Đánh giá sự đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Tp. Hồ Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuật RAPD

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RƢ̀NG Dendrobium THU THÂP̣ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢ̀NG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUÂṬ RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG MINH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RƢ̀NG Dendrobium THU THÂP̣ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ RƢ̀NG NAM CÁT TIÊN BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ DUNG TRƢƠNG MINH DŨNG TS. VÕ THÁI DÂN CN. LƢU PHÚC LƠỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TA ̣ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Viêṇ Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ và Môi Trƣờng – Đaị hoc̣ Nông Lâm TP. HCM. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin trân troṇg gƣ̉i lời biết ơn đến các thầy cô: - TS. Trần Thị Dung - TS. Võ Thái Dân - CN. Lƣu Phúc Lợi Đa ̃tâṇ tình hƣớng dâñ , chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng nhƣ taọ điều kiêṇ tốt nhất cho viêc̣ thƣc̣ hiêṇ và hoàn tất đề tài tốt nghiêp̣ này. CN. Huỳnh Kim Hƣng và toàn thể các anh chị thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng – Đaị hoc̣ Nông Lâm TP. HCM đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian ở phòng thí nghiệm. Kỹ sƣ Huỳnh Tuấn Anh – trƣởng Traṃ khuyến nông huyêṇ Tân Phú , tỉnh Đồng Nai đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian thu mẫu tại rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Cô Nguyêñ Thị Cách và các anh Trƣờng , Tùng, chị Vân đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt thời gian thu mâũ taị Thành phố Hồ Chí Minh. Toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. TP. HCM, tháng 09 năm 2007 Trƣơng Minh Dũng iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRƢƠNG MINH DŨNG , Đaị hoc̣ Nông Lâm Tp . Hồ Chí Minh, 9/2007. “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thâp̣ taị Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên bằng kỹ thuâṭ RAPD.” Hôị đồng hƣớng dâñ: TS. Trần Thi ̣ Dung, TS. Võ Thái Dân, CN. Lƣu Phúc Lơị. Điạ điểm nghiên cƣ́u : Viêṇ Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ và Môi Trƣờng , Đaị hoc̣ Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Viêṭ Nam sở hƣ̃u nhiều nguồn gen quý hiếm, đôc̣ đáo, mới la ̣của giống lan rƣ̀ng Dendrobium. Các giống Dendrobium không nhƣ̃ng đep̣ , giá trị kinh tế cao , mà còn có giá trị y học . Vì vậy, trƣớc hết chúng ta cần phải khảo sát sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan rừng Dendrobium, tạo nền tảng cho công tác bảo tồn và tạo các giống mới, trên cơ sở đó, xây dƣṇg thƣơng hiêụ cho cây lan Viêṭ Nam . Thiết lâp̣ quy trình li trích DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá có đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇ h cao. Bên caṇh đó , xây dƣṇg phản ƣ́ng PCR với primer RAPD cho tính đa hình cao . Tƣ̀ đó, phân tích tính đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium thu thâp̣ tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên dựa trên phần mềm NTSYSp c Version 2.1 và Winboot. Quy trình li trích DNA tƣ̀ mâũ lá có đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇh cao đa ̃đƣơc̣ tối ƣu thành công . 6 primer ngâũ nhiên : OPAC10, OPAH13, 0PB01, OPB08, S1384, U693 đƣơc̣ dùng trong phân tích đa daṇg di truyền của các giống lan khảo sát bằng kỹ thuật RAPD . Trên cơ sở đó , xây dƣṇg sơ đồ phân nhóm di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium. Sơ đồ phân nhóm di truyền cho thấy các giống lan khảo sát có sƣ ̣đa daṇg cao về măṭ di truyền, phân thành 5 nhóm với mức tƣơng đồng gen từ 0.39 – 0.79. v SUMMARY Genetic diversity analysis of wild Dendrobium stem at Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest by RAPD Supervisor: Tran Thi Dung 1 , PhD; Vo Thai Dan 2 , PhD; Luu Phuc Loi 1 , BSc Student: Truong Minh Dung 1 1 Department of Biotechnology, Nong Lam university, Ho Chi Minh city 2 Faculty of Agriculture, Nong Lam university, Ho Chi Minh city To analysis the genetic diversity of wild Dendrobium orchid, six decamers were used for 10 wild Dendrobium species, collected from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province). Collecting 10 species from Ho Chi Minh city and Nam Cat Tien forest (Dong Nai province), optimizing of protocols for DNA extraction and purification, constructing of protocol for RAPD, analyzing the genetic of 10 wild Dendrobium species by RAPD and constructing the dendrogram by NTSYSpc 2.1 software, Winboot program are the objective of the study. Methods - To identify 10 wild Dendrobium species with genotype. - Extraction of total DNA from fresh tissue of 10 wild Dendrobium species. - Six random primer: OPAC10, OPAH13, OPB01, OPB08, S1384, U693 were used to analysis of genetic diversity. - Following RAPD reactions, dendrogram were constructed by NTSYSpc 2.1 and Winboot program. Conclusion Six decamers are enough to compare the identity of all samples. We could use those primers to establish the methodology to perform genetic comparisons in Vietnam. Besides, the genetic diversity among 10 wild Dendrobium species were established to support the breeder overcome difficulties in plant salection. vi MỤC LỤC CHƢƠNG Trang LỜI CẢM TA ̣.................................................................................................. iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ............................................................................... iv SUMMARY ..................................................................................................... v MỤC LỤC ....................................................................................................... vi DANH SÁCH CHƢ̃ VIẾT TẮT ..................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................ x DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ........................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................. xi 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 2 1.2. Mục tiêu – nôị dung – yêu cầu đề tài ........................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ ............................................................................ 3 2.1.Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium................................ 3 2.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................. 3 2.1.2. Các nhóm lan Dendrobium .................................................................... 5 2.1.3. Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài .............................. 6 2.2. Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật .................................................. 8 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR ....................................................................... 11 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR ................................................................ 11 2.3.2. Thành phần thực hiện một phản ứng PCR ............................................ 14 2.3.2.1. Mẫu ..................................................................................................... 14 2.3.2.2. Primer ................................................................................................. 14 2.3.2.3. dNTP ................................................................................................... 16 2.3.2.4. MgCl2 ................................................................................................. 17 2.3.2.5. Taq ...................................................................................................... 17 vii 2.3.5.6. Buffer .................................................................................................. 17 2.4. Đa dạng di truyền – một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................................................................... 18 2.4.1. Đa dạng di truyền .................................................................................. 18 2.4.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền .............................. 18 2.4.2.1. Phƣơng pháp chỉ thị hình thái ............................................................. 18 2.4.2.2. Phƣơng pháp chỉ thị isozyme ............................................................. 19 2.4.2.3. Phƣơng pháp dùng chỉ thị phân tử ...................................................... 19 2.5. Đánh giá sƣ ̣đa daṇg di truyền bằng phần mềm NTSYSpc và Winboot .. 26 2.5.1. NTSYSpc version 2.1 ............................................................................ 26 2.5.2. Winboot ................................................................................................. 28 2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan ................................................... 29 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 29 2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc .......................................................... 31 3. VÂṬ LIÊỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................................ 32 3.1. Nội dung, thời gian và địa điểm ............................................................... 32 3.1.1. Nội dung ................................................................................................ 32 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ......................................................... 32 3.2. Vật liệu...................................................................................................... 32 3.2.1. Các giống lan Dendrobium thí nghiệm ................................................. 32 3.2.2. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................... 34 3.2.3 Hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 34 3.3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu .................................................... 36 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 36 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 36 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ......................................................................... 45 4.1. Điều tra và thu thâp̣ các giống lan rƣ̀ng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái .................. 45 viii 4.2. Tối ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá tƣơi cho đô ̣tinh sac̣h và ổn điṇh cao ............................................................................. 48 4.3. Xây dƣṇg quy trình PCR dƣạ trên kỹ thuâṭ RAPD cho tính đa hình cao ....................................................................................................... 53 4.4. Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium dựa trên 30 primer RAPD ................................................................................ 54 4.5. Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của 10 giống lan rƣ̀ng Dendrobium bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot ........................................ 60 5. KẾT LUÂṆ - ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 69 5.1. Kết luâṇ ..................................................................................................... 69 5.2. Đề nghi.̣..................................................................................................... 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 71 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism bp: base pair CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EB: extraction buffer EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid mM: milimolar (milimol/lite) NCT: Nam Cát Tiên OD: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction pmol: Picomol RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism RNA: Ribonucleic acid Rnase: Ribonuclease SSR: Simple Sequence Repeat Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp) TAE: Tris – Acetate – EDTA TE: Tris – EDTA Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) TP. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh U: Đơn vị hoạt tính UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic VNTR: variable number tandem repeat x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG Trang Bảng 2.1. Nồng độ agarose và kích thƣớc đoạn cần phân tách. ...................... 11 Bảng 3.1. Primer .............................................................................................. 34 Bảng 3.2. Các giống lan thu thập từ Tp. Hố Chí Minh và rừng Nam Cát Tiên ..................................................................................... 37 Bảng 3.4. Điểm khác nhau giữa 3 quy trình li trích. ....................................... 40 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR. ................................ 42 Bảng 3.6. Quy trình PCR. ................................................................................ 42 Bảng 4.1. So sánh các đăc̣ trƣng về lá của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium .. 46 Bảng 4.2. So sánh các đăc̣ trƣng về thân của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium ..................................................................................................... 47 Bảng 4.3. Tỉ lệ DNA tổng số tinh sạch trong 3 quy trình li trích khảo sát ...... 50 Bảng 4.4. Nồng đô ̣DNA (ng/µl) tổng số theo 3 quy trình .............................. 51 Bảng 4.5. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ................................. 53 Bảng 4.6. Quy trình PCR ................................................................................. 53 Bảng 4.7. Số band khuếch đại và band đa hình trên một số primer. ............... 55 Bảng 4.8. Hệ số đồng dạng của 10 giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên ........................................ 62 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ DNA mẫu tổng số tinh sạch li trích theo 3 quy trình khảo sát. ........................................................................................ 50 Biểu đồ 4.2. Biểu đồ thể hiện tính ổn định của 3 quy trình khảo sát. ............. 51 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH Trang Hình 2.1. Các giống lan rừng Dendrobium ..................................................... 5 Hình 2.2. Nguyên lí của phản ứng PCR .......................................................... 13 Hình 2.3. Nguyên lí của phản ứng RFLP. ....................................................... 21 Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP. ....................................................... 23 Hình 2.5. Nguyên lí của phản ứng RAPD ....................................................... 25 Hình 2.6. Nguyên lí của phản ứng microsatellite... ......................................... 26 Hình 2.7. Giao diêṇ NTSYSpc 2.10m ............................................................. 27 Hình 2.8. Giao diêṇ chƣơng trình Winboot ..................................................... 29 Hình 3.1. Các giống lan Dendrobium nghiên cứu trong đề tài. ....................... 33 Hình 4.1. So sánh các đăc̣ trƣng về lá của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium ... 45 Hình 4.2. DNA li trích theo quy trình 1........................................................... 49 Hình 4.3. DNA li trích theo qui trình 2 ........................................................... 49 Hình 4.4. DNA li trích theo quy trình 3........................................................... 50 Hình 4.5. Ảnh điêṇ di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 54 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 55 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAC10 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 56 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 56 Hình 4.9. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPAH13 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 57 Hình 4.10. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 57 Hình 4.11. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB01 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................ 58 xii Hình 4.12. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 58 Hình 4.13. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer OPB08 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 59 Hình 4.14. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 59 Hình 4.15. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer S1384 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 60 Hình 4.16. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Thành phố Hồ Chí Minh. ................ 60 Hình 4.17. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với primer U693 đối với các giống lan rừng Dendrobium thu thập tại Nam Cát Tiên. ................................. 61 Hình 4.18. Sơ đồ phân nhóm di truyền dựa trên kết quả RAPD đối với nhóm lan rừng Dendrobium thu thập từ Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên .......................................................................................................... 63 Hình 4.19. Sơ đồ PCA dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái của các giống lan rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 64 Hình 4.20. Sơ đồ 3D PCA dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái của các giống lan rừng Dendrobium khảo sát. ............................................................................. 65 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hoa lan là một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị, không những góp phần tích cực vào việc nâng cao hiệu quả sử dụng lao động, đất, nƣớc và các nguồn lực khác, mà còn làm cho chất lƣợng môi trƣờng sống ngày càng mỹ quan hơn. Vì vậy phát triển hoa lan là một xu thế trong sản xuất nông nghiệp ở các đô thị hiện nay và ngay cả trong tƣơng lai. Với khí hâụ nhiệt đới, Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí Minh, Nam Cát Tiên nói riêng có nhiều điều kiện tự nhiên thích hợp với việc phát triển nhiều loại phong lan, địa lan, đăc̣ biêṭ là giống Dendrobium. Lan Dendrobium không nhƣ̃ng đep̣ mà còn có giá tri ̣ cao về măṭ kinh tế . Bên caṇh việc nhập nội, lai tạo, nhân giống các giống mới, chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo, mới lạ của giống lan rƣ̀ng Dendrobium. Do hiêṇ nay , các giống lan rừng vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều trong xã hội , nên tiềm năng phát tri ển của giống lan rƣ̀ng Dendrobium vâñ chƣa đƣơc̣ khai thác triêṭ để . Vì vậy , trƣớc hết chúng ta cần phải tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền các giống lan rƣ̀ng Dendrobium giƣ̃a các địa phƣơng, trên cơ sở đó thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống mới, đồng thời xây dựng các định hƣớng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen giống lan Dendrobium trong nƣớc. Để nghiên cứu đa dạng di truyền, trên thế giới hiêṇ có nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử (RFLP, AFLP, RAPD, SSR). Tùy vào đối tƣợng, điều kiện và mục đích nghiên cứu mà ngƣời ta lựa chọn phƣơng pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của giống lan rƣ̀ng Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD vì đây là kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh, và đặc biệt là không cần phải biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng. 2 Trên cở sở đó, chúng tôi đa ̃tiến hành nghiên cƣ́u và thƣc̣ hiêṇ đề tài : “Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập taị Thành ph ố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên bằng ky ̃thuâṭ RAPD”. Kết quả của đề tài này tạo cơ sở cho việc xây dựng thƣơng hiệu cho cây lan Việt Nam nói chung và cây lan Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng. 1.2. Mục tiêu – nôị dung – yêu cầu đề tài Mục tiêu Xây dựng phƣơng pháp nghiên cứu tối ƣu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium, thu thập tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên. Nôị dung - Điều tra và thu thâp̣ các giống lan rƣ̀ng Dendrobium tƣ̀ Thành phố Hồ Chí Minh và rƣ̀ng Nam Cát Tiên dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái . - Tối ƣu phƣơng pháp ly trích DNA tổng số tƣ̀ mâũ lá tƣơi cho đô ̣tinh sac̣h và ổn định cao. - Xây dƣṇg quy trình PCR dƣạ trên kỹ thuâṭ RAPD cho t ính đa hình cao. - Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan rƣ̀ng Dendrobium dƣạ trên primer RAPD. - Phân tích sƣ ̣đa daṇg di truyền của các giống lan khảo sát bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot. Yêu cầu - Điṇh danh chính xác các giống lan dƣạ trên đăc̣ điểm hình thái . - Li trích DNA tổng số từ mẫu lá với độ tinh sac̣h cao. - Xây dựng đƣợc qui trình PCR – RAPD ổn định, cho tính đa hình cao. - Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống lan rừng Dendrobium qua việc phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên. - Mô tả quan hệ di truyền của các giống lan rừng Dendrobium bằng phần mềm NTSYS và Winboot. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu tổng quan về giống lan rừng Dendrobium Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epidendroideae, phân họ Orchidaceae. Lan Dendrobium có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Dendrobium có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có đốm to hay nhỏ. Giống Dendrobium có trên 1200 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều giống mới. Loài hoa này có xuất xứ ở châu Á, Philippines, Borneo, Australia, New Guinea và New Zealand. Cây có thể mọc ở nhiều vùng địa lý khác nhau, vừa chịu đƣơc̣ khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu đƣơc̣ khí hậu khô hạn, ví dụ nhƣ vùng rừng thấp nhiệt đới, đồi núi cao của dãy Himalaya hay kể cả sa mạc khô hạn của Australia. Điều kiện khí hậu lí tƣởng nhất cho việc nuôi trồng loài hoa này là từ 280C- 330C nên rất thích hợp với điều kiện Việt Nam nói chung, Thành phố Hồ Chí Minh và Nam Cát Tiên nói riêng. Dendrobium không chỉ là loài hoa có giá trị về mặt mỹ thuật mà còn là một cây dƣợc liệu quí của nền y học cổ truyền. 2.1.1. Đặc điểm hình thái Rễ: Ngoài chức năng neo bám và nuôi dƣỡng cho cây, rễ còn có vai trò dự trữ , hô hấp và cả nhiệm vụ quang hợp (photosynthese). Rễ càng phát triển còn có khả năng gạn lọc hấp thu các muối khoáng , các chất dinh dƣỡng , các chất tan trong nƣớc mƣa hay trong sƣơng mai . Trên bề măṭ của rễ lan , chất nhung tơ (Vélamen) giữ nhiệm vụ hút nƣớc đƣợc nhiều nhất và nhanh nhất, là màng che nóng hết sức hiệu quả cho bộ rễ. Khi tiếp xúc với vỏ cây (giá thể) chúng tự hình thành một lớp các chất kết dính để cố định cho lan thật vững chắc trên giá thể hay giá đỡ của chúng. 4 Thân: Dendrobium thuộc nhóm đa thân. Thân có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nƣớc và các chất dinh dƣỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. Củ giả rất đa dạng: hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả. Cấu tạo củ giả: gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài là lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ, tránh sự mất nƣớc do mặt trời hun nóng. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó làm nhiệm vụ quang hợp. Lá: Hầu hết các loài phong lan là cây tự dƣỡng, nó phát triển đầy đủ về hệ thống lá. Hình dạng của lá thay đổi rất nhiều, từ loại lá mọng nƣớc đến loại lá phiến mỏng. Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung hay chỉ gấp lại theo gân hình chữ V. Màu sắc lá thƣờng xanh bóng, nhƣng có trƣờng hợp 2 mặt lá khác nhau. Thƣờng mặt dƣới có màu xanh đậm hay tía, mặt trên lại khảm nhiều màu sặc sỡ. Hoa: hoa đối xứng qua một mặt phẳng. Bên ngoài có 6 cánh hoa, trong đó 3 cánh ngoài cùng là 3 cánh đài, thƣờng có màu sắc và kích thƣớc giống nhau. Một cánh đài nằm ở phía trên hay phía sau của hoa gọi là cánh đài lý, hai cánh đài nằm ở 2 bên gọi là cánh đài cạnh. Nằm kề bên trong và xen kẽ với 3 cánh đài là 3 cánh hoa, chúng giống nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc. Cánh còn lại nằm ở phía trên hay phía dƣới, có hình dạng và màu sắc khác hẳn với các cánh còn lại gọi là cánh môi. Cánh môi quyết định giá trị thẩm mỹ của hoa lan. Ở giữa hoa có một trụ nổi lên, đó là bộ phận sinh dục của cây, giúp cây duy trì nòi giống. Trụ gồm nhị và nhụy. Sau khi thụ phấn, các cánh hoa héo, cuống hoa hình thành quả lan. Quả và hạt: quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đƣờng nứt dọc. Quả có dạng cải dài đến hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Hạt lan rất nhiều, hạt liti. Hạt chỉ cấu tạo bởi một lớp chƣa phân hoá, trên một mạng lƣới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí. Hạt trƣởng thành sau 2 - 18 tháng. 5 2.1.2. Các nhóm lan Dendrobium Hình 2.1. Các giống lan rừng Dendrobium 6 Theo nhà phân loại học Việt Nam Phạm Hoàng Hộ, giống lan Dendrobium đƣợc chia thành 13 nhóm sau: Nhóm Bolbidium Nhóm Callista Nhóm Apoum Nhóm Strongyle Nhóm Gastridium Nhóm Conostalix Nhóm Rhopalanthe Nhóm Formosae Nhóm Pedilonum Nhóm Dendrobium Nhóm Breviflores Nhóm Dischophyllum Nhóm Stachyobium Trong đó, các giống lan nghiên cứu trong đề tài thuộc hai nhóm Callista và Dendrobium. 2.1.3. Đặc điểm của 10 giống lan nghiên cứu trong đề tài D. anosmum (Giả Hạc): Thân thòng dài (đến 1.2m); lá có phiến mỏng (dài 10cm - 18cm); hoa đơn độc trên các đốt già, to, ửng hƣờng với môi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn (cao 3cm - 4cm), môi có lông nằm, xoan rộng. Cây phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam Trung Bộ (Tây Nguyên) và phân bố từ Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Indonesia. D. chrysotoxum (Kim Điệp): Thân hình đùi hay bắp (dài 8cm - 40cm), có nhiều sóng dọc thấp; lá 2 - 8, phiến dài 8cm - 15cm, rộng 2.5cm - 3cm, chót lõm; hoa mọc thành chùm thƣa, xéo rồi thòng, dài 15cm - 20cm, hoa to, vàng ánh với môi có tâm cam, môi tròn, bìa dung, rìa lông mịn. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên: Kom Tum, Daklak, Lâm Đồng và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. 7 D. densiflorum (Thủy Tiên mỡ gà): Thân cao 20cm - 30cm, có 4 cạnh tròn, từ hẹp đến đáy; lá 3 - 4, thon, dày, dài đến 15cm; hoa mọc thành chùm dày, to, thòng, hoa rộng 5cm, vàng cả, môi có tâm cam, tròn hình quặn, bìa có răng mịn. Cây mọc ở miền Trung (Vinh, Quãng Trị, Kon Tum, Lâm Đồng), nam bộ (Đồng Nai) và phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. farmeri (Thủy Tiên trắng vàng): Giả hành thon, đáy từ từ hẹp, có 4 cạnh tròn, cao 20cm - 40cm, long dài; lá 2 - 4, xoan thon, thon nhọn; hoa thòng, thƣờng mọc trên dã hành không lá, ít hay nhiều hoa, hoa thƣờng trắng với môi có bớt vàng (có thể toàn trắng), môi tròn, bìa có môi nhỏ, không đều. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam, còn phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan. D. fimbriatum (Long Nhãn): Thân hình trụ hay đùi, cao đến 1m, lúc khô vàng tƣơi; lá có phiến mỏng, thon, dài 10cm - 13cm, bẹ ngắn; hoa mọc thành chùm, thòng, thƣa, hoa to, vàng nghệ, môi có bớt đỏ đậm, phiến hoa cao 3cm - 4cm, môi xoan rộng, bìa dung và có rìa mịn. Cây mọc nhiều ở Tuyên Quang, Bắc cạn, Ninh Bình, Vinh, Bảo Lộc, Kon Tu và phân bố ở Lào. D. heterocarpum (Nhất Điểm Hoàng): Mọc thành bụi đứng; than hình đùi, dài 20cm - 45cm, có rãnh; lá có phiến tròn, dài, thon, dài 10cm - 13cm, đầu tà, có 2 thùy. Hoa từng cặp, to, màu vàng rơm, môi cam có sọc đỏ hay nâu, phiến hoa dài 3cm, môi hình bánh bò, hay mũi giáo, dài 4cm. Cây mọc ở Đà Lạt (Lâm Đồng), và phân bố ở Lào, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia. D. primulinum (Long Tu): Thân mảnh, đứng hay thòng, hình trụ dài, dài 45cm ; lá có phiến thon, dài 8cm - 10cm, rộng 2cm. Hoa hƣờng, tím tím dợt, rộng 6cm, môi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và rìa lông, gần nhƣ trắng, có đốm vàng và tím ở đáy. Cây mọc chủ yếu ở Tây Nguyên và phân bố Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. lindleyi (Vẩy Rồng): Căn hành bò mang giả hành cao 3cm - 4cm, to 1.5cm, xanh, lúc khô vàng; lá 1, phiến cứng, tròn dài, chùm thòng, dài 20cm - 30cm; hoa vàng dợt, tâm cam, lá đài và cánh hoa dài 1.5cm - 1.7cm, môi tròn, có lông ở đáy và 8 tâm, bìa dúng, chót hơi lõm. Cây mọc từ Bắc vào Nam và phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. D. thyrsiflorum (Thủy Tiên vàng): Thân hình đùi, có 4 rãnh, dài tới 40cm, lúc khô vàng nâu; lá 2 - 5, phiến dài 10cm, rộng 3cm - 4cm, dày, 5 - 7 gân; hoa thành chùm, dày, thòng, rộng 10cm, phiến hoa trắng hay vàng rất lợt, to 4cm, lá đài giữa cao 15mm, cánh hoa dài 2cm, môi vàng nghệ, có rìa mịn. D. moschatum (Thái Bình): Bụi cao đến 1.5m, thân hình trụ có rãnh, không lá khi phát hoa; lá có phiến tròn, dài, thon, đầu lõm, dài 7cm - 12cm, gân chánh 7 - 9; hoa mọc thành chùm dài 2cm - 30cm, hoa vàng ánh, to 4.5cm, môi có lông dày, hình chén, màu cam sậm, có hai bớt đỏ tròn, bìa rìa mịn. Cây mọc ở Đà Lạt và phân bố ở Lào, Mianma, Hymalaya, Thái Lan, Trung Quốc. 2.2. Quy trình li trích DNA ở tế bào thực vật Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng lớn nucleic acid tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trƣờng khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần đƣợc tách chiết ở nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-DNase và Ribonuclease-RNase). Một qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật gồm 3 bƣớc cơ bản: Bƣớc 1: Phá vỡ màng tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. 9 Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các protein. Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng. Loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nƣớc và pha hữu cơ dễ tách rời nhau. Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích. Mặc dù phenol làm biến tính protein nhƣng nó có thể làm ức chế hình dạng của RNase và làm dung môi cho phân tử RNase có chứa những chuỗi dài polyA (Brawerman và ctv,1972). Do đó, có thể khắc phục nhƣợc điểm này bằng cách sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid. Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha hữu cơ. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại. Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng lại trong dung môi theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là: - Tủa trong ethanol (ethylic alcohol), việc tủa này đƣợc thực hiện trong môi trƣờng có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5 dung dịch ethanol: l dung dịch mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc kết tủa. Hầu nhƣ toàn bộ nucleic acid đều tủa trong điều kiện nêu trên. - Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phƣơng pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu là 1: 1. Các DNA có trọng lƣợng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol. 10 Trong cả hai phƣơng pháp, nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa phải đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại. Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, ngƣời ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lƣợng chúng bằng một số phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp đo mật độ quang, điện di. Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế Phƣơng pháp này không thật chính xác nhƣng cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thƣờng điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260nm của các base purine và pyrimidine . Gía trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260nm (OD260nm- Optical Density260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan giữa một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với 50µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi. Tuy nhiên, cách tính nay chỉ đúng với dung dịch nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ tin sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở 280nm (OD280nm). Ở bƣớc sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhƣng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm nhƣ các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 - 2.0. Phƣơng pháp điện di Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng cả trong phân tích định tính lẫn trong thu nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dƣới tác động của một điện trƣờng đƣợc tính theo công thức: 11 Log u = Log u0 – Kr*C Trong đó, Log u0 là tính linh động của phân tử trong môi trƣờng lỏng, Kr là hằng số làm chậm (retardation coefficient) do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lƣợng của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel. Qua đó, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lƣợng phân tƣ tức là số lƣợng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng độ các chất cấu thành gel. Việc lựa chọn gel cũng nhƣ nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thƣớc trung bình của đoạn nucleic acid cần phân tách. Bảng 2.1. Nồng độ agarose và kích thƣớc đoạn cần phân tách. % agarose Kích thƣớc các đoạn cần phân tách (kb) 0.6 - 0.8 7 – 20 0.9 - 1.2 0.5 – 7 1.2 - 1.5 0.2 – 0.5 2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp di truyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, đoạt giải Nobel năm 1993 và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E. coli hay nấm men. 2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể đƣợc thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Ngƣời ta gọi đó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro. Cơ sở của phản ứng PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase: chúng chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ khuôn kể từ một primer (primer – là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. 12 PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc: Bƣớc 1: Giai đoạn biến tính - denaturation Trong giai đoạn này, các phân tử DNA sợi đôi đƣợc biến tính thành DNA sợi đơn ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (melting temperature - Tm) của phân tử, thƣờng là từ 940C - 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Bƣớc 2: Giai đoạn lai - hybridization Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ Tm của primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, thƣờng là từ 400C - 700C tùy thuộc vào Tm của primer sử dụng, và kéo dài từ 30 giây đấn 1 phút. Bƣớc 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài - elongation Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase sử dụng (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trìn tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Một chu kỳ bao gồm 3 bƣớc trên sẽ đƣợc lập đi lập lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân; theo tính toán sau 35 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 236 so với số lƣợng mẫu ban đầu. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau: Tổng số khuếch đại = m*2n Trong đó, n là số chu kỳ và m là số copy của chuỗi mã hóa cần nghiên cứu. 13 Hình 2.2. Nguyên lí của phản ứng PCR ( 14 2.3.2. Thành phần thực hiện một phản ứng PCR 2.3.2.1. Mẫu Trong PCR, kết quả đạt tốt nhất nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ mô lá. Số lƣợng DNA cần cho phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5ng - 10ng DNA thuần khiết. Thông thƣờng, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hƣởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch. Đối với những DNA có kích thƣớc quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. 2.3.2.2. Primer Mồi (primer) là một thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng PCR. Primer là những đoạn nucleotide ngắn , bắt căp̣ bổ sung đầu 5’ hay đầu 3’ của mạch DNA khuôn mẫu. Primer đƣợc thiết kế dựa vào vùng trình tự đã đƣợc biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc một sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả cao. Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phƣơng pháp PCR, và phải tuân thủ một số nguyên tắc: - Chiều dài primer Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu và nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer. Nói cách khác, primer càng dài thì càng thể hiện đƣợc tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng primer có chiều dài từ 18 base – 24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đặc hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ƣu. Kích thƣớc primer không nên quá ngắn, trừ trƣờng hợp phục vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp. - Nhiệt độ nóng chảy Tm Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nữa sợi DNA là sợi đơn và một nữa còn lại là DNA sợi đôi. Tm là đặc tính của các thành phần base. Thành phần 15 (C+G) trong DNA cao sẽ dẫn tới nhiệt độ Tm cao vì liên kết H trong DNA cao hơn. Có nhiều công thức tính Tm, một trong những công thức phổ biến nhất là: Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) – 600/chiều dài Hai primer xuôi và ngƣợc trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai đƣợc với DNA. - Nhiệt độ bắt cặp Tanneal Nhiệt độ bắt cặp Tanneal là nhiệt độ mà tại đó primer bắt cặp vào trong DNA khuôn. Tanneal đƣợc tính theo công thức sau: Tanneal = Tm-primer – 4 0 C - Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer nhƣ đã nói ở trên. Để có độ đặc hiệu cao, primer phải đƣợc thiết kế sao cho chỉ khuếch đại một trình tự đặc trƣng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ. Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không đƣợc quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp của primer để đảm bảo tính đặc hiệu. - Trình tự bổ sung trên primer Trình tự primer phải đƣợc thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình tự bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tƣợng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer với DNA. Hai primer xuôi và ngƣợc phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau để tránh hiện tƣợng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn. Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu,1999). Thông thƣờng, primer xuôi và primer ngƣợc thƣờng có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1μM tƣơng đƣơng với 2.5pmol trong 25μl dung dịch phản ứng. Trình tự DNA nằm giữa 16 hai primer “xuôi” và “ngƣợc” không đƣợc quá lớn. Phản ứng sẽ tối ƣu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1kb. - Hàm lƣợng GC và AG Thành phần base ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của quá trình lai, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ lai và sự ổn định của cấu trúc phân tử. Thành phần base của các primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lại nhiều lần. Hàm lƣợng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50% (Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tƣởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắc của Wallace). Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vì điều này sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu. Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine AG cũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại. - Trình tự đầu 3’ Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tƣợng “mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G - C mạnh hơn A - T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu. 2.3.2.3. dNTP Nồng độ dNTP thƣờng đƣợc sử dụng là 20μM - 200μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm giảm tính chuyên biệt của phản ứng PCR bằng cách tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase cũng nhƣ kìm hãm magnesium, làm ảnh hƣởng đến nồng độ tối ƣu của magnesium (Gelfand, 1989; Coen, 1995). Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. 17 2.3.2.4. MgCl2 Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Trong thực nghiệm, nồng độ Mg2+ thấp là yếu tố hàng đầu đảm bảo tính chuyên biệt của phản ứng PCR, nồng độ cao làm hạn chế sự chuyên biệt. Mg 2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tƣợng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lƣợng quá lớn nhƣng mức độ chuyên biệt thấp. 2.3.2.5. Taq Taq DNA polymerase (Taq) là enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp DNA đƣợc tách ra từ loài vi khuẩn ƣa nhiệt Thermus aquaticus. Nhờ tính chất bền với nhiệt, hoạt tính polymerase và khả năng bổ sung gốc adenosin (A) vào đầu 3’ của chuỗi DNA dạng sợi kép nên Taq có hai thuận lợi chính sau: hồi phục sau khi tác động nhiệt không cần kéo dài, enzyme này hoạt động mạnh ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn sẽ chuyên biệt hơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn. Taq nhạy cảm với ion magnesium. Nồng độ tối hảo của Mg2+ là 1.5mM - 2.5mM. Vì dNTP có thể gắn với Mg2+, còn EDTA lại là chất có khả năng tạo phức của các ion kim loại, cho nên nồng độ chính xác của magnesium tùy thuộc vào nồng độ của dNTP và EDTA. 2.3.2.6. Buffer Dung dịch đệm có tác dụng làm cho phản ứng PCR diễn ra hiệu quả. Dung dịch đệm giúp duy trì pH, hạn chế ảnh hƣởng của chất ức chế, bảo vệ enzyme, ổn định mẫu. 18 Polymerase có phạm vi pH hẹp, sự thay đổi pH từ 0.5 – 1.0 cũng làm giảm số lƣợng của sản phẩm PCR. Khi thay đổi nhiệt độ, Tris ảnh hƣởng đến pH của buffer, ảnh hƣởng đến sƣ hoạt động của Taq polymerase. 2.4. Đa dạng di truyền – một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.4.1. Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là tập hợp tất cả các gen khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Qua đó, sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã đƣợc biểu hiện. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Đa dạng di truyền giúp cho các loài sinh vật đảm bảo sự sinh sản, chống chịu với bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trƣờng luôn luôn thay đổi. Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen và các genotype, ngăn chặn sự tuyệt chủng các nòi địa lý (landraces) mà vốn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trƣờng hợp cực đoan, đó là sự tiệt chủng của loài. 2.4.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.4.2.1. Phƣơng pháp chỉ thị hình thái Gen - thể hiện bản chất di truyền, thƣờng thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể đo đếm đƣợc – gen đó xem nhƣ gen chỉ thị. Chỉ thị hình thái là một trong những phƣơng pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền. Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chƣơng trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ 19 quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể. Sự thể hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hƣởng bởi điều kiện môi trƣờng, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng. 2.4.2.2. Phƣơng pháp chỉ thị isozyme Isozyme là các dạng protein có cùng phản ứng enzyme nhƣng có sự khác nhau khi chạy điện di. Kỹ thuật điện di đƣợc dùng để đo sự di động của phân tử protein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trƣờng đồng nhất. Các protein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di. Sự khác nhau này phản ánh sự khác nhau trong kích thƣớc và cấu trúc của phân tử protein. Trong nhiều trƣờng hợp, còn liên quan tới sự thay thế bởi một amino acid trong phân tử protein do đột biến từ alen này sang alen khác. Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thể phân tích nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định.