Đề tài Công nghệ sản xuất giống nấm Linh Chi

Thuận lợi  - Nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm và dồi dào: phế liệu của nông nghiệp như cỏ dại, rơm rạ, mùn cưa, thân cây, lõi bắp, thân cây đậu, bã mía, phân gà, phân chuồng… - Vốn đầu tư không cao, tùy thuộc vào mô hình sản xuất. - Vòng quay vốn nhanh do chu kỳ sản xuất ngắn.Chẳng hạn như nấm rơm thu hoạch sau 15 ngày nuôi trồng, nấm mèo và bào ngư sau 2 tháng đã có sản phẩm bán ra thị trường. - Ít tốn đất, hiệu quả sử dụng đất rất cao vì có thể trồng trên giàn kệ nhiều tầng, không choán chỗ đất nông nghiệp, tận dụng được đất không trồng trọt được, lại có tác dụng cải tạo đất bằng bã sau khi thu hoạch nấm. - Giá trị kinh tế cao: nhiều loại nấm ăn có giá trị xuất khẩu như nấm rơm, nấm mèo, nấm bào ngư, nấm mỡ, nấm hương. - Lao động trồng nấm nhẹ nhàng, có thể tận dụng thời gian nhàn rỗi, tậndụng mọi nguồn lao động. - Ít tiêu tốn nước hơn so với nhiều loại cây trồng. - Bã phế liệu sau khi trồng nấm là phân bón tốt cho cây trồng hoặc dùngnuôi giun cho nuôi gia cầm và cá. - Trồng nấm không có mùi thối, lại biến phế thải thành chất có ích hợpquy luật tự nhiên góp phần tích cực cho nông nghiệp bền vững. 1.2.2. Khó khăn - Nhiều khó khăn của nông nghiệp nói chung như thời tiết, các yếu tố môi trường, sâu bệnh làm cho sản lượng nấm không ổn định,…Tuy đã được công nghiệp hóa một phần, chủ động hơn trong việc khống chế các yếu tố môi trường nhưng nhiều tình huống vẫn khó tránh khỏi. - Loại hình sản xuất liên quan chặt chẽ với các vi sinh vật, khâu làm giống phải làm riêng trong phòng thí nghiệm, đòi hỏi kỹ thuật cao, do đó vấn đề sản xuất giống nấm đối với người nuôi trồng còn gặp nhiều hạn chế. - Người trồng nấm khó tìm được nguyên nhân gây bệnh ở nấm, do đó chưa có biện pháp phòng trừ hoặc khắc phục. - Nấm tươi cần phải tiêu thụ nhanh, chính vì vậy đòi hỏi người nuôi trồng nấm phải trang bị kiến thức về các phương pháp bảo quản và chế biến nấm. - Chưa chú ý đầu tư cơ sở vật chất và kỹ thuật cho nghề nuôi trồng nấm,nước ta vẫn còn quan niệm đây là nghề phụ, tranh thủ, tận dụng các nguồn phụ phẩm của nông nghiệp và lao động nhàn rỗi. 1.3.Tình hình sản xuất - tiêu thụ nấm ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm ở Việt Nam Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt khoảng trên 150.000 tấn/năm. Kim ngạch xuất khẩu khoảng 60 triệuUSD/năm. Hiện nay, Việt Nam đang nuôi trồng 6 loại nấm phổ biến, phân bố ở các địa phương như sau: - Nấm rơm trồng ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (Đồng Tháp, SócTrăng, Trà Vinh, Cần Thơ...) chiếm 90% sản lượng nấm rơm cả nước. - Mộc nhĩ trồng tập trung ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ chiếm 50% sản lượng mộc nhĩ trong toàn quốc. - Nấm mỡ, nấm sò, nấm hương chủ yếu được trồng ở các tỉnh miền Bắc, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 30.000 tấn. - Nấm dược liệu: Linh chi, Vân chi, Đầu khỉ... mới được nuôi trồng ở một số tỉnh, thành phố, sản lượng mõi năm đạt khoảng 150 tấn. Một số loại nấm khác như: Trân châu, Kim châm... đang nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm, sản lượng chưa đáng kể. Nghề trồng nấm ở Việt Nam đang phát triển nhưng còn ở quy mô nhỏ lẻ hộ gia đình, trang trại, mỗi năm sử dụng vài tấn nguyên liệu có sẵn tới vài trăm tấn ở mỗi cơ sở để sản xuất nấm. Tiềm năng và những điều kiện thuận lợi của nghề trồng nấm ăn và nấm dược liệu rất phù hợp với người nông dân nước ta vì:  - Nguyên liệu trồng nấm rất sẵn có như rơm rạ, mùn cưa, thân cây gỗ, thân lõi ngô, bông phế loại ở các nhà máy dệt, bã mía ở các nhà máy đường ước tính cả nước có trên 40 triệu tấn nguyên liệu, chỉ cần sử dụng khoảng 10 – 15% lượng nguyên liệu này để nuôi trồng nấm đã tạo ra trên 1 triệu tấn/năm và hàng trăm ngàn tấn phân hữu cơ. - Trong những năm gần đây, nhiều đơn vị nghiên cứu ở các viện, trường, trung tâm đã chọn được một số loại giống nấm ăn, nấm dược liệu có khả năng thích ứng với điều kiện môi trường ở Việt Nam cho năng suất khá cao. Các tiến bộ kỹ thuật về nuôi trồng, chăm sóc, bảo quản và chế biến nấm ngày càng đượchoàn thiện. Trình độ và kinh nghiệm của người nông dân được nâng cao. Năng suất trung bình các loại nấm đang nuôi trồng hiện nay cao gấp 1,5 – 3 lần so với 10 năm về trước. - Vồn đầu tư để trồng nấm so với các ngành sản xuất khác không lớn vì đầu vào chủ yếu là công lao động. Nếu tính trung bình để giải quyết việc làm cho 1 người lao động chuyên trồng nấm ở nông thôn hiện nay có mức thu nhập 800-900 đ/tháng, chỉ cần một số vốn đầu tư ban đầu khoảng 10 triệu đồng và 100m2 diện tích để làm lán trại. - Thị trường tiêu thụ nấm trong nước và xuất khẩu ngày càng được mở rộng. Giá bán nấm tươi ở các thành phố lớn như Hà Nội, Hải Phòng, Lạng Sơn.... khá cao. Nhu cầu ăn nấm của nhân dân trong nước ngày càng tăng. Thị trường xuất khẩu nấm mỡ, nấm rơm: muối, sấy khô, đóng hộp của Việt Nam còn chưa đáp ứng đủ. - Phát triển nghề sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu còn có ý nghĩa góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. Phần lớn rơm rạ sau khi thu hoạch lúa ở một số địa phương đều bị đốt bỏ ngoài đồng ruộng hoặc ném xuống kênh rạch, sông ngòi gây tắc nghẽn dòng chảy. Đây là nguồn tài nguyên rất lớn nhưng chưa được sử dụng, nếu đem trồng nấm không những tạo ra loại thực phẩm có giá trị cao mà phế liệu sau khi thu hoạch nấm được chuyển sang làm phân bón hữu cơ, tạo thêm độ phì cho đất. 1.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm trên thế giới Ngành sản xuất nấm ăn đã hình thành và phát triển trên thế giới hàng trăm năm. Hiện nay người ta đã biết 2000 loài nấm ăn được, trong đó có 80 loài nấm ăn ngon và đang được nghiên cứu nuôi trồng nhân tạo. Việc nghiên cứu và nuôi trồng nấm trên thế giới đang ngày càng phát triển mạnh mẽ, đã trở thành một ngành công nghiệp thực phẩm thực thụ. Sản lượng nấm ăn nuôi trồng năm 2008 đạt 25 triệu tấn nấm tươi. Ở Châu Âu Bắc Mỹ trồng nấm đã trở thành một ngành công nghiệp lớn được cơ giới hóa toàn bộ nên năng suất và sản lượng rất cao. Các loại nấm được nuôi trồng chủ yếu là nấm mỡ, nấm sò theo quy mô dây chuyền công nghiệp chuyên môn hóa cao độ: Các nhà máy chuyên xử lý nguyên liệu, đã sử dụng robot trong khâu nuôi trồng, chăm sóc và thu hái nấm. Nhiều nước ở Châu Á trồng nấm còn mang tính thủ công, năng suất không cao, nhưng sản xuất gia đình, trang trại với số đong nên sản lượng rất lớn chiếm 70% sản lượng trên toàn thế giới. Các nước Đông Bắc như Hàn Quốc, Nhật Bản và vùng lãnh thổ Đài Loan áp dụng kỹ thuật tiên tiến và công nghiệp hóa trong nghề nấm đã có mức tăng trưởng hàng trăm lần trong vòng 10 năm, Nhật Bản có nghề trồng nấm truyền thống là nấm Hương mỗi năm đạt gần hàng triệu tấn. Hàn Quốc nổi tiếng với nấm Linh Chi mỗi năm xuất khẩu thu về hàng triệu đôla. Nhìn chung nghề trồng nấm phát triển mạnh và rộng khắp nhát trong 20 năm gần đây. Sản xuất nấm đem lại nguồn thực phẩm, tạo việc làm tại chỗ, vệ sinh môi trường đồng ruộng, hạn chế việc đốt rơm rạ, đốt phá rừng tạo ra nguồn phân bón hữu cơ co cải tạo đất, góp phần tích cực vào chu trình chuyển hóa vật chất. II. NẤM LINH CHI 2.1. Giới thiệu chung về nấm Linh Chi Từ hơn 4000 năm trước ở Trung Quốc, nấm linh chi đã được coi như một loại thần dược, chỉ dành riêng cho các bậc vua chúa, vì thế linh chi còn có nhiều tên gọi khác như bất lão thảo, thần tiên thảo, vạn niên, nấm thần linh, cỏ huyền diệu...Mỗi tên gọi của Linh chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó. Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum. Tên tiếng Anh: Varnished Conk hay Ling Chih. 2.2. Đặc tính sinh học nấm Linh Chi 2.2.1. Hình dạng và màu sắc Cấu tạo quả thể nấm Linh Chi gồm 2 phần: cuống nấm và mũ nấm -Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bong, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. -Mũ nấm khi còn non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh – vàng nghệ - vàng nâu – vàng cam – đỏ nâu – nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm đường kính 2-15cm, dày 0,8-1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. Hình 1.2 Cấu tạo nấm Linh Chi 2.2.2. Chu trình sống nấm Linh Chi 2.2.3. Nấm Linh Chi có những lợi ích gì? Trị đau nhức. Chống dị ứng. Phòng ngừa viêm cuống phổi. Kháng viêm. Kháng khuẩn, chẳng hạn như vi khuẩn staphylocooca, streptocooi, bacillus pneumoniae. (Có thể do tính tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch). Kháng độc tố, nhờ vào tính đào thải được gốc tự do. Chống ung thư. Kháng siêu vi. Làm hạ huyết áp. Trợ tim, làm hạ cholesterrol, làm giảm xơ cứng thành động mạch. Giúp thư giãn thần kinh, làm giảm ảnh hưởng của cafeine và làm thư giãn bắp thịt. Long đàm (nghiên cứu ở chuột). Chống HIV. Làm tăng cường hoạt động của nang thượng thận. 2.2.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Linh Chi -Nhiệt độ thích hợp: -Giai đoạn nuôi sợi, nấm linh chi sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 20 -300C -Giai đoạn hình thành quả thể thích hợp ở nhiệt độ 22 – 280C -Độ ẩm: -Độ ẩm cơ chất: 60 - 65%. -Độ ẩm không khí: trong giai đoạn nuôi sợi là 70-80%, trong giai đoạn ra quả thể là 80 - 95%. -Ánh sáng: -Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng. -Giai đoạn hình thành qủa thể: cần ánh sáng tán xạ (ánh sáng có thể đọc sách được) và cường độ ánh phải cân đối từ mọi phía. -Độ pH: Nấm linh chi thích hợp trong môi trường có pH từ 5,5 - 7. -Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể,nấm linh chi cần độ thông thoáng tốt. -Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose. CHƯƠNG II: NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI I. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI 1.1. Sơ đồ quy trình nhân giống nấm Linh Chi Nhân giống nấm là khâu đầu tiên và quan trọng trong nghề sản xuất nấm, trải qua nhiều công đoạn và nhiều cấp khác nhau. Quá trình nhân giống đòi hỏi yêu cầu kỹ thuật, thiết bị dụng cụ tương đối phức tạp. Quá trình nhân giống nấm Linh Chi được mô tả tổng quát theo quy trình sau: Quả thể Bào tử Tơ nấm Phân lập Nước chiết Giống gốc MT Thạch (PDA) Thạch (agar) Nhân giống cấp I -Cấy chuyền -Nuôi sợi -Bảo quản Chất bổ sung Đường Giống cấp I Nhân giống cấp II -Cấy chuyền -Nuôi sợi -Bảo quản MT dạng hạt -Lúa -Hat ngũ cốc Giống cấp II MT cấp II -Cấy chuyền -Nuôi sợi -Bảo quản MT dạng que -Sắn Nhân giống cấp III Giống cấp III MT cấp III Mùn cưa -Bảo quản Nuôi trồng Sơ đồ 1: Quy trình nhân giống nâm Linh Chi 1.2. Mô tả sơ lược quy trình sản xuất giống nấm 1.2.1. Môi trường dinh dưỡng Muốn nuôi cấy hoặc nhân giống bất kỳ loại nấm nào, điều trước tiên là cần có môi trường dinh dưỡng. Môi trường dinh dưỡng cũng thay đổi theo từng giai đoạn của quá trình nhân giống: môi trường thạch, môi trường hạt, que và giá môi. -Meo thạch ngoài việc cung cấp dinh dưỡng dễ hấp thụ cho tơ nấm còn tiện cho việc quan sát các mầm tạp nhiễm. -Môi trường hạt làm tăng về số lượng phân bố. -Môi trường dạng que là dạng trung gian tiện lợi cho việc chuyền giống. -Môi trường giá môi giúp sợi tơ nấm thích nghi với cơ chất sẽ nuôi trồng. Môi trường dinh dưỡng cần đảm bảo các yêu cầu thiết yếu: -Cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cần thiết cho nấm. -Không ảnh hưởng đến sinh lý và khả năng hấp thụ dinh dưỡng của nấm: pH môi trường, sự tích lũy các chất độc… -Không làm thay đổi đặc tính của nấm: nhanh già, nhanh lão hóa… -Dễ thực hiện và tiện dụng 1.2.1.1. Môi trường thạch (MT cấp I) Môi trường được sử dụng phổ biến nhất là PDA. Công thức: Khoai tây: 200g Đường glucose: 20g Agar: 20g Hình 1.3 Cắt khoai tây Nước cất: 1 lít Cách pha chế môi trường tiến hành như sau: -Chọn khoai tây không mọc nầm hoặc không biến màu xanh, gọt vỏ, rửa sạch, thái hạt lựu khoảng 1-2cm2, cho vào nấu với 1 lít nước đến khi chín mềm ra. -Chiết lấy nước và thêm agar vào nấu thật tan (lưu ý: khi nấu agar, phải khuấy liên tục để agar không bị lắng dưới đáy, dễ bị khét). Thêm đường glucose vào, quậy tan đường, bắt xuốngSau khi kiểm tra pH xong cho vào đĩa petri hoặc các ống nghiệm, chai thủy tinh. Để nguội, làm nút bông quấn giấy bao nút lại. Hình 1.4 Chai môi trường Sau đó hấp khử trùng môi trường bằng phương pháp hấp áp lực cao (Autoclave): 1210C/1 atm/ 30 phút, lấy ra để nghiêng (đối với môi trường trong ống nghiệm) và chờ thạch đông. Để kiểm tra độ an toàn của môi trường, ta cho các ống (chai) môi trường đã khử trùng vào tủ ấm, nuôi ủ 35-370C trong 24 giờ, nếu ống nào nhiễm khuẩn thì loại bỏ. Sau 2-3 ngày, bề mặt môi trường khô mới tiến hành phân lập giống gốc hay cấy chuyền giống nấm cấp I. 1.2.1.2. Môi trường cấp II Môi trường cấp II dùng để nhân giống nấm Linh Chi là môi trường rắn, có thể dạng hạt (như hạt thóc, bo bo,…) hoặc dạng que (như thân cây sắn,…). a.Quy trình môi trường dạng hạt Bo bo Đậu Gạo Lúa Loại hạt lép Nấu chín Rửa Loại hạt lép Nấu chín Rửa Vo Nấu chín Thêm ít nước Phối trộn bột nhẹ Chai hạt (ống hạt) Khử trùng 1210C/ 1 giờ 30 Cấy giống Sơ đồ 2: Quy trình môi trường dạng hạt Các hạt ngũ cốc được rửa và loại hạt lép. Sau đó, có thể ủ nẩy mầm hoặc không, rồi nấu cho vừa chín nở. Để nguôi và phối trộn bột nhẹ theo công thức, cho vào các chai thủy tinh hoặc chai nhựa ( ¾ chai), làm nút bông và đem đi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C/ 1,5-2 giờ. Hình 1.5 Chai hạt ngũ cốc b. Quy trình môi trường dạng que Riêng ở nước ta, trong quy trình nhân giống nấm còn có thêm công đoạn làm giống que, nhằm giúp đơn giản thao tác cấy từ hạt sang nguyên liệu thô, nhưng quan trọng hơn là tơ nấm phát triển nhanh và tuổi meo đồng đều hơn (so với cấy hạt). Thân cây sắn Thân gỗ mềm Thân cây đậu Thân cây bắp Bẹ chuối Thân cây bắp Chặt khúc6-8cm Chẻ 2-4 Cưa khúc 12-14cm Cưa khúc 10-12cm Chẻ nhỏ Chặt khúc 6-8cm Chẻ 2-4 Cắt khúc 10-12cm Chẻ đôi Cắt khúc 5-6cm Chặt khúc 6-8cm Chẻ 2-4 Cưa khúc 12-14cm Cắt khúc 6-8cm Bó 3-4que Phơi khô Ngâm vôi 0,5%, 48 giờ Vớt ra, rửa sạch Làm ráo nước Áo cám gạo hoặc cám bắp Chai que hoặc túi que Khử trùng 1210C/ 2 giờ Cấy giống Sơ đồ 3: Quy trình môi trường dạng que Nguyên liệu sử dụng được xử lý trong nước vôi 1%, trong thời gian 48 giờ. Vớt ra rửa sạch, để ráo. Sau đó, bổ sung thêm cám gạo hoặc cám bắp. Cho vào chai thủy tinh hoặc chai nhựa (3/4 chai), làm nút bông và đem đi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C/ 1,5-2 giờ. Hình 1.6 Que sắn 1.2.1.3. Môi trường cấp III Môi trường cấp III thường sử dụng các cơ chất gần giống như giá thể trong nuôi trồng nấm. Mùn cưa của các loại cây gỗ mềm, không có tinh dầu và độc tố. Mùn cưa không bị nhiễm nấm mốc, không lẫn đất đá, tốt nhất nên sử dụng mùn cưa cây cao su, bồ đề. Mùn cưa được làm ẩm vơi nước vôi có pH = 12-13, ủ đống 3-4 ngày. Sau khi sử lý xong, mùn cưa được phối trộn phụ gia theo tỉ lệ: : cám gạo 15%, bột ngô 15%, bột nhẹ ( CaCO3) 1,5%, độ ẩm 65-70%. Cho cơ chất vào túi nilon chiụ nhiệt. Sau đó làm nút bông và đem đi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C/ 1,5-2 giờ 1.2.2. Giống nấm Hình 1.7 Bào tử nấm Linh chi Giống nấm gốc có thể được phân lập từ mô của các quả thể nấm hoặc từ bào tử nấm. Giống gốc phải ổn định về các đặc tính di truyền, đảm bảo năng suất và hiệu quả kinh tế. Thực hiện cấy chuyền nấm gốc sang môi trường thạch cấp I, hệ sợi nấm sẽ sinh trưởng tạo thành các ống giống cấp I. Ta tiến hành lựa chọn các ống giống cấp I đạt tiêu chuẩn để sử dụng nhân giống cấp II hoặc đưa vào bảo quản để tạo nguồn giống, sử dụng dần. Môi trường cấp II là môi trường rắn, có thể dạng hạt (như hạt thóc, bo bo,…) hoặc dạng que (như thân cây sắn,…). Cấy chuyền giống cấp I đã lựa chọn sang môi trường cấp II, hệ sợi sinh trưởng và mọc lan trên các hạt, que dến khi ăn kín đáy chai, hình thành các chai giống cấp II. Tiến hành lựa chọn các chai giống đạt tiêu chuẩn để sử dụng nhân giống cấp III hay đưa vào bảo quản để tạo nguồn giống, sử dụng dần. Môi trường cấp III có thành phần hoàn toàn giống như môi trường cấp II, nhưng được đóng vào các túi nilon. Cấy chuyền giống cấp II đã được lựa chọn sang môi trường cấp III, hệ sợi sinh trưởng và mọc lan trên các hạt, que đến khi ăn kín đáy túi, hình thành các túi giống cấp III. Tiến hành lựa chọn các chai giống đạt tiêu chuẩn để sử dụng nuôi trồng nấm. Mục đích của việc nhân giống cấp III là làm tăng số lượng giống nấm. Giống gốc Giống cấp I Giống cấp II Giống cấp III Sơ đồ cấy giống . II. NHÂN GIỐNG NẤM CẤP I 2.1.Chuẩn bị giống gốc Khởi đầu của quá trình nhân giống hay làm meo giống là phải có giống gốc. Giống gốc hay giống ban đầu có thể thực hiện bằng nhiều cách. -Thu nhận và gây nẩy mầm bào tử nấm -Tách sợi nấm từ các cơ chất có nấm mọc -Phân lập từ quả thể nấm Môi trường dinh dưỡng để nuôi sợi tơ nấm thường sử dụng là môi trường thạch tổng hợp. Sau khi nuôi cấy ở môi trường dinh dưỡng, từ tơ nấm sẽ ăn lan trên mặt thạch thành lớp sợi trắng. Những sợi nấm này lan dần ra từ bào tử hoặc từ mô thịt nấm cho đến khi phủ kín các bề mặt thạch. Giống được dùng làm giống gốc phải đạt các yêu cầu sau: -Là giống thuần, không lẫn tạp. -Tơ mọc khỏe chia nhánh đều. -Tơ nấm bò sát mặt thạch hoặc ăn vòng thành ống nghiệm, ít tơ khí sinh, tơ rối bông. Giống gốc là khâu quyết định trong sản xuất và nuôi trồng nấm vì nó được nhân ra với số lượng lớn và chỉ biết kết quả sau một vài tháng, nghĩa là sau khi thu hoặc nấm. Do đó sơ suất khi chọn giống gốc sẽ dẫn đến thiệt hại rất lớn. Tóm lại, giống gốc là khâu quyết định trong sản xuất và nuôi trồng nấm, nên rất cần sự cẩn thận khi thực hiện. 2.2. Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng 2.2.1. Môi trường PDA. Công thức: Khoai tây: 200g Đường glucose: 20g Agar: 20g Nước cất: 1 lít pH = 7,0 Ngoài những thành phần trên một số môi trường thường bổ sung thêm một số nguyên tố khoáng: K, P, Mg…dưới dạng muối vô cơ, các thành phần này bổ sung với liều lượng khoảng 1-3g/ lít môi trường, cũng có khi bổ sung thêm vào môi trường tỉ lệ nhỏ các loại vitamin, kháng sinh… 2.2.2. Các bước tiến hành 2.2.2.1. Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ nguyên liệu và hóa chất ¶ Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ Nồi Autoclave, tủ ấm, tủ cấy vô trùng Bếp gas ( hoặc bếp từ, lò vi sóng) Nồi nấu môi trường Cốc thủy tinh, ống đong, ống nghiệm, chai thủy tinh, đũa thủy tinh Cân kỹ thuật Máy đo pH, giấy đo pH Phễu, giá rót môi trường, rổ, vợt, vải lọc, dao cắt Bông không thám nước, giấy báo, nilon, dây cao su. ¶ Chuẩn bị nguyên liệu Nước cất Khoai tây: loại tốt, không bị hư hỏng, không nảy nầm ¶ Chuẩn bị hóa chất Agar Đường Glucose ( hoặc Sachrose) Muối khoáng, vitamin, kháng sinh (nếu cần bổ sung) 2.2.3. Pha chế môi trường cấp I Tạo môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm cấp I từ hỗn hợp các thành phần theo công thức hỗn hợp trên Sau khi tạo hỗn hợp môi trường xong, phân môi trường vào các ống nghiệm và đậy bằng nút bông không thấm nước *Thao tác thực hiện: Hình 2.1. Thái lát khoai tây Bước 1: Kiểm tra lại các dụng cụ, nguyên liệu cần thiết Bước 2: Chiết chất dinh dưỡng từ khoai tây Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt thành khối có kích thước 1-2cm2 Cân chính xác 200g khoai tây đã cắt thành hình khối cho vào nồi nấu môi trường Đổ 600ml nước cất vào nồi và đun sôi trên bếp ga (hoặc bếp từ) Đun cho đến khi khoai tây hơi mềm: dùng dũa bẻ đôi khối khoai tây, đến khi khối khoai tây gãy đôi là được Lọc qua rổ thu dịch lọc Bước 3: Chuẩn bị dung dịch nước đường Đặt cân về vị trí cân bằng, đầy dủ ánh sáng Điều chỉnh cân về vị trí cân bằng Cân chính xác 20g đường glucose cho vào cốc thủy tinh Đong 100ml nước cất cho vào cốc đã có đường Khấy tan đường Bước 5: Nấu môi trường Cân 20g agar cho vào dung dịch khoai tây Khấy cho agar hòa tan Thêm nước cất cho đến khi thể tích đúng 1000ml Đun sôi môi trường 3-5 phút (lưu ý: khi nấu agar phải khuấy đều, để agar không bị lắng dưới đáy, dễ bị khét) Thêm dung dịch nước đường vào, ta thu được môi trường cấp I Bắt xuống, để nguội Bước 6: Phân phối môi trường vào ống nghiệm hoăc chai thủy tinh Đổ môi trường cấp I vào các cốc có miệng để dễ rót vào ống nghiệm, chai Dùng phễu phân nhanh môi trường vào các ống nghiệm hoặc chai thủy tinh: đối với ống nghiệm lượng môi trường chiếm khoảng 1/5 ống nghiệm (6-7 ml/1 ống nghiệm), đối với chai thủy tinh từ 5-10 ml, nấu đổ vào ống nghiệm thì phễu được cố định trên một giá đỡ. Hinh 2.2.Cho môi trường vào chai thủy tinh Hình 2.3.Dịch chiết khoai tây Bước 7: Làm nút bông cho ống nghiệm, chai thủy tinh đã có môi trường Lấy một lượng bông vừa đủ: sao cho nút bông sau khi làm xong không quá chắt hay quá lỏng, phần nút bông trong ống nghiệm tròn đều, phần ngoài không bị xơ Bước 8: Chuyển các ống nghiệm, chai thủy tinh có môi trường vào nồi khử trùng 2.2.4. Khử trùng môi trường cấp I Mục đích khử trùng là để tiêu diêt hoàn toàn các nguồn tạp nhiễm trong môi trường, môi trường sau khi hấp khử trùng xong phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối và không làm giảm chất lượng môi trường Thiết bị thường áp dụng là nồi hấp Autoclave 1210C/25 phút. Sau khi hấp thanh trùng kết thúc môi trường đang còn ở trạng thái lỏng ta tiến hành làm thạch nghiêng ngay. *Cách tiến hành: -Bước 1: Bó ống nghiệm đã có môi trường thành các bó nhỏ: khoảng 7-10 ống nghiệm/bó. -Bước 2: Buộc đầu nút bông các bó ống nghiệm, miệng chai thủy tinh bằng giấy báo hoặc giấy nilon để hạn chế sự thấm nước vào nút bông trong quá trình hấp khử trùng. -Bước 3: Xếp môi trường vào các dụng cụ đưa vào nôi Autoclave hấp khử trùng 1210C/25 phút. -Bước 4: Lấy môi trường ra khỏi nồi và tiến hành làm thạch nghiêng. Dùng que gỗ mỏng đặt lên trên một mặt phẳng có thể dùng giá nghiêng đã được thiết kế cho tạo môi trường thạch nghiêng. Lấy từng ống môi trường sau khi đẫ khử trùng còn nóng đặt nghiêng trên que gỗ nghiêng 1 góc 40-450 Cứ tiến hành cho đến hết các ống môi trường còn lại Hình 2.4 Làm thạch nghiêng -Bước 5: Để nguội môi trường trong khoảng thời gian 1-2 giờ -Bước 6: Kiểm tra vô trùng môi trường trước khi sử dungj trong nhân giống:các ống, chai môi trường sau khi đông rắn ta tiến hành chyển vào tủ ấm ở nhiệt độ 35- 370C ít nhất sau 7 ngày, kiểm tra nếu môi trường không thấy có mặt các vi sinh vật mọc trong môi trường, màu môi trường không thay đổi thì môi trường đạt yêu cầu. Các ống nghiệm, chai môi trường được đặt vào tủ lạnh, nhiệt độ 2-100C để dùng dần. 2.3. Cấy chyền giống nấm cấp I Cấy chuyền giống nấm cấp I là quá trình chuyển giống nấm từ các ống giống gốc sang các ống nghiệm, chai thủy tinh chứa môi trường cấp I đã được vô trùng và thao tác cấy chuyền được thực hiện trong điều kiện vô trùng. 2.3.1. Kiểm tra phòng cấy, tủ cấy và dụng cụ cấy giống Trước khi tiến hành thao tác cấy chuyền giống yêu cầu: phòng cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự xâm nhập nguồn tạp nhiễm vào giống nấm trong quá trình cấy chuyền. -Phòng cấy: phải luôn sạch sẽ, vì vậy cần phải: Quét dọn lau sạch sàn, xung quanh tường bằng nước sạch trước và sau mỗi lần cấy giống Bậc quạt thông gió -Tủ cấy: Dùng bông thấm cồn lau sạch tủ bên trong, ngoài tủ Phủ màn tối kín tủ Hình 2.5 Khử trùng bàn cấy Bật đèn tử ngoại, quạt trong thời gian 15-30 phút Lấy màn che khỏi tủ Tắt đèn tử ngoại sau thời gian 15-30 phút để đẩy hết khí ozon ra khỏi tủ Bật đèn sáng Tiến hành cấy giống: Dụng cụ cấy: các dụng cụ sử dụng trong phòng cấy giống (bình tam giác, que cấy, panh cấy, kéo…) được bao gói và hấp khử trùng ở nhiệt độ 160-1700C, sau khi khử trùng xong phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay. Cấy chuyền từ ống gốc sang môi trường cấp I Cách cấy chuyền giống được thực hiện theo các bước sau: -Bước 1: Mang bảo hộ: áo bluse, khẩu trang -Bước 2: Khử trùng tay: dùng bông thấm cồn lau từ khủy tay đến các ngón tay, kẽ tay -Bước 3: Kiểm tra lại các ống (chai) giống gốc và các ống (chai) môi trường cấp I và dùng bông thấm lau cồn xung quanh các ống ( chai) giống và ống (chai) môi trường trước khi đưa vào tủ. Hình 2.5 Khử trùng que cấy -Bước 4: Chuyển bộ dụng cụ cấy giống, đèn cồn, bình tam giác có chứa cồn, khay đựng dụng cụ cấy vào tủ cấy và bố trí sao cho tiện trong quá trình thao tác trong tủ. -Bước 5:Ngồi vào vị trí và vệ sinh tay lại một lần nữa bằng cồn và đợi cho tay khô hết cồn. -Bước 6: Đốt đèn cồn để đèn cồn cháy tự do trong thời gian 2-3 phút, ngọn lửa đèn cồn không nên để quá lớn hoặc quá nhỏ, nên cao từ 3-4cm. -Bước 7: Khử trùng lại các dụng cụ cấy bằng cách nhung vaò cồn và đốt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, thao tác lặp lại 2-3 lần, sau đó để nguội -Bước 8: Mở nút bông và giữ nút bông của ống gốc và ống môi trường bằng kẽ tay út và áp út, hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, chỉ mở quanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng về hướng ngọn lửa. -Bước 9: Dùng que cấy chuyển một mẫu giống từ ống giống gốc sang ống (chai) môi trường cấp I b)Chuyển mẫu giống gốc a) Lấy giống gốc c)Chuyển giống gốc vào môi trường Hình 2.6: Thao tác cấy chuyền giống -Bước 10: Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn và hơ nhanh nút bông của ống môi trường và đậy nút bông lại. -Bước 11: Thao tác cứ tiến hành cho đến khi hết lượng giống trong ống giống gốc. Trung bình một ống giống gốc như vậy ta cấy được khoảng 30-40 ống giống cấp I -Bước 12: Dùng giấy báo bọc đầu nút bông của ống giống lại. -Bước 13: Ghi tên loại giống, ngày giờ cấy. -Bước 14: Xếp các ống giống cấp I trên các giá và chuyển toàn bộ vào phòng nuôi sợi để trên các giàn kệ nuôi sợi giống. -Bước 15: Vệ sinh tủ cấy và phòng cấy sau khi cấy giống xong 2.4. Nuôi sợi giống nấm cấp I Kiểm tra điều kiện phòng nuôi Phòng sạch sẽ không có bụi bẩn, rác thải, không bị ẩm mốc Phòng càng ít ánh sáng càng tốt,khô thoáng, có đầy đủ hệ thống điện Có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ khi cần, thường nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi sợi ở nấm Linh Chi là 260C +_2 và thời gian ăn kín ống nghiệm là 10 +_1 Chọn nhiễm và phân lập giống nấm cấp I Tốc độ sinh trưởng và phát triển hệ sợi nấm cấp I của nấm Linh Chi sẽ phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, chất lượng, độ tuổi giống đem nhân giống cũng như thành phần môi trường và điều kiện nuôi sợi. Sau thời gian nhất định có những ống giống sợi nấm phát triển mạnh, ăn kín toàn bộ bề mắt thạch, sợi nấm ăn khỏe và có một màu đồng nhất, với những ống như vậy ta sử dụng trực tiếp hoặc chuyển sang bảo quản. Tuy nhiên cũng có những ống giống không đạt yêu cầu: Bị nhiễm vi sinh vật khác Sợi nấm bị thoái hóa hay lão hóa Sợi sinh trưởng kém Giống cấp I thường nhiễm các loại: Nhiễm khuẩn: Trên môi trường thạch có những vết trắng đục như sữa Nhiễm mốc: Trên môi trường xuất hiện những chấm nhỏ nhiều màu, sợi giống nấm không phát triển được. Nguyên nhân giống nấm bị nhiễm: + Hấp khử trùng môi trường không tốt: Môi trường đã khử trùng, để ở nhiệt độ bình thường trong khoảng 3-4 ngày có hiện tượng nhiễm khuẩn là do nồi hấp bị hỏng hoặc chế độ khử trùng không đảm bảo. + Ống gốc bị nhiễm: Tất cả các ống cấp I được cấy từ ống giống này đều bị nhiễm + Do thao tác cấy: Trong khi cấy các ống nghiệm để gần ngọn lửa đèn cồn sẽ làm cho giống chết, thạch bị chảy ra và rất dễ nhiễm khuẩn. + Có thể do tủ cấy không đảm bảo vô trùng hoặc phòng cấy không thường xuyên khử trùng + Có thể bị lây nhiễm từ ngoài vào trong quá trình nuôi sợi. Việc lây nhiễm này chủ yếu là do phòng nuôi sợi, ống nghiệm, nút bông bị ẩm và bị nhiễm bẩn… Một số biểu hiện của sợi nấm bị thoái hóa?: + Sợi nấm co lại không phát triển, hệ sợi nấm dày, màu sợi nấm mờ + Tơ tiết có màu từ trắng chuyển sang vàng trong + Sợi nấm đổi màu: bình thường sợi nấm màu trắng chuyển sang màu tối, xám tro, màu nâu + Thời gian ăn kín ống nghiệm quá lâu III. NHÂN GIỐNG NẤM CẤP II 3.1. Chuẩn bị giống nấm cấp I Giống cấp I phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Sợi nấm ăn kín bề mặt thạch nghiéng - Hệ sợi phân bố đồng đều - Không có hiện tượng bị nhiễm trên bề mặt và nút bông - Sợi nấm không có dấu hiệu bị lão hoá Giống cấp I trước khi đưa vào nhân giống cấp II phải đượcc kiểm tra thật kỹ đảm bảo các yêu cầu trên và đang được bảo quản ở nhiệt độ thường. Nếu dùng giống cấp I được bảo quản ở điều kiện lạnh để nhân giống, trước khi sử dụng phải đưa ra điều kiện bình thường ít nhất 1- 2 ngày. 3.2. Làm môi trường nhân giống nấm cấp II Giống cấp II có thể áp dụng nhiều công thức khác nhau, nhưng tất cả đều là môi trường xốp với nguyên liệu chính: thóc, ngũ cốc, mùn cưa, cám gạo, bột ngô. . . Đối với linh chi, môi trường nhân giống cấp II là môi trường dạng hạt. 3.2.1. Công thức môi trường cấp II - Công thức: nhân giống cấp II nấm linh chi + Thóc luộc + Bột nhẹ (CaCO3): 1% 3.2.2. Các bước tiến hành 3.2.2.1. Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu và hoá chất * Thiết bị, dụng cụ: - Nồi Autoclave hoặc hệ thống nồi thanh trùng - Máy trộn nguyên liệu - Bếp gas công nghiệp, nồi luộc, que khuấy - Quạt công nghiệp - Chai thủy tinh 500m1, chai nhựa, nắp nhựa, thau nhựa, rổ - Cân đồng hồ, ẩm kế - Bông không thấm nước, dây cao su, giấy báo, giấy nilon * Nguyên liệu - Nước sạch: pH: 7,0 - Thóc tẻ: có chất lượng tốt, không mốc, không bị sâu mọt đục phá, - Mùn cưa từ các loại gỗ mềm, không có tinh dầu, hoá chất, để nhân giống nên chọn mùn cưa cao su, bồ đề là tốt nhất. Ngoài ra còn chuẩn bị một số phụ gia bổ sung: cám gạo, bột ngô * Hoá chất - Vôi sống: hàm lượng CaO > 60% - Cồn công nghiệp - Bột nhẹ: có chất lượng tốt, pH<9. - Phân vô cơ: urê, DAP, MgSO4, chất khoáng... 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm cấp II * Chuẩn bị môi trường nhân giống theo công thức (tạo môi trường nhân giống cấp II từ nguyên liệu thóc) Bước 1: Xử lý nguyên liệu thóc - Cân khối lượng thóc cần làm đổ vào thau nhựa - Rửa nhiều lần bằng nước sạch để loại bỏ bụi, đất và các hạt thóc lép - Ngâm thóc trong nước sạch 12 - 16 giờ, để thóc ngâm nước - Thóc sau khi ngâm, tiến hành đãi, rửa sạch để khử hết mùi chua - Cho thóc vào nấu và tiến hành luộc, khi vỏ trấu mở khoảng 1/3, kiểm tra không còn lõi trắng ở giữa là đạt yêu cầu. - Vớt thóc ra các dụng cụ chứa để thoát nước như: rá, rổ,... và để cho bay hết hơi nước (có thể dùng quạt để hơi nước bay nhanh hơn), độ ẩm còn khoảng 70 - 75% là được. * Chú ý khi luộc thóc: trong quá trình luộc phải thường xuyên khuấy trộn để độ nở các hạt thóc đồng đều nhau. Bước 2: Khi trộn bột nhẹ vào thóc đã luộc - Cân chính xác lượng thóc và bột nhẹ theo tỉ lệ công thức - Trộn đều để bột nhẹ bám vào vỏ hạt thóc đồng đều bằng tay hoặc bằng máy trộn. - Kiểm tra độ ẩm: 65- 70% là đạt yêu cầu. Bước 3: Phân phối thóc đã phối trộn vào các chai thủy tinh hoặc chai nhựa Thóc được đổ vào các chai thủy tinh hoặc chai nhựa, lượng thóc cho vào mỗi chai từ 300 — 350g (hình 2.7). Bước 4: Tiến hành làm nút bông (hình 2.8) - Lấy một lượng bông vừa đủ với miệng chai - Tạo đầu nút bông tròn - Đưa vào cổ chai: phần bông trong cổ chai khoảng 3 - 4cm, phần bông bên ngoài khoảng 1–2 cm. Hình 2.7. Phân phối thóc vào chai Hình 2.8. Làm nút bông Thủy tinh Bước 5: Đậy nắp chai môi trường Dùng nắp nhựa đậy kín miệng chai, hoặc dùng túi nilon, giấy báo bọc kín dùng nút bông để chống hút ẩm trong quá trình hấp khử trùng (hình 2.9). Bước 6: Chuyển các chai môi trường vào nồi hấp khử trùng. Hình 2.9. Bao gói nút bông 3.2.2.3. Khử trùng môi trường nhân giống nấm cấp II Để khử trùng môi trường cấp II, người ta thường sử dụng nồi Autoclave hoặc hệ thống nồi hơi (nếu sản xuất quy mô lớn). Sử dụng nhiệt của hơi nước bão hòa để khử trùng môi trường, chế độ khử trùng: áp suất 1,2-1,5 atm, thời gian 90-120 phút. Khi hấp xong, chuyển các chai giống vào phòng chờ, xêps lên bàn hoặc các giàn kệ, mở ngay bao nilon hoặc nắp đậy ra khỏi chai giống để nút bông khô một cách tự nhiên. Để ngụi sau thời gian khoảng 24-48 giờ mới tiến hành cấy giống cấp I vào. 3.3 Cấy chuyền giống nấm cấp II 3.3.1. Kiểm tra phòng cấy, tủ cấy và dụng cụ cấy giống. Trước khi tiến hành thao tác cấy chuyền yêu cầu: phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự xâm nhiễm nguồn tạp nhễm vào giống nấm trong quá trình cấy chuyền. Phòng cấy: yêu cầu phải sạch sẽ, vì vậy phải quét dọn, lau sạch sàn và xung quanh tường bằng nước sạch (có thể xông focmol để khử trùng trước đó vài ngày), bật quạt thông gió, điều hòa (nếu có). Tủ cấy: phải vô trùng tuyệt đối. Cách tiến hành: Dùng bông thấm cồn lau sạch tủ bên trong, ngoài tủ Phủ màn tối kín tủ Bật đèn tử ngoại, quạt trong thờigian 15-30 phút Lấy màn che ra khỏi tủ Tắt đènt tử ngoại đợi sau thời gian 15-30 phút, để đẩy hết khí ozon ra khỏi tủ Bật đèn sáng Tiến hành vào làm việc. *Chú ý: Khi sử dụng đèn tử ngoại: Trong thời gian bật đèn tử ngoại, không được làm việc trong phòng Không được nhìn trực tiếp vào đèn khi đang bật. Đúng thời gian bật, tắt đèn tử ngoại theo quy định mới được vào làm việc. Dụng cụ cấy: Các dụng cụ sử dụng trong cấy giống (bình tam giác, que cấy đầu bẹp, panh cấy, kéo, giấy bạc…) (Hình 2.10) được bao gói và khử trùng khô ở nhiệt độ 160-1700C, thời gian 1,2-2 giờ, hoặc hấp khử trùng hơi nước trong nồi Autoclave, dụng cụ sau khử trùng xong phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay. Hình 2.10. Dụng cụ cấy giống 3.3.2. Cấy chuyền giống từ giống cấp I sang môi trường nhân giống cấp II Quá trình cấy chuyền giống thực hiện tương tự các bước giống như việc cấy chuyền giống gốc sang ống môi trường cấp I. Thứ tự theo các bước sau: -Bước 1: Mang bảo hộ: áo bluse, khẩu trang -Bước 2: Khử trùng tay: dùng bông thấm cồn lau từ khủy tay đến các ngón tay, kẽ tay -Bước 3: Kiểm tra lại các ống giống cấp I và các chai môi trường nhan giống cấp II (chai giống không bị bể) -Bước 4: Đưa bộ dụng cụ cấy giống, đèn cồn, bình tam giác có chứa cồn, khay dụng cụ cấy vào tủ cấy và bố trí sao cho tiện trong quá trình thao tác trong tủ *Chú ý: Các dụng cụ bình tam giác, đèn cồn, khay phải được lau cồn trước khi đưa vào tủ -Bước 5: Vào vị trí làm việc và vệ sinh tay lại một lần nữa bằng cồn và đợi khô cồn trên tay. -Bước 6: Đốt đèn cồn để đèn cồn cháy tự do trong thời gian 2-3 phút, ngọn lửa đèn cồn không nên để quá lớn hoặc quá nhỏ, nên cao từ 3-4 cm. -Bước 7: Khử trùng lại các dụng cụ cấy bằng cách nhúng cồn và đốt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, thao tác tiến hành 2-3 lần và để nguội. -Bước 8:Mở nút bông và giữ nút bông của ống giống cấp I và ống môi trường cấp II bằng kẽ tay út và áp út, hơ miệng ống nghiệm và chai môi trường trên ngọn lửa đèn cồn, chỉ mở nút bông tquanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng về hướng ngọn lửa. -Bước 9: Dùng que cấy chấn 1/2-1/3 phần giống trong ống giống cấp I và chuyển phần giống đó sang chai môi trường cấp II, nếu giống trên các chai thủy tinh, thì cũng dùng que cấy lấy một đường có kích thước 1-2 cm (hình 2.11). Hình 2.11. thao tác chuyển giống từ cấp I sang cấp II *Chú ý trong quá trình chuyền giống: Thao tác phải thực hiện trên hoặc quanh ngọn lửa đèn cồn và ngang tầm lửa, trong khu vực bán kính 10 cm so với ngọn lửa đèn cồn. -Bước 10: Hơ miệng chai giống trên ngọn lửa đèn cồn và hơ nhanh nút bông của chai môi trường cấp II và giữ nút bông lại ( hình 2.12) Hình 2.13. Bao gói nút bông chai giống Hình 2.12. Đậy nút bông chai giống cấp II -Bước 11: Thao tác cứ tiến hành cho đến khi hết lượng giống cấp I -Bước 12: Dùng giấy báo bọc đầu nút bông chai giống cấp II lại để hạn chế sự tạp nhiễm vào môi trường nuôi sợi nấm ( hình 2.13) -Bước 13: Ghi lại tên giống, ngày giờ cấy trên chai giống -Bước 14: Xếp các chai giống cấp II vào rổ hoặc xe đẩy và chuyển toàn bộ vào phòng nuôi sợi, các chai xếp cách nhau 5 cm, hàng cách hàng 5 cm. -Bước 15: Vệ sinh tủ cấy và phòng cấy sau khi hoàn thành công việc. *Chú ý: Nếu trong quá trình cấy phát hiện ống giống bị nhiễm cần phải nhanh chóng đậy nút bông lại và chuyển ra khỏi khu vực cấy giống và tiến hànhh công việc khử trùng lại tủ cấy, dụng cụ cấy giống như ban đầu. 3.4. Nuôi sợi giống nấm cấp II 3.4.1 Kiểm tra điều kiện môi trường phòng nuôi sợi Phòng nuôi sợi cho các loại giống nấm khác nhau thì khác nhau, nói chung phải đảm bảo yêu cầu sau đây: Phòng sạch sẽ không có bụi bẩn, rác thải, không bị ẩm mốc Phòng phải tối, khô thoáng Có đầy đủ hê thống điện Có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ khi cần, thường nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi sợi ở các loại nấm khác nhau thì khác nhau: Phòng nuôi giống chịu nhiệt (nấm rơm): nhiệt độ trong phòng được duy trì ổn định ở 28-300C. Phòng nuôi giống chịu nhiệt độ thấp (giống nấm sò, linh chi, mộc nhĩ,…) nhiệt độ trong phòng được duy trì ổn định ở 22-250C. Phòng nuôi giống nấm chịu lạnh (giống nấm kim châm, nấm trà tân, nấm mỡ…): nhiệt độ trong phòng được duy trì từ 15-160C. 3.4.2. Chọn nhiễm và phân lập giống nấm cấp II Trong thời gian nuôi sợi cấp II, phải thường xuyên theo dõi nhiệt độ nuôi và loại bỏ những chai giống bị nhiễm và không đạt chất lượng Sau khi cấy giống từ 2-3 ngày, ta tiến hành chọn nhiễm khuẩn trên khối giống cấp I và tốc độ lan sợi của khối giống vào trong khối môi trường cấp II trong chai giống. Nếu thấy khối giống cấp I bị chuyển màu và sợi không phát triển ăn vào khối môi trường cấp II, thì cần phải xem lại nhiệt độ và kiểm tra lại giống cấp I, môi trường nhân giống. Từ ngày thứ 4-6, tiến hành chọn nhiễm trong môi trường nhân giống cấp II, chai giống bị nhiễm thường có biểu hiện trong chai giống: hạt thóc thường chảy nước đục hoặc rỉ nhựa. Từ ngày thứ 6-10, tiến hành chọn nhiễm mốc trên bề mặt và xung quanh chai giống, biểu hiện: trong chai giống có các chấm đen, xanh, vàng hoa cau hoặc sợi bị rối. - Sau ngày thứ 10, tiền hành loại bỏ những chai giống bị lẫn sợi, tốc độ phát triển của  sợi quá nhanh hoặc quá chậm. - Sau thời gian nhất định có những chai giống sợi phát triển mạnh, ăn kín toàn bộ khối môi trường trong chai giống, sợi nấm ăn khỏe và có một màu đồng nhất, với những chai giống như vậy ta sử dụng trực hoặc chuyển sang bảo quản. Còn đối với những chai giống bị nhiễm không đảm bảo yêu cầu thì đưa đi xử lý Hình 2.14. Quá trình phát triển của sợi nấm trong môi trường IV. NHÂN GIỐNG NẤM CẤP III 4.1. Chuẩn bị giống nấm cấp III Giống nấm cấp III chỉ được nhân chuyển khi giống đã đủ tuổi, hệ sợi phân bố đồng đều, không có hiện tượng bị nhiễm trong chai giống, trên bề mặt và nút bông. Cách tính tuổi giống nấm cấp II tùy thuộc vào từng loại nấm, một giống nấm cấp II đạt yêu cầu để sử dụng cấy chuyền khi thời gian sợi nấm ăn kín đáy chai giống trong điều kiện bình thường của nấm và để thêm 2 ngày nữa thì giống đến tuổi cấy chuyền. Nấm linh chi: trung bình từ 13-15 ngày tuổi hệ sợi ăn kín đáy chai, ta để thêm 2 ngày nữa thì giống đến tuổi nhân chuyền. Các chai giống cấp II được bảo quản trong điều kiện lạnh, trước khi sử dụng phải được đưa về điều kiện bình thường ít nhất 1-2 ngày. 4.2. Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm cấp III Môi trường nhân giống nấm cấp III cũng giống với thành phần môi trường nhân giống cấp II, thường dùng môi trường hạt (thóc), môi trường xốp (mùn cưa, trấu, rơm rạ…), môi trường que (que sắn, thân ngô…). Ngoài ra còn bổ sung thêm một số phụ gia, hóa chất khác để tăng hàm lượng dinh dưỡng cho sợi nấm phát triển: bột ngô, cám gạo, phân vô cơ (ure, sunphat, magie. DPA…), bột nhẹ…Tỉ lệ thành phần các chất bổ sung trong môi trường nhân giống khác nhau tùy theo từng nguồn nguyên liệu chính ta sử dụng. Sau đây chỉ giới thiệu một vài công thức môi trường nhân giống nấm cấp III phổ biến có thể áp dụng hầu hết các loại nấm. 4.2.1. Công thức môi trường cấp III -Công thức: Môi trường mùn cưa +Mùn cưa đã xử lý +Cám gạo: 5% +Bột ngô: 7% +Bột nhẹ (CaCO3): 1,0-1,5% 4.2.2. Các bước tiến hành 4.2.2.1 Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ nguyên liệu và hóa chất * Thiết bị, dụng cụ -Nồi Autoclave hoặc hệ thống nồi thanh trùng -Máy trộn nguyên liệu -Bếp gas công nghiệp, quạt công nghiệp -Nồi luộc, que khuấy -Túi nilon PP 13 x 28 cm, bông không thấm nước -Chai nhựa, chai thủy tinh 500 ml, thau nhựa, rổ -Nắp nhựa, cổ nhựa hoặc cổ giấy, dây cao su, giấy báo -Cân, ẩm kế… * Nguyên liệu - Thóc tẻ: có chấtt lượng tốt, không bị mốc, sâu mọt, hạt to càng tốt. - Mùn cưa: các loại cây gỗ mềm (tốt nhất là dùng mùn cưa cao su, bồ đề), không lẫn tạp chất, ẩm mốc. - Que sắn: loại bỏ lõi, cạo sạch vỏ, cắt thành khúc ngắn có kích thước: dài 12 - 13cm, rộng 1,2 - 1,5cm; bề dày 0,3 - 0,6cm. Que sắn phải khô không bị mốc, sâu mọt đục phá. - Rơm rạ: khô, có màu vàng tự nhiên, không bị thấm nước mưa, nhũn nát. - Bông phế thải: sạch, không ẩm mốc, không bị xử lý hóa chất hoặc dính dầu mỡ. - Các loại phụ gia: cám gạo, bột ngô * Hoá chất - Cồn công nghiệp - Bột nhẹ: có chất lượng tốt, pH<9. - Phân vô cơ: urê, diamonphosphat (DAP), magie sunphat (MgSO4), lân... 4.2.2.2. Làm môi trường nhân giống nấm cấp III * Tạo hỗn hợp môi trường nhân giống cấp III theo công thức tạo môi trường nhân giống nấm cấp III bằng nguyên liệu mùn cưa. Bước 1: Xử lý mùn cưa - Chọn mùn cưa của các loại cây gỗ mềm, không có tinh dầu, không bị dính hoá chất... - Mùn cưa phải sàng lọc loại bỏ các tạp chất cơ học - Tạo ẩm mùn cưa bằng nước vôi có pH 12-13, độ ẩm đạt 65 - 70% - Tiến hành ủ đống: đống ủ kéo dài tối thiểu từ 5 - 7 ngày (nếu ủ lâu hơn thì khoảng 10 ngày đảo 1lần). Bước 2: Phối trộn phụ gia - Cân các phụ gia theo công thức - Trộn phụ gia vào mùn cưa đã tạo ẩm. Khi trộn có thể dùng máy trộn nguyên liệu hoặc dụng cụ thủ công như cào sắt, xẻng đảo trộn đều phụ gia vào trong mùn cưa. Bước 3: Kiểm tra độ ẩm mùn cưa trước khi đóng vào túi. - Mùn cưa trước khi đóng túi phải có độ ẩm 65-70% Bước 4: Đóng túi mùn cưa - Dùng thìa xúc mùn cưa đổ vào các túi nilon, nén tạo khối căng tròn đều, trọng lượng mỗi túi 0,4 — 0,5kg * Chú ý khi nén túi: không nên nén mùn cưa quá chật tay, túi mùn cưa bị thũng phải loại ngay. Bước 5: Làm cổ nút - Xoắn tròn miệng túi giống, xâu lồng vòng cổ nhựa (hoặc cổ giấy) xung quanh vòng xoắn nilon, bẻ ngược miệng túi nilon kéo xuống bao quanh vòng cổ nhựa. - Buộc miệng cổ lại bằng dây cao su. Bước 6: Làm nút bông - Lấy một lượng bông vừa đủ với miệng cổ nút môi trường - Tạo đầu nút bông tròn - Đưa vào cổ nút: phần bông trong cổ nút khoảng 3 - 4cm, phần bông bên ngoài khoảng 1-2cm. * Chú ý khi làm nút bông: - Dùng bông không thấm nước - Nút bông không nên làm quá chật cũng không quá lỏng Bước 7: Đậy nắp túi môi trường - Dùng nắp nhựa đậy kín miệng túi hoặc dùng túi nilon, giấy báo bọc kín đầu nút bông để chống hút ẩm trong quá trình hấp khử trùng Bước 8: Chuyển túi môi trường vào nồi hấp khử trùng 4.2.2.3. Khử trùng môi trường nhân giống cấp III Để khử trùng môi trường cấp III, người ta thường sử dụng nồi autoclave hoặc hệ thống nồi hơi (nếu sản xuất quy mô lớn). Sử dụng nhiệt của hơi nước bão hòa để khử trùng môi trường, chế độ khử trùng: áp suất 1,2 -1,5 atm, thời gian 120-150 phút. Khi hấp xong, chuyển các túi giống vào phòng chở, xắp lên bàn hoặc các giàn kệ, mở ngay bao nilon hoặc nắp nhựa ra khỏi chai giống để nút bông khô một cách tự nhiên. Để nguội sau thời gian khoảng 24 - 48 giờ mới tiến hành cấy giống cấp II vào. 4.3. Cấy chuyển giống nấm cấp III 4.3.1. Kiểm tra phòng cấy, tủ cấy và dụng cụ cấy giống Trước khi tiến hành thao tác cấy chuyền giống, yêu cầu: phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự xâm nhiễm nguồn tạp nhiễm vào giống nấm trong quá trình cấy chuyền. Quá trình chuẩn bị hoàn toàn giống quá trình chuẩn bị phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy giống cấp I, cấp II 4.3.2. Cấy chuyền từ giống giống nấm cấp II sang môi trường nhân giống cấp III Quá trình cấy chuyền giống thực hiện tương tự các bước giống như việc cấy giống từ giống cấp I sang môi trường giống cấp II. Thứ tự theo các bước sau: -Bước 1: Mang bảo hộ: áo bluse, khẩu trang -Bước 2: Khử trùng tay: dùng bông thấm cồn lau từ khủy tay đến các ngón tay, kẽ tay -Bước 3: Kiểm tra lại các chai giống cấp II và các túi, chai môi trường giống cấp III (chai giống không bị bể, túi môi trường không bị thủng) -Bước 4: Đưa bộ dụng cụ cấy giống, đèn cồn, bình tam giác có chứa cồn, khay đựng dụng cụ cấy vào tủ cấy và bố trí sao cho tiện trong quá trình thao tác trong tủ. Các dụng cụ bình tam giác, đèn cồn, khay phải được lau cồn trước khi đưa vào tủ -Bước 5: Vào vị trí làm việc và vệ sinh tay lại một lần nữa bằng cồn và đợi khô cồn trên tay. -Bước 6: Đốt đèn cồn để đèn cồn cháy tự do trong thời gian 2-3 phút, ngọn lửa đèn cồn không nên để quá lớn hoặc quá nhỏ, nên cao từ 3-4 cm. -Bước 7: Khử trùng lại các dụng cụ cấy bằng cách nhúng cồn và đốt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, thao tác tiến hành 2-3 lần và để nguội. -Bước 8:Mở nút bông của chai giống cấp II bằng ngón tay út,sau đó dùng que cấy đã vô trùng lấy phần thạch và lớp trên bề mặt chai giống cấp II ra khỏi chai và đặt chai giống nằm nghiêng trên mặt tủ cấy, miệng chai giống hướng về ngọn lửa đèn cồn. *Chú ý: Khi mở nút bông: chỉ mở nút bông quanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng vào hướng ngọn lửa. -Bước 9: Mở nút bông túi môi trường cấp III bằng ngón út -Bước 10:Dùng que cấy lấy giống từ chai giống cấp II chuyển sang túi môi trường cấp III, lượng giống cấy cho mỗi túi giống cấp III khoảng 15-16g *Chú ý: Trong quá trình chuyển giống: Thao tác phải thực hiện trên hoặc quanh ngọn lửa đèn cồn và ngang tầm lửa, trong khu vực bán kính 10 cm so với ngọn lửa đèn cồn. -Bước 11: Hơ miệng túi giống và hơ nhanh nút bông của túi môi trường cấp III trên ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại. -Bước 12: Thao tác cứ tiến hành cho đến khi hết lượng giống cấp II -Bước 13: Dùng giấy báo bọc đầu nút bông túi giống cấp III lại để hạn chế sự tạp nhiễm vào môi trường nuôi sợi nấm. -Bước 14: Ghi lại tên giống, ngày giờ cấy trên túi giống. -Bước 15: Xếp các chai giống cấp III vào rổ hoặc xe đẩy và chuyển toàn bộ vào phòng nuôi sợi, xếp trên các giàn giá nuôi sợi, các túi xếp cách nhau khoảng 5 cm. -Bước 16: Vệ sinh tủ cấy và phòng cấy sau khi hoàn thành công việc. * Chú ý: trong quá trình cấy giống -Nếu trong quá trình cấy phát hiện giống bị nhiễm cần phải nhanh chóng đậy nút bông lại và chuyển ra khỏi khu vực cấy giống và tiến hành công việc khử trùng lại tủ cấy, dụng cụ cấy giống như ban đầu. -Đảm bảo an toàn trong thao tác tránh gây cháy bỏng -Thao tác cấy phải nhanh gọn trên ngọn lửa đèn cồn, hạn chế rơi vãi giống nấm cũng như môi trường nhân giống ra khu vực đang cấy giống - Đảm bảo an toàn trong thao tác tránh gay cháy bỏng. 4.4. Nuôi sợi giống nấm cấp III 4.4.1. Kiểm tra điều kiện phòng nuôi sợi Phòng nuôi sợi cho các loại nấm khác nhau thì khác nhau, nói chung vẫn phải đảm bảo các yêu cầu sau đây: - Có đầy đủ giàn kệ để túi hoặc chai giống nấm để tiết kiệm diện tích - Phòng sạch sẽ, không có bụi bẩn, rác thải, không bị ẩm mốc. - Phòng phải tối, khô thoáng - Phòng có đầy đủ hệ thống điện - Có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ khi cần, thường nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi sợi ở các loại nấm khác nhau thì khác nhau: phòng nuôi sợi giống nấm linh chi duy trì ổn định ở nhiệt độ 22-250C 4.4.2. Chọn nguyên liệu và phân lập giống nấm cấp III Trong thời gian nuôi sợi cấp III, phải thường xuyên theo dõi nhiệt độ nuôi và loại bỏ nhưngc chai, túi giống bị nhiễm và không đạt chất lượng: -Sau khi cấy giống từ 2-3 ngày, ta tiến hành chọn, kiểm tra hạt giống nấm cấp II và theo dõi tốc độ lan sợi của hạt giống vào trong khối môi trường cấp III trong túi hoặc chai giống. Nếu thấy các hạt giống cấp II bị chuyển màu và sợi không ăn ra khối môi trường cấp III, thì cần phải xem lại điều kiện phòng nuôi, kiểm tra giống cấp II và môi trường nhân giống. -Từ ngày thứ 4-6, kiểm tra môi trường cấp III, nếu có biểu hiện hạt thóc chảy nước đục hoặc chảy nhựa là có dấu hiệu bị nhiễm vi sinh vật. -Từ ngày thứ 6-10, tiến hành chọn nhiễm mốc trên bề mặt và xung quanh chai hoặc túi giống biểu hiện: xuất hiện các chấm đen, xanh, vàng, hoa cau hặc sợi bị rối. - Sau ngày thứ 10, tiến hành loại bỏ những chai, túi giống bị lẫn sợi hoặc có những chai, túi có tốc độ phát triển của sợi quá nhanh (có khi sợi nấm gây nhiễm) hoặc quá chậm (sợi nấm quá yếu) cũng cần loại bỏ ngay. Sau thời gian nhất định có những chai, túi giống, sợi nấm ăn khỏe và có một màu đồng nhất. Những chai, túi giống đạt tiêu chuẩn ta sử dụng trực tiếp hoặc chuyển sang bảo quản, những chai giống bị nhiễm không đảm bảo đưa đi xử lý. 4.4.3. Vận chuyển giống nấm cấp III Trong quá trình vận chuyển giống nấm, đặc biệt là giống nấm trong các túi nilon cần phải lưu ý một số vấn đề sau: -Cẩn thận, tránh va đập mạnh làm đập nát hay làm bể chai giống -Không nên chèn một lúc quá nhiều túi hoặc chai giống nấm -Các túi giống nấm hoặc chai nấm phải được đặt thẳng đứng, trong các thùng giấy, có độ thông thoáng, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp. -Thời gian vận chuyển giống nấm không nên quá lâu. -Sau khi vận chuyển đến nơi phải lấy giống ra khỏi thùng để nơi mát mẻ, khô thoáng, sau thời gian 1-2 ngày mới tiến hành đưa vào sản xuất. V. BẢO QUẢN GIỐNG NẤM VÀ VỆ SINH PHÒNG CẤY, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SAU KHI CẤY 5.1. Bảo quản giống nấm 5.1.1. Bảo quản giống nấm cấp I Sau khi giống nấm ăn kín ống nghiệm, chai thủy tinh, các ống giống đủ tiêu chuẩn, chất lượng tốt nếu chưa đùng ngay thì ta tiến hành bảo quản. Thông thường người ta bảo quản bằng phương pháp lạnh ở nhiệt độ thấp bằng tủ lạnh hoặc phòng lạnh. Trong phạm vi nhiệt đọ bảo quản cho phép thì nhiệt độ bảo quản càng thấp thì thời gian bảo quản càng lâu Nấm Linh Chi bảo quản ở nhiệt độ 9-120 thời gian < 2 tháng. 5.1.2. Bảo quản giống nấm cấp II, cấp III -Đối với giống nấm cấp II: Khi giống nấm ăn kín đáy chai, những chai giống có chất lượng tốt, đủ tiêu chuẩn được sử dụng cấy chuyền sang giống cấp III hoặc bảo quản để dùng dần. Giống linh chi: nếu ở nhiệt độ thường thì thời gian bảo quản là 17 ngày và nếu bảo quản ở nhiệt độ 10-150C, thì thời gian bảo quản nhiều nhất là 30 ngày. -Đối với giống nấm cấp III: khi giống nấm ăn kín đáy chai, những chai, túi giống có chất lượng tốt, đủ tiêu chuẩn đưa vào sản xuất hoặc bảo quản để dùng dần. 5.2. Vệ sinh phòng cấy, thiết bị, dụng cụ sau khi cấy: - Dụng cụ: sau khi sử dụng xong, chuyển ra ngoài vệ sinh bằng các chất tẩy rửa, sau đó rửa lại bằng nước sạch, sấy khô, bao gói và đem đi khử trùng, để chuẩn bị cho lần sau. - Tủ cấy: Dùng bông thấm cồn vệ sinh cả bên trong và bên ngoài tủ, sau đó dùng màn phủ kín tủ lại, hạn chế bụi bẩn bay vào. - Phòng cấy: + Dọn quét sạch sẽ các rác thải ra trong quá trình cấy, + Lau phòng cấy bằng nước sạch hoặc có thể dùng formol để khử trùng.