Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Thái nguyên 10/2010 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ THỊ PHƯỢNG Më ®Çu Mục đích: Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương Cystatin và gen cystatin được xác định có liên quan với khả năng chịu hạn của thực vật. TỔNG QUAN TÀI LIỆU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NỘI DUNG TRÌNH BÀY Cây Đậu tương Glycine max (L.) Merrill, có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp Khí hậu nước ta phức tạp, tác động bất lợi đến cây trồng Më ®Çu Đậu tương thuộc nhóm chịu hạn kém. Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu đặc tính chịu hạn và cơ sở phân tử của đặc tính này để tuyển chọn giống chất lượng, chịu hạn. Tuy nhiên, sự hiểu biết về gen liên quan đến chịu hạn còn ít và chưa đầy đủ Lý do chọn đề tài Cystatin và gen cystatin được xác định có liên quan với khả năng chịu hạn của thực vật và đã được nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng khác nhau.... Vậy gen cystatin liên quan thế nào đến khả năng chịu hạn của đậu tương? Mục đích: Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương 2. Mục tiêu : Xác định khả năng chịu hạn và phân nhóm về mức độ chịu hạn của các giống đậu tương ngiên cứu. Phân tích đặc điểm gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương. 3. Nội dung: Xác định khả năng phản ứng với hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo; Tách ARN tổng số từ hạt đậu tương ở giai đoạn hạt non; Thu thập thông tin về gen cystatin, thiết kế và tổng hợp cặp mồi để nhân gen cystatin; Tạo dòng cADN từ mARN bằng phản ứng phiên ma ngược và nhân gen cystatin bằng kĩ thuật PCR; Đọc trình tự nu của gen cystatin ở cây đậu tương. Më ®Çu Đề tài luận văn đã tổng kết 56 tài liệu có liên quan thể hiện một số vấn đề sau: Đặc điểm, giá trị kinh tế và tình hình sản xuất của cây đậu tương Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương Gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cystatin và gen cystatin Cystatin là chất ức chế có bản chất protein, có khả năng ức chế đặc hiệu hoạt động của papain và các enzyme phân hủy cysteine (cysteine proteinase). Khi stress hạn xảy ra, một số protein bị biến tính và tổn thương. Cysteine protease tham gia loại bỏ các protein biến tính; tham gia hoàn thiện, tái tạo protein nhằm giúp cây thích ứng với những tác động của ngoại cảnh. Quá trình này có thể bị cản trở bởi cystatin. Sự biểu hiện của gen cystatin thường trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật. Do vậy, phân lập gen cystatin nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích luỹ cystatin là rất cần thiết. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Các loại hóa chất, thiết bị dùng cho các thí nghiệm phân tích hoá sinh và sinh học học phân tử: gồm các loại mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc... Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đánh gía khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo, theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp sinh học phân tử PP tách chiết RNA tổng số từ hạt ở quả đậu tương non Phương pháp điện di RNA trên gel agarose Phương pháp RT-PCR Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Biến nạp vector tái tổ hợp vào TB khả biến E.coli DH5α Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Tách chiết plasmid Phương pháp xác định trình tự nucleotide 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Phương pháp xử lý trình tự gen kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.1. Hạt của 5 giống đậu tương Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.1. Màu sắc, số lượng và khối lượng hạt của 5 giống đậu tương nghiên cứu Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt 5 giống đậu tương nghiên cứu Sau 5 ngày Sau 7 ngày Sau 9 ngày Hình 3.2. Hình ảnh cây đậu tương non 3 lá A. trước khi xử lí bởi hạn; B. sau khi xử lý hạn Khả năng chịu hạn của giống đậu tương B A kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Khả năng chịu hạn của giống đậu tương Bảng 3.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tương nghiên cứu Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá: BD > BH> TN> CT> DT84 kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.3. Kết quả tách chiết RNA tổng số 3.2.1. Kết quả tách chiết ARN tổng số 2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN Chương 3. kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN bp 1000 750 Hình 3.4. Kết quả PCR nhân gen cystatin từ hạt non của giống đậu tương Thái Nguyên 3.2.2. Kết quả khuếch đại gen cystatin Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN 3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 750 M 1 2 3 4 1000 bp Ghi chú: M: Marker 1Kb 1Kb; Giếng 1; 2; 3; 4 là các khuẩn lạc trắng được chọn Hình 3.6. Sản phẩm clony-PCR 3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp M 1 2 3 4 kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN 750 M 1 2 3 M: Marker 1Kb; Giếng 1: Plasmid không mang đoạn DNA (đối chứng âm); Giếng 2;3: Plasmid mang đoạn ADN chèn vào. H.3.8. Kết quả cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI 3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN 3.2.7. Kết quả đọc trình tự nucleotit Đọc trình tự nucleotit trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analizer, xử lí bằng phần mề̀m DNAstar. So sánh trình tự này trong BLAST của ngân hàng NCBI, kết quả cho thấy đây là trình tự gen cystatin của đậu tương kích thước mong muốn dài 738 bp SO SÁNH TRÌNH TỰ NU CỦA GEN CYSTATIN CỦA GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI 4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Bảng: Hệ số tương đồng và hệ số khác nhau của trình tự gen cystatin Thái Nguyên với trình tự gen cystatin của 9 giống đậu tương công bố trên GenBank. kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 10 giống đậu tương kÕt qu¶ VÀ THẢO LUẬN So với gen cystatin mã số D31700; AK246065; D64115: khác 1 nucleotide (ở vị trí nu 109) dẫn tới sự thay đổi 1 axit amin SO SÁNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN DO GEN CYSTATIN Mà HÓA CỦA GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI 4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK So với gen cystatin mã số BT098957 : khác 2 nucleotide ở 2 vị trí nucleotide 109 và 207) dẫn tới sai khác 2 axit amin. Bộ ba GAA (mã hóa aa Glutamic) Ở vị trí nucleotide số 109: G thay bằng T. Do đó: Bộ ba TAA (kết thúc dịch mã) 1. Trong quá trình tổng hợp cDNA từ mRNA, hay nhân gen PCR có sự lắp ghép sai một nucleotide, ở vị trí nu 109 G thay bằng T; 3. Gen cystatin phân lập từ ADN (4 exon và 3 intron). Trình tự gen cystatin giống nghiên cứu tách từ mRNA tương đồng với trình tự nu ở 4 exon. Khi phiên mã tổng hợp mRNA, các đoạn không mã hóa và mã hóa đều được sao thành phân tử tiền mRNA. Qua giai đoạn cắt bỏ các đoạn intron và nối các exon lại với nhau của phân tử tiền mRNA tạo ARN hoàn chỉnh có thể dẫn tới sự sai sót trên. 2. Trong quá trình tái bản hoặc phiên mã gen bị đột biến thay thế một nucleotide; 4. Ở khả năng do đột biến thay thế thì đoạn polypeptide được dịch mã là 36 axit amin; vì chuỗi polypeptide được suy từ trình tự nucleotide của cADN ( phiên mã từ mARN) nên rất có thể xảy ra: Cystatin hoàn chỉnh không được tổng hợp nên cysteine proteinase không bị ức chế. Đoạn polypeptide gồm 36 axit amin có thể tham gia trong các hoạt động sinh lý, hóa sinh của tế bào SỰ THAY THẾ G BỞI T CÓ THỂ XẢY RA MỘT SỐ KHẢ NĂNG: KẾT LUẬN 5. So với 9 trình tự nu của gen cystatin đậu tương trên genbank thấy trình tự nu của gen cystatin giống đậu tương TN có độ tương đồng dao động từ 94,5% - 99,8%. 2. Ở giai đoạn cây non ba lá, 5 giống nghiên cứu phản ứng khác nhau với hạn. Chỉ số chịu hạn tương đối (215,07 - 3595,77). Khả năng chịu hạn: BD> BH > TN> CT> DT84. 3. Đã thiết kế cặp mồi và khuếch đại thành công gen cystatin từ mARN tách chiết ở hạt non của giống đậu tương TN 4. Gen cystatin của giống đậu tương TN(738 bp), xuất hiện đột biến thay thế ở vị trí nu thứ 109 làm bộ ba GAA thay bằng TAA (mã kết thúc) và chuỗi polypeptit tổng hợp chỉ có 36 aa. 1. Các giống đậu tương nghiên cứu đa dạng về hình thái hạt, số quả và số hạt. Khối lượng 1000 hạt của 5 giống: DT84> BH> BD> CT = TN. ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc của gen cystatin ở các giống đậu tương khác. Đặc biệt so sánh cấu trúc gen cystatin của giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với giống đậu tương chịu hạn kém, để xác định mối liên quan giữa sự thay đổi cấu trúc gen với đặc tính chịu hạn của cây đậu tương.