Đại cương sắc ký ion giới thiệu hệ thống IC Dionex ứng dụng trên máy IC

ĐẠI CƯƠNG SẮC KÝ ION GIỚI THIỆU HỆ THỐNG IC DIONEX ỨNG DỤNG TRÊN MÁY IC Người trình bày : ThS. Phan Bích Hà Cn. Nguyễn Thị Hà Linh KHOA XÉT NGHIỆM ĐẠI CƯƠNG SẮC KÝ ION GIỚI THIỆU HỆ THỐNG IC DIONEX ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1903 Tswett (1872–1919) công bố tách được các chất màu trong cây cỏ. CHROMATOGRAPHY ThS. Phan Bích Hà 3Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân tích sắc ký Nguyên lý cơ bản - Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động + pha tĩnh: có tác dụng giữ cấu tử cần tách (lớp chất cố định) + pha động: có tác dụng kéo cấu tử cần tách ra khỏi cột (chất lỏng, khí) ThS. Phan Bích Hà 4Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM PPPT sắc ký + khả năng phân tách cao, có thể tách những chất rất giống nhau về mặt hóa học lẫn vật lý + là 1 trong những PPPT mạnh nhất ThS. Phan Bích Hà 5Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 6Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân loại sắc ký theo bản chất của 2 pha sử dụng Pha động Pha tĩnh Tên gọi của kỹ thuật sắc ký Ứng dụng Chất lỏng Chất rắn Sắc ký lỏng - rắn Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp Chất lỏng Sắc ký lỏng - lỏng Sắc ký lỏng cao áp Chất khí Chất rắn Sắc ký khí - rắn Sắc ký khí Chất lỏng Sắc ký khí - lỏng ThS. Phan Bích Hà 7Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân loại sắc ký theo cấu hình Hình học Cấu hình sắc ký Chiều di chuyển của pha động Phẳng Giấy Đi lên, đi xuống, từ tâm lan toả tròn Lớp mỏng Đi lên, đi xuống, từ tâm lan toả tròn Cột Cột hở Đi xuống Sắc ký khí Nhờ vào ngoại lực Sắc ký lỏng cao áp Nhờ vào ngoại lực ThS. Phan Bích Hà 8Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Cột sắc ký ThS. Phan Bích Hà 9Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Thứ tự ra khỏi cột • Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước • Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau ThS. Phan Bích Hà 10Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Sắc ký đồ ThS. Phan Bích Hà 11Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM SẮC KÝ ION A special application of HPLC 1975 ThS. Phan Bích Hà 12Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM So sánh với HPLC HPLC IC - CD Đối tượng Phân tử trung hòa Ion (chu ̉ yếu anion) Pha động Hỗn hợp dung môi Dung dịch Ion Thể tích chết ngoài cột Nho ̉ hơn Lớn hơn Đường kính, chiều dài, cỡ hạt của cột Nhỏ hơn Lớn hơn Chiều rộng mũi sắc ky ́ Nhỏ hơn Lớn hơn ThS. Phan Bích Hà 13Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 14Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ĐỊNH NGHĨA • Sắc ký ion là kỹ thuật tách các cấu tử anion hay cation từ hỗn hợp qua cột sắc ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động. – Ion càng bị giữ mạnh bởi pha tĩnh thi ̀ càng ra trê ̃. – Gradient : tăng nồng đô/điện tích của eluent. ThS. Phan Bích Hà 15Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Nguyên lý • Sắc ký ion tách các ion và phân tử phân cực dựa trên điện tích của chúng. – IC-CD : Phát hiện ion chu ̉ yếu dựa trên đô ̣ dẫn điện – Dung dịch ion có tính dẫn điện nên khi sử dụng CD cần khử nền. ThS. Phan Bích Hà 16Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Thành phần cơ bản của sắc kí ion ThS. Phan Bích Hà 17Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM SƠ ĐỒ THIẾT BỊ SẮC KÝ ION ThS. Phan Bích Hà 18Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Ion Chromatography HCO3 -/CO3 2- Eluent Eluant 0.0028M NaHCO 3 0.0022M Na CO2 3 ~2 ml/min flow Pump 500 - 5,000 psi 1,000 nominal Check for air bubbles Sample Loop Sample in Syringe or from Autosampler Waste 50 ul Inject Valve Sample Guard Column Separator Column RNR 3 + HCO 3 - + Cl - RNR 3 + Cl - HCO 3 - + 2RNR 3 + CO 3 = + SO 4 = 2RNR 3 + CO 3 =+SO 4 = SO 4 = Cl - NO 3 - "R" = latex resin particle Conductivity Detector + - Na +HCO 3 - + - C a tio n E x c h a n g e M e m b ra n e H + C a ti o n E x c h a n g e M e m b ra n e Na + H CO2 3 A n o d e C a th o d e - H O2 + O 2 + H O2 OH - H 2 - - Computer/Integrator Self Regenerating Anion Suppressor time Chromatogram Cl - F - SO 4 =NO 3 - water dip C o n d u c tiv ity (u S ) PO 4 3- PO 4 3- - - ThS. Phan Bích Hà 19Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Degas Eluant Quaternary Pump 500 - 5,000 psi 1,650 psi nominal Sample Loop Sample in Syringe or from Autosampler Waste 100 ml Inject Valve Sample Guard Column Separator Column RNR 3 + OH- + Cl - RNR 3 + Cl - OH-+ 2RNR 3 + 2(OH-) + SO4 2- 2RNR 3 + + SO4 2- Cl- NO3 - "R" = latex resin particle Conductivity Detector + - Na+OH- + - C a tio n E x c h a n g e M e m b ra n e H+ C a ti o n E x c h a n g e M e m b ra n e Na+ H2O A n o d e C a th o d e -+ + OH-- - Computer/Integrator Self Regenerating Anion Suppressor time Chromatogram Cl- F- SO4 2-NO3 - C o n d u c ti v it y ( m S ) PO4 3- - - Ion Chromatography OH - Eluent 40 mM NaOH Degas Eluant DI Water SO4 2- 2OH- H2OH2O O2 H2 PO4 3- CO3 2- ThS. Phan Bích Hà 20Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Eluent He Gas To Pump Pump Mode He Gas To Pump Degas Mode Eluent ThS. Phan Bích Hà 21Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM time Suppressed IC C o n d u c ti v it y ( m S ) time Non-Suppressed IC C o n d u c ti v it y ( m S ) ThS. Phan Bích Hà 22Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Hệ thống sắc ký ion Metrohm IC850 ThS. Phan Bích Hà 23Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Hệ thống sắc ký ion Shimadzu ThS. Phan Bích Hà 24Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Hệ thống sắc ký ion Dionex 3000 ThS. Phan Bích Hà 25Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Sắc ký ion Dionex 3000 tại Viện ThS. Phan Bích Hà 26Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM CÁC BỘ PHẬN ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 27 CÁC BỘ PHẬN • Bơm SP : Single pump • EGC : Eluent genarator cartridges RFIC Reagent Free Ion Chromatography – CT-RC : Continously Regenerated Trap Column • Injector : AS-AP • DC : Detector/Chromatography: Separation (Guard column, column); detection(CD và ED); automation – ASRS : Anion Self-Regenerating Suppressor • Hệ xử lý dữ liệu ThS. Phan Bích Hà 28Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM PHÂN LOẠI SẮC KÝ ION • Sắc ky ́ trao đổi ion. (Ion exchange) • Sắc ky ́ ghép cặp ion. (Ion pair) –Không sử dụng đầu dò độ dẫn • Sắc ky ́ đuổi ion. (Ion exclusion) –Ứng dụng cho acid hữu cơ ThS. Phan Bích Hà 29Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Sắc ký ghép cặp ion • Sử dụng cột sắc ky ́ lỏng pha đảo với đầu dò thường ThS. Phan Bích Hà 30Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Sắc ký loại ion • Phân tích acid va ̀ baz yếu R-COOH  RCOO- + H+ • Sự lưu giữ phu ̣ thuộc – Kích cỡ của R. – Tương tác của R với chất nền pha tĩnh. – pKa • R tương tác với eluent va ̀ chất nền pha tĩnh ThS. Phan Bích Hà 31Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân biệt Size exclusion chromatography ThS. Phan Bích Hà 32Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Ion exclusion chromatography • Pha tĩnh trao đổi cation có các nhóm SO3H. Pha động có nước làm pha tĩnh bị hidrat hóa. Lớp nước hidrat hóa tạo màng đặc biệt gọi là màng Donnan, mang điện tích âm chỉ cho qua các phân tử trung hòa về mặt điện tích. • Các acid hữu cơ không phân ly, có thể được lưu giữ trên pha tĩnh, khi phân ly sẽ bị loại ra và sẽ rửa giải theo pha động ThS. Phan Bích Hà 33Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Sắc ký trao đổi ion ThS. Phan Bích Hà 34Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Cơ chế trao đổi ion The anion exchange mechanism The cation exchange mechanism ThS. Phan Bích Hà 35Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM CÁC ĐẠI LƯỢNG TRONG SẮC KÝ ION • Tương tự như trong HPLC • Ba đại lượng liên quan đến đô ̣ phân giải R : – Hệ sô ́ lưu giữ : không nên lớn quá. – Sô ́ đĩa lý thuyết N : tương đối lớn. – Độ chọn lọc : không bị ảnh hưởng nhiều bởi các thông sô ́ pha động mà chịu ảnh hưởng do pha tĩnh. ThS. Phan Bích Hà 36Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Retention time – Thời gian lưu Dùng để định tính ThS. Phan Bích Hà 37Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 38Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Retention time – Ion phân tích • Charge = valency – điện tích ion • Size - Kích thước • Polarizability – khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà 39Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Điện tích ion ThS. Phan Bích Hà 40Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Điện tích ion ThS. Phan Bích Hà 41Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Kích thước ThS. Phan Bích Hà 42Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Kích thước ThS. Phan Bích Hà 43Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Kích thước ThS. Phan Bích Hà 44Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà 45Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà 46Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà 47Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Retention time • Nồng độ pha động • Nhiệt độ cột • pH của pha động ThS. Phan Bích Hà 48Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 49Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 50Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 51Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU BẰNG IC ThS. Phan Bích Hà 52Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 53Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 54Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Ion chromatography system configuration ThS. Phan Bích Hà 55Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Dionex - Ion Chromatography Product Line ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 56 RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà 57Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Bơm (Pump) Bền hơn PEEK (Polyether ether ketone) P(IC) < P(HPLC) SP Single Pump DP Dual Pump ThS. Phan Bích Hà 58Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC Sử dụng điện phân để tạo pha động nồng độ chính xác ThS. Phan Bích Hà 59Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Anion) ThS. Phan Bích Hà 60Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Cation) ThS. Phan Bích Hà 61Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Anion) ThS. Phan Bích Hà 62Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 63Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM EPM (Electrolytic pH Modifier) ThS. Phan Bích Hà 64Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM CR-TC Continously Regenerated Trap Column ThS. Phan Bích Hà 65Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM CR-ATC ThS. Phan Bích Hà 66Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM CR-CTC ThS. Phan Bích Hà 67Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà 68Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Injector ThS. Phan Bích Hà 69Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Injector ThS. Phan Bích Hà 70Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM AUTOSAMPLER ThS. Phan Bích Hà 71Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà 72Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM DC MODULE ThS. Phan Bích Hà 73Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM SEPARATION ThS. Phan Bích Hà 74Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Column Material substrate / resin carrier spacer group functional group Composition of the stationary phase Substrate: • Polystyrene / divinylbenzene • Polymethacrylate • Polyvinylalcohol • Silica gel • Hydroxyethylmethacrylate (HEMA) Anion exchanger • quaternary ammonium groups • alkyl amines • hydroxy-alkylamines Cation exchanger • sulfonates • carboxylates Spacer • Alkyl chain ThS. Phan Bích Hà 75Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM The stationary phase ThS. Phan Bích Hà 76Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Column Material ion exchangers for IC polymer resinssilica gels polymer coated surface functionalized surface functionalizedpolymer coated PS/DVB PVA MAlayer latex particles microporous macroporous Metrosep C 4 Metrosep C 2 A Supp 10 A Supp 15 &16 A Supp 4 A Supp 5 DIONEX ThS. Phan Bích Hà 77Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Cấu trúc nhựa latex ThS. Phan Bích Hà 78Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Latex Bead OSO3 - +H3N NH3 + NH3 + SO4 2- OH- Cl- OH- OH- ThS. Phan Bích Hà 79Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM DETECTOR ThS. Phan Bích Hà 80Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM DETECTOR ThS. Phan Bích Hà 81Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM SRS 300 Self-Regenerating Suppressor ThS. Phan Bích Hà 82Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM SRS 300 Self-Regenerating Suppressor ThS. Phan Bích Hà 83Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Các loại khác ThS. Phan Bích Hà 84Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 85Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà 86Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM The assembly of key SRS components ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 87 The electrolytic suppression processes in the ASRS ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 88 Conductivity Detector + - Na+HCO3 - + - C a ti o n E x c h a n g e M e m b ra n e H+ C a ti o n E x c h a n g e M e m b ra n e Na+ H CO2 3 A n o d e C a th o d e - H O2 + O2 + H O2 OH- O2 - - Self Regenerating Anion Suppressor From Separator Column ThS. Phan Bích Hà 89Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Conductivity Detector + - Na+OH- + - C a tio n E x c h a n g e M e m b ra n e H+ C a ti o n E x c h a n g e M e m b ra n e Na+ H2O A n o d e C a th o d e - + + OH- - - H2OH2O O2 H2 - - NO3 - NO3 - H+ ~ pH 10 ~ pH 3 ThS. Phan Bích Hà 90Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 91 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 92 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 93 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh 2. Tổng hợp các tài liệu của Dionex ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 95 ỨNG DỤNG TRÊN MÁY IC Trình bày: Cn. Nguyễn Thị Hà Linh Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân tích trên mẫu nước Phân tích các anion • Column: ionpac As22 ( 4x250mm), ionpac AG22 ( 4x250mm); • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.4mmol/L NaHCO3 • Flow rate: 1.2 mL/min • Injection volume: 2.5µL • SRS suppressor: ASRS 300(2mm) • Background: 20-23µL Phân tích các anion • Column: ionpac As22 ( 4x250mm), ionpac AG22 ( 4x250mm); • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.4mmol/L NaHCO3 • Flow rate: 1.2 mL/min • Injection volume: 10µL • SRS suppressor: asrs 300(4mm) • Background: 20-23µL >< Phân tích các anion • Column: AS23, AG23 • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.0mmol/L NaHCO3 • Flow rate: 1.0 mL/min • Detection: suppressed conductivity with CRD-300 • Scrubber: 0.5 mol/L KOH • Background: < 1.0µL Peak ppb • Fluoride 10 • Chlorite 10 • Bromate 5 • Chloride 100 • Chlorate 10 • Bromide 500 • Nitrate 500 • Sulfate 100 Phân tích các anion Phân tích cation Phân tích cation Phân tích trên mẫu thực phẩm Phân tích trên mẫu thực phẩm Phân tích Phương pháp trên IC Anion vô cơ HPIC/ Suppressed Conductivitty, DC Amperometry, UV/Vis Kim loại kiềm thổ HPIC/ Suppressed Conductivity Acid hữu cơ HPIC/ Suppressed Conductivity; HPICE/ Suppressed Conductivity Amine béo HPIC/ Suppressed Conductivity/ Pulsed Amperometry Carbohydrates HPIC/ Pulsed Amperometry Alcolhols/ aldehydes HPICE/ Pulsed Amperometry Amino acids HPIC/ Pulsed Amperometry Phân tích NO2 - , NO3 - trong thịt Phân tích iodide trong sữa bột Phân tích polyphosphates trong phomai Anion trong trà • Column: ionpac AS19(0.4x250mm and AG19(0.4x50mm) • Eluent: KOH(EG) • Flow rate: 10µL/min • Inj.volume: 0.4µL • Detection: suppressed conductivity Phân tích phosphate và citrate trong nước ngọt Phân tích chất hữu cơ trong nước Phân tích đường Phân tích đường monosaccharides trong càphê hòa tan ỨNG DỤNG TRÊN IC