Đề án Quy trình định tính Shigella

Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH SHIGELLA GVHD: NHÓM: LỚP: 2 DANH SÁCH NHÓM HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN MÃ SỐ SINH VIÊN NHIỆM VỤ 3 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU ..................................................................................................................... 4 I. Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới và ở Việt Nam ........................................... 5 a) Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới ................................................................. 5 b) Tình hình nhiễm Shigella ở Việt Nam .................................................................. 5 II. Tổng quan về Shigella spp. .................................................................................... 6 III. Phương pháp phân tích. ......................................................................................... 6 a) Truyến thống: ......................................................................................................... 6 b) Hiện đại .................................................................................................................... 8 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 10 4 LỜI NÓI ĐẦU Shigella là trực khuẩn, hiếu khí và kị khí tùy ý. Cho thử nghiệm catalase (+) (trừ S. dysentrirae), oxidase (+), lên men glucose không sinh hơi, hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ lactose, dolcitol, không sinh H2S, không có enzyme lysine decarboxydase. Shigella là tác nhân gây nên bệnh shigellosis, là một bệnh rất nguy hiểm lây lan rất nhanh trong cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm cả nước uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu là từ nguyên liệu, từ nước hay từ công nhân chế biến. Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập được Shigella là xà lách, thịt băm, thủy sản. Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/g sản phẩm. Do vậy Shigella được kiểm soát rất nghiêm ngặt trong thực phẩm, đòi hỏi các phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các quy trình kiểm soát phải chặt chẽ. Shigella có thể được phát hiện bằng cách nuôi cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 5 I. Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới và ở Việt Nam a) Tình hình nhiễm Shigella trên thế giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm trên thế giới có khoảng 165 triệu ca nhiễm Shigella. Trong đó, ở những nước đang phát triển, tỷ lệ nhiễm chiếm đến 99% (69% là trẻ em dưới 5 tuổi) và có 1,1 triệu ca tử vong do nhiễm Shigella hằng năm (60% trong số đó là trẻ em dưới 5 tuổi). Người ta nhận thấy có sự thay đổi tuýphuyết thanh giữa các loài cũng như thay đổi về loài gây bệnh phổ biến ở từng giai đoạn. Đầu tiên, S. dysenteriae tuýp 1 là loài gây bệnh phổ biến, sau đó dần được thay thế bởi S. flexneri, và cuối cùng chuyển dần sang S. sonnei. Có sự khác biệt giữa loài Shigella thường gặp ở những nước phát triển và những nước đang phát triển.Ở những nước phát triển, loài Shigella gây bệnh thường gặp là S. sonnei (chiếm 77%) và S. flexneri (chiếm 16%).Trong khi đó, ở những nước đang phát triển S. flexneri thường gặp nhất (chiếm 60% tổng số ca nhiễm), tiếp sau là S. sonnei (chiếm 15%). Ở loài S. flexneri, tuýp 2a chiếm từ 32% - 58%, tuýp 1b gây ra 12% - 13%, và tuýp 3a gây ra 4 – 11% tổng số ca nhiễm ở những nước đang phát triển. S. dysenteria thường được tìm thấy ở vùng Nam Á và châu Phi, trong đó tuýp 1 phổ biến ở Ấn Độ, Nigeria và Singapore, tuýp 2 phổ biến ở Guatamala, Hungary và Yemen. S. boydii là Shigella được phát hiện đầu tiên ở Ấn Độ, và không phổ biến lắm, chủ yếu gây bệnh ở vùng tiểu lục địa Ấn, trong đó S. boydii tuýp 2 là S. boydii gây bệnh phổ biến ở những nước đang phát triển. b) Tình hình nhiễm Shigella ở Việt Nam Ở Việt Nam, số ca nhiễm Shigella rất cao, hơn hẳn bệnh gây ra bởi Salmonella typhi và Vibrio choleraeri.Việt Nam có khoảng 435.000 ca nhiễm Shigella (khoảng 39.500 ca nhiễm hằng năm). Số ca nhiễm hằng năm trên 100.000 dân cao nhất ở vùng cao nguyên Trung Bộ (241,7 ca), kế đến là vùng bờ biển Nam Trung Bộ (100,2 ca) và thấp nhất là vùng đồng bằng sông Hồng (hình 1.2). Nghiên cứu cũng cho thấy lượng mưa nhiều và tình trạng nghèo đói là những nguy cơ quan trọng trong nhiễm Shigella. Tỷ lệ nhiễm Shigella trung bình hằng năm trên 100.000 dân Nhìn chung ở Việt Nam, loài Shigella gây bệnh phổ biến là S. flexneri và S. sonnei. Vào đầu những năm 90, tại thành phố Hồ Chí Minh, trong các nhóm Shigella gây bệnh, S. flexneri là loài có tỷ lệ gây bệnh cao nhất (72,58%), kế đến là S. sonnei (23,87%), tình hình nhiễm Shigella cũng tương tự, với S. flexneri là loài gây bệnh phổ biến nhất (69,59%), và kế đến là S. sonnei (13,40%). Tuy nhiên, hiện nay tình hình gây bệnh của các nhóm Shigella có sự thay đổi. Từ năm 2000 đến năm 2002 tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, tỷ lệ các mẫu phân lập cho kết quả S. flexneri và S. sonnei là tương đương nhau (45,6%). Từ năm 2006 đến năm 2008, trong 113 mẫu Shigella phân lập được từ Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới, S.sonnei chiếm đến 70,8%, còn S. flexneri chỉ chiếm 27,4% (Hà Vinh và cộng sự, số liệu chưa công bố) Số lượng S. boydii (17%) phân lập từ năm 1991 đến năm 2001 dọc theo vùng sông Hồng cao hơn nhiều so với các thập kỷ trước (3%). Bên cạnh đó, 6 tuýp huyết thanh của S. flexneri gây bệnh phổ biến cũng có sự thay đổi. Những năm 1960, tuýp huyết thanh phân lập được gồm tuýp 2 (66%), tuýp 3 (16%), tuýp (10%) và tuýp 4 (5%), trong khi hiện nay, các tuýp phân lập được gồm tuýp 6 (17%), tuýp 1 (13), tuýp 4 (10), biến thể Y (9%), và 40% các mẫu S. flexneri phân lập không thể định tuýp huyết thanh nếu chỉ dựa vào những bộ kít thương mại. Điều này cho thấy rằng Shigella đang dần xuất hiện những biến thể khác, chúng có thể phát triển mạnh ở nhiều điều kiện môi trường và tập quán ăn uống khác nhau trong những thời điểm khác nhau. Điều này, cùng với ngày càng nhiều Shigella kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị Shigella trở nên khó khăn hơn, cũng như khó sử dụng loại vắc-xin đặc hiệu cho từng tuýp huyết thanh của Shigella. II. Tổng quan về Shigella spp. Shigella spp. là trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, Shigella spp. không sinh bào tử và thường hay bị nhầm lẫn với Salmonella trong quá trình kiểm tra vi sinh. Shigella spp. không di động và không sinh bào tử, có phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, lactose âm tính, H2S âm tính, một vài chủng không sinh hơi khi lên men đường glucose. Giống Shigella gồm 4 loài: Shigella dysenteriae (kháng huyết thanh nhóm A), Shigella flexneri (kháng huyết thanh nhóm B), Shigella boydii (kháng huyết thanh nhóm C), Shigella sonei (kháng huyết thanh nhóm D). III. Phương pháp phân tích. a) Truyến thống: Phạm vi áp dụng Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 21567:2004 được áp dụng phát hiện Shigella trong tất cả các loại thực phẩm. Nguyên tắc. Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc.Từ môi trường nuôi cấy này phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghỉ ngơi và được kiểm tra khẳng định thử nghiện sịnh hóa và kháng huyết thanh. Môi trường và hóa chất. Môi trường và hóa chất Mục đích Shigella Borth Tăng sinh chọn lọc MacConkey Phân lập XLD Hektoen Enteric Agar 7 Nutrient Agar (NA) Phục hồi TSI Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Shigella Urea LDC HCl và NAOH 10% Chỉnh pH Quy trình phân tích X g hoặc X ml mẫu thử + 9Xml canh thang Shigella chứa novobioxin 0.5µg/ml Đồng hóa và chỉnh pH đến 7.0 nếu cần ủ kỵ khí 41.5o C/16-20h MacConkey agar XLD agar Hektoen enteric agar ủ 37oC, 20-24h Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch dinh dưỡng / ủ 37oC, 20-24h Khẳng định sinh hóa Các bước tiến hành. Bước 1. Tăng sinh chọn lọc Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho phép ±5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng ( hoặc bình tam giác), bổ sung 225ml môi trường tăng sinh chọn lọc Shigella và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) trong 60 giây, ủ ở 37oC trong 18 ± 3h. Bước 2. Phân lập Dùng que quấy vòng phân lập từ cây thang tăng sinh chọn lọc Shigella lên mỗi đỉa thạch chứa môi trường chọn lọc MacConkey, XLD và HE. Sau khi cấy, lật ngược các đĩa sao cho đáy hướng lên trên vào ủ ở 37oC ± 1oC trong 24 ± 3h. Sau khi ủ 24 ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi ngờ là Shigella. Trên môi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm màu đen. 8 Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có tâm đen. Trên môi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella diển hình có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục). Đánh giấu các khuẩn lạc này trên đáy đĩa. Bước 3. Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA. Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ điển hình từ mỗi đĩa trên môi trường phân lập MacConkey, XLD và HE. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA. Ủ ở 37oC ± 1oC trong 24 ± 3h. Trường hợp 1:từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, Nếu cho các kết quả thử nghiện sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Shigella trong mẫu. Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này có kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận Shigella có trong mẫu và ngược lại kết luận không phát hiện Shigella trong mẫu. Bước 4. Khẳng định sinh hóa. Từ các khuẩn lạc cấy rỉa lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi trường sau: Thạch TSI, ủ ở 37oC trong 24h. Shigella cho phản úng kiềm trên mặt nghiêng và acid ở phần sâu, không sinh hơi và không sinh H2S trong môi trường. Môi trường LDC, ủ ở 37oC trong 24h.Shigella cho phản ứng LDC âm tính. Môi trường urea agar (urea lỏng), ủ trong 37oC trong 24h. Shigella cho phản ứng urea âm tính. Kết quả Phát hiện (hay không phát hiện) Shigella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng. b) Hiện đại Phương pháp PCR Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993), K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này. Bộ công cụ dùng trong xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy rất cao với các vi khuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện ra chúng. Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như: e.coli, e. coli 0157:h7, salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc... 9 Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài). Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước... để giúp kiểm tra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không. Kỹ thuật PCR dùng phát hiện Shigella được tiến hành trên cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho Shigella và cặp mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm trong vùng bảo tồn cùa 16S rRNA hiện diện trong mọi loài vi khuẩn. So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính xác và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thời gian.Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện Shigella ở mức 10CFU/25g mẫu sau 12→14h tăng sinh,cho kết quả sau 24h. Kỹ thuật LA (latex agglutination) Ngoài ra dựa trên kỹ thuật phân tích kháng thể dùng trong phát hiện Shigella còn có bộ Kit Wellcolex ,bộ kít Bactigen dựa trên kiểu phân tích LA. Được sử dụng từ những năm 1956, xét nghiệm LA rất phổ biến tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, áp dụng để phát hiện hơn 100 bệnh truyền nhiễm. Thử nghiệm này dựa trên sự ngưng kết giữa các hạt cao su với các kháng thể huyết thanh.Chẩn đoán xác định Shigella từ các mẫu lâm sàng trong 24h với độ đặc hiệu (>98%) và độ nhạy (100%),hơn nữa thao tác rất đơn giản và dễ sử dụng. Ví dụ: cơ chế của thử nghiệm LA: Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau khi được xử lý được pha trộn với hạt cao su đã được phủ một kháng thể hoặc kháng nguyên cụ thể. Nếu mẫu bị nghi ngờ có sự hiện diện của Shigella, các hạt cao su sẽ cụm lại với nhau (tựu lại). Sau thử nghiệm Nếu thử nghiệm là âm tính, cao su vẫn còn mịn và giữ lại màu sắc ban đầu của nó. Nếu thử nghiệm dương tính ,hạt cao su thay đổi màu sắc khác biệt so với hạt cao su xung quanh. 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm, 2014. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2006.