Công nghệ sản xuất Insulin

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 12/16/2010 ‹#› GVHD : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương SVTH : Phạm Ngọc Xuân Phạm Ngọc Thiên Trần Đức Thiện Đặng Minh Châu Hà Thanh Trúc Lớp : HC07SH2 Năm học : 2010-2011 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN Nội dung chính I . Lời mở đầu Đôi nét về bệnh tiểu đường II. Một số loại insulin trên thị trường III. Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin 1. Cấu trúc phân tử insulin 2. Tổng hợp insulin trong cơ thể 3. Vai trò sinh học của insulin IV. Công nghệ sản xuất insulin. 1.Sản xuất insulin tách chiết từ động vật 2.Sản xuất insulin từ thực vật chuyển gen 3.Sản xuất insulin từ đối tượng vi sinh vật chuyển gen 4. Kết luận I. Lời mở đầu Bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ con người.Trên thế giới số người mắc bệnh tiểu đường ngày càng tăng, sự gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường liên tục gia tăng trong những năm gần đây. Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiếp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này. Best và Banting- những người đầu tiên đã chiết suất được insulin năm 1921 Collip và MacLeod- những người đầu tiên dùng insulin chiết suất đó để điều trị bệnh tiểu đường type 1 cho Leonard Thomson Vậy bạn biết gì về bệnh tiểu đường ? Vài nét về bệnh tiểu đường 1. Khái niệm 2. Phân loại 3. Tình hình thực tế về bệnh tiểu đường hiện nay 1. Khái niệm Bệnh đái tháo đường, còn gọi là Bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, v.v 2. Phân loại Tiểu đường loại 1: (tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu đường ở người trẻ ) chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân Nguyên nhân bệnh: cơ chế tự miễn (tuyến tụy bị tấn công và phá hủy bởi chính cơ thể, làm cho tuyến tụy không còn khả năng sản xuất insulin nữa) Những triệu chứng điển hình: tiểu nhiều, uống nhiều, đôi khi ăn nhiều, mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng. Tiểu đường loại 2: ( tiểu đường không phụ thuộc insulin hay tiểu đường ở người trưởng thành) chiếm khoảng 90-95% trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên. Tụy người bệnh vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng không đủ. Ít có triệu chứng và thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng(nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não), hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ. Tỷ lệ tiểu đường tăng theo tuổi, yếu tố di truyền cũng đóng vai trò quan trọng. Có mối liên quan trực tiếp giữa béo phì và tiểu đường loại 2. II. Một số loại insulin trên thị trường Loại insulin  Màu sắc  Nguồn gốc Thời gian bắt đầu có tác dụng Thời gian hết tác dụng Tác dụng nhanh - Insulin Actrapid HM. - Insulinum maxirapid. trong Người Lợn 30 phút (tiêm dưới da) 8 giờ Tác dụng bán chậm - Insulatard HM. - Insulin Lente. đục Người Lợn 1 giờ 20 giờ 18 giờ Loại pha trộn - Mixtard HM 30/70. đục Người 30 phút 20 giờ Tác dụng rất chậm - Utra - Lente đục Bò 4 giờ 30 giờ III. Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất nsulin 1. Cấu trúc phân tử insulin Insulin người là một polypeptide Bao gồm: Chuỗi A 21 acid amin Chuỗi B 30 acid amin Có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối giữa hai chuỗi A và B. Công thức hóa học: C257H383N65O77S6 Trọng lượng phân tử: 5808 Cấu trúc hóa học của insulin 2. Tổng hợp insulin trong cơ thể Preproinsulin: là chuỗi peptid dài 110 acid amine, tổng hợp trong các tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tụy. Proinsulin: Khi Preproinsulin tiến tới lưới nội chất, một protease chuyên biệt sẽ cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu tạo proinsulin. Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Insulin: Hình thành qua quá trình phân cắt nhờ enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và C và enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và C. 3. Vai trò sinh học của insulin Insulin và trao đổi hydratcacbon Insulin và trao đổi lipit Những tác động khác của insulin Sơ đồ biểu hiện sự điều hòa hàm lượng glucose máu Gia tăng tuần hoàn insulin Glycogen chuyển thành Glucose ở gan Tăng lượng Glucose trong máu Kích thích tuyến tụy tiết ra insulin Glucose trong máu Hấp thu Glucose vào máu Lượng Glucose còn lại Tế bào hấp thu glucose Năng lượng trao đổi chất Tổng hợp chất béo Tổng hợp Glycogen Giảm lượng Glucose trong máu Kích thích tuyến tụy tiết ra Glucagon Gia tăng tuần hoàn Glucagon Những tác động khác của insulin - Insulin làm tăng tính hấp thụ của các axitamin.- Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ tạo điều kiện cho quá trình photphoryl hoá và sử dụng glucoz. Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ IV. Công nghệ sản xuất insulin Insulin Từ động vật Từ thực vật Từ vi sinh vật 1.Sản xuất insulin tách chiết từ động vật Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò và được tinh sạch Ngày nay loại insulin này được tinh chế bằng phương pháp sắc ký đạt độ tinh khiết hóa rất cao.  Chủng loại Chuỗi A các vị trí   8   9  10 Chuỗi B các vị trí       30 Người Heo,chó,tinh dịch cá voi Thỏ Gia súc(trâu, bò ngựa, dê cừu Ngựa Sei whale Thr-Ser-ILe   Thr-Ser-ILe   Thr-Ser-ILe   Ala-Ser- Val   Ala-Gly- Val   Thr-Gly-Leu   Ala-Ser-Thr     Thr    Ala       Ser       Ala       Ala       Ala       Ala    Sự thay đổi chuỗi cấu trúc amino acid của các loài động vật so với con người   (Source W.F ganong, 2004)  Sản xuất insulin từ tế bào gốc để trị bệnh tiểu đường Những tế bào gốc từ dây rốn có khả năng sản xuất một hợp chất có tên là C-peptide (một chất protein tiền thân của insulin và chỉ hiện diện khi tế bào sản xuất ra insulin). Sự hiện diện C-pep  đã có một lượng insulin nhất định được sản xuất bởi tế bào gốc được dùng thay thế cho tế bào tụy tạng đã hư hại hoặc bị phá hủy. Các nhà khoa học Anh và Mỹ cho biết họ đã SX được insulin từ tế bào gốc lấy từ dây rốn trẻ sơ sinh để điều trị bệnh tiểu đường. (Ảnh: www.neonet.ch) Nhược điểm Insulin ĐV có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người Khả năng hấp thụ kém Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể Trong quá trình tách chiết không thể loại bỏ được hết các tác nhân gây bệnh ở ĐV Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để SX) giá thành cao Khó SX lượng lớn với quy mô công nghiệp Sản xuất Insulin trị bệnh tiểu đường từ hoa rum Các nhà khoa học ĐH Calgary đã cấy một gen Insulin nhân tạo vào cây hoa rum. Khi gen này đi vào hoạt động, hoa rum sẽ bắt đầu sản sinh ra Insulin nhanh hơn các phương pháp truyền thống được tiến hành trên lợn, bò, men hay vi khuẩn. Khoảng 4.000m2 hoa  sẽ có sản lượng lên tới gần 1kg Insulin  6.475 ha hoa rum là có thể chiết xuất đủ Insulin cho toàn bộ những người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới.  Cây hoa rum dùng để chiết suất insulin Trị bệnh tiểu đường bằng insulin từ rau diếp hoặc cây thuốc lá Nghiên cứu này được thực hiện bởi giáo sư Henry Daniell, thuộc Trường Đại học Central Florida, và các cộng sự. Nhóm nghiên cứu đưa các tế bào thực vật đông khô có chứa insulin dưới dạng bột vào cơ thể chuột mắc bệnh tiểu đường. Khi các tế bào này tiến vào ruột chuột, vi khuẩn đang sống ở đó sẽ phân hủy các thành tế bào và insulin thoát ra sẽ được đưa dần dần vào máu. Sau 8 tuần lễ thử nghiệm, các chuyên gia nhận thấy [glucose] trong máu và nước tiểu chuột đã trở lại mức an toàn, và các tế bào beta trong tuyến tụy của chuột đã sản xuất được insulin ở mức độ cần thiết cho cơ thể. Giáo sư Henry Daniell (ĐH Central Florida) 3. Công nghệ sản xuất insulin Từ vi sinh vật Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…) Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là : nhóm phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp miniproinsulin. Phương pháp 1: Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp 2 chuỗi Nhược điểm : Hiệu suất tạo Insulin hoạt tính không cao. Phương pháp 2: Sinh tổng hợp Insulin tái tổ hợp theo phương pháp miniproinsulin (MPI) Hướng nghiên cứu mới: Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó là Pichia pastoris. Hơn 3 thập niên qua, E.coli được sử dụng rộng rãi như tế bào chủ cho biểu hiện protein. Tuy nhiên, việc ứng dụng E.coli trong quá trình biểu hiện các protein có nguồn gốc từ eukaryote còn bị hạn chế do E.coli thiếu các bộ máy nội bào để thực hiện các quá trình biến đổi sau dịch mã. Tế bào E.coli khi biểu hiện protein có khuynh hướng giữ lại đuôi Met, đuôi amino acid này có thể ảnh hưởng tới sự ổn định của protein và gây đáp ứng miễn dịch, sau khi biểu hiện, việc tạo ra điều kiện gấp cuộn cho protein rất khó khăn để thực hiện, rất tốn thời gian và quá trình này không phải lúc nào cũng thành công. Những điều này làm tăng giá thành sản xuất protein khi sử dụng hệ thống tế bào E.coli Những thuận lợi của hệ thống Pichia pastoris Cũng như nấm men S.cerevisiae, P.pastoris là vi sinh vật đơn bào dễ nuôi cấy, dễ thao tác an toàn đối với con người. P.pastoris là một eukaryote, có các quá trình biến đổi sau dịch mã như khả năng gấp cuộn, hình thành cầu nối disulfide, và glycosyl hóa. Do đó, nhiều protein khi biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn bị bất hoạt do hình thành dưới dạng thể vùi nhưng lại có hoạt tính sinh học cao khi biểu hiện trong P.pastoris. Có một promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng là methanol rẻ tiền hơn so với tế bào E.coli Có khả năng phát triển ở pH từ 37 do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein tiết ra Có thể phát triển với mật độ tế bào cao hơn nhiều lần so với S.cerevisiae Có thể biểu hiện protein với hàm lượng từ miligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp Các protein của bản thân P.pastoris được tiết ra môi trường với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau sẽ rất dễ dàng. Thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản, chi phí lên men thấp, các phương pháp sử dụng được thương mại hóa, chủng và các vector biểu hiện có sẵn trên thị trường Hạn chế được sự nhiễm trong quá trình lên men Quá trình lên men có thể thực hiện nhanh chóng 3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA INSULIN NGƯỜI TRÊN HỆ THỐNG TẾ BÀO PICHIA PASTORIS a. Chủng vi sinh vật và plasmid Chủng vi sinh vật: Pichia pastoris E.Coli Plasmid (Invitrogen) pPIC9K TOPO pCR2.1 Chủng Pichia pastoris thường được sử dụng nhiều nhất là GS115 (his4), có gene mã hóa cho histidinol dehydrogenease bị đột biến nên không có khả năng tự tổng hợp histidine; chứa gene AOX1 và AOX2, phát triển được trên methanol ở mức ngang bằng với chủng hoang dại. Chủng E.coli DH5α hoang dại (Nanogen Biopharma) Vector nhân dòng pCR2.1 Kích thước 3,931 bp Trình tự sao chép f1 Gen kháng ampicillin Gen kháng kanamycin ….. Topo pCR2.1 3,931 bp Vector biểu hiện pPIC9K (invitrogen) Thiết kế và tổng hợp gene mã hóa cho hMPI Trong nghiên cứu này, trình tự gene mã hóa cho insulin người đã được biến đổi một số acid amin so với trình tự công bố trên NCBI nhằm làm tăng khả năng biểu hiện protein, tăng hiệu quả gấp cuộn, và tăng hoạt tính sinh học. Trong nghiên cứu này, hMPI được thiết kế bao gồm 53 amino acid: chuỗi B 29 amino acid; mini C 3 amino acid (Asp-Gly-Lys), chuỗi A 21 amino acid. Sau quá trình gấp cuộn, 3 amino acid nối 2 chuỗi A và B sẽ được cắt bỏ bằng trypsin để tạo ra insulin trưởng thành. Trong cấu trúc insulin, vị trí LysB29 có thể bị phân cắt khi xử lý bằng tripsin nên chuỗi B được thiết kế chỉ có 29 amino acid, ThrB30 được thêm vào sau khi quá trình xử lý tripsin hoàn tất. ProB28 được thay thế bằng AspB28, HisB10 được thay thế bằng AspB10 Do có nhiều thay thế trong trình tự amino acid của insulin, nên thay vì tổng hợp gene bằng phương pháp PCR với khuôn mẫu từ mRNA người và với cặp mồi đặc trưng cho gene mã hóa cho insulin, sau đó tiến hành tạo đột biến điểm tại những vị trí cần thiết, chúng tôi sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học Hai chuỗi oligonucleotide mã hóa cho hMPI được tổng hợp hóa học với phần overlap dài 20 nucleotide. Phản ứng PCR được thực hiện với sự hiện diện của enzyme Klenow nhằm kéo dài 2 đoạn oligonucleotide tạ thành trình tự DNA mạch đôi hoàn chỉnh. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pCR2.1 chứa gen mã hóa cho hMPI Với mục đích khuếch đại và lưu trữ gen hMPI cho các thí nghiệm tiếp theo, TA cloning kit được dùng để dòng hóa gen hMPI vào pCR2.1 (tỉ lệ sản phẩm PCR:plasmid ~3:1) ở 160C qua đêm có sự hiện diện của T4 ligase. Quá trình nối này sẽ tạo plasmid pCR2.1 tái tổ hợp mang gen hMPI(pCR2.1/hMPI). Plasmid này được điện biến nạp vào E.coli DH5α. Trên môi trường LB chứa ampicillin (50 μg/ml) có bổ sung X-gal (80 μg/ml) và IPTG (1mM). Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có màu trắng và kiểm tra lại bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi thông dụng M13-F/R cho vector pCR2.1. Những khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách chiết plasmid, và khẳng định lại lần nữa bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI và NotI. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pCR 2.1 chứa gene mã hóa cho hMPI Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pPIC9k chứa gen mã hóa cho hMPI Plasmid tái tổ hợp pCR2.1/hMPI và plasmid pPIC9K cùng được cắt bởi EcoRI và Not I. gene mục tiêu được tinh sạch từ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pCR2.1/hMPI và nối vào plasmid pPIC9K bằng enzyme T4 ligase để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI được điện biến nạp vào E.coli DH5α và trải trên môi trường thạch LB chứa 50μg/ml ampicillin, ủ ở 370C.các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F/R đặc trưng cho vector pPIC9K Đồng thời vector này được đi giải trình tự để chắc chắn gen mã hóa cho hMPI không có gì thay đổi so với khi thiết kế Plasmid tái tổ hợp pCR2.1/hMPI Plasmid pPIC9K pPIC9K/hMPI E.Coli DH5α Giải trình tự với cặp mồi AOX1-F/R Môi trường thạch LB -50 μg/ml Amp - ủ ở 370C Kiểm tra khuẩn lạc bằng PCR -AOX1-F: 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ - AOX1-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’ Khẳng định gen mã hóa cho hMPI EcoRI và NotI 3.3 Tạo dòng tế bào nấm men P.pastoris mang gen mã hóa cho hMPI Plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI được cắt bằng Sal I tại vị trí HIS4 tạo ra plasmid dạng thẳng và điện biến nạp vào tế bào P.pastoris. Sau khi biến nạp, quá tình tái tổ hợp tương đồng sẽ diễn ra giữa pPIC9K/hMPI và genome của nấm men. Những dòng tế bào có chứa pPIC9K/hMPI tái tổ hợp được sàng lọc trên môi trường MD. Đây là môi trường chọn lọc cho các chủng đột biến khuyết dưỡng hisdidine. Vector biểu hiện pPIC9K/hMPI có chứa các gene HIS4 có khả năng điều khiển sinh tổng hợp histidine trong khi chủng P.pastoris GS115 không có khả năng này, do đó, chỉ những dòng tế bào có sự tái tổ hợp tương đồng giữa pPIC9K/hMPI và genome của P.pastoris mới có khả năng mọc được trên môi trường này. Các khuẩn lạc mọc đượctrên môi trường MD được tiến hành tách chiết genomic DNA để kiểm tra sự hiện diện của gene hMPI bằng PCR với cặp mồi AOX1-F/R. Plasmid pPIC9K/hMPI được cắt bằng SalI tại vị trí HIS4 Plasmid dạng thẳng Điện biến nạp Tb P.Pastoris Sàng lọc trên mt MD Tế bào P.Pastoris tái tổ hợp có mang gen mã hóa cho hMPI Tái tổ hợp tương đồng giữa pPIC9K và genone của nấm men Tách chiết DNA và kiểm tra sự hiện diện của gen hMPI bằng PCR Cặp mồi AOX1-F/R 3.4 Sàng lọc dòng tế bào nấm men P.pastoris có khả năng biểu hiện hMPI cao Các khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính được nuôi cấy liên tục trên môi trường YPD với nồng độ kháng sinh G418 tăng dần (1,2,4,6 mg/ml) nhằm sàng lọc những chủng P.pastoris tái tổ hợp có mang nhiều bản sao của gen mã hóa cho hMPI. Các dòng này sau đó được nuôi cấy trên môi trường MM. Màng nitrocellulose được áp trực tiếp lên bề mặt nấm men và tiếp tục nuôi cấy qua đêm. Khi đó, hMPI được nấm men tiết ra sẽ bám trên màng. Kháng thể đặc hiệu kháng hMPI(Abcam) được sử dụng để phát tín hiệu hMPI trên màng; tùy thuộc độ đậm nhạt của tín hiệu tương ứng với khả năng biểu hiện cao hay thấp của từng dòng P.pasrstoris tái tổ hợp  chọn lọc được dòng P.pastoris có mang nhiều bản sao gen mục tiêu và có khả năng biểu hiện hMPI cao.  Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện mini-proinsulin của các dòng tế bào nấm men Pichia pastoris bằng áp màng trên khuẩn lạc lai miễn dịch với kháng thể đa dòng kháng insulin. Những mũi tên đỏ chỉ các dòng tế bào có khả năng biểu hiện mini-proinsulin cao. 3.5 Biểu hiện hMPI ở quy mô nuôi cấy lắc Chủng P.pastoris tái tổ hợp có chứa gene mã hóa cho hMPI (RPPI02) được tăng sinh qua đêm trong môi trường BMGY ở 280C, lắc 250 vòng/phút cho tới khi OD600 đạt 5-6. Sinh khối nấm men được thu nhận bằng ly tâm ở 6000 vòng/phút, và chuyển sang môi trường BMMY sao cho OD600 đạt 1. Đây là chỉ số OD ban đầu thích hợp cho quá trình cảm ứng MeOH và biểu hiện hMPI. Bình nuôi cấy được đậy bằng khẩu trang y tế (đã qua khảo sát), lắc ở 250 vòng/phút để tăng tối đa độ thoáng khí cho nấm men trong suốt quá trình biểu hiện. Quá tình biểu hiện được duy trì ở nhệt độ 200C nhằm giảm thiểu khả năng biểu hiện các protein tạp của chính tế bào nấm men, tăng % hMPI trong protein tổng số. Sau 24h nuôi cấy, MeOH 100% được thêm vào môi trường nuôi cấy đến nồng độ cuối là 1% cho tới khi kế thúc quá trình biểu hiện. mẫu được thu sau mỗi 24h để kiểm tra mật độ tế bào nấm men trong môi trường nuôi cấy. Chủng RPPI02 Tăng sinh Thu nhận sinh khối Nuôi cấy Cảm ứng và biểu hiện hMPI Kiểm tra hàm lượng protein Môi trường BMGY T0 C=280 C Lắc 250 vòng/phút Ly tâm 6000 vòng/phút T=15 phút Môi trường BMMY T0 C=200 C Lắc 250 vòng/phut Đậy bằng khẩu trang y tế Thêm MeOH sau mỗi 24h nuôi cấy Ly tâm thu dịch nổi Kiểm tra bằng pp Bradford và phân tích trên tricine SDS-PAGE 15% OD600 đạt 5-6 OD600 đạt 1 3.6 Biểu hiện hMPI trên quy mô fermentor Chủng RPPI02 được tăng sinh bằng nuôi cấy lắc với môi trường YPD ở nhiệt độ 280C, lắc 250 vòng /phút trong khoảng 18-20h. sinh khối sau đó được chuyển vào 2L môi trường BM trong fermentoe 5L có bổ sung PTM1,để tiếp tục tăng sinh trên fermentor với cơ chất là glycerol. Trong quá trình lên men, tốc độ tăng trưởng của P.pastoris được theo dõi thông qua sự gia tăng sinh khối ướt theo thời gian, lượng O2 cung cấp liên tục 6L/h. 3.7 Thu nhận và tinh sạch hMPI  3.8 Chuyển hóa hMPI thành hI hMPI sau khi được tinh sạch sẽ được cắt bằng tripsin để loại bỏ chuỗi C-peptide; đồng thời gắn thêm ThrB30 để tạo thành hI. Phương pháp: 20mg hMPI được hòa trong 0.1 ml hỗn hợp 34.3% acid acetic và 42.2% N,N dimethylformamide trong nước. 0.2ml 2M Thr-Obut trong N,N dimethylformamide được thêm vào phản ứng và duy trì ở 120C. 2mg trypsin pha trong 0.05ml 0.05M calcium acetate được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng. Sau 96h ủ ở 120C, protein được tủa với 4ml actetone đã làm lạnh sẵn, cặn protein được thu nhận bằng ly tâm 13000v/p trong 15p ở 40C. Thử nghiệm hoạt tính hI trên chuột tiểu đường type I Xây dựng mô hình chuột tiểu đường type I bằng STZ Cơ chế : Khi chuột được tiêm i.p streptozotocin (STZ) để kích thích quá trình phá hủy tế bào β tuyến tụy. Đối tượng : Chuột nhắt trắng cái 5 tuần tuổi. Chia làm 6 nhóm, 5 con/nhóm. Nhóm1 Nhóm 2-6 SCB STZ + SCB Xây dựng mô hình chuột tiểu đường type I bằng STZ Ngày 0 Kiểm tra nồng độ glucose trong máu hằng ngày Bỏ đói Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Tiêm STZ lần 2 Tiêm STZ lần1 -4h 2. Thử nghiệm hoạt tính hI tái tổ hợp in vivo Thử nghiệm trên 4 nhóm: 1 nhóm chuột bình thường, 3 nhóm chuột tiểu đường (5con/nhóm) Chuột khỏe PBS PBS Insulin (NOVO) hI Chuột bệnh Chuột bệnh Chuột bệnh Chứng âm 2. Thử nghiệm hoạt tính hI tái tổ hợp in vivo Tiêm insulin Bỏ đói N 0h 3h 1,5h 4,5h 6h 7,5h Kiểm tra nồng độ glucose trong máu (1,5h/lần) Sơ đồ quá trình theo dõi tác động nhanh của hI lên mô hình chuột tiểu đường typeI STZ 3. Kết quả thử nghiệm Tác động nhanh của hI : Nhóm đối chứng: được tiêm PBS có hàm lượng đường huyết tăng theo thời gian trong suốt 7,5h Nhóm tiêm insulin (NOVO) lượng đường huyết giảm mạnh sau 1,5h. Sau đó, hàm lượng đường lại tăng lên, trong 4,5h sau khi tiêm insulin hàm lượng đường huyết vẫn duy trì dưới ngưỡng 250mg/dl. Nhóm được tiêm hI tác động của insulin tương tự như insulin (NOVO). hI có tác dụng làm giảm lượng đường huyết của chuột tiểu đường Type I STZ tương tự như insuin(NOVO) Tác dụng lâu dài của hI: Nhóm chứng âm (chuột khỏe) vẫn duy trì hàm lượng đường huyết ổn định, khối lượng chuột tăng dần và 100% chuột duy trì sống sót. Nhóm chuột tiểu đường không tiêm insulin có hàm lượng đường huyết tăng dần theo ngày, sau 10 ngày lượng đường huyết luôn ở mức cao ( 500mg/dl) khối lượng cơ thể giảm mạnh. Sau 12 ngày 100% chuột chết. Nhóm được tiêm hI và insulin (NOVO) cho kết quả diễn biến bệnh tương tự nhau. 100% chuột sống sau 15 ngày quan sát, hàm lượng đường huyết duy trì ổn định. Bên cạnh đó khối lượng cơ thể chuột tăng dần.  hI có tác dụng tương đương insulin (NOVO) trong quá trình cải thiện tình trạng bệnh ở chuột tiểu đường TypeI STZ 4. Kết luận Với những kết quả đạt được đã thiết lập thành công hệ thống tế bào P.pastoris dùng cho biểu hiện hMPI trên quy mô nuôi cấy lắc và quy mô fermenter với hàm lượng protein đạt 150 μg/l và 1g/l. Phương pháp tủa protein sau lên men bằng (NH4 )2SO4 và tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel cũng được xây dựng với hiệu suất cao lên đến 90%. hI đã thể hiện hoat tính tốt, tương đương với sản phẩm insulin thương mại của NOVO Chọn Pichia pastoris là hệ thống phù hợp để biểu hiện protein người vừa cho năng suất cao, chi phí lên men thấp, trong khi protein được biểu hiện có hoạt tính tốt khi thử nghiệm in vivo. Cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe