Chuyên đề : Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn salmonella

NHÓM 2 * BÁO CÁOChuyên đề:NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA * Hình ảnh vi khuẩn Salmonella * 1. Đặc điểm vi khuẩn2. Đặc tính sinh lý3. Đặc tính sinh hóa4. Phương pháp phân lập5. Thử nghiệm và cách nhận biết * 1. Đặc điểm vi khuẩn Giống Salmonella có khoảng 2300 serotype và thuộc họ Enterobacteriacaea. Salmonella spp. có những đặc điểm sau: Gram âm, hình que, kỵ khí tùy nghi, với đường kính khoảng 0,7-1,5 micromet, dài 2-5 micromet, và roi mà cấp theo mọi hướng. Di động bằng tiên mao nhưng những dạng đột biến có thể không di động và có một serotype (Gallinarum) là không di động. * 1. Đặc điểm vi khuẩn Các chủng Salmonella tạo acid từ glucose và mannitol nhưng không tạo acid từ saccharose và lactose. Chúng không tạo indol và không phân cắt urea. Phần lớn các chủng sinh H2S và có enzyme Lysine decarboxylase và Ornithine decarboxylase. * 1. Đặc điểm vi khuẩn Giống Salmonella được chia thành nhiều serotype theo xếp loại của Kauffmann-White, dựa theo kháng nguyên thân (somatic) O và kháng nguyên H (flagella). Một số serotype như Enteritidis, Typhi, Paratyphi và Typhimurium được xếp loại theo phage. * 2. Đặc tính sinh lý - Kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá huỷ bởi quá trình tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur & đun nấu kỹ. - Tuy nhiên Samonella có thể sống sót trong thời gian dài ở các thực phẩm khô & ướp lạnh, do đó khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này dễ phát triển lại. * - Sức đề kháng yếu: sống sót kém ở pH < 5, và chết ở 60OC trong vòng 20 phút, 700C trong 2 phút và 850C trong 1 giây, dưới ánh sáng 5h chết. Sự đóng băng có thể làm giảm số lượng vi khuẩn nhưng Salmonella có thể còn tồn tại trong thời gian rất dài ở các thực phẩm đã đóng băng như thịt, cá. - Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển. * Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển. * 3. Đặc tính sinh hóa Salmonella có tính ưa ngọt với đường glucoce MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Buffered peptone water – BPW Rappaport-Vassiliadis soy peptone broth – RV Tryptic soy agar TSA Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar Brilliant green phenol red lactose sucrose agar – BLPS * - Triple sugar iron agar – TSI - Urea broth- Lysine decarboxylase broth- BOrnithine decarboxylase broth - Mannitol- Nước tryptone- Thuốc thử Kovacs’- Nước muối sinh lý * 3. Đặc tính sinh hóa Bảng một số đặc tính sinh hóa của Salmonella Stt Thử nghiệm hoặc cơ chất Phản ứng của Salmonella spp. Glucose (TSI) + H2S (TSI) + Ure - Lysin decarboxylase + 5 Ornithine decarboxylase + 6 Indole - 7 Mannitol + * 4. Phương pháp phân lập Giai đoạn phân lập này được thực hiện đồng thời trên hai môi trường thạch XLD (Xylose lysine desoxycholate agar) và BPLS (Brilliant green phenol red lactose sucrose agar). Sau khi ủ 24 + 3, dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ ống RV, cấy ria sang hai môi trường thạch XLD và BPLS. Lật ngược các đĩa và ủ trong tủ ủ ở 37.01.00C trong 24 + 3 giờ. Sau khi ủ 24 + 3 giờ xem xét sự hiện diện khuẩn lạc điển hình * 4. Phương pháp phân lập Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc Salmonella spp. điển hình có vùng trong, hơi nhuốm đỏ do chất chỉ thị màu thay đổi trong môi trường, và có tâm đen Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc Salmonella spp. điển hình hơi trong có màu hơi đỏ trong môi trường. * 4. Phương pháp phân lập Chú ý. Một số lòai Salmonella không có khả năng sinh H2S như Salmonella Paratyphi A phát triển trên môi trường XLD có màu hồng với tâm hồng đậm, Salmonella có lactose dương tính phát triển trên môi trường XLD có màu vàng có tâm đen hoặc không đen * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA 5.1 Triple sugar iron agar (TSI agar) a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ các ống trong tủ ủ 37,0  10C /24 + 3 giờ. * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ ủ được mô tả như sau Đáy ống Vàng …..……… Glucose dương tính Đỏ …………. Glucose âm tính Đen ………… Hình thành H2S Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ glucose * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết Mặt nghiêng Vàng ……… Lactose hoặc Sucrose dương tính Đỏ ………… Lactose và Sucrose âm tính Ống TSI cấy Salmonella điển hình có mặt nghiêng kiềm (màu đỏ), đáy ống acid (vàng), có khí và 90% có màu đen(H2S được hình thành) * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết Chú ý 1. Khi đọc kết quả ống TSI, không được đọc sớm (ví dụ sau 12 giờ ủ) do sẽ cho kết quả dương tính giả hoặc đường lên men nhưng chưa đủ lượng acid để thay đổi chất chỉ thị pH (phenol red). Nếu đọc sau 24 giờ sẽ cho kết quả đỏ/ đỏ sai do vi khuẩn sử dụng peptone làm môi trường có tính kiềm * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết Chú ý 2. Một vi khuẩn sinh H2S có thể tạo ra nhiều kết tủa đen (FeS) che khuất màu vàng ở đáy ống. Tuy nhiên, nếu đáy ống không có màu vàng dù là không thể quan sát được và nên ghi nhận kết quả như thế * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.2 Urea broth a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ sinh khối trên TSA, chuyển sang ống môi trường lỏng ure. Ủ các ống trong tủ ủ 37.0  1.00C /24 + 3 giờ. Nếu phản ứng dương tính, sự phân cắt ure giải phóng NH3 làm thay đổi màu của phenol-red sang hồng kế đó là đỏ hồng. Phản ứng thường rõ ràng sau 2-4 giờ * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: Dương tính khi màu đỏ hồng khắp cả ống (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Providencia rettgeri). Âm tính khi môi trường không đổi màu. Chú ý 1. Tiến hành thử nghiệm song song với mẫu đối chứng âm (không có ure) để loại trừ trường hợp NH3 do thủy phân protein mà ra * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết Chú ý 2. Proteus vulgaris và Proteus mirabilis cho phản ứng dương tính sau khoảng 8 giờ Chú ý 3. Phản ứng âm tính giả có thể xảy ra nếu lượng NH3 quá ít không thể thay đổi nồng độ ion H+ của hệ đệm, do đó không làm chất chỉ thị pH thay đổi màu hoặc một vi khuẩn nào đó có thể thủy phân Ure nhưng không thể sử dụng NH3 như nguồn Nitơ, sự sinh trưởng không xảy ra * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.3 Lysin decarboxylation và Ornithin decarboxylase a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ sinh khối trên TSA ống nghiệm chứa khoảng 5 ml môi trường Lysin decarboxylation và ống nghiệm chứa khoảng 5 môi trường Ornithine decarboxylation. Sau khi cấy, phủ lên trên một lớp mỏng dầu khóang. Ủ các ống trong tủ ủ 37.0  1.00C /24 + 3 giờ * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: Dương tính khi môi trường có màu tím, đục. Âm tính khi môi trường có màu vàng.    Chú ý 1. Kết quả có thể cho thấy hai lớp màu khác nhau trong ống nghiệm: tía & vàng. Nên lắc nhẹ ống nghiệm trước khi báo cáo kết quả * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết Chú ý 2. Thường thì khó đọc thử nghiệm Decarboxylase dương tính do sự hiện diện màu tía-vàng nhạt không rõ ràng. Nếu điều này xảy ra, nên só sánh với ống không cấy mẫu. Bất kỳ có vết màu tía nào thì kết quả được xem là dương tính nếu được ủ ít nhất là 24 giờ * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.4 Indole Chuyển sinh khối từ TSA vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tryptone (Pepton from casein) ủ ở 37,0  1OC. Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs. Phản ứng dương tính xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt ống nghiệm, màu nâu vàng là âm tính * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.6 Thử nghiệm sử dụng đường a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSA sau khi ủ, cấy lần lượt sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Mannitol. Ủ các ống trong tủ ủ ở 37.0 1.00C/24 – 48 giờ. * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi dung dịch đường không đổi màu (màu đỏ) Chú ý. Thông thường phản ứng dương tính xảy ra trong khoảng 24 – 48 giờ. Nếu có thể ủ tiếp cho đến 5 ngày * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết THỬ NGHIỆM KHÁNG HUYẾT THANH 5.7 Thử nghiệm tự ngưng kết: a) Thực hiện: Kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn bằng cách nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính sạch. Sau đó, dùng que cấy vòng lấy một lượng sinh khối vừa đủ trên môi trường TSA, trộn đều nhẹ nhàng trong vòng 30-60 giây thành huyền dịch, quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là sử dụng kính lúp. * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: nếu có những hạt ngưng kết thì ngừng phản ứng, nếu huyền dịch vẫn đục đều thì tiến hành thực hiện phản ứng kháng huyết thanh với kháng nguyên O và H * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.8 Thử ngưng kết kháng nguyên O Thực hiện: sử dụng khuẩn lạc thuần không có khả năng tự ngưng kết, tiếp tục qui trình giống như thử nghiệm tự ngưng kết, thay thế giọt nước muối sinh lý bằng kháng huyết thanh O Kết quả: Phản ứng dương tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết 5.9 Thử ngưng kết kháng nguyên H a) Thực hiện: sử dụng khuẩn lạc thuần không có khả năng tự ngưng kết cấy vào môi trường thạch mềm TSA ủ 37.0  10C /24 + 3 giờ. Sau khi ủ lấy sinh khối trên thạch mềm tiếp tục qui trình giống như thử nghiệm tự ngưng kết, thay thế giọt nước muối sinh lý bằng kháng huyết thanh H. * 5. Thử nghiệm và cách nhận biết b) Kết quả: Phản ứng dương tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti, phản ứng âm tính khi huyền dịch vẩn đục * LƯU Ý Không thể kết luận dương tính hoặc âm tính Salmonella spp. trong mẫu thử khi chỉ dựa vào hoặc thử nghiệm sinh hóa hoặc thử nghiệm huyết thanh kháng. Do: a) Thử nghiệm sinh hóa không thể phát hiện tất cả các serotype, ngoài ra các dòng Salmonella spp. không phải luôn luôn cho phản ứng điển hình. * LƯU Ý Nếu phản ứng ngưng kết kháng nguyên O là dương tính, khi đó chưa thể kết luận là Salmonella spp. được vì có một số loài khác (E.coli, Citrobacter, Shigella và Enterobacter) hoặc có cùng chung một số kháng nguyên O hoặc cũng có những kháng nguyên tương tự với kháng nguyên của Salmonella spp. * LƯU Ý b) Thử nghiệm huyết thanh kháng dựa vào phản ứng ngưng kết kháng nguyên O, kháng nguyên H. Tuy nhiên, Salmonella spp. có thể thay đổi hình dáng khuẩn lạc từ trơn (smooth) sang nhăn (rough). Dạng nhăn là do đột biến do ngăn sự tổng hợp polysaccharide. Do đó, không có chuỗi nhánh O, mất đi khả năng ngưng kết kháng nguyên O. * LƯU Ý Nếu phản ứng ngưng kết kháng nguyên O là dương tính, khi đó chưa thể kết luận là Salmonella spp. được vì có một số loài khác (E.coli, Citrobacter, Shigella và Enterobacter) hoặc có cùng chung một số kháng nguyên O hoặc cũng có những kháng nguyên tương tự với kháng nguyên của Salmonella spp. * LƯU Ý Do đó, để kết luận mẫu dương tính hoặc âm tính Salmonella spp., cần phải kết hợp kết quả của hai thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh kháng để kết quả đạt được là cao nhất, chính xác nhất. * TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Định tính Salmonella trong thực phẩm theo NMKL 71:1999; 2. Vi sinh vật–Ths Đoàn Thị Nguyện; 3. Thí nghiệm Vi sinh vật họ c – Nguyễn Đức Lượng;4.Công nghệ Vi sinh vật (Tậ p 1,2) – Nguyễn Đức Lượng; * *