl-3 methylimidazolium bromua ([C4MIM] Br), 1-butyl-3-methylimidazoliumtetrafluoroborate ([C4MIM] [BF4]), 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([C4MIM] [PF6]), 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([C2MIM] [BF4]), 1-hexyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([C6MIM] [BF4]), 1-octyl-3 - methylimidazolium tetrafluoroborate ([C8MIM] [BF4]) Chúng được tổng hợp theo các qui trình mẫu. Tất cả ILs đã được sấy khô khoảng 12h dưới chân không ở 700C và độ tinh khiết của ILs đã được kiểm tra bởi quang phổ 1H NMR và 13C NMR. Các đặc tính của quang phổ NMR đã cho thấy không có tạp chất cơ học trong ILs. Các chất đã được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử Karl Fischer Titration. Độ nhớt được đo bằng máy đo độ nhớt. Tỷ trọng của ILs đã được đo bằng cách lấy chính xác thể tích 1ml bằng bình định mức, đánh dấu với mỗi IL và sau đó xác định trọng lượng. Ngoài ra, phương pháp nitrat bạc cho thấy không có nhũ tương trong [BF4] ILs. Những hằng số vật lý của ILs được liệt kê trong bảng 1. Bảng 1. Some physicochemical properties of studied ILs Ionic liquid  Solubility in water  Water content (ppm)  Density ( 250C, g/ml, dried)  Viscosity(Cp, 250C)     Measured  Literature  Measured  Literature  Measured  Literature   [C2MIM] BF4  Miscible  990  -  1.24  1.25  78  46/66   [C4MIM] Cl  Miscible  2320  220  1.10  1.08/1.10  Solid  Solid   [C4MIM] Br  Miscible  2080  -  1.32  -  Solid  -   [C4MIM] BF4  Miscible  4200  4530  1.16  1.12/1.17  248  219/233   [C4MIM] PF6  18 g/l  610  590  1.36  1.36  493  450   [C6MIM] BF4  Partly soluble  1900  -  1.23  1.21  380  310   [C8MIM] BF4  Partly soluble  1250  -  1.10  1.11  492  440   Chiết xuất hỗ trợ vi sóng kết hợp vói Ils: Lấp hệ thống sinh hàn trong suốt quá trình chiết xuất MAE. Cân 1g mẫu đã được sấy khô trộn với 10ml các dung dịch IL khác nhau, và sau đó chiếu xạ vi sóng. Các điều kiện chiết xuất đã được tối ưu hóa. Sau mỗi lần chiếu xạ, các hợp chất thu được làm lạnh đến 250C, sau đó pha loãng với 50ml nước cất hai lần, và lọc qua một màng lọc có kích thước 0,45(m và tiến hành phân tích HPLC. Phân tích HPLC và định lượng: Pha loãng dịch chiết, tiêm trực tiếp vào thiết bị của hệ thống sắc ký lỏng. Dung môi pha động là dùng đồng thời hỗn hợp 2 dung dịch: dd triethylamine 0,1% (A) và CH3CN (B). Tỉ lệ dung môi được thiết lập như sau: 5 phút đầu dd B chiếm 60% hh dung môi, 5 phút sau dd B chiếm 30%; tốc độ dòng là 0.8ml/phút. Độ dài bước sóng 280nm và thể tích tiêm là 20(l. Theo những điều kiện này, 3 alkaloid phenolic được tách biệt nhau. Việc xác định đỉnh hấp thu được thực hiện bằng cách so sánh với thời gian lưu của mẫu chuẩn. Việc so sánh các sắc ký đồ của ba alkaloid phenolic với sự có mặt của Ils so với dd chuẩn đã được liệt kê trong hình 1. Nhận thấy rằng không có bất kỳ sự ảnh hưởng nào của các IL đối với quá trình phân tích, điều đó được thể hiện trên sắc ký đồ, thứ tự rửa giải và thời gian rửa giải.
Hình 1: Sắc ký đồ HPLC và cấu trúc hóa học của Linensinie, Isolinensine, Neferine trong dịch chiết ion[C6MIM][BF4] và của Linensinie, Isolinensine, Neferine chuẩn (hình nhỏ) Kết quả và thảo luận Các thử nghiệm về ILs: Cấu trúc của ILs ảnh hưởng đáng kể tính chất hóa lý của nó, điều đó có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất các chất phân tích. Để đánh giá hiệu quả chiết xuất của các dẫn chất 1-alkyl-3-methylimidazolium (xem Bảng 1) trong quy trình MAE, tác dụng của các anion và độ dài chuỗi alkyl của cation trên hiệu quả chiết xuất đã được nghiên cứu. Từ Bảng 1 có thể rõ ràng nhận thấy rằng trong các ILs được giới thiệu ở đây, sự hiện diện của các anion có ảnh hưởng rất lớn. Như vậy, 1-butyl-3-methylimidazolium ILs với bốn anion khác nhau (Cl-, Br-, BF4-, PF6-) đã được thử nghiệm. Hiệu quả chiết xuất ba hợp chất chính cho thấy rằng BF4- hiệu quả hơn so với các anion khác trên mẫu nghiên cứu. Ngược lại, [C4MIM] [PF6] cho thấy không có hiệu quả vào việc chiết xuất, điều này có thể quy cho tính kỵ nước của nó. Theo các kết quả nghiên cứu, với cùng một anion là BF4 -, việc tăng độ dài chuỗi alkyl từ ethyl đến octyl của cation 1-alkyl-3 - methylimidazolium có ảnh hưởng không đáng kể trên việc chiết xuất. Mặc dù đã có báo cáo cho rằng các thành phần dịch chiết được của BF4 - IL không những phụ thuộc vào độ dài của chuỗi alkyl, mà còn bị ảnh hưởng khi nồng độ ILs tương đối thấp (0.5M). Để xem xét sự phụ thuộc vào độ dài của chuỗi alkyl trong hiệu quả chiết xuất, hai IL, [C4MIM] [BF4] và [C6MIM] [BF4], được lựa chọn cho việc đánh giá này (xem Hình.2a). Hơn nữa, nồng độ của hai IL cũng đã được nghiên cứu. Kết quả được hiển thị trong Hình.2b chỉ ra rằng: nồng độ thích hợp của [C4MIM] [BF4] tối đa là 1.5M, trong khi [C6MIM] [BF4] tối đa là 1M. Hiệu quả chiết xuất sẽ giảm đáng kể khi tăng nồng độ của Ils.
Hình 2: (a) Ảnh hưởng của Ils ( [C4 MIM][BF4] 0.5M và [C6 MIM][BF4] 0.5M) đối với hiệu suất chiết. (b)Ảnh hưởng của nồng độ [C4 MIM][BF4] và [C6 MIM][BF4] đối với hiệu suất chiết. Với khối lượng mẫu 1.0g, thể tích dịch chiết 10ml, cường độ chiếu xạ 280W, thời gian chiết 120s. Tối ưu hóa quy trình ILMAE: Phương pháp này được dùng khi đã tối ưu hóa ba tham số có ảnh hưởng lớn đến quy trình chiết xuất: năng lượng bức xạ, thời gian chiết và tỷ lệ rắn – lỏng (những kết quả của [C6MIM][BF4] được hiển thị trong Hình 3). Đối với [C4MIM][BF4], hiệu quả chiết xuất có thể đạt giá trị cực đại với năng lượng bức xạ là 280W. Đối với [C6MIM][BF4 ], mặc dù nó có thể cho hiệu quả cao hơn một chút khi chiết liensine ở 460W, hình như nó có thể cho hiệu quả chiết tương đối cao hơn khi chiết isoliensine và neferine, năng lượng bức xạ là 280W (40% trị số cực đại).


Hình 3: Ảnh hưởng của cường độ chiếu xạ vi sóng (a), thời gian chiết (b), tỉ lệ dược liệu – dung môi (c) đối với hiệu suất chiết với nồng độ [C6 MIM][BF4] là 1.0M, khối lượng mẫu 1.0g. Thời gian chiết xuất dùng bức xạ vi sóng thay đổi trong khoảng 5-240s, hai dịch chiết có chứa dung dịch ion được xử lý tương tự. Hiển nhiên thấy rằng thời gian chiết tối ưu khoảng 90s. Đồng thời, hiệu quả chiết xuất tăng khi tỷ lệ rắn – lỏng thay đổi từ 1: 5 đến 1: 10 ở cả hai IL. Khi tăng đến 15 mL và sau đó là 20 mL [C4MIM][BF4] hiệu quả chiết tăng không có ý nghĩa. Tuy nhiên, đối với [C6MIM][BF4], hiệu quả giảm đáng kể khi tỷ lệ rắn- lỏng thay đổi từ 1: 15 đến 1: 20. Điều này là do khi tăng độ dài chuỗi alkyl, kết quả làm giảm tính tan trong nước và làm tăng độ nhớt. Từ đó cho thấy rằng tỷ lệ rắn – lỏng là 1: 15 cho [C4MIM][BF4] và 1: 10 cho [C6MIM][BF4] được chấp nhận trong sự nghiên cứu này. So sánh các phương pháp ILMAE với phương pháp thông thường: Analytes  Proposed methods    ILMAE ([C4MIM][BF4], n = 5)  ILMAE ([C6MIM][BF4], n = 5)    Observed values (mg/g)  Recovery yields (%)  Observed values (mg/g)  Recovery yields (%)    Mean  SD  Mean  SD  Mean  SD  Mean  SD   Liensinine  1.053  0.057  98.0  2.11  0.943  0.042  100.2  3.47   Isoliensinine  5.316  0.071  105.0  0.80  5.127  0.114  105.0  1.53   Neferine  15.76  0.329  104.9  0.84  14.69  0.324  104.6  0.30   Dựa trên 2 bảng kết quả, phương pháp ILMAE có thể nâng cao đáng kể tăng hiệu quả chiết xuất (20% - 50%) 3 hoạt chất và chiết xuất trong thời gian tổng cộng từ 2h đến 90s. Nhằm tiếp tục chứng minh việc sử dụng ILS, các phương pháp đề xuất sau đó được so sánh với quá trình MAE thông thường trong các điều kiện tương tự. Kết quả thể hiện trong Bảng 2 chỉ ra rằng hiệu quả chiết xuất của MAE thông thường là hơi cao hơn phương pháp HRE thường; tuy nhiên, kết quả thu được nó vẫn thấp hơn nhiều (20-50%) so với phương pháp cải tiến ILMAE. Điều này có nghĩa là việc kếp hợp ILs trong MAE có tiềm năng rất lớn, và là một phương pháp nhanh chóng và có hiệu quả cho việc chiết xuất các alkaloid phenolic từ Tâm sen. Bảng 2.Comparative study of extraction efficiency using different extraction methods Conventional methods   Regular MAE (MeOH 80%, n=3)  HRE (MeOH 80% , n=3)   Observed values (mg/g)  Recovery yields (%)  Observed values (mg/g)  Recovery yields (%)   Mean  SD  Mean  SD  Mean  SD  Mean  SD   0.621  0.017  103.2  2.43  0.565  0.024  108.2  4.76   4.012  0.122  102.9  1.06  3.573  0.080  106.5  3.84   12.02  0.494  104.0  1.51  10.68  0.130  109.8  3.21   Phân tích hiệu suất của phương pháp được đề xuất: Để đánh giá hiệu suất phương pháp MAE kết hợp với ILs, một vài tham số như tính tuyến tính (linearity), độ sao lại (reproducibility), và tỷ lệ phục hồi được xác định theo các điều kiện tối ưu (xem Bảng 3). Giới hạn phát hiện (LODs) và giới hạn của định lượng (LOQs) từ 2,16-2,56 (g/l và 7,20 - 8,54 (m/l, hệ số tương quan của phương trình hồi qui là 0,9994 - 0,9998. Nghiên cứu độ sao chép lại được thực hiện bằng việc chiết xuất lặp đi lặp lại (1,0g mẫu mỗi lần) với cả phương pháp cải tiến và truyền thống. Từ bảng 3 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp cải tiến là 1,2% - 5,4%. Với tỷ lệ phục hồi từ 98,0% - 105,0% và RSD thấp hơn 5,4%, điều này cho chúng ta thấy rằng, hiện nay phương pháp mới cải tiến này rất đáng tin cậy. Bảng 3: Phương trình đường thẳng, hệ số tương quan, miền giá trị, LOD, LOQ của Linensinie, Isolinensine, Neferine chiết với sự hỗ trợ vi sóng kết hợp Ils Chất  Phương trình đường thẳng  Hệ số tương quan  Miền giá trị (mg/l)  Giới hạn phát hiện (LOD) (µg/ml)  Giới hạn định lượng (LOQ) (µg/ml)   Linensinie  y =14.038x –0.453  R2 = 0.9997  x = 5.05–2020  2.56  8.54   Isolinensine  y = 16.657x + 48.740  R2 = 0.9994  x = 4.86–2430  2.16  7.20   Neferine  y = 14.472x + 65.959  R2 = 0.9998  x = 8.13–1300  2.49  8.29   Kết luận Nghiên cứu này đã chứng minh rằng các quá trình chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng kết hợp với Ils cho hiệu quả chiết xuất rất tuyệt vời. So với HRE và MAE thông thường, phương pháp cải tiến này cho hiệu quả chiết xuất cao hơn, và rõ ràng là giảm thời gian chiết xuất đáng kể.Các kết quả kiểm tra cho thấy phương pháp này thích hợp cho việc chiết xuất hiệu quả các alkaloid phenolic từ sen. 2.4. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction): Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm ngày càng chứng tỏ có nhiều lợi ích trong việc chiết xuất các hợp chất từ dược liệu. Tuy nhiên, nhóm chúng tôi chưa tìm được quy trình chiết xuất cụ thể. Phần trình bày dưới đây là các thí nghiệm nhằm xây dựng quy trình chiết Liensinine, Isoliensinine và Neferin từ tâm sen, cho thấy phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của siêu âm cho hiệu quả cao khi chiết xuất các alkaloid này. Xây dựng quy trình chiết LIE, ISO, và NEF từ tâm sen Thiết bị và điều kiện tiến hành HPLC - Chất chuẩn cho LIE, ISO và NEF được chuẩn bị sẵn. Độ tinh khiết của các hợp chất này > 98% (xác định độ tinh khiết bằng HPLC, NMR và MS). - Dung môi chạy HPLC là Acetonitrile (được mua từ Công ty TNHH Hóa chất và Hoá chất Thượng Hải, Thượng Hải, Trung Quốc) - Nước được sử dụng trong các thí nghiệm là Milli-Q Grade (Millipore, Bedford, MA, USA). - Các hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết. - Tất cả các mẫu thử và các dung môi được sử dụng cho các phép đo HPLC được lọc qua màng lọc (0,45 μm) và loại khí trước khi sử dụng. - Hệ thống HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo Alto,CA, Hoa Kỳ) được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm. Hệ thống này được trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động với một khay chứa mẫu được làm mát, một hệ thống phân phối dung môi và một hệ thống kiểm soát nhiệt độ cột. - Bước sóng phát hiện là 282 nm. Tại bước sóng này, dectector phát hiện được cả 3 hợp chất. - Thể tích tiêm mẫu là 10 μl. - Nhiệt độ cột là 30oC. - Tốc độ dòng là 1ml/phút cho tất cả thí nghiệm. - Cột phân tích có kích thước 4.6mm x 150mm, được nạp 5μm silica C18. - Dung môi rửa giải (pha động) là hỗn hợp acetonitrile và triethylamine 0.1% . Xây dựng quy trình Để xây dựng được quy trình chiết ba alkaloid từ tâm sen, cần tiến hành các thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của các dung môi, ảnh hưởng của các phương pháp chiết, thời gian chiết cũng như tỉ lệ dung môi- dược liệu. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết - Phương pháp chiết: phương pháp cất hồi lưu (refluxing). - Cố định tỷ lệ dung môi - dược liệu và thời gian chiết - Cách tiến hành + Cân 1,0 g tâm sen, cho vào một becher 100ml. + Tiến hành chiết với 7 dung môi: ethanol 95% (1); ethanol 70% (2); ethanol 50% (3); methanol 90% (4); dung dịch acid hydroclorid 0,25% (5); dung dịch acid sulfuric 0,25% (6) và cloroform (7). + Mỗi dịch chiết thu được cho vào một bình định mức 100ml và bổ sung vừa đủ 100 ml bằng dung môi tương ứng. + Lần lượt lọc các dịch chiết qua lọc 0,45μm + Tiến hành phân tích bằng HPLC, mỗi dịch chiết được lặp lại 4 lần. - Kết quả Hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA (total alkaloid = alkaloid toàn phần= tổng hàm lượng LIE, ISO, NEF) khi chiết với 7 dung môi được liệt kê ở Bảng 4. Bảng 4: Hàm lượng (g/100g) của LIE, ISO, NEF và TA khi chiết với các dung môi Dung môi  Hàm lượng (g/100g)    LIE  ISO  NEF  TA   Ethanol 95%  0.311  0.263  0.839  1.413   Ethanol 70%  0.318  0.279  0.882  1.479   Ethanol 50%  0.282  0.213  0.667  1.162   Dung dịch acid hydroclorid 0,25%  -  0.282  0.881  1.163   Dung dịch acid sulfuric 0,25%  -  0.288  0.883  1.171   Methanol 90%  0.369  0.231  0.780  1.380   Cloroform  0.251  0.232  0.798  1.281   Ghi chú: - : sản phẩm bị phân hủy trong dịch chiết - Nhận xét: + Dịch chiết nước acid cho hàm lượng alkaloid khá cao, nhưng, LIE bị phân hủy khi chiết với dung dịch nước acid (nguyên nhân gây ra sự phân hủy của LIE có thể là do ảnh hưởng của nhiệt độ chiết). + Khi chiết với dung môi là ethanol 50% thì kết quả không khác biệt nhiều so với chiết bằng methanol 90% và chloroform. + Ethanol 70% cho hiệu suất chiết cao nhất. + Khi tăng nồng độ cồn hơn 70%, thì hàm lượng alkaloid thu được không thay đổi nhiều. Điều này có nghĩa là có thể chiết xuất với nồng độ cồn cao hơn 70%, tuy nhiên cần tránh xây dựng một quy thình chiết xuất với nồng độ cồn quá cao. Vì vậy, chọn dung môi là ethanol 70% . Thí nghiệm 2: So sánh các phương pháp chiết - Theo thí nghiệm trên, dung môi chiết đượ chọn là ethanol 70%. - Cố định tỷ lệ dung môi - dược liệu và thời gian chiết. - Cách tiến hành + Cân 1,0 g tâm sen, cho vào một becher 100ml. + Tiến hành chiết bằng bốn phương pháp: ngấm kiệt (Maceration), chiết hồi lưu (Refluxing), chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction), chiết với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction). + Mỗi dịch chiết thu được cho vào một bình định mức 100ml và bổ sung dung môi (ethanol 70%) vừa đủ 100 ml. + Lần lượt lọc các dịch chiết qua lọc 0,45μm + Tiến hành phân tích bằng HPLC, mỗi dịch chiết được lặp lại 4 lần. - Kết quả Hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA (total alkaloid = alkaloid toàn phần= tổng hàm lượng LIE, ISO, NEF) khi chiết bằng 4 phương pháp được liệt kê ở Bảng 5. Bảng 5: Hàm lượng (g/100g) của LIE, ISO, NEF và TA khi chiết bằng các phương pháp khác nhau Phương pháp chiết  Hàm lượng (g/100g)    LIE  ISO  NEF  TA   Ngấm kiệt  0.214  0.195  0.676  1.085   Chiết hồi lưu  0.312  0.264  0.873  1.449   Chiết có hỗ trợ vi sóng  0.231  0.230  0.791  1.252   Chiết có hỗ trợ siêu âm  0.294  0.265  0.866  1.425   - Nhận xét + Phương pháp cho hàm lượng alkaloid toàn phần cao nhất là chiết hồi lưu. + Hiệu suất chiết của phương pháp có hỗ trợ của siêu âm so với chiết hồi lưu là 98,3 % (chỉ chênh lệch 1.7%). + Hiệu suất chiết của 2 phương pháp ngấm kiệt và chiết có hỗ trợ của vi sóng so với chiết hồi lưu lần lượt là 74,9% và 86,4%. + Qui trình chiết với sự hỗ trợ của siêu âm đơn giản hơn nhiều so với quy trình chiết hồi lưu. Vì vậy chọn phương pháp chiết có sự hỗ trợ của siêu âm. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỉ lệ dung môi – dược liệu - Phương pháp chiết: chiết có sự hỗ trợ của siêu âm - Dung môi chiết: ethanol - Gọi nồng độ cồn, thời gian chiết, tỉ lệ dung môi – dược liệu lần lượt là x1, x2, x3 - Tiến hành thí nghiệm 15 lần với các giá trị x1, x2, x3 thay đổi (xem bảng 3). Kết quả - Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đối với hàm lượng LIE, ISO,NEF và TA được trình bày trong Bảng 6 . Bảng 6: Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đối với hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA Thí nghiệm  Các biến  Hàm lượng (g/100g)    x1 (%)  x2 (phút)  x3  LIE  ISO  NEF  TA   1  60  10  20  0.288  0.208  0.718  1.213   2  60  20  20  0.290  0.216  0.724  1.230   3  80  10  20  0.297  0.223  0.735  1.254   4  80  20  20  0.326  0.249  0.786  1.361   5  70  10  10  0.305  0.243  0.753  1.301   6  70  10  30  0.312  0.238  0.781  1.331   7  70  20  10  0.300  0.238  0.760  1.297   8  70  20  30  0.317  0.257  0.810  1.384   9  60  15  10  0.262  0.214  0.690  1.166   10  80  15  10  0.269  0.219  0.712  1.201   11  60  15  30  0.267  0.225  0.709  1.201   12  80  15  30  0.319  0.243  0.783  1.345   13  70  15  20  0.309  0.250  0.793  1.352   14  70  15  20  0.306  0.248  0.787  1.341   15  70  15  20  0.300  0.246  0.810  1.356   - Nhận xét + Nồng độ cồn, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi – dược liệu đều ảnh hưởng đến hàm lượng alkaloid toàn phần, đặc biệt là nồng độ cồn. + Sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt (RSM = Response surface methodology), với sự hỗ trợ của chương trình tối ưu hóa ARSA (Accelerated random search algorithm), các điều kiện tối ưu là: nồng độ cồn 75%, thời gian chiết 20 phút và tỷ lệ dung môi – dược liệu là 30:1. 2.5. Phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng điều chế (Preparative counter-current chromatography: Preparative CCC): Giới thiệu Kể từ khi Liensinine được phân lập vào năm 1962, ba alkaloid đã nhận được sự chú ý đáng kể vì đặc điểm nổi bật về tính chất hóa học và sinh học. Tuy nhiên, các nghiên cứu dược lý của chúng thường bị giới hạn do nguồn và độ tinh khiết của mẫu. Để có được những hợp chất tinh khiết bằng phương pháp tách thông thường, chẳng hạn như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng thì rất khó bởi vì cấu trúc của chúng tương tự nhau và tính chất hoá học không bền vững. Sắc ký phân bố ngược dòng là một kỹ thuật sắc ký phân bố lỏng - lỏng không sử dụng chất nền là chất rắn vì thế sẽ hạn chế được nhược điểm của chất rắn nền như sự mất mẫu do tính hấp phụ không thuận nghịch, làm mẫu mất tác dụng, không tinh khiết và gây hiện tượng kéo vệt. Phương pháp đã được áp dụng thành công để phân tích và tách nhiều loại sản phẩm tự nhiên và tổng hợp. Gần đây, các nghiên cứu đã phát triển CCC loại J đa năng với bốn cột cuộn đa tầng thẳng đứng được bố trí đối xứng quanh trục máy ly tâm, các thí nghiệm đã chứng minh rằng thiết bị CCC thẳng đứng rất hữu ích trong việc phân lập và tinh khiết các dịch chiết thô của hợp chất tự nhiên hay tổng hợp ở quy mô lớn. Cho đến nay, không có báo cáo nào công bố về sử dụng CCC cho phân lập và tinh khiết liensinine và hợp chất tương tự của nó. Do đó, nghiên cứu này là phát triển phương pháp CCC cho việc phân lập và tinh khiết liensinine và hợp chất tương tự từ tâm Sen. Thử nghiệm Thiết bị: CCC phân lập và tinh khiết Liensinine và các hợp chất tương tự từ tâm Sen đã được thực hiện bởi máy ly tâm cuộn hành tinh thẳng đứng với 4 cuộn đa tầng kết thành một chuỗi (upright coil planet centrifuge with four multilayer coils connected in series). Nguyên tắc và kích thước thiết kế của nó được mô tả trong tài liệu (S. Wu, C. Sun, K. Wang, Y. Pan, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 171). Điều chế các alkaloid thô: 12kg bột tâm sen khô được chiết xuất ba lần với ethanol 95% (10 lít × 3). Sau đó, gộp các dịch chiết, bốc hơi dưới áp suất giảm 40◦C để được khoảng 500ml. Dịch chiết đậm đặc được hòa tan trong 4 lít HCl 1.5% và lọc bằng giấy lọc loại 102 (giấy Xinhua, Hàng Châu, Trung Quốc). Tiếp theo, thêm ammoniac 10% vào dịch lọc cho đến khi pH của dung dịch đạt 8.5. Kết quả thu được 85g alkaloid thô có kết tủa màu vàng. Chuẩn bị hệ dung môi hai pha và dung dịch mẫu: Hệ dung môi hai pha được sử gồm dầu hỏa (b.p 60-900 C) - ethylacetate - tetrachloromethane - chloroform - methanol - nước với tỷ lệ thể tích khác nhau. Hỗn hợp dung môi được cân bằng trong phễu tách ở nhiệt độ phòng và sử dụng ngay sau khi hai pha đã được tách ra. Đối với việc tách bằng CCC điều chế được trình bày, tổng thể tích của hai pha là 6 lít. Các dung dịch mẫu được chuẩn bị bằng cách hòa tan các alkaloid thô trong một hỗn hợp dung môi hai pha có thể tích hai pha bằng nhau ở nồng độ phù hợp để tách bằng CCC quy mô lớn Quy trình tách: CCC điều chế được thực hiện như sau: bốn cột cuộn đa tầng kết nối thành một dãy, đầu tiên được nạp đầy bằng pha ở trên và đóng vai trò như pha tĩnh. Sau đó dung dịch mẫu đã được tiêm thông qua bộ phận tiêm mẫu, pha đóng vai trò như là pha động được bơm vào theo phương thức rửa giải từ đầu đến đuôi với tốc độ dòng 5ml / phút, trong khi đó cột được quay với tốc độ 450 vòng/phút. Các chất đi ra được theo dõi trực tiếp ở bước sóng 280 nm và tự động thu lấy 20 ml vào một ống kiểm tra mỗi 3 phút bằng cách sử dụng một dụng cụ thu phân đoạn BSZ-100. Peak của các phân đoạn phụ thuộc vào dữ liệu rửa giải và sự phát hiện của HPLC. Phân tích HPLC và xác định các peak phân đoạn của CCC: Phân tích bằng HPLC các alkaloid thô và peak của các phân đoạn của CCC được thực hiện bằng cột YMC-Pack ODS-A (150 mm × 4,6 mm i.d. , 5μ m, 120 Å). Pha động là A (acetonitrile) và B (dung dịch triethylamin 0,2% ) tại gradient: A từ 40-80% và B từ 60 đến 20% trong 15 phút. Tốc độ dòng là 0.8 ml/phút, và chất rửa giải được kiểm tra ở bước sóng 280 nm. Nhận ra các peak phân đoạn của CCC được thực hiện bởi electrospray ionization (ESI) đa khối phổ (MSn ), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều (1D và 2D NMR) bao gồm cả phổ 1H NMR, 13C NMR, DEPT 135, DEPT 90, 1H - 1H COSY, HMQC, HMBC. Phân tích ESI-MS n (+) được thực hiện bằng cách sử dụng quang phổ kế Bruker Esquire 3.000 plus với giao diện ESI. Phân tích MSn của các ion chọn lọc được thực hiện trong các bẫy ion bằng cách va chạm dẫn đến sự phân ly (CID) với Heli. Thí nghiệm NMR 1D và 2D đã được tiến hành bằng cách sử dụng máy quang phổ NMR Bruker Advanced DMX 500 với cloroform (CDCl3) là dung môi và tetramethylsilane (TMS) như tiêu chuẩn nội bộ. Kết quả và thảo luận: Phân tích HPLC và tách CCC điều chế: Alkaloid thô được lấy từ tâm Sen lần đầu tiên được phân tích bằng HPLC. Kết quả Hình 1 chỉ ra rằng có chứa một số hợp chất bao gồm liensinine (khoảng 15,4%), isoliensinine (khoảng 15,9%), neferine (khoảng 47,6%) và một số hợp chất chưa biết. Phân tách dùng CCC thành công phụ thuộc vào đúng hệ dung môi. Nói chung, hệ dung môi hai pha nên đáp ứng các yêu cầu sau: (1) không phân hủy hoặc làm biến tính mẫu; (2) đủ hòa tan mẫu; (3) hệ số phân bố thích hợp; (4) sự lưu lại trên pha tĩnh thích hợp. Vì vậy, một loạt các thí nghiệm để thăm dò việc hòa tan alkaloid thô trong nhiều dung môi, chẳng hạn như dầu hoả, ethyl acetate, tetracholoromethane, cloroform, meathanol, dimethyl sulfoxide và nước, đã được thực hiện và thấy rằng các alkaloid thô được trình bày có tính thân dầu có thể phân bố trong dung môi hai pha với độ phân cực trung bình. Vì thế hệ dung môi hai pha gồm dầu hoả (b.p.60-900C) - ethylacetate - Tetrachloromethane - chloroform - methanol - nước với tỷ lệ thể tích khác nhau đã được sử dụng làm dung môi bắt đầu. Để đạt được sự phân tích có hiệu quả các hợp chất mục tiêu, mỗi lần dùng 500mg alkaloid thô hòa tan trong 5 ml pha phía trên và 5 ml pha phía dưới và hệ dung môi hai pha với tỷ lệ thể tích 1:1:2:6:6:2, 1:1:3:5:6:2, 1:1:4:4:6:2, 1:1:8:0:6:1, và 0:1:6:0:4:1 được nghiên cứu bằng thiết bị CCC đã được trình bày với công suất 1600ml. Các kết quả tìm được cho thấy rằng các hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 1:1:4:4:6:2, 0:1:6:0:4:1 là tối ưu cho việc tách liensinine và các hợp chất tương tự của nó mặc dù khi sử dụng các hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 1:1:2:6:2, 1:1:3:5:6:2 và 1:1:8:6:2, mức độ lưu của pha tĩnh có thể lên đến 75% và alkaloid thô có thể được phân giải một phần. Sử dụng các hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 1:1:2:6:2, 1:1:3:5:6:2, hệ số phân bố và độ phân giải tương đối thấp cũng như thời gian rửa giải ngắn (ít hơn 120 phút), một phần có lẽ do độ phân cực của hai hệ dung môi này mạnh hơn hệ dung môi khác. Sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 1:1:4:4:6:2, trong việc lưu giữ các pha tĩnh trong cột cuộn đa tầng lên đến 80% và ba alkaloid được phân tích một cách hiệu quả trong thời gian ngắn (150 phút). Tuy nhiên, do thời gian rửa giải ngắn và các peak phân tích khít nhau, hệ dung môi không thể rửa giải một lượng lớn alkaloid. Sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 0:1:6:0:4:1, ba alkaloid đã được tách ra ở độ phân giải cao hơn mặc dù thời gian rửa giải dài hơn (9 h). Do sự lưu giữ cao của pha tĩnh (84%) và độ phân giải cao, hệ dung môi có thể được sử dụng để rửa giải một lượng lớn alkaloid. Sử dụng hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 1:1:8:0:6:1, sự lưu giữ của pha tĩnh (76%) là thấp hơn và thời gian rửa giải (11 h) dài hơn so với hệ dung môi với tỷ lệ thể tích 0:1:6:0:4:1. Do đó, hai hệ dung môi với tỉ lệ thể tích là 1:1:4:4:6:2 và 0:1:6:0:4:1 đã được lựa chọn và áp dụng cho việc điều chế và phân tách bằng CCC ở quy mô lớn. Hình. 2 cho thấy sự phân tách bằng phương pháp CCC điều chế, 1102 mg alkaloid thô với hệ dung môi dầu hỏa (b.p.60–900C) – ethylacetate – tetrachloromethane – chloroform – methanol – water (1:1:4:4:6:2, v/v) và phân tích HPLC tương ứng với các peak của Liensinine, isoliensinine và neferine của CCC. Để tiết kiệm dung môi và thời gian, sau khi những chất mục tiêu đã được tách ra, các hợp chất rửa giải khác bằng cách bơm các pha tĩnh ra ngoài thay vì dùng pha động để rửa giải vì các pha tĩnh chỉ dùng một lần. Sau khi thu các phân đoạn tương ứng dữ liệu CCC và thêm HPLC phân tích. Kết quả thu được 350mg neferine, 100mg isoliensinine và 95mg liensinine với độ tinh khiết hơn 95% chỉ với một bước phân tách trong thời gian 150 phút, cho thấy rằng hệ dung môi hai pha rất hiệu quả cho việc tách nhanh alkaloid phenolic bằng CCC. Hình.3 cho thấy sự phân tách bằng CCC điều chế 5850 mg alkaloid thô sử dụng hệ dung môi ethylacetate – tetrachloromethane – methanol – water (1:6:4:1, v/v) và phân tích HPLC tương ứng với các peak liensinine, isoliensinine và neferine của CCC. Kết quả thu được 2545mg neferine, 698mg isoliensinine và 650mg liensinine độ tinh khiết hơn 97% chỉ với một bước phân tách trong thời gian 9h, mà nó chỉ rõ rằng hệ dung môi hai pha rất hiệu quả cho việc tách alkaloid bằng CCC ở quy mô lớn. Nhận dạng cấu trúc của các hợp chất phân lập Các cấu trúc của tất cả các hợp chất tương ứng với peak của CCC ở phân đoạn 1, 2, 3 được xác định bởi ESI-MS n, phổ NMR 1D và 2D. Wu et al và các nghiên cứu gần đây báo cáo dữ liệu Electron Impact Ionization (EI), 1H và 13C NMR của liensinine, isoliensinine và neferine. Tuy nhiên, không có đầy đủ dữ liệu về 1D, 2D và ESI-MS n cho các hợp chất này. Ở đây lần đầu tiên chúng tôi đưa ra dữ liệu ESI-MS n và 2D rõ ràng về proton, carbon của ba hợp chất. Liensinine dạng bột vô định hình, màu trắng, độ hấp thụ UV (
) ở 212 và 278 nm. Phổ ESI-MS của hợp chất (+) cho thấy các ion đặc trưng tại m / z 611 do [M + H] + (Hình.4A). Phổ MS2 của các ion tiền thân m / z 611 cho thấy rõ những mảnh đặc trưng (hình.4B). Các dữ liệu NMR 1D và 2D được thể hiện trong Bảng 7 và 8.

Hình 4. Electrospray positive ion mass spectra of liensinine: (A) MS, (B) MS–MS spectrum (m/z 611, ()