Chuyên đề Dược liệu Các phương pháp đánh giá dược liệu chứa alkaloid nói chung và dược liệu chứa quinine nói riêng

CHUYÊN ĐỀ DƯỢC LIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID NÓI CHUNG VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA QUININE NÓI RIÊNG --------------------------------------- MỤC LỤC Lời mở đầu 3 Chương I. Tổng quan tài liệu 4 1.1 Phương pháp đánh giá dược liệu 4 1.1.1 Cảm quan 4 1.1.2 Sử dụng kính hiển vi 4 1.1.3 Phương pháp hóa học 4 1.1.4 Phương pháp vật lý 5 1.1.5 Xác định độ ẩm 6 1.1.6 Định lượng tro 6 1.1.6.1 Tro toàn phần 6 1.1.6.2 Tro không tan trong acid hydrochlorid 7 1.1.6.3 Tro sulfat 7 1.1.7 Phương pháp sắc ký 7 1.2 Phương pháp phân tích Alkaloid 10 1.2.1 Phân tích định tính 10 1.2.1.1 Các phản ứng tạo tủa 10 1.2.1.2 Phản ứng tạo tủa 11 1.2.2 Phân tích định lượng 11 1.2.2.1 Xác định hàm lượng Alkaloid bằng phương pháp phân tích trọng lượng 12 1.2.2.2 Xác định hàm lượng Alkaloid bằng phương pháp không nước 14 Chương II. Phân tích dược liệu chứa quinine 15 2.1 Phân tích định tính thuốc trị sốt rét quinine bằng sắc ký mỏng 15 2.1.1 Nguyên tắc 15 2.1.2 Thuốc, dụng cụ, hóa chất 17 2.1.2.1 Thuốc 17 2.1.2.2 Dụng cụ, hóa chất 17 2.1.3 Các bước tiến hành kỹ thuật 17 2.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu 17 2.1.3.2 Chuẩn bị mẫu thử 17 2.1.3.3 Chấm sắc ký 18 2.1.3.4 Chạy sắc ký 18 2.1.3.5 Phát hiện 19 2.1.4 Đọc kết quả 19 2.1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp 20 2.2 Phân tích định tính bằng các phản ứng tạo màu và tạo tủa 20 2.2.1 Phản ứng tạo màu 20 2.2.2 Phản ứng tạo tủa 21 2.3 Phân tích định lượng 22 Chương III. Chỉ tiêu chất lượng 23LỜI MỞ ĐẦU Cây Canhkina có tên phiên âm tiếng Pháp là Quinquina. Xuất phát từ Nam Mĩ, từ lâu vỏ cây Canhkina được người dân một số vùng trên thế giới sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt hữu hiệu trong việc trị bệnh sốt rét. Ở nước ta, vỏ cây Canhkina chỉ mới được biết đến và sử dụng vào đầu thế kỉ 20. Ngày nay, quinine đã được ứng dụng để điều chế thuốc chống sốt rét. Tuy nhiên đã bị lạm dụng nên chất lượng thuốc bị giảm kém và có khi bị làm giả. Với bài chuyên đề này, chúng tôi muốn trình bày rõ các phương pháp đánh giá dược liệu chứa alkaloid nói chung và dược liệu chứa quinine nói riêng. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 1.1. Phương pháp đánh giá dược liệu: Đánh giá một dược liệu nghĩa là xác định dược liệu đó có đúng tiêu chuẩn quy định hay không. Tiêu chuẩn của một dược liệu quy định: đặc chất, độ tro, độ ẩm. Những tiêu chuẩn đó được đề ra để đảm bảo chất lượng của thuốc và có căn cứ để giao dịch trên thị trường. Có thể sắp xếp các phương pháp đánh giá như sau: 1.1.1. Cảm quan: Phương pháp cảm quan nghĩa là dùng các cảm quan của chúng ta để đánh giá như nhìn bên ngoài về hình dáng, kích thước, màu sắc, đối với một vài dược liệu thì cần bẻ ra để quan sát bên trong. Mùi là đặc điểm của nhiều dược liệu chứa tinh dầu, nhựa. Vị có thể ngọt như cam thảo, cỏ ngọt; chua đối với dược liệu chứa acid hữu cơ; đắng đối với các dược liệu chứa alkaloid, glucosid; cay như ớt, gừng… 1.1.2. Sử dụng kính hiển vi: Phương pháp đánh giá dựa vào kính hiển vi bao gồm vi phẩu và soi bột. Đây là phương pháp hay dùng nhất để kiểm nghiệm dược liệu. Trong một vài trường hợp phương pháp này có ưu thế hơn phương pháp hóa học. ví dụ để phân biệt các loại tinh bột người ta không thể dựa vào phương pháp hóa học mà phải nhờ vào kính hiển vi. Một vài mảnh lá trúc đào trong dạ dày tử thi được xác định dễ dàng bằng soi vi phẩu hơn là làm phản ứng tìm oleandrosid. Dùng kính hiển vi không chỉ để xác định sự giả mạo mà còn có thể ước lượng tỉ lệ chất giả mạo căn cứ vào số lượng một đặc điểm nào đó của mẫu kiểm nghiệm so sánh với mẫu đối chứng. 1.1.3. Phương pháp hóa học: Phần lớn các dược liệu đều có thành phần hoạt chất xác định. Các hoạt chất này có thể cho các phản ứng màu đặc trưng, người ta dựa vào đó để định tính và định lượng. Ví dụ các anthranoid thì dựa vào phản ứng Borntraeger, các glycoside tim thì dựa vào các phản ứng của các dẫn xuất nitro thơm. Đối với alkaloid thì dựa vào tính kiềm định lượng bằng phương pháp acid-kiềm. Đôi khi người ta lại dựa vào thành phần hóa học không phải là hoạt chất nhưng đặc trưng cho dược liệu đó để đánh giá. 1.1.4. Phương pháp vật lý: Trong nhiều trường hợp có thể phát hiện bị pha lẫn hay giả mạo bằng cách soi mặt cắt dược liệu hay bột dược liệu dưới ánh đèn phân tích tử ngoại. Có khi trước khi soi người ta nhỏ thêm trên bột dược liệu một vài loại thuốc thử (kiềm, acid…). Một số cao dược liệu cũng cho màu sắc khác nhau, các hoạt chất cũng vậy, ví dụ aconitin (lơ sáng), berberin (vàng), emetin (đỏ cam). Quinin cho màu xanh lơ trong dung dịch oxy acid ngay dưới ánh sáng thường và rất rõ dưới đèn tử ngoại. Việc ứng dụng các hằng số vật lý để đánh giá thường hay tiến hành đối với tinh dầu béo và các hoạt chất: Độ hòa tan (thường biểu thị như sau: 1gam tan trong …ml nước, …ml cồn ethylic, glycerin…) Tỷ trọng ( đặc biệt đối với tinh dầu và dầu béo) ví dụ: tỷ trọng tinh dầu bạc hà ở 20oC: 0,890-0,922. Tỷ trọng mật ong ở 20oC không dưới 1,38. Góc quay cực riêng: Đối với chất lỏng như tinh dầu, dầu béo thì [α]D25= α /l.d. Đối với hoạt chất rắn thì [α]D25= α.100/l.c α: Góc quay cực đo được. l: bề dày lớp chất tình bằng decimet. d: tỷ trọng chất. c: nồng độ phần trăm của chất trong dung dịch. Đo góc quay cực và tỷ trọng ở cùng một nhiệt độ, ví dụ ở đây là 25oC. Chỉ số khúc xạ (đặc biệt đối với tinh dầu và dầu béo) ví dụ: chỉ số khúc xạ của tinh dầu hương nhu trắng ở 20oC là 1,510-1,528. Nhiệt độ đông đặc ( Đối với tinh dầu và dầu béo) ví dụ nhiệt độ đông đặc của tinh dầu hồi phải trên +15oC. Nhiệt độ nóng chảy (Đối với sáp ong hoặc các hoạt chất alkaloid, glycosid…)ví dụ nhiệt độ nóng chảy của sáp ong vàng: 62-66oC. 1.1.5. Xác định độ ẩm: Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định ví dụ dược điển II tập 3 quy định độ ẩm của lá thanh cao hoa vàng không quá 13%, quá độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng. Song song với việc định lượng hoạt chất thì cũng cần xác định độ ẩm để quy hàm lượng so với dược liệu khô tuyệt đối. Có thể xác định độ ẩm bằng những cách sau đây: - Sấy trong tủ sấy ở áp xuất bình thường. - Sấy trong tủ sấy ở áp xuất giảm (do máy hút chân không) - Làm khô trong bình hút ẩm với những chất hút nước mạnh như acid sunfuric đậm đặc, phosphorpentoxid và ở áp suất giảm (có máy hút chân không). Hai cách sau thường được áp dụng với những dược liệu quí dễ hỏng bởi nhiệt độ và ta cần thu hồi ví dụ như sữa ong chúa, nọc rắn… Đối với dược liệu chứa tinh dầu thì xác định độ ẩm bằng phương pháp cất lôi cuốn đẳng phí, nghĩa là lôi cuốn nước bằng cách cất với một dung môi hữu cơ không trộn lẫn được với dung dịch nhưng lại cho với nước một hỗn hợp đẳng phí có nhiệt độ sôi ổn định. Sau khi ngưng tụ và để nguội, nước được tách ra và đọc thể tích. Dung môi có thể dùng là xylem, toluene. 1.1.6. Định lượng tro. 1.1.6.1. Tro toàn phần: Tro toàn phần là khối lượng cặn còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu. Để có thể so sánh được kết quả, cần phải tiến hành trong những điều kiện nhất định. Ví dụ, trong chén nung bằng sứ, đường kính 35mm, sơ bộ đã đem nung đỏ, để nguội và cân bì, đặt mẫu dược liệu đã cắt hoặc tán nhỏ (1-5gram) đã được cân chính xác. Lúc đầu đốt nhẹ rồi tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết. Cần theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ để tránh than không bị thoát ra khỏi miệng chén. Đốt xong xong cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 500oC cho đến khi thu được khối lượng không đổi. Để tránh các dược liệu hóa gỗ tạo ra than khó đốt cháy, có thể ngừng nung rồi làm ẩm bằng nước cất hoặc acid nitric đậm đặc rồi đem nung lại. Sau khi tro không còn màu đen, người ta để nguội trong bình hút ẩm và đem cân. 1.1.6.2. Tro không tan trong acid hydrochloric: Thêm vào tro toàn phần 5ml HCl 10%. Đậy chén vung bằng một mặt kính đồng hồ và đun cách thủy trong 10 phút. Dùng 5ml nước cất nóng để rửa mặt kính đồng hồ và dùng nước rửa này để pha loãng dung dịch còn lại trong chén. Lọc dung dịch qua giấy lọc không tro, rửa cặn và giấy lọc bằng nước cất nóng cho đến khi nước rửa không còn phản ứng của ion chlorid nữa. Chuyển giấy lọc có cặn vào chén nung ở trên, sấy khô, đốt rồi nung ở nhiệt độ 500oC cho đến khi khối lượng không đổi. Trừ trường hợp đặc biệt như mộc tặc, tro biểu thị chủ yếu là cát cấu tạo bởi silic oxyd do dược liệu không làm sạch kỹ. 1.1.6.3. Tro sulfat: Tro sulfat là tro còn lại sau khi nhỏ aicd sulfuric dược liệu và đem nung. Phương pháp này cho kết quả ổn định hơn phương pháp tro toàn phần vì các carbonat và oxyd được chuyển thành sulfat. 1.1.7. Phương pháp sắc ký: Đây là phương pháp rất hữu hiệu áp dụng để định tính, định lượng và tách chiết các thành phần hóa học của dược liệu. 1.1.7.1. Sắc kí cột: Sắc kí cột bao gồm sắc kí cột cổ điển và sắc kí cột hiện đại hay còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp. Trong sắc ký cột cổ điển người ta thường dùng các cột thủy tinh đường kính 1-5cm dài 30-100cm. Hạt nhồi cột đường kính từ 150-300µm. Sau khi các chất được tách trên pha tĩnh ta có thể lấy từng phần của pha tĩnh có mang chất đem ra chiết lấy từng chất. Nếu các dược chất được tách ra ngoài pha tĩnh thì ta hứng lấy các phân đoạn dịch rửa có hòa tan các chất nhờ một bộ phận góp tự động. Trang bị cho sắc kí cột cổ điển rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các thành phần hóa học của dược liệu. Trong sắc kí cao áp, chất nhồi cột có cỡ hạt 3-10 µm. Vì hạt rất nhỏ, dung môi chảy khó nên phải dùng bơm để nén. Sắc kí lỏng cao áp có khả năng tách các chất rất tốt. Dung môi (pha di động) để rửa phải rất tinh khiết. Cần lọc loại vẩn và đuổi hết khí hòa tan bằng siêu âm hoặc đun nóng, khuấy hút hoặc sục khí trơ. Bơm nén phải tạo được áp suất cao 200-500atm. Cột bằng thép không rỉ có đường kính trong 4-10mm, dài 10-30cm. Có loại nhỏ chiều dài 3-10cm, đường kính 1-4mm. Cột thủy tinh chỉ dùng ở áp suất dưới 50atm. Khi dung môi hòa tan chất ra khỏi cột thì đi qua detecto hay được dùng là detecto quang phổ tử ngoại và khả biến. Tùy theo bản chất hiện tượng sắc kí người ta chia ta sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc kí trao đổi ion, sắc kí trên gel. Trong sắc ký hấp phụ, nhôm oxyd, silicagel hay được sử dụng. Trong quá trình khai triển hoặc rửa giải thì các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh. Về pha động ta có thể sử dụng các dung môi với độ phân cực tăng dần: Dung môi Ɛ0 Ether dầu 0,1 Hexan 0,1 Heptan 0,1 Cyclo 0,04 Carbon tetrachlorid 0,18 Ether isopropylic 0,28 Toluen 0,29 Benzen 0,32 Ether ethylic 0,38 Chlorofrom 0,40 Methylen chlorid 0,42 Dichlor ethan 0,49 Aceton 0,56 Dioxan 0,56 Butanol 0,56 Ethyl acetat 0,58 Acetonitril 0,65 Pyridin 0,71 Dimethylsulfoxid 0,75 Alcol isopropylic 0,82 Alcol ethylic 0,88 alcolmethylic 0,95 Muốn có dung môi với giá trị trung gian không có trong bảng trên, ta dùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tỉ lệ thích hợp. Trong sắc kí phân bố, pha tĩnh được chia làm 2 loại: Loại thứ nhất, chất lỏng được mang trên bề mặt của hạt chất mang, qua quá trình rửa giải dần dần bị dung môi hòa tan, hiện nay ít được dùng. Loại thứ hai, pha tĩnh được kết hợp với chất mang. Ví dụ chất mang có thể là silicagel đã tạo thành những dẫn chất siloxan. Siloxan. Nếu R là nhóm kém phân cực như octyl (C8) octadecyl (C18) và pha động là dung môi phân cực như methanol, 1.2. Phương pháp phân tích Alkaloid: 1.2.1. Phân tích định tính: Người ta đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự có mặt của ancaloit trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hóa học của ancaloit phần lớn không rõ ràng, nên người ta chỉ phân biệt các phản ứng này là phản ứng màu hoặc phản ứng tạo tủa. 1.2.1.1. Các phản ứng tạo tủa: Thuốc thử Mayer (1865): K2HgI4 [kali-thủy ngân (II) iodua - kaliumiodomercurat]: Là thuốc thử ancaloit thông thường cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể cả trong dung dịch axit loãng. Thuốc thử Dragendorff hay Kraut (1881): KBiI4 [Kali-bizmut-iodua]: Thuốc thử ancaloit cho tủa kết tinh màu vàng cam (đỏ). Thuốc thử Bouchardat (1839) hay Wagner (1863): KI3 [dung dịch kali-iodua 0,1N + I2]: cho tủa kết tinh màu nâu đỏ sẫm với ancaloit. Thuốc thử Sonnenchein (1857): H3[P(Mo3O10)4], axit phosphormolibdenic: Tạo tủa tương đương mol với hầu hết các ancaloit. Đặc biệt nhạy đối với quinin và strychnin. Thuốc thử Godeffroys: K4[Si(W3O10)4], axit silicowonframic: Người ta sử dụng dung dịch nước 5% muối natri của nó, cho phản ứng rất nhạy với ancaloit cho tủa màu trắng. Axit cheric (tannin): Tạo tủa vô định hình không màu hoặc trắng vàng. Muối Reinecke: NH4[Cr(SCN)4(NH3)2], Amoni-tetrarodanato-diammin- cromat(III): Ban đầu, người ta sử dụng nó như tác nhân tạo tủa với các amin bậc II và amin tercier. Rosenhaler đã sử dụng nó để xác nhận sự có mặt của các ancaloit và cho tinh thể rất đặc trưng. Natri-tetraphenyl-borat (Kalignost), Na[B(C6H5)4]: Ban đầu, người ta sử dụng nó như tác nhân thử kali, sau đó được sử dụng thử ancaloit thông thường, cho tủa màu trắng trong axit axêtic. Cần lưu ý rằng: các amin tổng hợp tercier hoặc quaternary amin cũng thường cho phản ứng tủa ancaloit. 1.2.1.2. Phản ứng tạo tủa: Trong số các phản ứng ancaloit, phản ứng của ancaloit với các axit khoáng đặc đôi khi cho chúng ta khả năng phân biệt. Các phản ứng chỉ cho kết quả tốt đối với các ancaloit có độ sạch cần thiết. Đặc biệt là các phản ứng tạo màu với axit H2SO4 đậm đặc dựa trên cơ sở khả năng hút nước và ôxy hóa của nó. Tác nhân Erdmann: 20ml axit H2SO4 đậm đặc + 10 giọt (dung dịch 100ml chứa 10 giọt axit HNO3). Phản ứng không màu với các ancaloit: atropin, koniin, nicotin, caffein, quinin, cocain, strychnin. Đỏ, vàng: Brucin. Vàng cam, đỏ máu: Veratrin. Nâu đỏ, nâu sẫm: Papaverin. Đỏ máu, vàng: Tebain. Tác nhân Fröhde: axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-molibdat. Xanh tím: Morphin Xanh oliu: Hydrastin. Tác nhân Mandelin: axit H2SO4 đậm đặc + vanadin (axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-vanadat). Xanh da trời sang đỏ: strichnin Tác nhân Marquis: Formaldehide + axit H2SO4 đậm đặc (1ml axit H2SO4 đậm đặc + 1 giọt formaldehide). Đỏ tím: Morphin và các dẫn xuất. Tác nhân Arnold-Vitali: lượng nhỏ KNO2 + axit H2SO4 đậm đặc. Màu tím: Atropin, hyoscyamin, scopolamin. Đỏ tím: strichnin. Tác nhân Thalleiochin: nước clo (brôm) + amoniac. Xanh lá cây: quinin, quinidin. 1.2.2. Phân tích định lượng: Những năm trước đây, để xác định được hàm lượng ancaloit cần tiến hành hai bước.  Bước 1. Muối ancaloit tan trong nước được kiềm hóa bằng bazơ thích hợp để giải phóng ancaloit ở dạng bazơ không tan trong nước. Bước 2. ancaloit tự do được chiết bằng dung môi thích hợp (chloroform), sau đó đuổi dung môi và xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp phân tích trọng lượng (gravimetric analysis). Sau này, khi người ta phát hiện thấy nếu hằng số phân ly của ancaloit đủ lớn (pKb ≥ 7), thì có thể sử dụng phương pháp chuẩn độ để xác định hàm lượng của nó. Trong trường hợp này, sau khi đuổi hết dung môi hữu cơ người ta cho vào dung dịch ancaloit thừa lượng axit H2SO4 0,1N hoặc 0,2N để tạo muối, dung dịch thừa axit được chuẩn độ bằng dung dịch kiềm 0,1N hoặc 0,2N. Ngày nay, người ta sử dụng phương pháp chuẩn độ trong môi trường ‟không nước‟, các muối ancaloit trong dung dịch axit axêtic băng của chúng được chuẩn độ trực tiếp bằng axit percloric (HClO4). Tác nhân gây nhiễu trong khi đo nếu do thành phần axit (trong trường hợp muối ancaloit được tạo bởi các axit halogenid) có thể loại trừ bằng muối thủy ngân (II) axêtat. Phương pháp này có thể xác định hàm lượng cho cả các ancaloit có hằng số phân ly nhỏ (pKb ≤7) như quinin hay papaverin. Để xác định hàm lượng ancaloit có thực hiện theo các phương pháp sau: 1.2.2.1. Xác định hàm lượng Alkaloid bằng phương pháp phân tích trọng lượng: a) Kiềm hóa giải phóng ancaloit tự do trước khi chuẩn độ. Để kiềm hóa, thông thường người ta sử dụng amoniac, đôi khi là natri-bicacbonat (NaHCO3) hoặc nước vôi trong. Nếu kiềm hóa bằng dung dịch kiềm mạnh (NaOH, KOH) có thể tạo ra các phản ứng không mong muốn. Ví dụ: các hợp chất ancaloit dạng este (atropin) có thể bị xà phòng hóa, các ancaloit dạng phenol (morphin) có thể tạo phenolat không thể chiết được bằng chloroform... Một số bazơ dùng để giải phóng ancaloit tự do khỏi muối của nó như: NaOH: Muối quinidin, muối quinin, codein-phốtphat, dihydrocodeinon - tartarat, dihydrocodein-tartarat. Amoniac (NH3): Muối của các este-ancaloit khung tropan, muối clorua của các dẫn xuất morphin-ancaloit (không dùng cho muối clorua của morphin), papaverin, ephedrin, pilocarpin, strichnin. Natri-bicacbonat (NaHCO3): Morphin-clorua, phyzostigmin-salicylat. b) Phương pháp tiến hành: Cho lượng muối ancaloit đã cân vào phễu chiết và hòa tan trong 5ml nước, kiềm hóa dung dịch muối đến pH = 10. Ancaloit tự do thường ít tan trong nước, do vậy người ta chiết nó bằng chloroform (ete). Dung dịch kiềm hóa được chiết 6 lần (mỗi lần 10 ml CHCl3). Tách loại và kiểm tra sự có mặt của ancaloit trong pha hữu cơ lần cuối (dịch chiết lần 6) bằng thuốc thử Dragendorff hoặc Mayer. Gộp các pha hữu cơ, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan. Lọc qua giấy lọc. Dung dịch thu được chứa ancaloit tự do, người ta xác định hàm lượng ancaloit theo các phương pháp thích hợp (phân tích chuẩn độ hay phân tích trọng lượng) tùy thuộc vào độ lớn hằng số phân ly của nó. Phương pháp chiết nhanh Schulek: Phương pháp chỉ một lần chiết này chỉ áp dụng được đối với các muối ancaloit tan tốt trong nước. Cách tiến hành như sau: Hòa tan lượng muối ancaloit đã biết trong 2 ml nước, thêm 70 ml CHCl3 và lắc đều, trong thực tế lượng ancaloit sau khi được giải phóng sẽ hòa tan hoàn toàn trong pha hữu cơ (pha CHCl3), sau đó làm khô bằng Na2SO4 khan, lọc lấy dịch chiết CHCl3 và tiến hành xác định hàm lượng ancaloit như trên. 1.2.2.2. Xác định hàm lượng Alcaloid bằng phương pháp “không nước”. Trước khi chuẩn độ người ta cho dung dịch thủy ngân (II) axêtat (trong axit axêtic băng) vào dung dịch axit axêtic băng của muối ancaloit-halogenua để tạo ancaloit-axêtat và chất không tan thủy ngân (II) halogenua. 2 B.HCl + Hg(AcO)2 → 2 B. AcOH + HgCl2 Thủy ngân (II) axêtat trong axit axêtic băng là một bazơ yếu không gây ảnh hưởng đến xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp chuẩn độ. Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp chuẩn độ axit thành phần muối ancaloit. Ví dụ: Để xác định thành phần ancaloit thông qua muối clorua của nó được tiến hành theo phương pháp sau. Người ta cho CHCl3 vào dung dịch nước của ancaloit-clorua, lắc đều. Sau đó, chuẩn độ dung dịch 2 pha bằng dung dịch NaOH 0.1N. Ancaloit tự do tan vào trong CHCl3 và muối NaCl tan vào nước. Do vậy, có thể coi đây là phương pháp xác định lượng axit đơn giản. Phương pháp này áp dụng cho các ancaloit quinin và papaverin rất tốt. Trong số các phương pháp xác định hàm lượng ancaloit trên, phương pháp xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp “không nước” còn có thể áp dụng cho những muối amin có phân tử lớn và các tercier hay quaternary amin. CHƯƠNG II. PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU CHỨA QUININE 2.1. Phân tích định tính thuốc trị sốt rét quinine bằng sắc kí mỏng: 2.1.1. Nguyên tắc: - Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) là kỹ thuật phân tích sắc ký hai pha lỏng rắn, trong đó pha tĩnh là lớp chất hấp phụ (pha rắn) được trải thành những lớp mỏng trên những tấm kính hay kim loại, pha động là các dung môi hay hệ dung môi thích hợp (pha lỏng). - Các chất cần phân tích ở dưới dạng dung dịch được đưa lên bảng mỏng và đặt bảng mỏng trong bình triển khai sắc ký với hệ dung môi thích hợp, các chất cần phân tích sẽ chuyển động theo chiều chuyển động của dung môi. Do khả năng hấp phụ khác nhau giữa các chất, do ái lực giữa hai pha của các chất khác nhau mà sự di chuyển của chúng khác nhau. Từ đó có thể xác định được giá trị Rf của các chất cần phân tích và chất chuẩn cần tiến hành song song trên cùng một bản mỏng, trong cùng một điều kiện. Giá trị Rf được tính theo công thức: a Rf = --------- b Phương pháp này dùng nồng độ chất chuẩn là 80% và 100%. a: Khoảng cách từ tâm của vết chấm đến tâm của vết sắc đó. b: Khoảng cách từ tâm của vết chấm đến điểm kết thúc dung môi. Hình 2.1. Sơ đồ bản sắc kí ( C100%: nồng độ chuẩn 100%, C80%: nồng độ chuẩn 80%, T: chất cần phân tích). ¶ Chú ý: Giá trị Rf phụ thuộc vào 3 yếu tố sau: Bản chất của chất tinh (không lẫn tạp) chạy sắc ký: trong cùng hệ dung môi, trên cùngloại bản mỏng, các chất khác nhau có Rf khác nhau (theo lý thuyết vì trên thực tế có nhiều chất trên cùng hệ dung môi và loại bản mỏng có Rf rất gần nhau, không thể phân biệt được) Hệ dung môi: pha động Pha tĩnh: Mà ở đây là silica gel trên bản mỏng của bạn đó (chú ý là bản mỏng có nhiều loại khác nhau nhé: Silica gel và alumina, nhưng loại silica gel là dùng phổ biến)à Tựu trung Rf phụ thuộc vào sự tương tác của 3 yếu tố kể trên. Phương pháp kiểm tra và phân tích từng loại thuốc được thực hiện theo sổ tay hướng dẫn kiểm tra chất lượng các thuốc thiết yếu của German Pharma Health Fund (GPHF). 2.1.2. Thuốc, dụng cụ, hóa chất: 2.1.2.1. Thuốc: - Thuốc chống sốt rét chứa quinine. Dạng bào chế: viên nén, viên bao, viên nhộng hoặc thuốc tiêm. - Các chất chuẩn do German Pharma Health Fund (GPHF) cung cấp 2.1.2.2. Dụng cụ, hóa chất: - Chày sứ, lá kim loại bằng nhôm, bình thủy tinh dung tích từ 25–100ml, phễu lọc, pipet thẳng 1-25ml, lọ thủy tinh nhỏ dung tích 10 và 25 ml, ống mao quản thủy tinh 2μl. - Bản mỏng : silica gel G, cỡ 5x10cm, bàn là, bình triển khai sắc ký, đèn tử ngoại bước sóng 254 và 366 nm, bình phát hiện, đĩa petri và bình iod. - Nhãn dính, bút dạ, bút chì, giấy lọc, kéo, panh, kẹp. - Dung môi: nước cất, methanol, acid sufuric đặc 96%, acid acetic đặc, ethyl acetat, aceton, acetonitril, dung dịch amoniac đậm đặc… 2.1.3. Các bước tiến hành kỹ thuật 2.1.3.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu: Dung dịch đối chiếu (1): Dung dịch quinin sulfat chuẩn 1,0% trong hỗn hợp 2 thể tích chloroform (TT) và 1 thể tích ethanol 96%(TT). Dung dịch đối chiếu (2): Dung dịch có chứa 1,0% mỗi một chất chuẩn quinidin sulfat và quinin sulfat trong hỗn hợp 2 thể tích chloroform (TT) và 1 thể tích ethanol 96% (TT). 2.1.3.2. Chuẩn bị mẫu thử: Lấy một lượng bột viên đã nghiền mịn có chứa khoảng 0,1 g quinin sulfat, lắc kỹ với 10 ml hỗn hợp gồm 2 thể tích chloroform (TT) và 1 thể tích ethanol 96% (TT). Sau đó đem đi lọc 2.1.3.3. Chấm sắc kí: Lấy bút chì kẻ 1 đường thẳng cách mép dưới của bản sắc ký 1,5cm. Dùng ống mao quản (2μl) hút dung dịch chuẩn và dung dịch thử rồi chấm trên đường thẳng đã được kẻ trước ở trên với khoảng cách đều nhau. Có thể chấm 5 vết trong 1 bản sắc ký. Dùng đèn UV 254nm để kiểm tra sự tương đồng của các vết. Tất cả các vết chấm phải có hình tròn đều nhau. 2.1.3.4. Chạy sắc kí: Dùng pipet hút chính xác dung môi Diethylamin-Aceton-Toluen (10:20:80) cho vào bình triển khai sắc ký. Sau khi cho dung môi vào bình sắc ký, đập nắp và lắc đều. Cắt mẫu giấy lọc để dựa vào thành bình để dung môi bảo hòa (khoảng 15 phút). Cẩn thận đặt bảng sắc ký đã được chấm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào trong bình sắc ký. Đóng kín nút lọ sắc ký, chờ đến khi dung môi chạy được khoảng 3/4 độ dài của bản sắc ký (khoảng 15-20 phút) thì chuyển bản sắc ký ra ngoài, đánh dấu mức dung môi và đợi khô, có thể bay hơi dung môi bằng cách sấy khô bằng dụng cụ làm nóng nếu cần thiết. 2.1.3.5. Phát hiện Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) về vị trí màu sắc và kích thước. Phép thử chỉ có giá trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) cho 2 vết chính tách biệt rõ ràng. 2.1.4. Đọc kết quả: - Nếu vết của chất cần phân tích và chất chuẩn có hình dạng, kích thước, màu sắc, cường độ màu và giá trị Rf giống nhau, ta kết luận chất thử và chất chuẩn giống nhau. Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc đồ không có vết lạ. Nếu trên sắc đồ không phát hiện thấy vết của chất cần phân tích thì có thể chất cần phân tích không chứa hoạt chất như chất chuẩn. - Nếu vết của chất cần phân tích có màu sắc nhạt hơn, hình dạng nhỏ hơn nhiều so với vết C80% hoặc màu sắc đậm hơn, hình dạng vết sắc ký lớn hơn nhiều so với vết C100% (sau 2 lần kiểm tra với cùng 1 phương pháp) thì cần đánh giá hoạt chất của chế phẩm. 2.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp: - Ưu điểm: kỹ thuật này có thể thực hiện tại thực địa để sàng lọc các thuốc giả và thuốc kém chất lượng; - Nhược điểm: không xác định được chính xác hàm lượng hoạt chất. 2.2. Phân tích định tính bằng các phản ứng tạo màu và tạo tủa Người ta đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự có mặt của Ankaloid trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hóa học của Ankaloid phần lớn không rõ ràng, nên người ta chỉ biết phân biệt các phản ứng này là phản ứng màu hoặc tạo tủa. 2.2.1. Phản ứng tạo màu: - Đun nóng 0,2g bột canhkina trong ống nghiệm khô sẽ thấy hơi màu tím đỏ bốc lên. Nhưng hơi này sẽ ngưng tụ ở phần trên của ống thành những giọt màu tím. - Phản ứng Thalleoquinin: Dung dịch nước muối của quinin và quinidin trong nước có huỳnh quang cho thêm nước clor hay brom cho đến hết huỳnh quang, rồi thêm amoniac thừa sẽ có màu xanh lục hay kết tủa xanh lục. - Phản ứng Erythroquinin: Dung dịch muối quinin sau khi tác dụng với nước clor hoặc brom, cho thêm amoniac và một ít kali ferocyanua sẽ xuất hiện màu đỏ. Cho thêm cloroform vào lắc, màu đỏ sẽ chuyển sang lớp cloroform. Andre đã phát hiện phản ứng Thalleoquinin từ năm 1835 và được diễn tả với tên gọi ngày nay là do Brandes. Nhưng cơ chế của phản ứng gần đây mới được giải thích rõ. Từ nghiên cứu của Skraup đã cho biết phản ứng chỉ thế oxy vào vị trí 6 nhân quinin của alcaloid (quinin và quinidin). Bước thứ nhất là sự oxy hóa halogen đã sinh ra nhiều hợp chất, trong đó dẫn xuất của 6-ceto quinolin cho phản ứng tiếp tục là cơ bản cho thêm amoniac sẽ xuất hiện màu xanh. Trên sắc kí đồ lớp mỏng cho thấy chất màu gồm nhiều vết “Thalleoquinin”. Điều đó cũng dễ hiểu vì khi cho thêm amoniac có cetimin tương ứng sinh ra, nó có khả năng ngưng tụ với một phẩn tử cetoquinilin, nhưng ở đây sự kết hợp có thể thực hiện qua nguyên tử N của imin không những với C-6 của cetoquinolin mà còn với C-5. khi tác dụng với halogen, phản ứng cộng hợp xảy ra một phần ở nhóm vinyl, một phần thế ở C-5 và C-7, sau đó thế halogen bằng nhóm –OH, do đó tạo ra một sản phẩm phản ứng có màu xanh. Hình 2.2. Phản ứng Thalleoquinin. 2.2.2. Phản ứng tạo tủa: - Lấy 0,10g bột dược liệu thêm 10ml H2SO4 loãng, lắc, để yên, lọc, dịch lọc phải phát huỳnh quang màu xanh lơ dưới ánh sáng tử ngoại. Lấy 1ml dịch lọc này thêm 0,5 ml thuốc thử Mayer phải cho tủa rõ. Thuốc thử Mayer (1865): K2HgI4 [kali-thủy ngân (II) iodua-kaliumiodomercurat]: Là thuốc thử ancaloit thông thường cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể cả trong dung dịch axit loãng. 2.3. Phân tích định lượng: Cân chính xác 3g bột dược liệu đã qua rây có kích thước lỗ mắt rây 0,125mm và sấy khô ở 60oC đến khối lượng không đổi vào một bình nón 250ml có nút mài. Thêm 2ml HCl loãng(TT) và 10ml nước, đun nóng trên cách thủy sôi trong 10 phút. Để nguội, thêm 5ml dung dịch NaOH 30% (TT) vào 150ml hỗn hợp dung môi ether-cloroform [3:1]. Lắc đều trong 10 phút. Thêm vào hỗn hợp 5g bột mịn gồm tragacan, lắc đều trong 5 phút. Để yên 5 phút. Lấy chính xác 100ml dịch chiết của ether cloroform cho vào một bình nón khác rồi bốc hơi tới khô. Hòa tan cắn trong 10ml ethanol 96o (TT) đã trung tính hóa và đun nóng nhẹ trên cách thủy. Thêm vào dung dịch chiết ethanol 10ml nước cất và 5 giọt dung dịch đỏ methyl. Chuẩn độ bằng HCl 0,1 N cho đến khi màu chuyển từ vàng sang đỏ. Gọi n là số ml dung dịch HCl 0,1N đã dùng, 1ml dung dịch HCl 0,1 N tương ứng với 0,03094 alcaloid toàn phần biểu thị bằng hỗn hợp đồng phần tử quinin và cinchonin. Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần trong dược liệu: X%= Dược điển Việt Nam quy định ít nhất phải có 6% alcaloid toàn phần. Ngoài ra có thể định lượng bằng phương pháp đo quang: - Bandelin đã tạo tủa màu alcaloid với thuốc thử Reinecke, lấy riêng tủa, hòa tan trong aceton rồi đo quang ở 525nm. Muối Reinecke: NH4[Cr(SCN)4(NH3)2], Amoni-tetrarodanato-diammin- cromat(III): Ban đầu, người ta sử dụng nó như tác nhân tạo tủa với các amin bậc II và amin tercier. Rosenhaler đã sử dụng nó để xác nhận sự có mặt của các ancaloit và cho tinh thể rất đặc trưng. - Sanchez đã định lượng quinin và quinidin bằng phương pháp làm mất nhóm methy của –OCH3 bằng H2SO4 phenol sinh ra tạo màu đỏ với thuốc thử diazo. Đo cường độ màu, tính hàm lượng quinin và quinidin trong dược liệu. - Monnet định lượng quinin bằng phương pháp đo quang dựa vào phản ứng erythroquinin. CHƯƠNG III. CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG. Tên chung quốc tế: Quinine. Mã ATC: P01B C01. Loại thuốc: Chống sốt rét. Dạng bào chế và hàm lượng Viên nén: 300 mg (dưới dạng quinin dihydroclorid hoặc quinin hydroclorid). Viên nén bao: 125 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg (dưới dạng quinin sulfat). Ống tiêm dạng quinin dihydroclorid 300 mg/1 ml, 600 mg/2 ml. Ống tiêm quinoserum 100 mg/10 ml (Quinin dihydroclorid, trong dung dịch nước muối đẳng trương). 100 mg quinin base khan tương ứng với: 122 mg quinin dihydroclorid, 122 mg quinin hydroclorid, 121 mg quinin sulfat, 122 mg quinin ethylcarbonat (là chất không đắng), 136 mg quinin hydrobromid, 169 mg quinin bisulfat. Các dạng muối quinin sulfat, hydroclorid, dihydroclorid và ethyl carbonat có hàm lượng quinin base gần bằng nhau. Có thể dùng các muối này theo liều chỉ định cho các muối quinin. Thông tin qui chế: Quinin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ 4 năm 1999. Thuốc dạng tiêm phải kê đơn và bán theo đơn. Tài liệu tham khảo: 1. Bài giảng Dược liệu Tập I - 1998. 2. Bài giảng Dược liệu Tập II - NXB Y học 2002. 3. Dược điển Việt Nam III.  4. Nguyễn Viết Thân - Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi- NXB khoa học và kỹ thuật- 2003. 5. 6. 7.