Đề tài Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và Cypermethrin đối với sâu xanh (Heliothis armigera)

CH - COOH NH2 H2SO4 + Chất xúc tác t 0 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 42 Acid Boric là một acid yếu (Ka = 5,8 x 10-20). Khi chuẩn độ bằng HCl loãng tại điểm đổi màu pH từ 4,4 đến 6,2 thì dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ. Sử dụng hỗn hợp chất chỉ thị Methyl đỏ với Bromocresol xanh. Hàm lượng đạm tổng số của nguyên liệu có thể được tính gián tiếp bằng cách xác định hàm lượng nitơ tổng số, sau đó nhân với hệ số 6,25. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống Micro - Kjeldahl bán tự động. - Burrette bán tự động - Bộ vô cơ hóa mẫu - Tủ hốt - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc, giấy quì tím - Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g - Bình tam giác + Hóa chất - Hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1) - H3BO3 4% - NaOH N/100 - Thuốc thử Methyl đỏ và Bromocresol xanh. Cách thực hiện + Vô cơ hóa mẫu Cân chính xác 100 mg bột mẫu đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, cho vào bình tam giác. Sau đó thêm 1g chất xúc tác + 5 ml acid H2SO4 đậm đặc vào mỗi bình, lắc nhẹ, để yên 30 phút. sau đó đem vô cơ hóa mẫu. Vô cơ hóa mẫu được tiến hành trong tủ hốt để tránh khí độc SO2, CO2. Trong quá trình đun, dung dịch chuyển từ nâu sẫm đến nâu, đến vàng nhạt cho đến khi dung dịch trắng trong thì quá trình vô cơ hóa mẫu kế thúc. + Tiến hành cất đạm Cất đạm được tiến hành trên máy Micro – Kjeldahl Sử dụng hệ chuẩn HCl 0,25 N để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh những sai số về sự thay đổi nồng độ đượng lượng của kiềm trong không khí. 43 Cho vào bình hứng khoảng 2 ml acid H3BO3 4%, thêm một ít nước cất sao cho dung dịch acid ngập đầu mút sinh hàn. Trong bình hứng dung dịch H3BO3 tự phân ly theo phản ứng: H3BO3 HBO2 + H2O Khi cất đạm, NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH)2SO4 theo hệ thống ống sinh hàn vào bình hứng. Trong bình hứng, NH3 phản ứng với HBO2 như sau: NH4OH + HBO2 NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazơ mạnh, nên dung dịch của bình hứng chuyển từ màu xanh sang vàng. Quá trình kết thúc khi dịch hứng ở đầu ra có pH = 7,0. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng chuẩn độ ngược với HCl 0,25 N. Tính kết quả Thông qua chỉ số HCl 0,25 N, người ta biết được lượng acid Boric kết hợp với NH3 và từ đó biết lượng NH3 giải phóng ra từ mẫu. 1ml HCl tương ứng với 0,0035g nitơ hữu cơ. Hàm lượng nitơ tổng số được tính theo công thức: % Nitơ tổng số = (VHCl x 0,0035 x 100%)/ m Trong đó: VHCl: Thể tích HCl 0,25 N dùng để chuẩn độ 0,0035: Khối lượng N hữu cơ tương ứng với 1 ml HCl 0,25 N. m: Trọng lượng mẫu (g) Hàm lƣợng đạm tổng số = % Nitơ tổng số x 6,25 3.2.1.8 Định lƣợng đƣờng tổng số [10] Định lượng đường tổng số bằng phương pháp so màu. Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng màu đặc trưng của đường với sụ hiện diện của H2SO4. Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào: - Độ sạch của dụng cụ - Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4 - Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Để tạo phản ứng màu, có thể dùng nhiều loại thuốc thử khác nhau như: Phenol, antron hay orcinol. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Phenol. 44 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất + Thiết bị và dụng cụ - Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml - Cốc hay bình tam giác 50 ml, 100 ml - Pipet, giấy lọc, phiểu lọc - Ống nghiệm - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – Vis). + Hóa chất - Cồn 800, 960 - H2SO4 đậm đặc - Thuốc thử phenol 60%: 6 thể tích H2SO4 đậm đặc và 4 thể tích nước cất. - Các dung dịch đường chuẩn gồm: saccharose 0,1%; glucose 0,01%. Cách thực hiện Gồm 2 bước + Bước 1: Ly trích đường Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn có chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 960 vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi lần sôi, lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để nguội, lọc qua giấy lọc (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Sau đó thêm 10 ml cồn 800 vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi hai lần trên nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng hai lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 800 nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để còn bay hơi hết. Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này được dùng để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch 5 – 10 lần tùy theo nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít. + Bước 2: Thực hiện phản ứng màu bằng cách sử dụng thuốc thử là phenol Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi cho thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml acid H2SO4 đậm đặc vào 45 ống nghiệm (không để dính acid vào thành ống nghiệm). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 300C để hiện màu. + Xây dựng đồ thị chuẩn Lấy 7 bình định mức 100 ml cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1%, cho thêm nước đến vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml đã pha loãng cho vào ống nghiệm rồi nhuộm màu bằng phenol và H2SO4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose. Phải làm ống thử không với 1 ml nước cất thay thế dung dịch đường. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu bằng máy so màu ở bước sóng 490 nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không. Từ đó ta xây dựng một đường cong chuẩn. Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không rồi dựa vào đường cong chuẩn để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu. 3.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Nguyên liệu Quả xoan chịu hạn được thu hái từ cây 4 – 5 tuổi trồng tại Ninh Thuận, làm sạch vỏ và thịt hạt, sau đó phơi khô hạt trong bóng râm hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50 0C. Hạt được tách vỏ lấy nhân hạt để ép dầu. Thiết bị và hoá chất Máy ép dầu thực vật chuyên dụng KOMET Model D 85 – 1G (Đức). Máy cô quay chân không. Dung môi Êtanol. Cách tiến hành [9; 24] Nhân hạt xoan chịu hạn được ép lạnh trên máy ép dầu chuyên dụng Komet (Đức) ở nhiệt độ được khống chế từ 350C đến 450C, thu được dầu và bánh dầu. Bánh dầu (bã còn lại sau khi ép dầu) được cho ngấm kiệt và chiết xuất với ethanol nhằm tận thu các hoạt chất còn lại trong bánh dầu, đặc biệt là azadirachtin. Dịch chiết bánh dầu 46 được loại hết ethanol bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 500C và trộn với dầu, thu được dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin. (Hình 3.1) Hình 3.1: Qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn Hạt xoan chịu hạn Nhân hạt Tách vỏ Ép lạnh Bánh dầu Dầu Chiết bánh dầu với êtanol Dịch chiết Bỏ bã Cao chiết Cô quay chân không o Định lượng azadirachtin bằng HPLC o Tạo chế phẩm thử nghiệm trên sâu xanh Dầu xoan chịu hạn đã làm giàu azadirachtin 47 Hình 3.2: Máy Micro – Kjeldahl Hình 3.3: Máy cô quay chân không Hình 3.4: Lọc chân không Hình 3.5: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hình 3.6: Hệ thống Soxhlet Hình 3.7: Máy ép dầu chuyên dụng KOMET (Đức) 48 3.2.3 Phƣơng pháp định lƣợng azadirachtin bằng sắc ký lỏng cao áp (Hight Performance Lipuid Chromatography - HPLC) [24; 39; 45] Xử lý mẫu Cân 20 g hạt xoan chịu hạn, nghiền nhỏ thành bột mịn và chiết rút với 200 ml êtanol từ 1,5 – 2,0 giờ, lặp lại qui trình này 5 lần. Các dịch chiết được gom lại, cô trên máy cô quay chân không ở 500C còn 10 ml và được loại mở bằng n – hexan. Dịch sau khi loại mở được lọc qua màng lọc 0,45 m và xác định hàm lượng các hoạt chất trong dịch lọc trên HPLC. Cách tiến hành + Dựng đường chuẩn azadirachtin: Dựng đường chuẩn 5 điểm với chất chuẩn azadirachtin của hãng Sigma (loại 0,5 mg/ lọ). Xác định hệ số tương quan R. + Phân tích HPLC: Xác định hàm lượng azadirachtin, salanin và mimbin trong dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography với các thông số sau (Hình 3.5): o Cột phân tích: Bondapak C18, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 300 mm. o Cột bảo vệ: Bondapak TM C18, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 20 mm o Detector DAD: = 220 nm o Lượng mẫu bơm vào cột: 5 l o Tốc độ rửa cột: 0,5 ml/ phút o Dung môi rửa cột: Axêtonitril / H2O, (tỷ lệ 55 / 45) o Chất chuẩn: mimbin, salanin của hãng Trifolio – GmbH (Đức) và azadirachtin của hãng Sigma 3.2.4 Phƣơng pháp nuôi sâu xanh (H. armigera) trong phòng thí nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi trên môi trường nhân tạo ở điều kiện nhiệt độ phòng và độ ẩm là 75 – 85%. Bướm sâu xanh được nuôi trong lồng để kiểm tra khả năng đẻ trứng. Nắp lồng được bịt bằng một lớp vải màn để cho bướm sâu xanh đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và thay thức ăn cho bướm. Một hoặc hai ngày sau khi đẻ, trứng đổi thành màu nâu sẫm. Lúc này vải màn chứa trứng được cắt và xếp vào đĩa petri có sẵn thức ăn cho sâu non. Sâu tuổi 1 và đầu tuổi 2 được nuôi tập thể trong đĩa petri. Ở tuổi 2 sâu được tách ra nuôi cá thể. Thức ăn cần thay thường xuyên để đảm bảo sâu đủ khả năng vào nhộng [1]. 49 3.2.5 Phƣơng pháp đánh giá sự ảnh hƣởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin đối với sâu xanh (H. armigera) 3.2.5.1 Chế phẩm thử nghiệm Chế phẩm thử nghiệm được phối trộn giữa hai nguồn gốc là dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (Hình 3.2) và dung dịch Cypermethrin 20% (được pha loãng từ dung dịch 93% do công ty VIPESCO cung cấp). Bao gồm 16 chế phẩm được chuẩn bị (ở dạng tươi để dùng ngay) tại Viện Sinh học Nhiệt Đới như Bảng 3.1 Bảng 3.1 Công thức phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt neem và cypermethrin STT Công thức phối chế (Thể tích cuối: 100 ml) Thành phần chính (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (%, m/v) 1 C0D0 0 (0 ml)* 0 (0 ml)* 2 C0D1 0 (0 ml) 10 (10 ml) 3 C0D2 0 (0 ml) 20 (20 ml) 4 C0D3 0 (0 ml) 30 (30 ml) 5 C1D0 0,03 (0,15 ml) 0 (0 ml) 6 C1D1 0,03 (0,15 ml) 10 (10 ml) 7 C1D2 0,03 (0,15 ml) 20 (20 ml) 8 C1D3 0,03 (0,15 ml) 30 (30 ml) 9 C2D0 0,06 (0,30 ml) 0 (0 ml) 10 C2D1 0,06 (0,30 ml) 10 (10 ml) 11 C2D2 0,06 (0,30 ml) 20 (20 ml) 12 C2D3 0,06 (0,30 ml) 30 (30 ml) 13 C3D0 0,09 (0,45 ml) 0 (0 ml) 14 C3D1 0,09 (0,45 ml) 10 (10 ml) 15 C3D2 0,09 (0,45 ml) 20 (20 ml) 16 C 3D3 0,09 (0,45 ml) 30 (30 ml) (*) Lượng thể tích ml tương đương với trọng lượng g. 50 Trong đó: + C: Là cypermethrin (các chữ số 0, 1, 2, 3 theo sau tương ứng với hàm lượng cypermethrin trong chế phẩm lần lược là 0,00; 0,03; 0,06 và 0,09%). + D: Là dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (các chữ số 0, 1, 2, 3 theo sau tương ứng với hàm lượng dịch chiết nhân hạt neem trong chế phẩm lần lược là 0, 10, 20 và 30%). 3.2.4.2 Đối tƣợng thử nghiệm Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi bằng thức ăn nhân tạo ở lứa tuổi 2, được cung cấp bởi Tổ Công nghệ Sinh học Động vật - Viện Sinh học Nhiệt đới. 3.2.4.3 Phƣơng pháp thử nghiệm Cách tiến hành Vì sâu xanh có tập tính ăn lẫn nhau khi ở tuổi 2, nên phải bố trí mỗi con ở mỗi lọ riêng biệt.Thức ăn nhân tạo được quét lên thành các lọ nhựa đựng sâu, sau đó quét đều các dung dịch thí nghiệm lên bề mặt thức ăn, đợi cho thức ăn hơi khô ráo thì cho sâu tuổi 2 vào, đậy nắp lại. Ghi nhận số lượng sâu chết sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thiết kế theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các nghiệm thức bao gồm 16 chế phẩm được bố trí 5 nồng độ: 5%, 10%, 15%, 20%, 25% và đối chứng không xử lý. Phƣơng pháp xử lý số liệu [14; 15; 16]. Tính tỷ lệ chết của sâu sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày Đánh giá xếp hạng các nhóm chế phẩm và tìm hiểu tương tác giữa 2 yếu tố dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin thông qua phân tích biến lượng (ANOVA) và trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm Statgraphics 7.0 Tính giá trị độ độc trung bình (LC50 – 50% Lethal Concentration) của chế phẩm đối với sâu xanh theo phương pháp phân tích Probit, thao tác trên phần mềm Excell . 51 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh hóa trong lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số chỉ tiêu sinh hoá của lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn như: trọng lượng khô tuyệt đối, hàm lượng khoáng tổng số, hàm lượng lipid, hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng đường, hàm lượng xơ thô, hàm lượng canxi, hàm lượng phốt – pho theo các phương pháp được trình bày ở mục 3.2.1 và thu được kết quả như sau: 4.1.1 Các chỉ tiêu sinh hóa của lá xoan chịu hạn Bảng 4.1: Các chỉ tiêu sinh hoá của lá xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 50,00 49,60 49,00 49,53 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 9,27 9,51 9,16 9,31 3 Hàm lượng lipid (%) 5,10 4,90 4,70 4,90 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 25,63 23,44 23,75 24,27 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 7,55 7,20 7,15 7,30 6 Hàm lượng xơ thô (%) 10,95 10,88 10,69 10,84 7 Hàm lượng canxi (%) 0,02 0,03 0,02 0,02 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,14 0,16 0,16 0,15 Nhận xét: Lá xoan chịu hạn có hàm lượng khoáng và vật chất khô khá cao. Ở nhiều nơi, xoan chịu hạn góp phần cải thiện đất đai bằng con đường tuần hoàn sinh học. Lá xoan chịu hạn khi rụng xuống sẽ cung cấp mùn và khoáng chất cho đất, cải thiện pH ở những vùng đất phèn. Ngoài ra, lá xoan chịu hạn cũng có hàm lượng canxi, phốt – pho và đạm tương đối cao nên có thể là nguồn cung cấp các chất vi lượng cần thiết cho gia súc, là nguồn cung cấp thức ăn hiệu quả trong chăn nuôi. Nếu tận dụng làm phân bón, lá cây là nguồn bổ sung các chất khoáng dồi dào cho cây. Trong lá xoan chịu hạn cũng chứa các hoạt chất sinh học có khả năng phòng trừ sâu hại, do đó lá còn 52 được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu. Trong y học, lá cũng có nhiều ứng dụng như sản xuất các loại thuốc bôi da, thuốc sát trùng, thuốc giảm đau,... [23] 4.1.2 Các chỉ tiêu sinh hoá của bánh dầu Bảng 4.2: Các chỉ tiêu sinh hoá của bánh dầu xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 12,20 13,50 11,50 12,40 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 10,50 9,85 10,80 10,38 3 Hàm lượng lipid (%) 6,90 6,45 6,15 6,50 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 43,13 45,31 44,31 44,25 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 8,60 8,25 9,05 8,63 6 Hàm lượng xơ thô (%) 10,25 9,85 10,05 10,05 7 Hàm lượng canxi (%) 0,00 0,02 0,013 0,01 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,39 0,45 0,52 0,45 Nhận xét: Với hàm lượng phốt – pho 0,45%, hàm lượng đạm tổng số 44,25% và hàm lượng các chất khoáng, đường tổng số khá cao, bánh dầu xoan chịu hạn là một trong những nguồn phân hữu cơ lý tưởng, vừa góp phần cung cấp dinh dưỡng cho cây, duy trì và cải thiện độ phì của đất vừa giải quyết được vấn đề chất thải cho ngành công nghiệp ép dầu. Ngoài ra, bánh dầu xoan chịu hạn còn là nguồn thức ăn lý tưởng cho gia súc. 4.1.3 Các chỉ tiêu sinh hóa của nhân hạt xoan chịu hạn Bảng 4.3: Các chỉ tiêu sinh hóa của nhân hạt xoan chịu hạn Stt Các chỉ tiêu Lần lặplại Trung bình I II III 1 Trọng lượng khô tuyệt đối (%) 4,50 4,50 4,02 4,34 2 Hàm lượng khoáng tổng số (%) 9,05 8,86 9,53 9,15 3 Hàm lượng lipid (%) 33,75 31,20 31,80 32,25 4 Hàm lượng đạm tổng số (%) 32,81 31,88 30,63 31,77 5 Hàm lượng đường tổng số (%) 7,25 7,45 7,06 7,25 6 Hàm lượng xơ thô (%) 9,35 8,40 8,60 8,78 7 Hàm lượng canxi (%) 0,025 0,012 0,01 0,02 8 Hàm lượng phốt – pho (%) 0,41 0,38 0,43 0,41 53 Nhận xét: So với lá thì nhân hạt xoan chịu hạn chứa hàm lượng lipid khá cao (32,25%), nên xoan chịu hạn có thể là một trong những cây cung cấp dầu béo cho các ngành công nghiệp khi được trồng với số lượng lớn và cho năng suất ổn định. Ngày nay, người ta thường sử dụng dầu xoan chịu hạn để sản xuất dầu bôi trơn, thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, sản xuất mỹ phẩm và nhiếu ứng dụng khác trong y học. Bên cạnh đó, dầu xoan chịu hạn chứa nhiều azadirchtin, salanin và nimbin là những hoạt chất có tác dụng phòng trị nhiều loại côn trùng khác nhau nên nhân hạt xoan chịu hạn có thể được dùng để sản xuất thuốc trừ sâu, nấm hại cây trồng. Ở một số nơi, người nông dân còn sử dụng nhân hạt xoan chịu hạn đã được xay nhỏ, ngâm với nước, sau đó đem phun trực tiếp lên rau xanh hoặc hoa màu, vừa phòng trừ sâu hại vừa cung cấp khoáng chất và thức ăn cho cây. Nhân hạt xoan chịu hạn cũng được xay nhỏ để làm thức ăn cho gia súc, vì có hàm lượng đạm tổng số khá cao (trung bình 31,77%). Kết quả thu được phù hợp với những nghiên cứu đã được công bố trước đây [23]. 4.2 Kết quả ép dầu xoan chịu hạn bằng máy KOMET Bảng 4.4: Kết quả ép dầu xoan chịu hạn bằng máy Komet Lần ép Lượng nhân hạt ép (kg) Lượng dầu thu được (kg) Lượng bánh dầu (kg) Nhiệt độ ép Lần ép I 7,1 2,8 (39,44%) 4,3 (60,54%) 400C Lần ép II 8,0 2,7 (33,75%) 5,3 (66,25%) 400C Lần ép III 1,5 0,45 (31,0%) 1,0 (69,00%) 400C Tổng cộng 16,6 5,95 (34,73%) 10,6 (65,27%) 400C Nhận xét: Qua ba lần ép nhân hạt xoan chịu hạn bằng máy ép dầu KOMET (Đức), với mỗi đợt ép từ 1,5 đến 8,0 kg nhân, chúng tôi nhận được kết quả sau: tỷ lệ ép dầu đạt từ 31,0% đến 39,44% (trung bình: 34,73%); bánh dầu từ 60,54% đến 69% (trung bình: 65,27%). Tỷ lệ dầu ép trung bình 34,73% và lượng bánh dầu trung bình thu được 65,27% là phù hợp với các số liệu đã được thông báo [22]. Sự dao động của tỷ lệ dầu và bánh dầu qua các lần ép là do ảnh hưởng của chất lượng hạt (hạt mới hoặc hạt cũ) và ẩm độ của hạt. Tỷ lệ hao hụt qua ba lần ép là không đáng kể. 4.3 Kết quả định lƣợng azadirachtin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tiến hành định lượng azadirachtin trong dịch chiết nhân bánh dầu bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) theo phương pháp và vật liệu tiến hành đã được trình bày ở phần 3.3.2, thu được kết quả sau (xem phụ lục 1): 54 (a) (b) Hình 4.1: Kết quả định lƣợng Azadirachtin trên sắc ký HPLC (a) Sắc ký đồ của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn. (b) Sắc ký đồ của chất chuẩn Từ kết quả phân tích HPLC, tính được hàm lượng các hoạt chất có trong 1 kg nhân hạt xoan chịu hạn như sau: trong 1 kg nhân hạt xoan chịu hạn chứa 2221 ppm (mg) azadirachtin; 74 ppm (mg) salannin và 26 ppm (mg) nimbin. Kết quả này phù hợp với các số liệu nghiên cứu đã được công bố trước đây [24]. Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng azadirachtin và cypermethrin trong từng chế phẩm thử nghiệm, kết quả được trình bày trong bảng 4.5: Bảng 4.5: Hàm lƣợng azadirachtin và cypermethrin trong chế phẩm Stt Chế phẩm Thành phần Stt Chế phẩm Thành phần Azadirachtin (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) Azadirrachtin (%, m/v) Cypermethrin (%, m/v) 1 C0D0 0 0 9 C0D2 3,34 0 2 C1D0 0 0,03 10 C1D2 3,34 0,03 3 C2D0 0 0,06 11 C2D2 3,34 0,06 4 C3D0 0 0,09 12 C3D2 3,34 0,09 5 C0D1 1,67 0 13 C0D3 5,00 0 6 C1D1 1,67 0,03 14 C1D3 5,00 0,03 7 C2D1 1,67 0,06 15 C2D3 5,00 0,06 8 C3D1 1,67 0,09 16 C3D3 5,00 0,09 55 4.4 Kết quả đánh giá sự ảnh hƣởng của chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin trên sâu xanh. Sau khi tiến hành thử nghiệm 16 chế phẩm được phối trộn từ dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin (Bảng 3.1) lên sâu xanh (Heliothis armigera) tuổi 2. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết của sâu sau 6 ngày, thu được kết quả sau (Bảng 4.6): Bảng 4.6: Tỷ lệ chết (%) sâu xanh (H. armigera) sau 6 ngày thử nghiệm chế phẩm Stt Chế phẩm Nồng độ thử nghiệm của các chế phẩm (%) 5% 10% 15% 20% 25% 1 C0D0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 C1D0 30,00 33,33 46,67 50,00 53,33 3 C2D0 40,00 50,00 53,33 56,67 63,33 4 C3D0 43,33 46,67 53,33 56,67 66,67 5 C0D1 40,00 46,67 53,33 56,67 63,33 6 C1D1 43,33 53,33 60,00 66,67 73,33 7 C2D1 50,00 53,33 56,67 66,67 70,00 8 C3D1 60,00 63,33 66,67 76,67 83,33 9 C0D2 53,33 60,00 66,67 73,33 76,67 10 C1D2 66,67 70,00 76,67 83,33 86,67 11 C2D2 70,00 80,00 83,33 86,67 93,33 12 C3D2 86,67 90,00 93,33 96,67 100 13 C0D3 66,67 70,00 76,67 83,33 90,00 14 C1D3 73,33 80,00 83,33 86,67 90,00 15 C2D3 80,00 83,33 86,67 90,00 93,33 16 C3D3 86,67 93,33 93,33 96,67 96,67 Trên cơ sở tỷ lệ chết (%) sâu thu được sau 6 ngày theo dõi, chúng tôi tiến hành phân tích Probit bằng phần mềm Excel để xác định LC50 và độ độc tương đối của các chế phẩm thử nghiệm, thu được kết quả sau (Bảng 4.7 và phụ lục 2 ): 56 Bảng 4.7: Kết quả phân tích Probit và LC50 của các chế phẩm thử nghiệm Stt Chế phẩm Phương trình tương quan Hệ số tương quan (R) Mức ý nghĩa (F) LC50 (%) Độ độc tương đối(*) 1 C1D0 y = 0,9376x + 3,7623 0,9590 0,0099 20,8978 0,54 2 C2D0 y = 0,7807x + 4,1965 0,9840 0,0024 10,6955 1,06 3 C3D0 y = 0,7484x + 4,2496 0,9586 0,0101 10,0624 1,12 4 C0D1 y = 0,8123x + 4,1447 0,9818 0,0029 11,2954 1 5 C1D1 y = 1,0914x + 4,0262 0,9847 0,0023 7,8019 1,45 6 C2D1 y = 0,7521x + 4,4022 0,9181 0,2780 6,2345 1,81 7 C3D1 y = 0,9552x + 4,4780 0,8903 0,0429 3,5197 3,21 8 C0D2 y = 0,9349x + 4,3805 0,9789 0,0034 4,5983 2,46 9 C1D2 y = 0,9823x + 4,6564 0,9441 0,0157 2,2331 5,06 10 C2D2 y = 1,2339x + 4,6116 0,9511 0,0129 2,0644 5,47 11 C3D2 y = 1,817x + 4,6336 0,8671 0,049 1,5911 7,1 12 C0D3 y = 1,1405x + 4,5138 0,9135 0,0301 2,6687 4,23 13 C1D3 y = 0,8983x + 4,9623 0,9829 0,0027 1,1015 10,25 14 C2D3 y = 0,8864x + 5,151 0,9441 0,0157 0,6755 16,72 15 C3D3 y = 1,0476x + 5,3881 0,9609 0,0092 0,4261 26,51 (*) Độc tính tương đối được tính trên nghiệm thức C0D1 (chỉ sử dụng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10%). Nhận xét: Ngoài nghiệm thức C0D0 (đối chứng trắng) không gây chết sâu xanh tuổi 2 ở tất cả các ngày theo dõi, các nghiệm thức còn lại sau 1 đến 3 ngày thử nghiệm đã có tác dụng gây chết sâu xanh, tuy nhiên hiệu quả không cao. Sau 4 – 5 ngày, hiệu lực gây chết của các chế phẩm tăng dần và đạt mức cao nhất vào ngày thứ 6. Do đó, chúng tôi 57 tập trung đánh giá hiệu quả gây chết sâu xanh sau 6 ngày thử ngiệm chế phẩm. Các kết quả cho thấy: Trong dãy nồng dộ thử nghiệm (5, 10, 15, 20 và 25%), hiệu lực gây chết sâu xanh (H. armigera) của mỗi chế phẩm tăng dần theo sự gia tăng nồng độ của chế phẩm trong dung dịch thử nghiệm. Khi tăng nồng độ thử nghiệm từ 5% lên 25%, tỷ lệ chết của sâu xanh tăng nhiều nhất ở nghiệm thức C2D1 (tăng 30%), các nghiệm thức còn lại tăng từ 13,33% đến 23,33%. Riêng nghiệm thức C3D3 có tỷ lệ chết tăng ít nhất (10%) và nghiện thức C0D0 (đối chứng trắng) không gây chết sâu ở cả 5 nồng độ thử nghiệm (tỷ lệ chết sau 6 ngày là 0%) (Bảng 4.6). Qua kết quả phân tích Probit (Bảng 4.7) cho thấy, độ độc của các chế phẩm đối với sâu xanh (H. armigera) tăng dần theo sự gia tăng nồng độ của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và Cypermethrin trong các chế phẩm. Các giá trị LC50 thấp nhất: 0,4261; 0,6755; 1,1015 và 1,5911% biểu hiện độc tính mạnh nhất của 4 chế phẩm tương ứng là C3D3 > C2D3 > C1D3 > C3D2 (có sự phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 20 – 30% và cypermethrin ở nồng độ 0,03 – 0,09%). Độc tính của các chế phẩm này mạnh hơn so với chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10% (nghiệm thức C0D1) tương ứng 26,5; 16,72; 10,25 và 7,1 lần. Kết quả phân tích cũng cho thấy cypermethrin ở các nồng độ 0,03; 0,06 và 0,09% tương ứng với các nghiệm thức C1D0, C2D0, và C3D0, có độ độc chỉ bằng 0,54; 1,06 và 1,12 lần so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10%. Các nghiệm thức phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 10% và cypermethrin ở nồng độ 0,03 – 0,06% (tương ứng với các nghiệm thức C1D1, C2D1) có độ độc chỉ bằng 1,45 và 1,81 lần so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10%. Các nghiệm thức phối hợp còn lại có độ độc tương đối mạnh hơn so với nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (nồng độ 10%) từ 2,46 đến 5,47 lần. Mạnh nhất là các nghiệm thức có sự phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 20 - 30% và cypermethrin ở nồng độ 0,09% (các nghiệm thức C3D2 và C3D3), độ độc tương đối của các chế phẩm này so với chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10% lần lược là 26,5 và 16,72 lần. Vì việc phân tích Probit bằng phần mềm Excel và phân tích biến lượng (ANOVA) trên phần mềm Statgraphics cho kết quả tương tự nhau, nên bên cạnh việc 58 phân tích Probit để xác định LC50 của các chế phẩm, chúng tôi tiến hành bắt cặp một số nghiệm thức để phân tích trên phần mềm Statgraphit 7.0 nhằm so sánh hiệu quả gây chết sâu xanh giữa các chế phẩm có sự phối trộn dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin với các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn hoặc cypermethrin, từ đó đưa ra công thức phối trộn tối ưu nhất, kết quả được trình bày ở các Bảng 4.8 và Bảng 4.9 (xem phần phụ lục 3, 4 và 5): Đầu tiên, chúng tôi tiến hành bắt cặp các nghiệm thức chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở các nồng độ khác nhau (C0D0, C0D1, C0D2, C0D3), sau đó tiếp tục bắt cặp các nghiệm thức chỉ chứa cypermethrin ở các nồng độ khác nhau (C0D0, C1D0, C2D0, C3D0). Ở cả hai trường hợp, tỷ lệ chết sâu được tính sau 5 ngày theo dõi và ở nồng độ thử nghiệm 25% (ở nồng độ 25%, khả năng gây chết sâu xanh của các chế phẩm trong cùng một nhóm có sự khác biệt rõ ràng nhất), sau khi phân tích trên phần mềm Statgraphics 7.0, thu được kết quả sau (Bảng 4.8): Bảng 4.8: Tỷ lệ gây chết sâu xanh (H. armigera) của các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và của các chế phẩm chỉ chứa Cypermethrin sau 5 ngày thử nghiệm ở nồng độ 25%. Các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết neem Các chế phẩm chỉ chứa Cypermethrin Stt Công thức phối chế Tỷ lệ chết của sâu xanh (%) Stt Công thức phối chế Tỷ lệ chết của sâu xanh (%) 1 C0D0 00,00c (*) 1 C0D0 00,00b (*) 2 C0D1 53,33b 2 C1D0 50,00a 3 C0D2 70,00ab 3 C2D0 56,67a 4 C0D3 83,33a 4 C3D0 63,33a (*) Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở P<0,05. Chúng tôi cũng đã bắt cặp một số nghiệm thức có sự phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin ở các nồng độ khác nhau để phân tích nhằm đánh giá hiệu quả gây chết sâu xanh của các chế phẩm phối trộn, tỷ lệ chết của sâu xanh được theo dõi sau 6 ngày thử nghiệm, ở nồng độ xử lý 25%, thu được kết quả sau (Bảng 4.9): 59 Bảng 4.9: Tỷ lệ gây chết sâu xanh (H. armigera) của các chế phẩm có sự phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoa chịu hạn và cypermethrin sau 6 ngày thử nghiệm ở nồng độ 25%. (*) Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở P<0,05. Nhìn chung, kết quả phân tích Statgraphit cũng tương tự kết quả phân tích Probit, các kết quả cho thấy: Chế phẩm chỉ chứa cypermethrin: Tương ứng với các nghiệm thức: C1D0, C2D0, C3D0 có khả năng gây chết sâu xanh tuổi 2 ở các mức độ khác nhau tuỳ theo hàm lượng cypermethrin trong mỗi chế phẩm và tuỳ theo nồng độ xử lý (Đồ thị 4.1). Trong phạm vi thử nghiệm, từ nồng độ 0,03 – 0,09% (tương ứng với các chế phẩm C1D0, C2D0 và C3D0 có hàm lượng cypermethrin lần lược là 0,03; 0,06 và 0,09 mg), tỷ lệ chết của sâu xanh sau 5 và 6 ngày đều tăng 13,33% ở nồng độ xử lý 25% (Bảng 4.8 và 4.9). Trong dãy nồng độ xử lý từ 5% đến 25%, chế phẩm C1D0 (chứa 0,03 mg cypermethrin) có khả năng gây chết từ 30 – 53,33% cá thể sâu xanh, trong khi chế phẩm C2D0 (chứa 0,06 mg cypermethrin) và C3D0 (chứa 0,09 mg cypermethrin) có khả năng gây chết sâu xanh tương ứng từ 40 – 63,66% và 43,33 – 66,67% số cá thể sâu xanh. Điều này chứng tỏ, trong cùng một chế phẩm, tỷ lệ chết của sâu xanh tăng theo hàm lượng cypermethrin trong chế phẩm thử nghiệm, hay nói một cách khác, tỷ lệ gây chết của xanh tăng khi tăng nồng độ xử lý chế phẩm. Stt Công thức phối chế Tỷ lệ chết của sâu xanh (%) Stt Công thức phối chế Tỷ lệ chết của sâu xanh (%) 1 C0D0 00,00d (*) 6 C1D1 73,33abc 2 C1D0 53,33c 7 C0D2 76,67ab 3 C0D1 63,33bc 8 C0D3 90,00a 4 C2D0 63,33bc 9 C2D2 93,33a 5 C3D0 66,67bc 10 C3D3 93,33a 60 30 40 4 3. 33 33 .3 3 50 46 .6 7 46 .6 7 53 .3 3 53 .3 3 50 56 .6 7 56 .6 7 53 .3 3 63 .3 3 66 .6 7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 C1D0 C2D0 C3D0 Chế phẩm Tỷ lệ ch ết (% ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.1: Tỷ lệ gây chết sâu xanh sau 6 ngày xử lý bằng các chế phẩm chỉ chứa cypermethrin. Chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn: Tương ứng với các nghiệm thức C0D1, C0D2, C0D3 cho thấy hiệu lực gây chết sâu xanh cũng tăng theo hàm lượng của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn trong chế phẩm (Đồ thị 4.2). Trong phạm vi thử nghiệm, từ nồng độ 10 – 30% (hàm lượng azadirachtin tương ứng từ 167 – 500 mg), sau 5 ngày thử nghiệm ở nồng độ xử lý 25%, tỷ lệ gây chết sâu tăng 30% (Bảng 4.8) và sau 6 ngày xử lý ở nồng độ 25%, tỷ lệ gây chết sâu tăng 26,67% (Bảng 4.9). Đối với chế phẩm C0D1 (có hàm lượng azadirachtin là 167 mg), khi nồng độ xử lý tăng từ 5% đến 25% thì tỷ lệ gây chết sâu xanh tăng từ 40 – 63,33%, còn đối vói các chế phẩm C0D2 và C0D3 (chứa hàm lượng azadirachtin tương ứng 434 và 500 mg) có tỷ lệ chết của sâu xanh tăng từ 53,33 – 76,67% và 66,67 – 90% khi tăng nồng độ xử lý từ 5% - 25% (Đồ thị 4.2). Điều này cho thấy, hiệu lực gây chết sâu xanh của các chế phẩm này cũng tăng theo nồng độ xử lý chế phẩm. Nhìn chung, chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn hoặc cypermethrin đều có tác dụng gây chết sâu xanh. Điều này phù hợp với các kết quả đã được công bố [6]. Tuy nhiên, chỉ những chế phẩm chứa hàm lượng cypermethrin và dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn cao nhất mới cho hiệu quả gây chết sâu xanh rõ rệt. Chế phẩm C3D0 và C0D3 gây chết sâu xanh tương ứng 66,67% và 90% ở nồng độ xử lý 25% sau 6 ngày. 61 40 53 .3 3 66 .6 7 46 .6 7 60 70 53 .3 3 66 .6 7 76 .6 7 56 .6 7 7 3. 33 83 .3 3 63 .3 3 76 .6 7 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C0D1 C0D2 C0D3 Chế phẩm Tỷ lệ c hế t ( % ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.2: Tỷ lệ gây chết sâu xanh sau 6 ngày xử lý bằng các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn. Chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin: Tương ứng với các nghiêm thức C1D1, C1D2, C1D3, C2D1, C2D2, C2D3, C3D1, C3D2, và C3D3 có hiệu lực gây chết sau xanh tuổi 2 sau 6 ngày thử nghiệm ở các mức độ khác nhau (Đồ thị 4.3 và Bảng 4.8) . Trong đó, chế phẩm C3D2 có hàm lượng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 20% phối trộn với cypermethrin 0,09% (tương ứng với 434 mg azadirachtin và 0,09 mg cypermethrin) gây chết 100% cá thể sâu xanh khi xử lý ở nồng độ 25%. Các chế phẩm C1D3, C2D3, và C3D3 chứa hàm lượng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 30% (tương ứng với 500 mg azadirachtin), phối trộn với cypermethrin cũng gây chết cao đối với sâu xanh, tỷ lệ chết sâu trung bình sau 6 ngày thử nghiệm đạt 93,4% ở nồng độ xử lý 25% và đạt 80% ở nồng độ xử lý 5%. Chế phẩm chứa hàm lượng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn 10% (tương ứng với 167 mg azadirachtin) phối trộn với cypermethrin (C1D1, C2D1 và C3D1) có hiệu lực gây chết sâu không cao, tỷ lệ chết sâu trung bình sau 6 ngày thử nghiệm chế phẩm ở nồng độ xử lý 25% đạt 75,5% và ở nồng độ xử lý 5% đạt 51,11%. Thử nghiệm cũng cho thấy rằng, dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ cao (chế phẩm C0D3) - chứa 30% dịch chiết (tương ứng 500 mg azadrrachtin), nhưng 62 không phối trộn với cypermethrin cũng như cypermethrin ở nồng độ cao (chế phẩm C3D0, có hàm lượng cypermethrin 0,09 mg) nhưng không phối hợp với dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn, có hiệu lực gây chế sâu xanh không cao. Cụ thể, trong dãy nồng độ xử lý (từ 5% đến 25%) tỷ lệ gây chết sâu xanh của chế phẩm C0D3 tương ứng từ 66,67% đến 90% (Đồ thị 4.2) và của chế phẩm C3D0 tương ứng từ 43,33% đến 66,67% (Đồ thị 4.1). Trong khi đó, các chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ở nồng độ 20% (tương ứng với 434 mg azadirachtin) với cypermethrin ở nồng độ 0,06 – 0,09% (chế phẩm C2D2 và C3D2) có hiệu lực cao đối với sâu xanh. Đặc biệt là chế phẩm C3D2 – gây chết 100% cá thể sâu xanh ở nồng độ xử lý 25% và đạt tỷ lệ chết 86,67% cá thể ở nồng độ xử lý 5%. Nhìn chung, các chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin có hiệu lực gây chết sâu xanh cao hơn so với các chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn hoặc cypermethrin, biểu hiện rõ nhất ở nồng độ xử lý thấp (5%). Ở nồng độ xử lý 5%, tỷ lệ gây chết sâu của chế phẩm C3D0 là 43,33%, của chế phẩm C0D3 là 66,67% và của chế phẩm C3D3 là 86,67%. Sự gia tăng hiệu lực gây chết nói trên cho thấy sự phối trộn dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn với cypermethrin đã làm tăng hiệu lực diệt sâu của chế phẩm. 43 .3 3 50 60 66 .6 7 70 86 .6 7 73 .3 3 80 86 .6 7 53 .3 3 53 .3 3 63 .3 3 70 80 90 80 8 3. 33 9 3. 33 60 56 .6 7 66 .6 7 76 .6 7 83 .3 3 93 .3 3 83 .3 3 86 .6 7 93 .3 3 66 .6 7 66 .6 7 76 .6 7 83 .3 3 86 .6 7 96 .6 7 86 .6 7 90 96 .6 7 73 .3 3 70 83 .3 3 86 .6 7 93 .3 3 10 0 90 9 3. 33 96 .6 7 0 20 40 60 80 100 120 C1D1 C2D1 C3D1 C1D2 C2D2 C3D2 C1D3 C2D3 C3D3 Chế phẩm Tỷ lệ ch ết (% ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.3: Tỷ lệ gây chết sâu xanh sau 6 ngày xử lý bằng các chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin. 63 Dựa vào các kết quả đã phân tích ở trên và Đồ thị 4.3 cho thấy, chế phẩm phối trộn C2D2 và C3D2 có hiệu lực gây chết cao tương đương các chế phẩm C1D3, C2D3 và C3D3 ngay ở nồng độ xử lý 5%, nhưng có hàm lượng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ít hơn. Do vậy, hai chế phẩm này có ý nghĩa về mặt kinh tế, và phù hợp với thực tiển sản xuất hơn cả. Các Đồ thị 4.4, 4.5, 4.6, và 4.7 biểu hiện động thái gây chết sâu xanh của các chế phẩm C3D0, C0D3, C2D3 và C3D2 theo thời gian. Đồ thị 4.4 và 4.5 cho thấy, dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn (hàm lượng 30%, tương ứng 500 mg azadirachtin) gây chết sâu xanh nhanh hơn cypermethrin (hàm lượng 0,09 mg). Cụ thể, sau 6 ngày xử lý, dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn gây chết từ 66,67 – 90% số cá thể sâu xanh, trong khi đó cypermethrin chỉ gây chết từ 43,33 – 66,67% số cá thể. Tuy nhiên, ở những ngày đầu xử lý, hiệu quả diệt sâu của hai loại chế phẩm này tương đương nhau, điều này có thể là do dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn có tác dụng chậm và ngoài tác dụng gây chết , dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn còn có khả năng gây ngán ăn đối với sâu xanh. Các Đồ thị 4.6 và 4.7 cho thấy, các chế phẩm có sự phối hợp giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin ở mức cao như C3D2 và C2D3 có khả năng gây chết sâu xanh nhanh và mạnh hơn nhiều so với khi chỉ sử dụng dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn hay cypermethrin (dù ở nồng độ cao nhất - chế phẩm C0D3 và C3D0). Chỉ sau hai ngày xử lý, các chế phẩm này đã có thể gây chết từ 26,67 – 56,67% số cá thể sâu xanh và sau 6 ngày xử lý, tỷ lệ chết đạt từ 86,67 – 100% đối với chế phẩm C3D2 và từ 80 – 93,33% đối với chế phẩm C2D3. 0 20 30 43.33 46.67 33.33 43.33 53.33 36.67 56.67 36.67 56.67 66.67 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Thời gian Tỷ lệ ch ết (% ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% 64 Đồ thị 4.4: Tỷ lệ gây chết sâu xanh theo thời gian sau khi xử lý chế phẩm C3D0 0 30 50 66.67 33.33 53.33 70 53.33 66.67 76.67 46.67 76.67 83.33 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Thời gian Tỷ lệ c hế t ( % ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.5: Tỷ lệ gây chết sâu xanh theo thời gian sau khi xử lý chế phẩm C0D3 0 33.33 53.33 86.67 30 63.33 90 43.33 70 93.33 56.67 83.33 100 0 20 40 60 80 100 120 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Thời gian T ỷ lệ c hế t ( % ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.6: Tỷ lệ gây chết sâu xanh theo thời gian sau khi xử lý chế phẩm C3D2 65 0 30 46.67 80 26.67 53.33 83.33 33.33 60 86.67 40 63.33 90 43.33 70 93.33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Thời gian Tỷ lệ ch ết (% ) Nồng độ 5% Nồng độ 10% Nồng độ 15% Nồng độ 20% Nồng độ 25% Đồ thị 4.7: Tỷ lệ gây chết sâu xanh theo thời gian sau khi xử lý chế phẩm C2D3 Hình 4.2 Tác động gây chết sâu Hình 4.3: Tác động gây chết sâu xanh của chế phẩm C2D2 xanh của chế phẩm C3D2 Hình 4.4: Tác động gây chết sâu Hình 4.5: Đối chứng sâu xanh xanh của chế phẩm C3D3 66 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã xác định được một số chỉ tiêu sinh hoá của lá, bánh dầu và nhân hạt xoan chịu hạn. So với lá và bánh dầu thì nhân hạt xoan chịu hạn có hàm lượng lipid cao nhất (32,25%), trong khi đó, bánh dầu có hàm lượng đạm tổng số cao nhất (44,25%) và lá có hàm lượng xơ thô (10,84%) và trọng lượng khô tuyệt đối (49,53%) cao nhất. Đã xây dựng được qui trình chiết xuất thô các hoạt chất sinh học trong nhân hạt xoan chịu hạn (Xem hình 3.2). Xác định được hàm lượng azadirachtin, salannin và nimbin trong các chế phẩm thử nghiệm bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Xác định được giá trị LC50 của các chế phẩm, trong đó các chế phẩm C3D3, C2D3, C1D3, và C3D2 biểu hiện độc tính mạnh nhất với các giá trị LC50 tương ứng là: 0,4261; 0,6755; 1,1015 và 1,5911%. Đánh giá được hiệu quả diệt sâu của các chế phẩm phối trộn từ dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin đối với sâu xanh (H. armigera) tuổi 2, trong đó: - Hiệu quả gây chết sâu xanh của chế phẩm chỉ chứa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn mạnh hơn chế phẩm chỉ chứa cypermethrin. - Hiệu quả gây chết sâu xanh của các chế phẩm phối trộn giữa cypermethrin và dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn nhanh và mạnh hơn các chế phẩm chỉ sử dụng cypermethrin hoặc dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn. - Các chế phẩm phối trộn giữa dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn và cypermethrin có tác động chậm, đòi hỏi phải có một thời gian nhất định để đạt hiệu lực gây chết tốt nhất. - Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn ngoài tác dụng gây chết sâu xanh, còn có khả năng gây ngán ăn và xua đuổi. - Các chế phẩm C2D2 và C3D2 có hiệu quả nhất về mặt kinh tế cũng như ý nghĩa phòng trừ sâu bệnh. 67 5.2 Đề nghị Trong phạm vi khoá luận này chúng tôi chỉ khảo sát tỷ lệ gây chết của chế phẩm thử nghiệm đối với sâu xanh (H. armigera), cần khảo sát thêm các tác động đặc trưng khác của dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn như: gây ngán ăn, tác động xua đuổi, khả năng là giảm sức sinh sản và gây vô sinh, khả năng gây biến dị di truyền,... Tiếp tục nghiên cứu và thử nghiệm khả năng gây chết của chế phẩm đối với sâu xanh trên qui mô đồng ruộng, cũng như trên các đối tượng khác như: sâu tơ (Plutella xylostella) và Artemia salina,... Khảo sát một số chất phụ gia có tác dụng làm tăng tính ổn định của sản phẩm như: chất nhủ hoá, chất chống oxy hoá... 68 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt 1. Trần Hồng Anh, 2003. Nghiên cứu khả năng phòng trừ một số loài sâu hại nông nghiệp của dịch chiết từ cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A. Juss). Khóa luận cử nhân sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Phạm văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh, 2000. Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp; trang 101 – 102. 3. Nguyễn Hữu Bình, 1994. Sâu xanh (Heliothis armigera) hại Bông và một số vấn đề cần lưu ý trong phòng trừ. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật 3/1994; trang 35 – 37. 4. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh và Văn Đức Chín, 2000. Thực tập lớn sinh hóa. Tủ sách Đại Học Khoa học Tự Nhiên Tp. HCM. 5. Lâm Công Định, 1991. Giới thiệu cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) nhập nội vào vùng cát nóng hạn Phan Thiết – Tuy Phong. Sở Nông – Lâm nghiệp Thuận Hải. 6. Vũ Văn Độ, Vũ Đănh Khánh và Nguyễn Tiến Thắng, 2005. Hiệu quả gây chết của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt (Bacillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu tơ (Plutella xylostella). Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5: trang 340 – 346. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 7. Trương Thanh Giản, 1995. Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Nguyễn Thị Minh Hà, 2002. Chiết xuất và khỏa sát hoạt tính ức chế sinh trưởng của dịch chiết từ nhân hạt cây (Azadirachta indica) trồng tại Việt Nam lên vi nấm Alternaria sp. và Fusarium oxysporum gây bệnh ở thực vật. Khóa luận cử nhân khoa học Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp. HCM. 9. Nguyễn Ngọc Hạnh, 2002. Tách chiết và cô lập các hợp chất tự nhiên. Giáo trình cao học, Bộ môn Hóa Hữu cơ - Trường Đại học Cần Thơ. 10. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật Sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 156 – 158. 11. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 115 – 117. 69 12. Hutchinson J., 1975. Những họ thực vật có hoa, tập I. Nguyễn Thạch Bích, Vũ Văn Chuyên, Vũ Văn Dũng, Lê Văn Quỳ, Trịnh Văn Thanh dịch. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 368 – 369. 13. Vũ Đăng Khánh, 2004. Khảo sát hoạt tính kháng một số loài nấm gây bênh cây và nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin của sản phẩm chiết xuất từ cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Sinh học. Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ CHí Minh. 14. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Thống kê học ứng dụng – Các kiểu mẫu thí nghiệm. Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Thực hành các kiểu mẫu thí nghiệm trên phần mềm Statgraphics. Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 16. Nguyễn Ngọc Kiểng, 1996. Thống kê học trong nghiên cứu khoa học. Nhà xuất bản Giáo Dục. 17. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực tập Sinh hóa. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 46 – 48 18. Lê Thị Thanh Phượng, 2004. Chiết xuất hoạt chất sinh học từ nhân hạt Neem (Azadirachta indica A.Juss) và khảo sát tác động của chúng đối với Ngài gạo (Corcyra cephalonica St). Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông Nghiệp. Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 19. Vũ Ngọc Phượng, Phạm Đức Trí, Thái Xuân Du và Nguyễn Văn Uyển, 2001. Nhân giống in vitro cây xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A.Juss). Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1999 – 2000 Viện Sinh học Nhiệt đới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 20. Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Kim Linh, Thái Xuân Du và Akiko Hirano, 2001. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem lên sự phát triển của Bọ hà (Cyclas formicarius f.) trên ruộng trồng khoai lang (Ipomoea batatas L.). Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1999 – 2000 Viện Sinh học Nhiệt đới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 21. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng và Akiko Hirano, 2001. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem lên sự ký sinh của Bọ hà (Cyclas formicarius f.) trưởng thành trong củ khoai lang (Ipomoea batatas L.). Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ 1999 – 2000, Viện Sinh học Nhiệt đới. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 141 – 147. 22. Nguyễn Tiến Thắng, Vũ Văn Độ, Đỗ Thị Tuyến, Lê Thị Thanh Phượng và Vũ Đăng Khánh, 2003. Xây dựng qui trình chiết xuất hoạt chất sinh học từ hạt neem (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam và khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng của vi nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum, Alternaria sp.) 70 và Ngài gạo (Corcyra cephalonica st.). Báo cáo đề tài cấp cơ sở - Viện Sinh học Nhiệt đới. 23. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Văn Uyển và những người khác, 2004. Hoàn thiện công nghệ nhân nhanh in vitro và triển khai trồng thử nghiệm đại trà cây hồng (Paulownia), xoan chịu hạn (Azadirachta indica) và cây điều (Anacardium occidentale L.). Báo cáo nghiệm thu đề tài Nghiên cứu khoa học trọng điểm cấp Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam. 24. Nguyễn Tiến Thắng và những người khác, 2003. Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) trồng tại Việt Nam. Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp nhà nước theo Nghị định thư. 25. Nguyễn Thị Thủy, 2002. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết từ hạt neem lên sự sinh trưởng của rầy nâu (Nilapartvata lugens stal.) và Ngài gạo (Corcyra cephalonica st.).Khóa luận cử nhân sinh học, Trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh, 69 trang. 26. Dương Anh Tuấn và những người khác, 2001. Azadirachtin - Hoạt chất gây ngán ăn mạnh đối với sâu khoang và được phân lập từ hạt neem (Azadirachta indica họ Meliaceae) di thực vào Việt Nam. Tuyển tập Hội nghị Khoa học và Công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ hai. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. Trang 333 – 337. 27. Đặng Thái Thuận và Nguyễn Mạnh Chinh, 1996. Sâu bệnh hại cây trồng thường thấy ở Miền Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 28. Hồ Khắc Tín, 1982. Giáo trình côn trùng nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tài Liệu Tiếng Anh 29. Biswas Kausik, Chattopadhyay Ishita, Banerjee, R.K. and Bondyopadhyay Uday, 2002. Biological activities and medicinal properties of neem (Azadirachta indica A.Juss). Current science, Vol. 82, No. 11. 30. Broughton H.B., Roner P.S., Ley S.V., Morgan E.D., Slamin A.M.Z. and Williams D.J., 1987. The chemical structure of azadirachtin. In: Schmutterer H., Ascher K.R.S. [Eds] Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.Juss) and other tropical plants. Proceedings of the Third International Neem Conference: p. 109 – 110. , Nairobi, Kenya. p. 103 – 110. 31. Coventry E. and Allan E.J., 2002. Microbiological and chemical analysis of neem (Azadirachta indica A.Juss) extracts. New data on antimicrobial activity. Pytoparasitica 29:5 32. Dahanukar S.A., Kulkarni R.A. and Rege N.N., 2002. Pharmacology of medicinal plants and natural products. Indian Journal of Pharmacology, 32, S81 – S118. 71 33. Dennis Dearth I.R., 1992. Neem – A tree for solving global problem. National Academy Press, Washington D.C., USA. 141 pages. 34. Foster P., 2000. Standardisation of analytical methods for neem based products – latest developments. Practice Oriented Results on Use and Production of Neem Ingredients and Pheromones VIII. Copyright by Druck & Graphic, Giessen. 35. Govindachari T.R. et al., 1999. Triterpenoidal constituents of an aqueous extract from neem kernels. Fitoterapia 70, p. 558 – 560. 36. Gunasena H.P.M., Marambe B., 1998. Neem in Sri Lanka – A monograph. A Publication of the university of Peradeniya – Oxford Forestry Insitute, UK. Forsetry Research Link, 62 pages. 37. Gupta B.N. and Sharma K.K., 1998. Neem – A Wonder Tree. Indian council of forestry research and education, Dehra Dun, India. p. 1 – 7 and p. 142 – 148. 38. Kleeberg H. and Hummel E., 2000. NeemAzal TM – T/S_Experience and possibility in biological plant protection system. Practice Oriented Results on Use and Production of Neem Ingredients and Pheromones VIII. Copyright by Druck & Graphic, Giessen. 39. Kleeberg H. and Zebitz C.P.W. [Eds], 1997. Neem analytics. Practice Oriented Results on Use and Production of Neem Ingredients and Pheromones V. Copyright by Trifolio – M GmH, Germany. 40. Larson R.O., 1987. Development of margosan _ O, a pesticide from neem seed. Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.Juss) and other tropical plants, (Schmutter, H. and Ascher, K.R.S. [Eds]). Proceedings of the Third International Neem Conference, Nairobi, Kenya, p.243 – 250. 41. Narasimhan et al., 1998. Efficacy of neem EC formulation of neem oil and pungam oil for the management of sheath rot disease of rice. Phytoparasitica 26(4):301:306. 42. Office of Complementary Medicines, Therapeutic Goods Adminiustration, 2001. Evaluation of Cold – Pressed Oil from the seed kernels of Azadirachta indica A.Juss, Meliacaea (Neem) for use in Listable Therapeutic Goods. posting November, 2002. 43. Pata Chera. International workshop on Heliothis management. India. 44. Rajappan et al., 2001. Management of sgrain discoloration of rice with solvent – free EC formulation of neem and pungam oil. Phytoparasitica 29:2. 45. Schnaider B.H. and Ermel K., 1987. Quantitative determination of azadiachtin from neem seeds using High Performance Lipuid Chromatography. Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.Juss) and other tropical 72 plants, (Schmutter H. and Ascher K.R.S. [Eds]). Proceedings of the Third International Neem Conference, Nairobi, Kenya, p.161 – 170. 46. Schmutter H. and Ascher K.R.S. [Eds], 1987. Natural pesticides from the neem tree (Azadirachta indica A.Juss) and other tropical plants. Eschborn. 47. Singh S. and Singh R.P., 1998. Neem (Azadirachta indica) seed kernel extracts and azadirachtin as oviposition deterrents against the Melon Fly (Bactrocera curcubitae) and the oriental Fruit Fly (Bactrocera dorsalis). Phytoparasitica 26(3). 48. Tewari D.N., 1988. Neem tree. Indian Council of Forestry Research and Education, India, 18 pages. 49. Tewari D.N., 1992. Monograph on neem. International Book Distributors. New Delhi, p. 279. 50. Vandana Shiva, 1998. The neem tree – a case history of biopiracy – Fact 98 – 01.